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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Desenvolvimento de método por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência para diferenciação de

genótipos de Lippia gracilis Schauer

SÃO CRISTÓVÃO - SERGIPE MAIO/ 2009

Desenvolvimento de método por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência para diferenciação de

genótipos de Lippia gracilis Schauer

Silvana Vieira Floresta Gomes

Orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes

São Cristóvão 2009

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Sergipe como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química.

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

G633d

Gomes, Silvana Vieira Floresta Desenvolvimento de método por cromatografia líquida de alta eficiência para diferenciação de genótipos de Lippia gracilis Schauer / Silvana Vieira Floresta Gomes. – São Cristóvão, 2009.

139 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de Sergipe, 2009.

Orientador: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes 1. Lippia gracilis. 2. Genótipos. 3. Fingerprint. 4. Cromatografia -

CLAE. I. Título.

CDU 543.54.5

DDeeddiiccoo eessttee ttrraabbaallhhoo aa DDeeuuss,,

mmeeuu eessppoossoo,, AAnnddeerrssoonn,,

mmeeuuss ppaaiiss,, SSaalloommããoo ee AAuurroorraa,,

mmiinnhhaass iirrmmããss,, FFeerrnnaannddaa ee LLuucciiaannaa..

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Deus, pela vida, fé, força e coragem para realizar este trabalho.

Ao Anderson, meu esposo, pelo amor, compreensão, estímulo, ajuda e paciência.

À minha mãe e pai, Aurora e Salomão, pelas orações, força e pelo amor incondicional em todos os momentos de minha vida.

Às minhas irmãs, Fernanda e Luciana, pelo carinho, orações e por ter torcido por mim. Vocês são demais.

Ao meu amigo, Djalma, pela força e ajuda neste trabalho.

À toda a minha família e amigos, que ficaram felizes por esta vitória. Muito obrigada por tudo.

A minha amiga, Maria da Paz, pelo apoio e incentivo para fazer o mestrado.

AGRADECIMENTOS

À profª Drª Valéria Regina de Souza Moraes, pelo companheirismo, amizade e orientação deste trabalho.

À Universidade Federal de Sergipe pela concessão da bolsa de estudo e ao Departamento de Química pela oportunidade de execução deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira por sua colaboração no desenvolvimento deste trabalho.

À Profª Drª Samísia Maria F. Machado pela ajuda e amizade.

Ao prof. Dr. Sandro Navickiene pela contribuição e por disponibilizar equipamentos e materiais do seu laboratório para o desenvolvimento deste trabalho.

Ao prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank pela identificação da espécie Lippia gracilis Schauer.

À prof. Drª Quézia Bezerra Cass do Departamento de Química da UFSCar, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado e ensinamentos, durante a minha passagem no seu laboratório.

Ao prof. Dr. Edenir Rodrigues Pereira-Filho do Departamento de Química da UFSCar, pelos ensinamentos de quimiometria e pelas análises quimiométricas das minhas amostras.

Ao prof. Dr. Antonio G. Ferreira do Departamento de Química da UFSCar, pela colaboração e aquisição dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear.

À Drª Lúcia Regina Rocha Martins pelos ensinamentos em cromatografia líquida de alta eficiência, análise quimiométrica e ajuda em tudo o que precisei no desenvolvimento deste trabalho.

Ao prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior do Departamento de Fisologia da UFS, pela ajuda e apoio nas análises farmacológicas deste trabalho.

Ao prof. Dr. Carlos Alexandre Borges Garcia por disponibilizar o seu laboratório para as pesagens de todas as minhas amostras.

Ao prof. Dr. Geraldo Humberto Silva pelos ensinamentos e contribuição deste trabalho.

Ao prof. Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcante do Departamento de Fisiologia da UFS, pelo incentivo para fazer o mestrado.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro através do Projeto Casadinho (Processo nº 620212/2006-3) para o desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus amigos do laboratório METABIO, Alan, Daniele, Pablo, Sandra, Wesley e Gilmara, por toda a amizade, apoio em todos os momentos que precisei e ajuda no desenvolvimento deste trabalho.

As minhas amigas do laboratório LAPEC, Adriana Gibara e Mônica, pelo apoio e ajuda no desenvolvimento deste trabalho.

A todos os amigos e funcionários do Departamento de Química – UFS, que, direta ou indiretamente, contribuíram e compartilharam a realização deste trabalho.

CURRICULUM VITAE

1. DADOS PESSOAIS

Nome: Silvana Vieira Floresta Gomes

Nome em citações bibliográficas: Gomes, S. V. F. ou Floresta, S. V.

Naturalidade: Salvador – BA

Data de Nascimento: 13/10/1980

2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO

Mestrado em Química

Universidade Federal de Sergipe, UFS. Ano de conclusão: 2009. Orientadora: Profª Drª Valéria Regina de S. Moraes.

Nível Superior

Farmácia Habilitação Clínica Industrial, Universidade Federal de Sergipe, UFS. Ano de conclusão: 2006

3. ÁREA DE ATUAÇÃO

Química Orgânica, Química de Produtos Naturais

Farmácia, Farmacologia

4. PRODUÇÃO CIENTÍFICA

3.1 – Trabalhos em eventos

1. Machado, S. M. F.; Guimarães, A. G.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V. R. S.; Nogueira, P. C. L.; Filho, E. R. P.; Viana, M. D.; Blank, A. F. Análise multivariada dos perfis cromatográficos de genótipos de Lippia gracilis, com e sem estresse hídrico. 32º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2009, PN-66, Fortaleza.

2. Gomes, S. V. F.; Martins, L. R. R.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Nogueira, P. C. L.; Machado, S. M. F.; ALVES, P. B.; Pereira-Filho, E. R.; Cass, Q. B.; Blank, A. F.; Moraes, V. R. S. Análise Multivariada dos perfis cromatográficos de amostras vegetais para diferenciação de genótipos de Lippia gracillis. 31º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2008, PN-056-PN-05, Água de Lindóia.

3. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R. S.; Nogueira, P. C. L.; Martins, L. R. R.; Cass, Q. B.; Pereira-Filho, E. R.; Blank, A. F.; ALVES, P. B. Diferenciação de genótipos de Lippia gracillis por análise multivariada de fingerprints obtidos por CLAE-DAD. XX Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil/ X International Congress of Ethnopharmacology, 2008. v. 1. p. 05355-05355, São Paulo.

4. Guimarães, A. G.; Machado, S. M. F.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V. R. S.; Viana, M. D.; Blank, A. F.; Castro, R. D. Influência do estresse hídrico na composição química (perfil químico cromatográfico) dos extratos das folhas de Lippia gracillis. 18º. Encontro de Iniciação Científica/4a. Encontro de Pós-graduação, 2008, Aracaju.

5. Bragança, R. B.; Moraes, V. R. S.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V. F.; Ferreira, A. G.. Busca por metabólitos secundários em Kielmeyera rugosa Choisy (Clusiaceae). 18º Encontro de Iniciação Científica / 4º Encontro de Pós-graduação da UFS, 2008, Aracaju.

6. Santos dos, A. D. C.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V. R. S.; Alves, P. B.; Blank, A. F.; Viana, M. D.; Pereira-Filho, E. R.; Martins, L. R. R.; Cass, Q. B. Determinação do perfil cromatográfico de plantas medicinais do nordeste: Lippia gracillis. 18º Encontro de Iniciação Científica / 4º Encontro de Pós-graduação da UFS, 2008, Aracaju.

7. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R. S.; Nogueira, P. C. L.; Martins, L. R. R.; Cass, Q. B.; Pereira-Filho, E. R.; Blank, A. F.; Alves, Péricles Barreto. Diferenciação de genótipos de Lippia gracillis por análise multivariada de fingerprints obtidos por CLAE-DAD. II Whorkshop Bioprospecção de Plantas Nativas do Semi-árido, 2008, Aracaju.

8. Moreno, M. P. N.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.; Floresta, S. V.; Cavalcanti, S. C. H.; Marçal, R. M.; Fernandes, J. B. Efeito analgésico do extrato acetato de etila da Hyptis Fruticosa. 29º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006, Água de Lindóia.

9. Moreira, Ítalo; Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Antoniolli, A. R.; Santos, M. R. V. Efeito vasorrelaxante da fração diclorometano de Hyptis fruticosa (LAMIACEAE) em artéria mesentérica isolada de rato. XIX Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 2006, Salvador.

10. Marçal, R. M.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.; Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Cardoso, G. C.; Cavalcanti, S. C. H.;

Fernandes, J. B. Antinociceptive profile of ethyl acetate extract of Hyptis fruticosa Salzm ex Benth (Lamiaceae). International Congress and 54th Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research, 2006, Helsink. Planta Medica, 2006. v. 72.

11. Moreno, M. P. N.; Floresta, S. V.; Campos, D. A.; Blank, F.; Kava, C.; Simote, S.; Alves, P. B.; Cavalcanti, S. C. H.; Antoniolli, A. R.; Vieira, P. C.; Rodrigues Filho, E.; Silva, M. F.; Fernandes, J. B. Avaliação Fitoquímica e potencial farmacológico da Hyptis fructicosa L. 28º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas.

12. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Fernandes, J. B.; Cavalcanti, S. C. H. Estudo químico e biológico da Hyptis fruticosa oriunda do Estado de Sergipe. VII Congresso de Iniciação Científica/ XV Encontro de Iniciação Científica, 2005, Aracaju.

13. Doria, G. A. A.; Silva, W. J.; Floresta, S. V.; Alves, P. B.; Marçal, R. M.; Cavalcanti, S. C. H. Teste larvicida de óleos essenciais de plantas contra as larvas do mosquito Aedes aegypti. VII Congresso de Iniciação Científica/ XV Encontro de Iniciação Científica, 2005, Aracaju.

14. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Cavalcanti, S. C. H. Triagem Fitoquímica da Hyptis fruticosa oriunda do estado de Sergipe. VI Congresso de Iniciação Científica, 2004, Aracaju.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .............................................................................. i LISTA DE ESPECTROS ........................................................................ v LISTA DE TABELAS ............................................................................. vi LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................ vii RESUMO ................................................................................................ x ABSTRACT ............................................................................................ xi 1. INTRODUÇÃO ................................................................................... 1.1 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ......................................

1.1.1 – Parâmetros cromatográficos ............................................ 1.1.2 – Otimização da separação ................................................ 1.1.3 – Modos de separação .......................................................

1.2 – Extração em Fase Sólida (SPE – Solid Phase Extraction) ............ 1.2.1 – Etapas de extração ..........................................................

1.3 – Análise Multivariada ...................................................................... 1.3.1 – Análise Exploratória de Dados ......................................... 1.3.2 – Análise dos Componentes Principais ..............................

1.4 – Dor e Nocicepção .......................................................................... 1.4.1 – Nociceptores – os receptores da dor ...............................

1 7 9

11 15 16 17 18 19 21 23 25

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 2.1 – Gênero Lippia ................................................................................ 2.2 – Lippia gracilis Schauer .................................................................. 2.3 – Constituintes químicos do gênero Lippia .......................................

2.3.1 – Óleo essencial ................................................................. 2.3.2 – Fitoconstituintes ............................................................... 2.3.2.1 – Flavonóides ................................................................... 2.3.2.2 – Naftoquinonas ............................................................... 2.3.2.3 – Iridóides ........................................................................

29 30 32 33 34 37 38 42 43

3. OBJETIVOS ....................................................................................... 3.1 – Objetivo Geral ................................................................................ 3.2 – Objetivos Específicos ....................................................................

