INFORME DE PRCTICAS CULTIVO DE TEJIDOS, MICROPROPAGACIN, COMSERVACIN Y EXPORTACIN DE GERMOPLASMA DE PAPAINFORME NO 005AL ING: Juan Larico VeraDe: Cabana Monzn Walter ElasAsunto: Informe de prcticas cultivo in vitro a partir de meristemos de papa (solanum tuberosum L.) Curso: Cultivo de tuberosas y racesFecha: 22/07/15

NDICEContenidoI . INTRODUCCIN2II . OBJETIVOS3AISLAMIENTO DE MERISTEMAS8MICROPROPAGACION10MANTENIMIENTO Y ALMACENAMIENTO A LARGO PLAZO11EXPORTACION IN VITRO12IV. MATERIALES Y METODOS12EQUIPOS12MATERIALES12PRODUCTOS QUMICOS13MEDIOS DE CULTIVO14MEDIOS DE INTRODUCCION14MEDIOS DE MICROPROPAGACION14MEDIOS DE CONSERVACION14MATERIAL VEGETATIVO14METODOS15V. RESULTADOS18VI. CONCLUSIONES19VII. RECOMENDACIONES19VIII. BIBLIOGRAFA19WEBGRAFA19IX . ANEXOS20

I . INTRODUCCINLa mayora de las plantas que se propagan de manera convencional mediante mtodos asexuales y cuando se descuidan los aspectos de orden fitosanitario corren el riesgo de infectarse con microorganismos como virus, hongos, bacterias y micoplasmas, causando en las plantas infectadas trastornos fisiolgicos que se reflejan en la calidad , longevidad, vigor y, principalmente , en los bajos ndices de produccin. Hasta la fecha para las plantas propagadas con enfermedades virosas no hay tratamientos qumicos eficientes a nivel comercial que erradiquen completamente la accin de estos organismos dentro de las plantas, por lo que su incidencia incontrolada permite la diseminacin de este tipo de enfermedades en clones completos. Basndose en el principio de que la distribucin de los virus en las plantas es de manera irregular, en los puntos de crecimiento la concentracin de los virus disminuye, ya que las regiones apicales y meristemticas hay una acelerada divisin mittica celular y una elevada actividad metablica; los virus no pueden controlar su maquinaria biosinttica dentro del hospedero, adems en estos puntos de crecimiento existe una carencia de tejido vascular definido que permita la libre trayectoria de los virus al no tener una va de transporte para invadir los tejidos meristemticos y la alta concentracin de auxnica endgena que inhibe la sntesis de los virus, son justificantes importantes que explican que mediante el aislamiento y cultivo in vitro de meristemos apicales podamos obtener plantas libres de patgenos incluidos los virus.Las tcnicas sobre el diagnostico de patgenos en plantas que incluye el uso de micro injertos, uso de plantas indicadoras, microscopa electrnica y el empleo demarcadores moleculares, conjuntamente con la aplicacin de las herramientas in vitro, permite cumplir satisfactoriamente los programas de diagnstico, certificacin de plantas libres de patgenos a nivel comercial.

II . OBJETIVOS1. aprender a localizar, disectar-aislar y sembrar in vitro meristemos apicales de papa (Solanum tuberossum). 2. observar la influencia de la constitucin de los medios de cultivo y reguladores en la regeneracin de plantas a partir de meristemos y pices de tallos sembrados.3. para recuperar cultivos en proceso de extincin

III MARCO TERICO Y CONCEPTUALVENTAJAS DE LAS TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOSEl Centro Internacional de la Papa (CIP) mantiene una coleccin de germoplasma de papa de aproximadamente 6 000 clones. Esta coleccin es fuente de diversidad gentica aprovechable por fitomejoradores en los programas de papa. La coleccin est expuesta a una amplia gama de riesgos, como enfermedades infecciosas o condiciones climticas adversas y su mantenimiento en el campo es costoso. Por eso la coleccin de germoplasma in vitro posee varias ventajas sobre el mantenimiento en el campo, a saber: menores costos de mano de obra, ausencia de infecciones de campo, ausencia de peligros ambientales como granizadas y heladas, acceso oportuno a material para micro propagacin, acceso oportuno a material para eliminacin de patgenos, disponibilidad permanente de material para propagacin y exportacin.En el CIP se est transfiriendo la coleccin de germoplasma de papa del campo a in vitro (cultivo de tejidos) pero se necesitan varios aos ms de trabajo para completar esa transferencia.

Trayectoria de un clon de papa a travs del cultivo de meristemas, micro propagacin, almacenamiento y su eventual exportacin.

