Kromatografi Lapis Tipis

I. Tujuan

I.1. Dapat menjelaskan teknik – teknik dasar kromatografi lapis tipis.

I.2. Dapat menjelaskan prinip dasar kromatografi.

I.3. Melakukan isolasi campuran senyawa sampai pemurniannya secara

kromatografi lapis tipis.

I.4. Untuk memisahkan campuran senyawa menjadi senyawa murninya

dan mengetahui uantitasnya yang digunakan.

I.5. Dapat menghitung nilai Rf.

II. Prinsip

Berdasarkan pada adsorpsi (zat terlarut diserap pada permukaan

fase diam) dan partisi (zat terlarut didistribusikan antara fase diam dan

fase gerak).

III. Reaksi –

IV. Teori Dasar

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling

kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena

pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan

analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada

tahap permulaan untuk semua cuplikan dan kromatografi preparatif

hanya dilakukan juka diperlukan fraksi murni dari campuran.

Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik

langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul.

Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik

kromatografi pemilohan teknik kromatografi sebagian besar

bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua

kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau

kombinasi cairan – padatan, dan fase gerak (berupa cairan atau gas).

1

Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen –

komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen yang berbeda

bergerak pada laju yang berbeda.

Kromatografi merupakan suatau teknik pemisahan campuean yang

berdasarkan pada kecepatan perambatan komponen dalam medium

tertentu. Uraian pada kromtografi tersebut diuraikan oleh Michael

Tsweet yang melakukan suatu pemisahan klorofil dari suatu pigmen –

pigmen lain dari ekstrak tanaman dengan menggunakan suatu

kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium karbonat.

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang

sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar

dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk

mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang

diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara

kromatografi dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang

dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa

yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa

yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif

seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang

berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni

dapat dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf

dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari

titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal.

Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0.

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisika – kimia

dengan fase gerak (larutan pengembang yang cocok), dan fase diam

(bahan berbutir) yang diletakkan pada penyangga berupa plat gelas

atau lapisan yang cocok. Kromatografi lapis tipis ini merupakan salah

satu analisis kualitatif dari suatu sample yang ingin dideteksi dengan

memisahkan komponen – komponen sample berdasarkan pada

perbedaan kepolaran.

2

Pada proses pemisahan dengan menggunakan kromatografi lapis

tipis, terjadi suatu hubungan keseimbangan antara fase diam dan fase

gerak, dimana akan ada interaksi antara permukaan fase diam dan

gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah

berinteraksi dengan fase geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi

oleh 3 faktor, yaitu kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak serta

kepolaran dan ukuran molekul.

Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembang), lalu

hasil pengembangan di deteksi. Zat yang memiliki kepolaran yang

sama dengan fase diam akan cenderung tertahan dan nilai Rf nya

paling kecil. Kromatografi lapis tipis ini digunakan untuk memisahkan

komponen – komponen atas dasar perbedaan adsorpsi oleh fase diam

dibawah gerakan pelarut pengembang.

Pada cara penggunaan kromatografi lapis tipis ini hampir sma

dengan menggunakan kromatografi kertas, hanya saja pada

kromatografi lapis tipis fase diamnya menggunakan plat gelas atau

logam atau alumunium foil sedangkan pada kromatografi kertas

menggunakan kertas saring.

Fase diam dapat berupa lapisan tipis berupa absorben contohnya

alumina (alumunium oksida), silika gel, dll. Sedangkan, untuk fase

gerak berupa cairan atau gas inert contohnya gabungan variasi pelarut

– pelarut non polar, semi polar, contohnya air, kloroform, etanol. Fase

diam yang digunakan pada kromatografi lapis tipis merupakan pnjerap

berukuran kecil dengan diameter partikel 10 – 30𝛈m. Semakin kecil

ukuran rata – rata partikel pada fase diam dan semakin sempit kisaran

ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi

dan resolusinya.