46 47 47

4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAL ............................................... 4.1 – Equipamentos e materiais ............................................................. 4.2 – Técnicas cromatográficas ..............................................................

4.2.1 – Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência .... 4.3 – Material vegetal ............................................................................. 4.4 – Preparação dos extratos ...............................................................

48 49 50 50 51 53

Páginas

s

4.5 – Preparação das amostras para CLAE analítica ............................ 4.5.1 – Extração em fase sólida ...................................................

4.6 – Condições analíticas dos cromatogramas fingerprint .................... 4.7 – Cromatografia com resina amberlite XAD-2 .................................. 4.8 – Análise em CLAE semipreparativa das folhas .............................. 4.9 – Análises por RMN .......................................................................... 4.10 – Análise quimiométrica ................................................................. 4.11 – Estudo farmacológico do extrato metanólico das folhas de Lippia gracilis ..........................................................................................

4.11.1 – Animais .......................................................................... 4.11.2 – Drogas ........................................................................... 4.11.3 – Avaliação da Atividade antinociceptiva .......................... 4.11.3.1 – Teste de contorção abdominal induzida pelo ácido

acético a 0,85% ...................................................................................... 4.11.3.2 – Formalina ....................................................................

53 53 55 56 57 59 59

59 60 60 60

60 61

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 5.1 – Desenvolvimento dos cromatogramas fingerprint .........................

5.1.1 – Otimização do procedimento de pré-tratamento .............. 5.1.2 – Cromatograma fingerprint das folhas de Lippia gracilis ... 5.1.3 – Cromatograma fingerprint dos caules de Lippia gracilis ..

5.2 – Isolamento dos marcadores químicos ........................................... 5.2.1 – Fracionamento do extrato das folhas do genótipo 107 de

Lippia gracilis com resina amberlite XAD-2 ............................................ 5.2.2 – Fracionamento do extrato dos caules do genótipo 107 de Lippia gracilis com resina amberlite XAD-2 ............................................

5.2.3 – CLAE semipreparativa das frações 50% e 85% MeOH:H2O das folhas de Lippia gracilis ................................................ 5.3 – Identificação estrutural ..................................................................

5.3.1 – Identificação da substância LGRA 12 .............................. 5.4 – Análise quimiométrica ...................................................................

5.4.1 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint das folhas ...............................................................................................

5.4.2 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint dos caules .............................................................................................. 5.5 – Atividade Antinociceptiva ...............................................................

62 63 63 67 79 87

87

90

93 96 96

105

106

112 118

6. CONCLUSÕES .................................................................................. 122 7. REFERÊNCIAS ..................................................................................

125

Gomes, S. V. F. 2009

i

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência ................................................................................................. Figura 2: Triângulo de seletividade para os solventes preferidos em: - fase reversa, --- fase normal ..................................................................

8

13

Figura 3: Nomógrafo no modo reverso ..................................................

14

Figura 4: Esquema do procedimento de SPE; A) Condicionamento do cartucho; B) Aplicação da amostra; C) Lavagem; D) Eluição ................

18

Figura 5: Esquema da seqüência usada na análise multivariada de dados experimentais ..............................................................................

21

Figura 6: Aferências modulares dos nociceptores: corte transversal da

medula espinhal, mostrando sinapses das fibras C e A .......................

25

Figura 7: Lippia gracilis Schauer ...........................................................

33

Figura 8: Mudas da espécie de Lippia gracilis no DEA .........................

52

Figura 9: Esquema com as etapas da extração em fase sólida ............

54

Figura 10: Dispositivo para extração em fase sólida .............................

55

Figura 11: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100%

MeOH após tratamento por extração em fase sólida (Varian ). Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN

(B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, Vinj.= 50µL ...........................

64


MeOH após tratamento por extração em fase sólida (Supelco ). Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN


64


MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker ). Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN


ii


65

Figura 14: Cromatograma das frações reunidas de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% e 60% MeOH:H2O e 100% MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker®) ................................................

66

Figura 15: Cromatograma das frações reunidas 5% MeOH:água e 100% MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker®). Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100%

de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, Vinj.= 50µL .............

67

Figura 16: Cromatograma do extrato metanólico da Lippia gracillis. Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN


69

Figura 17: Cromatogramas para seleção de condições para o método em CLAE. Os números correspondem às condições apresentadas na tabela 3 ...................................................................................................

72

Figura 18: Cromatograma obtido com a condição de eluição gradiente: 15-40% ACN (B):solução de 0,5% HCOOH (A) em 50 min;

40-70% (B) em 20 min, vazão 0,5 ml/min, =280nm, Vinj.= 25µL, coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0x0,46 cm, QC-UFSCar-158) .......

73

Figura 19: Cromatogramas fingerprint das folhas dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis ..................................................

74

Figura 20: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis .........................................

75

Figura 21: Cromatograma da amostra do genótipo 108 das folhas de Lippia gracilis. Numeração referente aos picos identificados no espectro de UV-Vis (CLAE-DAD) ...........................................................

76

Figura 22: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD) correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 20, da amostra do genótipo 108 de Lippia gracilis .................................

77

Figura 23: Cromatogramas dos sete genótipos das folhas de Lippia gracilis em quintuplicata .........................................................................

78

Figura 24: Cromatograma (a) extrato metanólico dos caules do genótipo 108 da Lippia gracilis e (b) extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v)

em 50 min, 40-70% (B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL ........................................................................................................

80

Figura 25: Cromatogramas para seleção de condições


iii

cromatográficos para análise dos extratos dos caules de Lippia gracilis. Os números correspondem às condições apresentadas na tabela 8 ...................................................................................................

82

Figura 26: Cromatogramas fingerprint dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis ...................................................................

83

Figura 27: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra dos caules do genótipo 108 de Lippia gracilis ........................................

