klt preparatif1

8/13/2019 KLT Preparatif1

1/23

KLT Preparatif

(KLTP)Metode isolasi :

1. sederhana dan mudah dilakukan untuk

pemisahan produk alam

(popularitas berkurang setelah kesuksesanHPLC dan countercurrent Chrommatogrphy).

2. tidak membutuhkan peralatan mahal.

3. Pemisahan dapat dilakukan dg cepat.4. Dapat menghasilkan dg isolat 1 mg1 g (cukup

untuk elucidasi struktur).


2/23

untuk pemurnian tahap akhir dalam prosedur isolasi (

tergantung kompleksitas ekstrak).

Jika campuran komplek dilakukan KLTP sebagailangkah awal, maka materi banyak pengulangan,banyak plate dan waktu lama.

(KLTP diutamakanuntuk pemisahan campuran yangtelah dipisahkan sebagian).

Campuran komplek, sebagai langkah awal dipisahkandg KCV, KK lebih dahulu sebelum KLTP

Kapan Penggunaan KLTP ??

Biomass (Plant,Mikroba, Insector marine)

ekstraksiPartisi

Fraksi nonpolar

Fraksi polar

Kromatografi kolomKCV, CC, HPLC

Lebih dari 1 tahap??

KLTP


3/23

Kapan Penggunaan KLTP ??

Senyawa yang dapat dipisah dg KLTP sangat tergantung bagaimanaprofilnya pada sistem kromatografi (umumnya pemisahan campurantak lebih 4 komponen mayor).

Data Proses isolasi tritepen friedelane:

Membutuhkan hanya satu kali tahap pemurnian sebelum KLTP

tidak mempunyai kromophor visualisasi dg pereaksi semprot : VanilinH2SO4

Species Ekstrak Step (1) Step (2) Struktur

Phyllobotryon

spathulatum

(kulit)

Petroleum

dan

CHCl3

VLC pada silika

gel. Fraksi dielusi

dg 25% EtOAc

dalam Hexane

KLTP dg

Toluen-EtOAc-

AcOH

(80:18:2)

O

HO

CH3

OH

FRIEDELANE


4/23

Scale-Up dari lempeng analitik ke KLTP scale-up dari analitik ke preparatif

terjadi perubahan ukuran sistem pemisahanmempengaruhi

kromatografi produk natural- ketebalan sorbent : Analitik 0,1-0,2 mm, KLTP : 0,5-4 mm

- ukuran plate : Analitik < 20x20 cm, KLTP : 20 x 20 cm

- ukuran partikel (ex silika) : Analitik 5-20 m, KLTP 5-40 m

Kromatografi dr senyawa yang dipisahkan dg lempeng analitik (1 g)bahan)profil dapat berubah signifikan bermakna ketika beberapamiligram (10 mg) diaplikasikan. Salah satu yg berpengaruh : ukuranpartikel sorbent.

Pada silika (phase normal),ketika mengubah dari analitk ke skalapreparatif, mungkin diperlukan mengurangi polaritas solven untukmendapatkan Rf sama (trial and error)contoh :

Pemisahan campuran 2 komponen yg pada analitik dg heksana : EtOAc(60:40) sebagai phase mobilperlu sistem yang kurang polar sepertiheksana : EtOAc (90:10) untuk menghasilkan Rf yang sebanding.


5/23

Lempeng KLTP komersial

Karakteristik :

Lempeng yang biasa digunakan : silika, alumina, C18,dan selulosa dg ketebalan 0,5, 1,0 dan 2 mm.

Lempeng silikadistribusi ukuran partikel 540 m,dibandingkan plate analitik 520 m.

Lempeng silika mempunyai luas permukaan tinggi,

sangat homogen dan memberikan hasil yang bagus. Lempeng normal phasememerlukan pre-elusi dg solven

polar seperti diklormethan untuk membersihkan danmengambil kontaminan. Pengotor dapat diambil dgsolven ke plate atas dan kemudian dikeringkan sebelum

digunakan. Ketika membuka kemasan, Lempeng yg belum

digunakan sebaiknya disimpan di desikator krnkeberadaan air akan berpengaruh pada aktivitasnya(khususnya silika).