Fase gerak ada berbagai cara untuk memilih dan mengoptimasi

fase gerak, diantaranya :

1. Fase gerak harus memiliki kemurnian yang tinggi karen KLT

merupakan teknik yang paling sensitif.

3

2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga

harga Rf terletak antara 0,2 – 0,8 untuk memaksimalkan

pemisahan.

3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti

silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan

migrasi solut yang berarti juga akan menentukan suatu nilai Rf.

Analisis pada KLT ini dapat digunakan dengan menggunakan 2

cara, yaitu diantaranya :

1. Analisis kuanitatif, dengan menentukan jenis – jenis senyawa

berdasarkan standar yang suda ada. Dengan menghitung Rf

Rf = Jarak yang ditempuholeh komponen

jarak yangditempuh oleh pelarut =

xy

2. Analisis kualitatif, dengan pennetuan kadar senyawa

berdasarkan pada densiometri (alat untuk mengukur kerapatan),

dan juga bisa menggunakan spektrofotometri.

Dibawah ini merupakan faktor – faktor yang mempengaruhi

gerakan noda dalam KLT dan yang dapat mempengaruhi harga Rf,

adalah :

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.

2. Tebal dan kerapatan dari lapisan penyerap. Sebab ketidakrataan

akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tidk rata dalam

daerah yang kecil dari plot.

3. Derajat kejenuhan dan uap bejana pengembangan yang

digunakan.

4. Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetasan cuplikan dakam

jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda –

noda dengan terbentuknya ekor dan efek kesetimbangan

lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalaha – kesalahan pada

suatu harga Rf.

5. Suhu. Pemisahan – pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu

tetap, hal ini dikarenakan terutama untuk mencegah perubahan

– perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh

suatu penguapan atau perubahan fase.

4

Pada kromatografi lapis tipis eluent adalah fase gerak yang

berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk

melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan

eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Eluent

dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut

atau campuran pelarut tersebut pada adsorben.

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak

bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat

membandingkan 2 sampel yang berbeda di bawah kondisi

kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut

kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat

kromatografi lapis tipis. Nilai Rf dapat di jadikan bukti dalam

mengidentifikasikan senyawa. Bila di identifikasi nilai Rf memiliki

nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki

karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan bila nilai Rf nya

berbeda, senyawa tersebut dapat di katakan merupakan senyawa yang

berbeda

Aplikasi metode KLT dalam bidang farmasi, contoh

penggunaannya metode KLT ini dapat ditetapkan dalam menganalisis

adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten,

apakah memerlukan persyaratan obat atau tidak sehingga kadarnya

tepat atau tidak obat tersebut dapat memberikan efek terapi yang

dikehendaki.

Kunyit mengandung senyawa yang berkhasiat obat, yang disebut

kurkuminoid yang terdiri dari kurkumin , desmetoksikumin sebanyak

10% dan bisdesmetoksikurkumin sebanyak 1-5% dan zat- zat

bermanfaat lainnya seperti minyak atsiri yang terdiri dari Keton

sesquiterpen, turmeron, tumeon 60%, Zingiberen 25%, felandren ,

sabinen , borneol dan sineil. Kunyit juga mengandung Lemak

sebanyak 1 -3%, Karbohidrat sebanyak 3%, Protein 30%, Pati 8%,

Vitamin C 45-55%, dan garam-garam mineral, yaitu zat besi, fosfor,

dan kalsium.

5

Kurkuminoid dikenal sebagai zat warna kuning yang terkandung

dalam rimpang. Kenyataan menunjukkan bahwa kurkumin yang

diperoleh dari rimpang kunyit selalu tercampur dengan dengan

senyawa analognya yaitu demetoksi kurkumin dan BIS demetoksi

kurkumin. Campuran ketiga senyawa tersebut dikenal dengan

kurkuminoid.