83

Figura 28: Cromatograma da amostra do genótipo 108 dos caules de Lippia gracilis. Numeração referente aos picos identificados no espectro de UV-Vis .................................................................................

84 Figura 29: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD) correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 28, da amostra do genótipo 108 de Lippia gracilis .................................

85

Figura 30: Cromatogramas dos sete genótipos dos caules de Lippia gracilis em quintuplicata .........................................................................

86

Figura 31: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5% MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d) 35% MeOH:H2O; e) 50% MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85% MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70%

(B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL .......................

89

Figura 32: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5% MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d) 35% MeOH:H2O; e) 50% MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85% MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70%

(B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL .......................

92

Figura 33: Cromatograma da fração 50% MeOH:H2O para isolamento dos compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 8% a 40% de ACN (B) em 50

min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 100 µL, minj = 10 mg ...............

95

Figura 34: Cromatograma da fração 85% MeOH:H2O para isolamento dos compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 35% a 53% de ACN (B) em 15

min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 200 µL, minj = 10 mg ...............

96

Figura 35: Parte do cromatograma das folhas: a) antes do alinhamento, b) após o alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW) ...................................................................

106


iv

Figura 36: Gráfico de pré-processamento centrado na média ..............

107

Figura 37: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s) ......................................................................................................

108

Figura 38: Gráfico de escores (PC1 versus PC2) .................................

109

Figura 39: Gráfico de loading das folhas de Lippia gracilis ...................

110

Figura 40: Cromatogramas fingerprint sobrepostos das folhas dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracillis .........................

111

Figura 41: Parte do cromatograma dos caules: a) antes do alinhamento, b) após o alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW) ...................................................................

112

Figura 42: Gráfico de pré-processamento centrado na média ..............

113

Figura 43: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s) ......................................................................................................

114

Figura 44: Gráfico de escores (PC1 versus PC3) .................................

115

Figura 45: Gráfico de loading dos caules de Lippia gracilis ..................

116

Figura 46: Cromatogramas fingerprint sobrepostos dos caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis ..........................

117

Figura 47: Efeito do EMLG sobre as contorções abdominais induzidas por ácido acético. Cada valor representa a média ± D.P.M. Os asteriscos denotam a significância estatística, * p < 0,05 e ** p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8 ........................................................

119

Figura 48: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 1ª fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a significância estatística, * p < 0,05 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8 ........................................................

120 Figura 49: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 2ª fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a significância estatística, * p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8 ........................................................

120


v

LISTA DE ESPECTROS

Espectro 1: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz) ....

98

Espectro 2: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da região entre 12,45 ppm e 11,7 ppm ................................

99

Espectro 3: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da região entre 7,60 ppm e 6,37 ppm ..................................

100


101


102

Espectro 6: Espectro de 13C da amostra LGRA 12 (400 MHz) ............

103


vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Flavonóides isolados de espécies do gênero Lippia .............

39

Tabela 2: Dados dos genótipos da espécie Lippia gracilis ....................

51

Tabela 3: Quantidade de material vegetal seco e triturado ...................

52

Tabela 4: Rendimento dos extratos metanólicos das folhas e caules ...

53

Tabela 5: Rendimento das frações obtidas da coluna Amberlite XAD-2

57

Tabela 6: Rendimento das amostras obtidas por CLAE semipreparativa ......................................................................................

58

Tabela 7: Condições cromatográficas avaliadas para separação dos

compostos químicos, com detecção em = 280 nm ..............................

70

Tabela 8: Condições cromatográficas para otimização do gradiente

com detecção em = 280 nm .................................................................

81

Tabela 9: Correlação observadas no espectro de RMN 1H e 13C da substância LGRA 12 e dados da naringenina da literatura ....................

104

Tabela 10: Variância percentual das Componentes Principais calculadas para os dados da matriz original centrados na média .........

108

Tabela 11: Variância percentual das Componentes Principais calculadas para os dados da matriz original centrados na média .........

114


vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACN Acetonitrila

AS Autoescalonamento

BK Bradicinina

CG Cromatografia Gasosa

CG/EM Cromatografia Gasosa acoplado a espectrometria de massas

CM Centrado na média

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado a detector de arranjo de diodos

CLAE-DAD-EM ou HPLC-DAD-MS Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas

CLAE-FR Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa

COBEA Colégio Brasileiro em Experimentação Animal

COW Correlation Optimised Warping

d Dubleto

dd Duplo dubleto

d.i Diâmetro interno

DABC Drug Administration Bureau of China

DEA Departamento de Engenharia Agronômica

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado


viii

D.P.M. Desvio padrão da média

EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products

EMLG Extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis

FDA Food and Drug Administration

HCA Hierarchical Cluster Analysis (Análise de Agrupamentos Hierárquicos)

HCOOH Ácido fórmico

INPI The International Plant Names Index

J Constante de acoplamento em hertz (Hz)

KNN K-nearest neighbor

LC-DAD-ESI/EM ou LC-DAD-ESI/MSD Cromatografia líquida acoplado ao detector de arranjo de diodos e ionização por eletrospray/espectrometria de massas

Lp Comprimento da coluna preparativa ou semipreparativa

La Comprimento da coluna analítica

minj Massa injetada

MeOH Metanol

NO Óxido nítrico

OMS Organização Mundial de Saúde

PAFs Fibras aferentes primárias

PCA Principal Component Analysis (Análise dos Componentes Principais)

PC Principal Component (Componentes Principais)

PGs Prostaglandinas

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio


ix

RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono - 13

Rp diâmetro das coluna preparativa ou semipreparativa

Ra Diâmetro da coluna analítica

s Singleto

S Fator de escalonamento

SIMCA Soft Independent Modeling by Class Analogy

SPE Solid Phase Extraction (Extração em fase sólida)

tg Tempo de gradiente

THF Tetraidrofurano

TMS Tetrametilsilano

UFS Universidade Federal de Sergipe

UFSCar Universidade Federal de São Carlos

v.o. Via oral

Vinj. Volume de injeção

XAD-2 resina de poliestireno-divinil-benzeno

5-HT Serotonina

Deslocamento químico em ppm

%B/min Variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente)