6/23

Lempeng preparatif yg dibuat sendiri

lebih fleksible dalam pemilihan sorben dapat memvariasi ketebalan plate

memerlukan penambahan binder (CaSO4),beberapa jenis sorbent silika sudah

mengandung binder (Merck) lempeng yang disiapkan dapat menggunakan

indikator UV atau tidak.

Jika dilakukan penggabungan perak nitrat padasorbent, plate sebaiknya disimpan dandikembangkan ditempat gelap untukmenghindari perubahan warna sorben.

Lebih murah


7/23

Aplikasi sampel

Sebelum digunakan (jika buat sendiri) plate preparatifdioven 115C selama 4 jam kmd didinginkan pd suhukamar.

Sampel yang diperiksa dilarutkan dalam sedikit pelarut

(umumnya konsentrasi 10-20 mg/ml). Sampel ditotolkan dekat tepi dasar (~1,5cm) sebagai

garis tipis (lebar 24 mm) menggunakan mikrosiring(pipa kapiler)

Jika diperlukan, aplikasi sampel ditandai dg pencil

(sekitar 1,5 dari tepi) atau dg bantuan kertas HVS A4 ygdiletakkan atas plate.

Jangan mengaplikasikan sampel hingga tepi plate untukmenghindari edge effect(kecepatan bergerak pelarutkeatas pada tepi plate atau sorbent kurang homogen)

pita tak beraturan.


8/23

Pengembangan dan Deteksi

Diawali pemilihan sistem solven-sorben yang tepat.

Fase gerakdibuat baru.

umumnya 100 ml dapat untuk mengembangkan 1-2plate pada chamber dan waktu yang sama.

Chamber perlu dijenuhkan dg bantuan kertas saringsepanjang sisi chamber.

Silika merupakan sorben yang cukup reaktifdan banyakproduk alam yang tak stabil sehingga selama

pengembangan perlu dijaga dari sinar langsung agartidak terjadi degradasi produk alami.

Pengembangan dilakukan hingga beberapa mm dari tepiatas, kmd plate diambil dan dikeringkan.


9/23

Pengembangan dan Deteksi

Sampel yang semimurni akan menunjukkanresidual yang berwarna, dapat mengetahuiseberapa jauh bermigrasi

Senyawa pigmen seperti klorofil dapatdiamati secara visual.

Senyawa yang mengabsorbsi UV dapatdilakukan deteksi dan selanjutnya bagian yang

jadi tujuan dikerok untuk proses isolasi.

Senyawa yang sedikit/tidak mengabsorbsi UV,

dilakukan deteksi dg pereaksi semprot padabagian tepi. Jika hasil deteksi menujukkanpemisahan tidak bagus maka senyawa/ bagianyang telah bereaksi harus diangkat dari lempenguntuk menghindari kontaminasi.


10/23

Desorpsi dan recovery

Setelah pemisahan senyawa telah cukupdilakukanproduk alami perlu di-recovery darisorbent, dikeringkan dan disimpan untukelucidasi struktur (dapat juga untuk PK).

Jika silika telah mengandung indikatorflourescen, maka pita yang mengabsorbsi uvditandai dg pencil dan dilepaskan dari padatanpendukung sorbent.

Jika deteksi menggunakan pereaksi semprot,maka bagian pita yang telah diwarnai pereaksidilepaskan dari plate menggunakan penggaris.

Gunakan masker saat melepaskan pita dari plate untuk menghindari

bahan berbahaya yang tek diketahui masuk pernapasan.


11/23

Bagaimana lepaskan dari sorben ??3 cara :

Sorbent yang mengandung senyawa dipindah ke erlenmeyerdan pelarut ditambahkan. Disuspensi 30 menit untukmelepaskan senyawa dari sorben, disaring. Proses diulangi 2atau 3x untuk memastikan recovery berjalan baik. Jenis solvenyang digunakan sebaiknya lebih polar dari yang biasadigunakan untuk melarutkan, misalnya sample dilarutkan padaCHCl3 maka pelarut digunakan unuk recovery CHCL3: metanol

(9:1) atau (8:2).Langkah ini untuk meyakinkan recovery telahmaksimal dari sorbent dan meminimalkan kemungkinan produktetap tertahan pada sorbent.