Kurkumin mempunyai rumus molekul C23H2006 dengan BM 368,37

serta titik lebur 183°C, tidak larut dalam air dan eter, larut dalam etil

asetat, metanol, etanol, benzena, asam asetat glasial, aseton dan alkali

hidroksida. Kurkumin merupakan senyawa yang peka terhadap

lingkungan terutama karena pengaruh ph dan suhu, cahaya serta

radikal-radikal.

V. Alat dan Bahan

V.1. Alat – alat :

V.1.1. Chamber

V.1.2. Lampu Uv

V.1.3. Pipet tetes

V.1.4. Pipa kapiler

V.1.5. Alumina

V.1.6. Pipet tetes

V.1.7. Kaca arloji

V.2. Bahan – bahan

V.2.1. Kunyit (ekstrak)

V.2.2. Chloroform

V.2.3. Metanol

V.2.4. Etanol

6

VI. Prosedur Percobaan

VI.1. Penotolan sample pada plat KLT

Ditandai plat menggunakan penil dan penggaris untuk

posisi tempat sample ditotolkan, sekitar 1cm dari bagian bawah

plat. Digunakan selalu pensil untuk memberi label sample.

Kemudian ditotolkan sample diatas plat menggunakan pipa kapiler

sampai noda cukup tebal tetapi tidak melebar. Setelah noda pada

plat kering, dimasukkan plat ke dalam wadah tertutup (chamber)

yang telah berisi pelarut yang sesuai. Sebelumnya, pelarut dalam

wadah tersebut dijenuhka terlebih dahulu dngan menempatkan

kertas saring di dalam wadah dan wadah tersebut harus tetap dlam

keadaan tertutup. Kemudian, dibiaran pelarut tersebut menaiki plat

di dalam wdah perlahan sampai mencapai sekitar 0,5cm dari

bagian atas plat. Selanjutnya, dikeluarkan plat dan dibiarkan

pelarut mengering.

Beberapa senawa organik berwarna, jika sample yang

berwarana maka penampakan noda akan mudah terlihat. Akan

tetapi, jika sebagian besar senyawa organik tidak berwarna maka

untuk melihat suatu penampakan noda diperlukan suatu alat bantu.

Biasanya, pada KLT mengguakan bahan indikator flouresens yang

dapat memancarkan suatu warna biru keunguan di bawah lampu

UV pada panjang gelombang 254nm. Snyawa yang menyerap sinar

UV pada panjang glombang tersebut akan memberikan

penampakan noda di bawah lampu UV. Cara lainnya untuk

penampakan noda adalah dengan memaukkan plat KLT ke dalam

wadah berisi iod padat yang akan menyublim dan mengabsorbsi

molekul organi afse gas, sehingga aan terbentuk noda kecoklatan.

Selain itu, terdapat beberapa larutan penampak noda lain seperti

serium sulfat, dan fosfomolibdat.

7

VI.2. Pembuatan ekstrak

Sebanyak 20g rimpang kunyit kering di dalam 50ml

diklormetana direfluks selama 1 jam. Campuran kemudian segera

disaring dengan saringan vakum hingga diperoleh lauran yang

kunig. Larutan lalu dipekatkan melalui destilasi pada penangas air.

Residu kuning kemerahan yang diperoleh kemudian dicampurkan

dengan 20ml n-heksana dan diaduk ecara merata. Campuran

kemudian disaring lagi dengan penyaring vakum, padatan yang

dihasilkan selanjutnya dianalisis dengan KLT menggunakan eluen

CH2Cl2 : MeOH = 97:3 dan juga perbandingan 93:7 yang akan

menunjukkan 3 komponen utama.

Hasil elusi dilhat di bawah lampu UV, kemudian pita

komponen utamanya diberi tanda dengan ujung tumpul pipa

kapiler. Bagian pita yang dipilih kemudian dipisahkan dari

komponen lainnya dengan cara mengerok lapisan silica tersebut

dan ditampung pada kertas. Dipindahkan silica tersebut ke dalam

gelas kimia, dilarutkan dengan diklormetana, kmudian saring dan

cuci dengan pelarut yang sama. Diukur panjang gelombang

menggunakan spektrofotometri UV-VIS.