Δ%B Diferença entre a % de B final e inicial


x

RESUMO

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de método por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para diferenciação de sete genótipos (106-110, 201 e 202) de folhas e caules de Lippia gracilis Schauer, o isolamento de marcadores químicos e avaliação da atividade antinociceptiva das folhas. Os extratos metanólicos das folhas e caules dos sete genótipos foram analisados por CLAE-DAD e após etapas de otimizações, foram obtidos os cromatogramas fingerprint. Para uma análise comparativa entre os genótipos, aplicaram-se ferramentas quimiométricas de análise exploratória (PCA), com as quais foi possível discriminar os genótipos, inferindo que o método analítico desenvolvido por CLAE-DAD pode ser utilizado para o controle de qualidade químico desta espécie. Das frações 50% e 85% MeOH:H2O, obtidas da cromatografia em coluna com resina amberlite XAD-2 do extrato metanólico do genótipo 107 das folhas, foram isoladas sete substâncias por CLAE semipreparativa. A substância codificada como LGRA 12 foi identificada através de RMN 1H, 13C e por comparação com dados da literatura como sendo a 5,7,4’-triidroxiflavanona, conhecida como naringenina. O extrato metanólico das folhas do genótipo 108 foi submetido a dois ensaios farmacológicos, o teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético e formalina, o qual resultou em uma atividade antinociceptiva provavelmente mediada pela inibição de fatores pró-inflamatórios (via das ciclooxigenase).

Palavras-chave: Lippia gracilis, genótipos, fingerprint, CLAE-DAD, quimiometria, naringenina, antinociceptivo.


xi

ABSTRACT

This work describes the development of method by High Performance Liquid Chromatograpy (HPLC) for differentiation of seven genotypes (106-110, 201 and 202) of Lippia gracilis Schauer, the isolation of chemical markers and evaluation of antinociceptive activity of leaves. The methanolic extracts of leaves and stems of seven genotypes were analyzed by HPLC-DAD and after stages of optimizations, we obtained the fingerprint chromatograms. For a comparative analysis of the genotypes, were applied chemometric tools for exploratory analysis (PCA), which it was possible to discriminate the genotypes, showing that the analytical method developed by HPLC-DAD can be used for quality control of chemical species. From fractions of 50% and 85% MeOH: H2O obtained in the chromatography column with amberlite resin XAD-2 of the methanol extract of leaves of genotype 107 were isolated seven substances by HPLC semipreparative. The substance named LGRA 12 was identified by 1H and 13C NMR and by comparison with literature data as the 5,7,4 '-trihydroxiflavanone known as naringenin. The methanolic extract of the leaves was submitted two pharmacological tests, the abdominal contortion test induced by acetic acid and formalin, which resulted in an antinociceptive activity probably mediated by inhibition of pro-inflammatory factors (route of cyclooxygenase).

Keywords: Lippia gracilis, genotypes, fingerprint, HPLC-DAD, chemometric, naringenin, antinociceptive.

Capítulo

1


2

1. INTRODUÇÃO

Sabe-se que o poder curativo das plantas é tão antigo quanto o

aparecimento da espécie humana na terra, pois, desde cedo as primeiras

civilizações perceberam, que algumas plantas continham em suas essências

princípios ativos, os quais ao serem experimentados no combate às doenças

revelaram empiricamente seu poder curativo.

Conforme Cunha [1], toda informação acumulada sobre o uso de

plantas medicinais, foi inicialmente transmitida oralmente de geração a

geração para só depois, com o advento da escrita, serem compiladas em

livros.

No início do século XIX, com o desenvolvimento da química

farmacêutica, as plantas passaram a representar a primeira fonte de

substâncias para o desenvolvimento de medicamentos. Atualmente, apesar

do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de novos processos

biotecnológicos, 25% dos medicamentos prescritos nos países

industrializados são originários de plantas, obtidos a partir de 90 espécies

que são utilizadas na terapia moderna [2].

Estima-se que no ano de 2000 os produtos a base de plantas

medicinais movimentaram cerca de 30 bilhões de dólares. Aliado a isso, a

Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 65-80% da população

mundial depende da medicina tradicional para atender às suas necessidades

de cuidados primários de saúde e grande parte desta medicina tradicional

envolve o uso de plantas medicinais, seus extratos vegetais ou seus

princípios ativos [3].


3

Com o progresso das técnicas cromatográficas e espectrométricas,

novas substâncias de origem natural vêm sendo descobertas, não só de

plantas, mas também de animais e microrganismos. No período de 1981 a

2002, foram descobertas 877 novas moléculas com atividades biológicas.

Destas, 33 % são de origem natural ou derivadas por semi-síntese,

destacando-se especialmente nas áreas terapêuticas como anticâncer e

anti-hipertensivos [4]. Dos fármacos produzidos a partir de 1995, 244

substâncias têm sido utilizadas como protótipos sendo que, destas, 83% são

provenientes de fontes naturais (animais, plantas e microrganismos) e 17%

são provenientes de síntese química ou observações das atividades

biológicas de compostos já existentes [5].

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) [6], as

plantas medicinais são todas as plantas que contêm em um ou mais de seus

órgãos substâncias que podem ser utilizadas com propósitos terapêuticos ou

que sejam precursores de semi-síntese químico-farmacêutico. Ainda nesse

sentido, Morgan [7] afirma que as plantas que contém princípios ativos em

sua composição que sejam úteis à saúde dos seres humanos são

consideradas plantas medicinais.