Sorbent yang mengandung senyawa ditempatkan pada corongdg sinterglas yang dipasang pada labu buchner untuk aplikasi

vakum. Sorbent dicuci dg pelarut dan larutan yang dihasilkanditampung dan diuapkan untuk menghasilkan produk.Pencucian diulang untuk efektifitas recovery senyawa dr plate.

Menggunakan kolom kecil, dikemas dg sorben yangmengandung senyawa. Kolom kemudian dielusi dg solvenuntuk recovery senyawa. Membutuhkan waktu lama dandiasumsikan senyawa stabil.


12/23


13/23

Penting diperhatikan !Pada beberapa kasus, dimana sorbentnya silika,metanol dapat digunakan sebagai langkah akhir untuk

menyakinkan senyawa telah direcovery.

Beberapa senyawa yang sangat polar (glikosidaflvonoid atau glikosida triterpen) memerlukanpenambahan 1 - 2% asam asetat.

Produk yg diperoleh harus dikeringkan dg cepat,

sebaiknya dg aliran N2 dan disimpan dalam frezer.Dihindari penggunaan vepatau alat penguap yangmenggunakan panasberesiko terjadi oksidasi,dekomposisi atau hilang menguap.


14/23

Uji Kemurnian dengan TLC KLT analitik dapat digunakan untuk menetapkan

kemurniannya.

Ukuran partikel yang lebih kecil pada plate KLTakan memberikan resolusi lebih baik dankemampuan yang lebih besar dalam mengukurkemurnian.

Penggunaan minimal 3 sistem solven yang berbedauntuk melihat senyawa yang mempunyai kemiripannilai Rf pada sistem solven.

jika senyawa menunjukkan ketidakmurnian bahkan

setelah di KLTPada kemungkinan senyawa tidakstabil pada sorbent atau dalam larutan.

perlu dicari alternatif fase diam atau prosespemisahan lain.


15/23


16/23

Keuntungan KLTP

metode yang murahjika dibanding HPLC atau

kromatografi countercurrent. teknik pengerjaan sederhana, hanya memerlukansedikit latihan dan pengetahuan kromatografi.

suatu metode analitik yang bisa di scale-upuntukmetode preparatif.

Produk natural dapat di isolasi dengan cepatdalam scala mgg jika dibanding HPLC.

Pemilihan solven dan sorben fleksibel, solvendapat diubah dg cepat selama runing.

Sejumlah besar senyawa dapat dianalisis ataudipisahkan secara simultan.


17/23

Kelemahan KLTP

deteksinya kurang pekajika dibandingkan HPLC.

kecepatan eluasi tidak dapat dikendalikanseperti pada HPLC.

kecepatan operasional lebih lambat jika dibanding KCV.

Jika diperlukan pengembangan ganda (terutama2-D) untuk isolasi skala gram perlu waktu lama.

terbatas hanya dengan sorbent-sorbent

sederhana seperti silika, alumina, selulosa.


18/23

KLT BioassayKLT bioassayterhadap fungi & bakteri

banyak digunakan, karena :

Mudah penggunaannya Murah

Cepat

Mampu untuk proses scale-upterhadap aktivitasantibakteri

Prinsip

Dilakukan KLT kemudian mikroorganisme disemprotkanpada lempeng (Direct bioautography) atau

lempeng ditutupkan pada medium pertumbuhan yangmengandung mikroorganisme (overlay assay).

bakteri yang resisten obat butuh obat-obat baru biassaysederhana sebagai antimikroba.