AISLAMIENTO DE MERISTEMASEl meristema es un tejido compuesto por clulas que se dividen rpidamente (clulas meristemticas) y constituye el punto activo de crecimiento de la yema vegetal. Para la propagacin de cultivos de yemas de papa, el meristema es ideal como material inicial ya que tiene dos caractersticas 'favorables: El meristema aislado se desarrolla en el medio de cultivo de una manera genticamente estable. Este no es el caso, por ejemplo, de los cultivos de callos, que son desorganizados y presentan importantes variaciones genticas. El aislamiento de meristemas reduce el nivel de infeccin virtica en el tejido y, bajo condiciones apropiadas, puede ser utilizado para una erradicacin completa de patgenos.La cpula de la yema apical contiene las clulas verdaderamente meris-temticas y est rodeada por primordios foliares y hojas primarias. Como los tejidos vasculares ms diferenciados se encuentran alejados del meristema (constituyen tejidos ms viejos en el tallo), los elementos vasculares de los primordios foliares todava no han estado en contacto con la parte principal del sistema vascular del tallo. De ah que las partculas de virus, que puedan estar presentes en el sistema vascular, llegan a la regin meristemtica del pice solamente mediante un movimiento de clula en clula. Esta es una de las principales razones por las cuales en una planta infectada por virus la concentracin de los virus decrece a medida que stos se acercan al meristema, sea de yema apical o axilar.En principio esta situacin es similar en todos los vegetales; la nica diferencia est en la forma del meristema y de los primordios foliares. No se ha comprobado si otros factores como la produccin -eif las clulasmeristemticas- de substancias inhibitorias de los virus, o el efecto de las hormonas en el medio de cultivo, influyen en la eliminacin de los virus mediante el cultivo de meristemas.El aislamiento bajo condiciones aspticas del pice meristemtico, y su cultivo en un medio asptico adecuado, conduce el desarrollo de plntulas. Este desarrollo, en general, sigue un modelo que es similar al de la planta entera: las clulas del meristema se dividen y la diferenciacin de los tejidos continua. La nutricin de la parte disecada de la planta es suplida por un medio artificial. Esta tcnica llamada cultivo de meristema, fue aplicada por primera vez hace 30 aos por Morel y Martin (1952) en la dalia y puede llevar a obtener plantas libres de patgenos.La diseccin asptica del meristema es un proceso delicado y requiere muchas horas de prctica. La secuencia de diseccin est presentada fotogrficamente en la Figura 2 y se hace de la siguiente manera: Se cortan los tallos en segmentos, cada uno los cuales debe tener un nudo con su yema axilar. Luego con mucho cuidado se eliminan las hojas. Las piezas se desinfectan primero durante 30 segundos en alcohol de 70%, y a continuacin en una solucin de 2,5% de hipoclorito de calcio durante 15 minutos. Se lavan cuatro veces con agua destilada esterilizada para quitar el exceso de hipoclorito.Con el apoyo de un microscopio binocular para diseccin, se desprenden los fololos que rodean el punto de crecimiento hasta que slo queden el pice y algunos primordios foliares. El pice con dos primordios foliares se corta y se transfiere al Medio A (ver Seccin 6). Semanalmente se hace la transferencia a un medio fresco. Despus de seis a ocho semanas las pequeas plntulas son transferidas a tubos ms grandes para que continen su crecimiento. La micropropagacin puede iniciarse cuando las plantas tengan 4 cm de altura.

Secuencia fotogrfica de la diseccin de meristemas: a Yema aislada en condicin estril.b y c Etapas de la diseccin en que se eliminan las hojas primaras.d Meristemo completamente disecado con dos primordios foliares.