A utilização de plantas medicinais tem recebido incentivos da OMS,

mediante a Resolução WHA 31.33 (1978) e 40.33 (1987), que reafirmam a

importância das plantas medicinais nos cuidados da saúde, recomendando,

entre outros aspectos, a criação de programas globais para a identificação,

validação, preparação, cultivo e conservação das plantas medicinais

utilizadas na medicina tradicional, bem como assegurar o controle de

qualidade delas [8].

De uma maneira geral, as plantas podem possuir centenas de

constituintes, alguns deles presentes em concentrações mínimas. Os

constituintes das plantas variam em função de fatores externos como

temperatura, umidade, luminosidade, método de coleta, secagem e

transporte [9]. Sendo assim, se faz necessário determinar vários

constituintes químicos para assegurar a confiabilidade e reprodutibilidade da


4

pesquisa farmacológica e clínica. Nessa perspectiva, o conceito de

fitoequivalência tem sido utilizado. Ele sugere que um cromatograma

fingerprint ou „‟impressão digital‟‟ seja comparado com padrões que poderá

ajudar na identificação de amostras autênticas e auxiliar na identificação de

possíveis compostos utilizados em uma adulteração [10].

Muitas técnicas analíticas modernas têm sido utilizadas para a

determinação da „‟impressão digital‟‟ ou fingerprint de plantas medicinais. Na

última década, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma das

mais utilizadas devido a sua facilidade de manuseio e por não estar limitada

a volatilidade ou estabilidade dos compostos da amostra. No entanto, a

otimização das condições para uma boa separação não são triviais por

envolver fatores como fase móvel, ajuste de pH, pressão de bombas e

tantos outros [10, 11].

Segundo Gan et al. [12], a cromatografia fingerprint tem sido utilizada

para verificar a autenticidade ou fornecer o controle de qualidade de plantas

medicinais. A cromatografia tem a vantagem de separar um sistema

complexo de fitoquímicos em subsistemas relativamente simples e, em

seguida, apresentar o perfil químico da planta medicinal sob a forma de um

cromatograma.

A técnica de cromatografia fingerprint vem atraindo cada vez mais a

atenção da comunidade científica, especialmente por enfatizar a

característica sistêmica dos componentes da amostra focando na

identificação e estabilidade dos constituintes químicos observados. Esta

análise foi introduzida e aceita pela OMS como estratégia para avaliação de

ervas naturais, exigida pelo Drug Administration Bureau of China (DABC)

para padronização das ervas medicinais chinesas e suas matérias primas, e

ainda é recomendado por outras entidades como Food and Drug

Administration dos Estados Unidos (FDA) e a European Agency for the

Evaluation of Medicinal Products (EMEA) [13].


5

Segundo Xu et al. [14], um fingerprint de uma planta medicinal é um

cromatograma representando todos os componentes químicos presentes ou

detectáveis no extrato. Com a ajuda do fingerprint, a autenticação e

identificação de uma planta podem ser fielmente conduzidas até mesmo se a

qualidade e quantidade dos constituintes químicos são desconhecidos.

Assim, para avaliar a qualidade de uma planta medicinal, podemos

considerar os múltiplos constituintes no extrato da planta, em vez de apenas

um ou dois marcadores químicos.

Jiang et al. [15] utilizaram a cromatografia fingerprint para diferenciar

quatro espécies de Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, C. salsa e C.

sinensis), através da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao

detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas (HPLC-DAD-MS).

Duas espécies, Cistanche deserticola e C. tubulosa, são oficiais e utilizadas

tradicionalmente para problemas renais e infertilidade na China, mas devido

à escassez de recursos, nos últimos anos duas espécies, C. salsa e C.

sinensis, também têm sido utilizadas em algumas regiões da China. Para

investigar a possibilidade de utilizar estas duas espécies não-oficiais como

alternativa para as espécies oficiais foi desenvolvido um método fingerprint

para analisar comparativamente os extratos brutos destas quatro espécies.

Os resultados comparativos demonstraram que o fingerprint de C. tubulosa

C. salsa possuem alta similaridade, enquanto que o da C. sinensis possui

baixa similaridade. Desta forma, a cromatografia fingerprint foi uma poderosa

ferramenta para diferenciação destas espécies podendo ser utilizado para o

controle de qualidade.

Em outro estudo, Jin et al. [16] desenvolveram um método fingerprint

por meio de cromatografia líquida acoplado a detector de arranjo de diodos

(CLAE-DAD) para o controle de qualidade da espécie Rheum tanguticum

Maxim. ex Balf. Nesta pesquisa foram comparados quarenta e duas

amostras de Rheum tanguticum de diferentes regiões. Ao comparar os

cromatogramas de todas as amostras, o resultado revelou que o método


6

fingerprint desenvolvido foi eficiente para identificar e distinguir as matérias-

primas de R. tanguticum.

A técnica de cromatografia líquida para obtenção de cromatogramas

fingerprint de plantas medicinais fornece um grande conjunto de dados. No

entanto, para que estes dados sejam convertidos em informação útil deve-se

usar métodos matemáticos e estatísticos sofisticados [17]. A aplicação de

métodos quimiométricos, nestes casos, aumenta consideravelmente a

qualidade da „‟impressão digital‟‟ ou fingerprint obtido. Comparações

avançadas de dados podem ser feitas utilizando a Análise dos Componentes

Principais (PCA). Hoje em dia a quimiometria não é mais uma opção na

análise de matrizes complexas como o fingerprint de plantas medicinais,

mas sim uma ferramenta essencial [18].

Dentre as diversas plantas utilizadas como medicinais no Brasil,

destacam-se as plantas do gênero Lippia. No Brasil, diversas espécies deste

gênero são utilizadas na medicina popular para doenças respiratórias,

gastrointestinais, antivirais, antimaláricos e antifúngicos [19]. Embora muitas

espécies deste gênero sejam bem estudadas, muitas outras ainda são

pouco conhecidas. Dentre elas tem-se a espécie Lippia gracilis, conhecida

popularmente como “alecrim-da-chapada” ou “alecrim-de-serrote” [20].