19/23

KLT bioutografi langsung

(Direct bioautography)

Menggunakan fungi atau bakteri

Untuk melacak aktivitas selama prosespemisahan

Sangat sensitif dan akurat dalam menunjukkansenyawa aktif

Uji antifungi umumnya tehadap Cladosporiumcucumerinum,

- patogen tehadap tumbuhan

- non patogenik tehadap manusia- mudah membentuk spora

- dapat dg mudah tumbuh pada lempeng KLT


20/23

KLT bioutograf i langsung (Direct bioautog raphy )

Uji antifungi:

1. Spot ekstrak/senyawa murni pada KLT (duplikate)dikembangkan dg fase gerak sesuai dan dikeringkan,

2. Menyiapkan C. Cucumerinum dari kultur hingga berumur 2hari.

3. Menyiapkan medium pertumbuhan pada TLC4. Menyiapkan suspensi spora fungi (no 2 ditambahkan no 3)

5. Menyemprotkan suspensi pada lempeng KLT danmenginkubasi pada 25C (2 hari) pada nampan uji yangberisi kapas lembab

6. Keberadaan senyawa antifungi ditunjukkan denganpenghambatan pertumbuhan micelia fungi.

7. Pengamatan lempeng KLT (ke-2) dg reagen atau UV danmembandingkan dg lempeng yg diinkubasi


21/23

KLT bioutograf i langsung (Direct bioautography)

Kelemahan metode :

Tak dapat membedakan

metabolit yang fungistatic/fungicidal.

Perlu uji lanjutanpenetapanMIC (Minimum InhibitoryConcentration)

Contoh : Dellar et.almengisolasi 2

senyawa dari Prosthanthera sp(Labiatae) melalui directbioutografidengan target fungiCladosporium cucumerinum.

Uji aktivitas antifungi senyawafenol. Hostettmenn dan Marstonmeneliti kelompok xanton(senyawa 1,2,3) dari Hypericumbrasiliense (Guttiferae) terhadap

Cladosporium cucumerinum

Prosthantherol(10ug, 70 jam)

HOO

Aristolen-2-one(1ug, 70 jam)

O

OH

OH

O

Senyawa 1(0,25 ug)

O

OCH3

OH

O

Senyawa 2(3 ug)

O

OH

OH

OSenyawa 3

(3 ug)

O


22/23

KLT bioautografi overlay assay

Senyawa murni/ekstrak dilakukan KLT, kemudian ditutup dgmedium yg mengandung m.o (dapat bakteri/fungi).

Uji terhadap Staphyloc occus aureus

Nutrient agar dituang pada dish uji.

Ekstrak, fraksi atau senyawa murni di KLT (dibuat 2)

Bercak dideteksi dengan UV, Rf ditentukan (akurat)

Menginokulasi S aureus dengan titer 109CFU/ml dalam MH,ditambahkan agar untuk mengentalkan hingga titer final 105 CFU/ml

Lempeng KLT diletakkan pada nutrient agar, medium yangmengandung m.o uji dituang diatas plate, diinkubasi pada 37 C (24

jam).

Zone hambat tampak spot jernih dg latar koloni bakteri. Zonedivisualisasi dg garam tetrazolium (p-iodonitrotetrazolium chloride

(INT) atau Methylthiazoltetrazolium chloride). Zone hambat(senyawa antimikrobial) nampak sebagai zone jernih dg latarpurple.

Zone hambat dibandingkan pada KLT ke-2 sehingga metabolit aktifdapat diisolasi.

Dapat digunakan ampicillin atau kloramphenicol sebagai kontrol.


23/23

KLT bioautografi over lay assay

Uji terhadap bakteri resistenobat, seperti methicillin-

resistant Staphylococcusaureus, perlu ditambahkanmethicillin (1 mg/L) untukmemperkecil resiko tanparesistensi.

Batista et.al. menggunakanmetode overlaydalambioassay-guided fractinationpada ekstrak akarPlectranthus hereroensis(Labiatae)mengisolasiditerpen antibakteri (senyawa4) dg menggunakan S.aureus.Senyawa diuji padadilution assaydengan MIC31,2 g/mL.

OAc

OH

O

O

OH

H

Senyawa 4

klt preparatif1

Documents