MICROPROPAGACIONEl objetivo de la micropropagacion es obtener un nmero grande de plantas clnales en un perodo corto. En el CIP, se siguen dos mtodos de micropropagacion de papa: esquejes de tallo para medios de agar, esquejes de tallo para medios lquidos.Para ambos casos se utiliza iluminacin indirecta durante 16 horas.Esquejes de tallo para medios de agar. De pequeas plntulas in vitro, se cortan nudos simples con hojas. Las hojas grandes se desecan con cuidado. Luego se coloca el esqueje sobre la superficie del Medio B, que es slido. La yema axilar crecer rpidamente (Figura 3) y en tres o cuatro semanas, habr otros seis o siete esquejes disponibles para ser transferidos.Esquejes de tallo para medios lquidos. Se cortan plntulas in vitro en pedazos con tres o cuatros nudos y se eliminan las hojas grandes. Estos3 segmentos de tallos se introducen en un frasco con 15 cm del Medio F lquido y el frasco se coloca en un agitador horizontal (80rpm). Despus dedos a tres semanas, se haproducido uncrecimiento muy veloz y de cada frasco se obtendrn 60 a 70 nudos. Cuando se haya producido un nmero adecuado de plntulas stas pueden ser trasplantadas a condiciones no estriles.Enraizamiento y trasplante a condiciones no estriles. A los esquejes de tallo de plntulas in vitro, se les quitan las hojas. Luego los esquejes se colocan en un Medio B donde crecen y enrazan. Cuando las plntulas tengan una altura de tres a cinco centmetros y hayan desarrollado un buen sistema radicular, estarnlistas para el tras plante. Las plntulas enraizadas pueden ser trasplantadas a macetas o tambin a almcigos quecontengan una mezcla adecuada de MANTENIMIENTO Y ALMACENAMIENTO A LARGO PLAZOEl material in vitro puede ser conservado en cultivo indefinidamente si se evita la contaminacin y se transfiere a medios frescos cada cierto tiempo. Se puede mantener una reserva de material de sanidad comprobada para utilizarlo en el futuro.Para el mantenimiento a corto plazo, las plntulas se cultivan en el medio B en tubos de ensayo. Estos se sellan con tapas de plstico que puedan ser esterilizadas en autoclave. Aunque los tapones de algodn son apropiados para un almacenamiento a corto plazo, no son recomendados para un almacenamiento a plazo mediano o largo, porque los hongos entran fcilmente en el algodn.La tasa de crecimiento de las plantas depende de la temperatura de incubacin, la composicin de los medios y la variedad de la planta. De all que se requieran, para un almacenamiento a largo plazo, modificaciones de los medios y de la temperatura de incubacin.Tanto el Medio C como el Medio D ejercen un estrs osmtico y pueden ser utilizados para un almacenamiento a 25C. El estrs reduce la tasa de crecimiento y produce entrenudos cortos. De ese modo se obtienen abundantes nudos para producir esquejes cuando se necesite propagar el material almacenado. Con un almacenamiento en estas condiciones, el material slo necesita ser transferido una vez al ao.Sin embargo, al utilizar el Medio C, la temperatura puede ser bajada a 8C, lo cual reduce significativamente la tasa de crecimiento de la plntula y, bajo estas condiciones, slo se necesita una transferencia cada dos o tres aos.En las condiciones de almacenamiento mencionadas en los prrafos anteriores es posible mantener una coleccin de germoplasma. Cuando llega un pedido de exportacin de un genotipo en particular, ste puede serEXPORTACION IN VITROEl material de la coleccin de sanidad comprobada puede ser exportado a otros pases como plntulas in vitro. De un material micropropagado se pueden obtener esquejes con un solo nudo, los cuales son transferidos a tubos de ensayo que contengan el Medio E. Cuando las plntulas tengan una altura de 2 cm y un sistema radicular bien desarrollado, los tubos con las plntulas se embalan con cuidado para su envo por avin. El destinatario es informado por tlex o cable sobre los nmeros de vuelo y gua aerea para que el envo pueda ser liberado de la aduana. Adjunto a cada envo in vitro va una nota que explica el manejo que se le debe dar al material despus de ser recibido, un certificado fitosanitario y una tarjeta, para llenar y devolver al CIP, con los detalles sobre el estado del material al llegar a su destino final.Las plntulas in vitro que se reciben de esta manera, pueden ser transferidas a una mezcla de musgo y arena, en macetas, o continuar siendo micropropagadas.Actualmente todos los envos in vitro se hacen en la forma de plntulas de 2 cm de altura, pero se est investigando para complementar o reemplazar este mtodo con la exportacin de tubrculos in vitro . Estos son unos tubrculos muy pequeos, aspticos y de sanidad comprobada, que pueden ser inducidos en un medio de cultivo. Es mucho ms cmodo transportarlos y su manejo por parte del pas de destino es ms fcil que en el caso de los tubos de ensayo.

IV. MATERIALES Y METODOSEQUIPOS Autoclave para esterilizar medios soluciones Agua destilada Materiales de vidrio Refrigeradora para guardas soluciones PH metro para medir PH Destilador de agua Balanza analtica Mango de bistur

MATERIALES 2 vasos de precipitado de 250 mL. 1 probeta de 250 mL. 1 pinza 1 mango para bistur nm. 3. 1 navaja de bistur nm. 10. 2 cajas petri estriles. 1 mechero de alcohol. Tubos de ensaye (o frascos) con medios de cultivo. 2 frascos con agua destilada y esterilizada con antioxidantes (150 mgL-1 de cido ctrico y 100 mgL-1 de cido ascrbico). hipoclorito de sodio (cloro comercial). alcohol etlico al 70%. Tween-20. 10 g de detergente. 1 estereoscopio. 1 cmara de flujo de aire laminar (cmara de siembra) Embudo Frasco de maduracin