A espécie Lippia gracilis Schauer é objeto de estudo de um programa

de melhoramento genético desenvolvido pelo Laboratório de Culturas de

Tecidos Vegetais e Melhoramento genético do Departamento de Engenharia

Agronômica (DEA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os genótipos

encontram-se instalados em um Banco de Germoplasma no Horto de

Plantas Medicinais da Fazenda Experimental “Campus Rural da UFS”.

O interesse pelo estudo desta espécie deve-se ao fato de ser uma

planta medicinal muito utilizada na medicina popular e que apresenta poucos

estudos sobre seus constituintes químicos fixos. Além disso, apresenta um

óleo essencial rico em timol e carvacrol que são substâncias de grande


7

importância econômica e industrial, principalmente na farmacologia,

cosméticos e, recentemente, na agricultura.

Este trabalho visou o conhecimento dos constituintes químicos e a

diferenciação de sete genótipos das folhas e caules de Lippia gracilis através

de CLAE-DAD, para obtenção de cromatogramas fingerprint, e posteriores

análises quimiométricas.

1.1- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)

A exigência cada vez maior na obtenção de produtos de origem

vegetal com qualidade requer o emprego de técnicas seletivas e eficientes,

que possibilitem com segurança a identificação e quantificação de diferentes

classes de compostos, o que pode ser obtido com a utilização da

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) [21].

Esta técnica tem sido usada de maneira rotineira para análise e

isolamento de produtos naturais a partir de matrizes complexas, como

extratos de plantas, obtendo-se cromatogramas que são usados como

„‟impressão digital‟‟ ou fingerprint, fornecendo informações importantes

quanto ao tipo de constituintes presentes.

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma técnica de

separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos

analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões

para esse crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para

determinações quantitativas com boa sensibilidade e a possibilidade de

separar espécies não voláteis e termicamente instáveis [22].

A CLAE é definida como um método físico-químico de separação dos

componentes de uma mistura, realizada através da distribuição entre duas

fases. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se

através dela. Durante o desenvolvimento cromatográfico, os componentes

da mistura são distribuídos entre as duas fases, resultando em migrações

diferenciais destes componentes [23].


8

A representação esquemática de um equipamento de CLAE (Figura

1) é composto por um reservatório de solvente, uma bomba de alta pressão,

injetor da amostra, coluna cromatográfica, detector e registrador de dados,

que são divididos em módulos, que podem ser controlados individualmente

ou por computador [24].

Figura 1: Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência

A bomba de alta pressão empregada em CLAE tem a função de

enviar um fluxo constante e reprodutível de fase móvel para a coluna e

apresenta características totalmente especiais. As principais são: devem

operar a pressões de 0,01 a 35 MPa (0,1 a 350 bar), com a mesma precisão

e exatidão de operações a pressão quase ambiente. Intervalo de vazões

entre 0,01 e 5 mL/min para aplicações analíticas, entre 0,05 e 200 µL/min

para uso com colunas microbore e capilar, e até 100 mL/min para aplicações

preparativas. Repetitividade e constância da vazão de 1%. Elas não devem

ser corroídas pelas fases móveis empregadas. A bomba deve proporcionar

ao sistema uma vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade,

possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado [25, 26].


9

Os detectores mais empregados em CLAE são os espectrofotômetros

no UV/VIS. Eles determinam a diferença de absorvância na região do ultra-

violeta ou no visível, sendo, assim, um detector seletivo para moléculas que

possuem cromóforos. Os detectores por arranjo de fotodiodos fornecem

espectros de varredura do analito no UV-VIS e tem sido utilizado há mais de

uma década para o estudo da química de plantas, o qual vem sendo muito

empregado nos laboratórios de pesquisa [24, 27, 28].

As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável,

com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na

faixa de 2,2cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns

colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas

colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta

resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação

[23].

1.1.1 – Parâmetros Cromatográficos [24, 29]

1.1.1.1 – Fator de Retenção (K)

O fator de retenção, K, é uma medida de retenção de um soluto e ele

é determinado pela razão dos tempos em que as moléculas do soluto ficam

retidas na fase estacionária ou percorrendo a coluna na fase móvel, como

mostra a equação:

onde, tR é o tempo de retenção e t0 o tempo de retenção de um soluto

não retido.

Os valores ideais para K variam de 2,0 a 10,0. Valores menores que

2,0 indicam pouca interação entre o soluto e a fase estacionária, enquanto

valores maiores que 10 indicam interação muito forte com a fase

estacionária, resultando em análises demoradas.


10

1.1.1.2 – Fator de Separação (α)

Mede a seletividade da separação para duas bandas adjacentes. É

calculado pela razão entre os fatores de separação do soluto mais retido (K2)

e do soluto menos retido (K1), como mostra a equação:

Pode ser alterado por variação na fase móvel e/ou estacionária,

temperatura, pH e força iônica.

1.1.1.3 – Número de Pratos (N)

Número de pratos, N, é parâmetro relacionado à eficiência

cromatográfica. Um prato equivale a uma etapa de equilíbrio do soluto entre

a fase estacionária e a fase móvel. Quanto maior o número de pratos, mais

equilíbrios existirão, maior será a eficiência e, portanto, melhor a separação.

Na prática, o número de pratos é uma medida do alargamento do pico que

ocorre quando o analito passa através do sistema e pode ser calculado pela

equação:

onde, Wb é a largura de um pico na linha de base e W0,5 é a largura

do pico na meia altura.

Qualitativamente, a eficiência pode ser avaliada pelo formato do pico

cromatográfico. Quanto mais estreito for o pico, maior a eficiência da coluna

na separação do soluto a que o pico se refere.