8

VII. Data Pengamatan

VII.1. Eluen 1 (CH2Cl2 : MeOH = 97:3)

Rf = Jarak yang ditempuh suatu komponen

Jarak yangditempuh suatu pelarut

Rf 1 = 1,26,9

=0,17

Rf 2 = 1,86,9

=0,26

Rf 3 = 6,56,9

=0,94

VII.2. Eluen 1 (CH2Cl2 : MeOH = 93:7)

Rf = Jarak yang ditempuh suatu komponen

Jarak yangditempuh suatu pelarut

Rf 1 = 0,37

=0,042

Rf 2 = 1,17

=0,57

Rf 3 = 5,87

=0,82

9

VIII. Pembahasan

Pada praktikum kali ini tentang Kromatografi Lapis Tipis dengan

menggunakan suatu sample yaitu dengan kunyit dengan fase diam

berupa aluminum dan menggunakan fase gerak yaitu kloroform

dengan metanol dengan masing – masing perbandingannya 93 :7 dan

juga 93 : 7. Sebelum melakukan teknik kromatografi lapis tipis pada

suatu sample maka perlu dilakukan terlebih dahulu suatu penjenuhan

dengan menggunakan suatu kertas saring hingga fase geraknya naik

hingga ujung kertas saring tersebut. Tujuannya penjenuhan tersebut

agar titik spot yang dihasilkan pada proses KLT tersebut berjalan

dengan baik dan fase gerak naik dengan sempurna, dan untuk

memperkecil suatu penguapan pada pelarut (fase gerak) tersebut.

Perlunya penandaan batas bawah dan atas setinggi 1 cm fungsinya

agar pada saat aluminium yang telah ditotolkan oleh sample tidak

tercelup oleh fase gerak. Apabila, hasil penotolan tercelup oleh fase

gerak maka bisa saja pelarut atau fase gerak tersebut melarutkan

sample tersebut sehingga mengganggu hasil pengamatan. Pada saat

penandaan batas bawah dan atas tidak boleh menggunakan pensil atau

dengan menggunakan tinta dikarenakan dalam suatu pensil dan suatu

tinta tersebut terdapat suatu senyawa lain, dan ketika dimasukkan ke

dalam chamber yang telah diiisi fase gerak yang terbawa bukan sample

melainkan dari senyawa yang terdapat dalam bolpoint atau pensil

tersebut.

Dalam menentukan batas bawah dan batas atas tingginya harus

sama apabila batas bawahnya 1 cm maka batas atasnya pun harus 1 cm

hal ini dikarenakan dapat mempengaruhi pada suatu nilai Rf, dan dapat

menyebabkan ketidaktelitian pada perhitungan Rf. Pada saat penotolan

juga tidak boleh terllau tebal dan juga tidak boleh terlalu tipis, apabila

terlalu tebal dapat menyebabkan suatu pengekoran yang disebabkan

oleh tebalnya suatu penotolan tersebut. Sedangkan, apabila terlalu tipis

10

maka dapat mengakibatkan tidak terlihatnya suatu spot pada saat

pengamatan. Penotolan tidak boleh terlalu lebar, dan ketika pada saat

penotolan selanjutnya harus berada di titik yang sama ketika penotolan

sebelumnya.

Ketika setelah akan melakukan praktikum KLT ini chamber tidak

boleh digerak – gerakkan, tujuannya karena dapat mempengaruhi pada

titik spot yang dibawa oleh fase gerak tersebut dan hasilnya tidak akan

lurus karena adanya pergerakan dari chamber tersebut.

Sample yang digunakan yaitu kunyit, kunyit yang telah dibuat

dalam bentuk ekstrak dilarutkan ke dengan etanol kemudian ditotolkan

ke alumunium untuk KLT diatas batas bawah yang telah ditentukan.

Pada kunyit ini terdapat suatu senyawa kurkumin, kurkumin ini

merupakan suatu pigmen yang paling dominan di dalam suatu kunyit,

kurkumin ini berkhasiat sebagai antioksidan.