PRODUCTOS QUMICOSMacro nutrientes Nitrato de amono Nitrato de potasio Cloruro de calcio 2 hidratado Sulfato de amonioMicro nutrientes Cloruro de potasio cido brico Sulfato de manganeso Sulfato de manganeso hidratado Cloruro de cobalto hidratado Y otrosReguladores de crecimiento Auxinas Citocininas GiberelinasModificadores de pH cido clorhdrico Dixido de sodio Hidrxido de sodio

Desinfectantes Hipoclorito de sodio Hipoclorito de calcio Detergente Lega comercial

MEDIOS DE CULTIVO Medio de cultivo sodio --------Agar Medio lquido -------------------Reactor agitador Medio semislido -------------BiscosoMEDIOS DE INTRODUCCION Auxinas Citocininas GiberelinasMEDIOS DE MICROPROPAGACION A G3MEDIOS DE CONSERVACION Sorbitol ManitolMATERIAL VEGETATIVO El material vegetativo sern esquejes de plantas de papa (Solanum tuberossum),las cuales se encuentran creciendo bajo condiciones de invernadero. Las plantas madre de donde se extraern los esquejes necesariamente debern tener caractersticas vegetativas, es decir, que los tallos no presenten el desarrollo de madurez ligado a la floracin o emisin de brotes florales Los explantes que se utilizaran para realizar la siembra in vitro, sern los meristemos y pices de papa (Solanum tuberossum).METODOS

Actividades de laboratorio Limpieza Medios de cultivo Micro propagacin Conservacin

Preparacin del medio de cultivo para papa 250 ml Pesar 1.1 g. de medio comercial MS (Murashigi Scoog) Pesar 1.75 g. de Agar Pesar 7.5 g. de azcar Alistar 1.5 ml de vitaminas en stock Alistar 0.25 ml de agar en stockEn un vaso de precipitado aadimos 200 ml de H2O destilada agregamos 1.1 gramos de medio MS Y aadimos 0.25 ml de vitaminas en stock, a continuacin agregamos 0.25 ml de cido giberelico en stock .

Luego de agregar esto enrazamos hasta 250 ml con agua destilada mesclamos con una esptula o vageta en medio del cultivo .Ajustamos el pH A 5.6 5.8 con ayuda de hidrxido de sodio para subir el pH acido clorhdrico para bajar el pH.

Una vez ajustado el pH llevamos el medio de cultivo a la cocinilla elctrica Y antes de que empiece a hervir agregamos 1.8 g. de agar 7.5 g. de azcar removiendo constantemente. Diferenciamos 10 ml de medio de cultivo en cada frasco de produccin por ltimo se tapa bien los frascos de produccin para llevarlo al autoclave a 125oc 15 libras de presin para esterilizarlo por 20 min

ETAPA 2A partir de una plntula Ubicacin del pice de la plntula para proceder a cortarla y dejarla como se observa en la figura Una vez cortado el pice se introduce la porcin de plntula (que contenga 1 o 2 nudos) en el medio de cultivoV. RESULTADOS

Estos seran los resultados esperados al finalizar la practica (la obtencin de mini tubrculos) y el desarrollo de la plntula a partir de un esqueje

VI. CONCLUSIONESPara realizar un buen cultivo in vitro se debe tener en cuenta las siguientes consideraciones, la especie a propagar, el problema a eliminar y el tipo mtodo a realizar.El explante del meristemo ms adecuado, que permiti el normal y rpido desarrollo fueron la parte axilar por estar en un gran porcentaje libre de virus. El cultivo de meristemos es el ms comercial gracias a ello se obtienen microplantas y microtuberculos que estn garantizadas ya que estn libres de patgenos.VII. RECOMENDACIONES

1.- En general, a medida que es ms grande el tamao de meristemo, mejor es su supervivencia in vitro

2.-La presencia de primordio foliar tambin parece determinar la habilidad de un meristemo para desarrollarse en una plntula. Por ello, se ha sugerido que los meristemos cortados deban incluir uno o dos primordios foliares.

3.- poner en practica esta tecnologa en toda la regin para incrementar los rendimientos y mejorar los ingresos econmicos en el cultivo de papa. VIII. BIBLIOGRAFAEspinoza, N., Lizrraga, R., Sigeas, C., Buitrn, F.Bryan, J. y Dodds, J.H. 1992. Cultivo de tejidos: Micropropagacin, conservacin y exportacin de germoplasma de papa. Gua de investigacin CIP, Centro Internacional de la Papa. Lima. Peru. 19 pp..

Hartman, H. T. y Kester D. E. 1988. Principios de cultivo de tejidos para micropropagacin, En: Propagacin de plantas: principios y prcticas. Compaa Editorial Continental, S.A de C.V. Mxico, D. F. Pp. 549-590WEBGRAFA

Ministerio de Agricultura: Cadenas Productivas Disponible en www.minag.gob.pe

IX . ANEXOS

Fotos tomadas en el laboratorio de practicas