Ketika fase gerak mulai menaiki suatu aluminium tersebut,

senyawa – senyawa yang terdapat dalam sample akan menaiki

aluminium mengikuti arahnya fase gerak tersebut. Kecepatan pada

naiknya suatu fase gerak tersebut tergantung kepada kelarutan suatu

senyawa yang berada dalam pelarut tersebut dan tergantung pada

besarnya suatu interaksi antara molekul – molekul suatu senyawa

dengan pelarut atau fase gerak tersebut.

Pada kurkumin ini memiliki suatu ikatan hirogen oleh karena itu,

suatu kurkumin tersebut akan udah untuk melekat pada suatu

aluminium tersebut dibandingkan dengan suatu senyawa lainnya, oleh

karena itu pada kurkumin akan terlihat jelas penampakan nodanya

pada aluminium tersebut. Pada kurkumin spot yang terbentuknya yaitu

3 spot.

Nilai Rf berada pada rentang 0,2 – 0,8 tidak boleh berada nilai

kurang dari 0,2 dan tidak boleh lebih dari nilai 0,8. Sedangkan, Rf

pada kurkumin berada pada rentang 0,2 – 0,5 akan tetapi, pada Rf

kurkumin ini tergantung pada suatu pelarut (fase gerak) yang

digunakan karena dengan perbandingan pelarut yang digunakan juga

11

harga Rf nya bisa berbeda – beda. Pada spot yang paling bawah atau

sopt yang pertama bersifat polar, sedangkan untuk spot selanjutnya

semi polar yaitu demetoksikurkumin dan spot yang terakhir bersifat

non polar yaitu bis – demetoksikurkumin.

Jika dilihat dari hasil pengamatan di bawah sinar UV, spot yang

baik dihasilkan yaitu pada perbandingan 97 : 3 (CH2Cl2 : MeOH)

dibandingan dengan perbandingan yang 93 : 7, karena hal ini bisa saja

pada perbandingan 97 : 3 lebih polar dibandingkan dengan 93 : 7

sehingga ikatan antara suatu fase gerak dengan senyawa kurkumin

lebih kuat. Karena semakin jarak nya jauh dari spot awal maka

semakin baik proses pada KLT nya.

Pada saat perhitungan Rf ada nilai Rf yang berada pada angka

0,0042 hal ini seharusnya tidak boleh karena nilai Rf minimum pada

kurkumin yaitu 0,2 hal ini bisa saja dikarenakan kurangnya ketelititan

pada saat menghitung jaraknya dengan penggaris tidak teliti dan juga

pada saat menandai bagian bawah dan atas tidak sama 1 cm.

12

IX. Kesimpulan

Pada praktikum kali ini penentuan KLT yang digunakan dengan

menghitung nilai Rf = jarak yangditempuh kompinenjarak yang ditempuh pelarut

. Pada hasil

praktikum kali ini ada nilai Rf yang dihasilkan tidak sesuai dengan

literatur, hal ini disebabkan karena kurangnya ketelitian pada saat

mengukur jarak yang ditempuh komponen dan pelarut, bisa juga

karena penandaan batas bawah dan atas yang tidak benar. Spot yang

dihasilkan lebih bagus dengan perbandingan fase gerak 97 : 3.

13

X. Daftar Pustaka

Roy J, Gritter, James M, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB.

Bandung

Hardjono, A. 2004. Ekstraksi Kurkumin dari Kunyit. Prosiding

Seminar Nasional Rekayas Kimia. Sekolah Tinggi Teknologi

Nasional Yogyakarta.

Sumar, Hendrayana. 2006. Kimia Pemisahan : Metode Kromatografi

dan Elektroforesis Modern. PT Remaja Rosdakrya. Bandung.

Available online at : www.scribd.com (diakses pada tanggal 10 April

2015)

Available online at : www.google.com (diakses pada tanggal 10 April

2015)

14