1.1.1.4 – Altura Equivalente a um Prato (H)


11

É a correlação entre o número de pratos teóricos e o tamanho da

coluna. É medido pela razão entre o comprimento da coluna (L) e o número

de pratos, que pode ser calculado pela equação:

1.1.1.5 – Resolução (Rs)

É uma medida quantitativa do grau de separação entre dois picos

adjacentes e pode ser calculado de acordo com a equação:

onde,

tR1 e tR2 = tempos de retenção de dois picos adjacentes;

Wb1 e Wb2 = largura dos picos na linha de base;

W0,5 1 e W0,5 2 = largura dos picos a meia-altura.

Valores de Rs acima de 1,5 são considerados ideais, indicando uma

boa separação entre os picos.

1.1.2 – Otimização da separação [24, 27, 29]

A otimização de uma separação é feita alterando-se os parâmetros

cromatográficos K, α e N, de acordo com equação básica da resolução:

O primeiro e mais fácil parâmetro a ser alterado é o fator se retenção

(K), seguido pelo fator de separação (α). Em último caso, torna-se

necessária a alteração no número de pratos teóricos (N).


12

A retenção de um componente é controlada pela força do solvente.

Solventes fortes diminuem a retenção e solventes fracos aumentam a

retenção. A força cromatográfica da fase móvel adequada para uma

separação é selecionada através da análise do fator de retenção, K. Um

valor de K baixo significa pouca interação dos solutos com a fase

estacionária. Por outro lado, um valor de K elevado implica forte interação

entre o soluto e a fase estacionária. Nenhum extremo é recomendado, seja

por fornecerem separações pouco eficientes seja por implicarem tempos de

análises longos, com alargamento dos picos. O intervalo ideal de fator de

retenção é 1≤ K ≤ 10; entretanto, para análises de múltiplos componentes,

também se aceita 0,5≤ K ≤ 20.

É importante ressaltar que, em separações de misturas complexas

pelo modo isocrático, raramente serão obtidos valores ideais de K para

todos os componentes da amostra, sendo recomendável o uso da eluição

gradiente.

O fator de retenção no modo reverso pode ser aumentado pelo

aumento do percentual de água e, conseqüentemente, diminuído pelo

acréscimo do percentual do modificador orgânico. A troca de uma fase C18

por uma C8 também pode ser feita para alterar o fator de retenção.

No modo normal de eluição, o aumento do fator de retenção é

conseguido pelo aumento do percentual do solvente de maior polaridade.

Fases estacionárias de diferentes polaridades também podem ser usadas

para conseguir a desejada retenção.

Após o ajuste do fator de retenção, a seletividade da separação deve

ajustada e para isso deve-se manter o K conseguido. Alteração em α são

feitas levando-se em consideração as interações do soluto com o solvente,

resultando de suas características, tanto no modo reverso quanto no modo

normal.


13

Para determinar a melhor seletividade da fase móvel, pode ser

empregado o método empírico do modelo dos quatro solventes. Apesar de

haver inúmeros solventes passíveis de utilização como fase móvel, verificou-

se que um número reduzido era escolhido, surgindo então o modelo dos

quatro solventes, esquematizado na figura 2. Esse procedimento está

baseado no triângulo de seletividade. A seletividade em cromatografia no

modo reverso pode ser alcançada variando-se três solventes de

seletividades diferentes – metanol (MeOH), tetraidrofurano (THF) e

acetonitrila (ACN) – e utilizando-se água para ajustar a força cromatográfica

da mistura. Para separações por cromatografia no modo normal, utilizam-se

éter metil terc-butílico (MTBE), clorofórmio (CHCl3), ou cloreto de metileno

(CH2Cl2) com hexano para ajuste da força cromatográfica.

Figura 2: Triângulo de seletividade para os solventes preferidos em: - fase reversa,

---- fase normal.

Para manter a polaridade da mistura praticamente constante, na troca

de solventes de diferentes seletividades, usa-se o nomógrafo mostrado na

figura 3.


14

Figura 3: Nomógrafo no modo reverso

A acetonitrila (ACN) é a primeira alternativa para início dos testes de

escolha da fase móvel. A mistura ACN/H20 pode ser usada na detecção no

UV, pois absorve a baixos comprimentos de onda (185-210 nm). A mistura

possui também baixa viscosidade, resultando em maior número de pratos

teóricos e em pressões mais baixas na coluna. O próximo melhor solvente

orgânico a ser escolhido é o metanol (MeOH), seguido do tetraidrofurano

(THF). O THF possui algumas desvantagens, tais como absorção em maior

comprimento de onda no UV, forma peróxido na presença de oxigênio e gera

um lento desequilíbrio da coluna quando a fase móvel é modificada,

dificultando seu uso em eluição gradiente.

A seletividade pode ainda ser alterada por troca da fase estacionária,

levando-se em consideração as interações específicas, resultantes de cada

tipo de fase: C18, sílica, aminopropilsílica, ciano, fenil, diol etc. e/ou por

interações com grupos silanóis residuais nas fases quimicamente derivadas.

A otimização do número de pratos teóricos é feita considerando a

equação:

Na equação o número de pratos teóricos (N) é diretamente

proporcional ao tamanho da coluna (L) e inversamente proporcional à altura

dos pratos teóricos (H). Conseqüentemente, mantendo-se os outros

parâmetros constantes, um aumento de L resulta em um aumento de N, e

quanto menor for H, maior será o valor de N. Os fatores que favorecem a


15

obtenção de baixos valores de H são: utilização de colunas de partículas

pequenas, fluxos de fase móvel baixos, fases móveis pouco viscosas, altas

temperaturas de separação e separação de pequenas concentrações de

amostra.

1.1.3- Modos de Separação

A classificação da cromatografia líquida de acordo com as

modificações químicas realizadas na fase estacionária (sílica gel) levou a

uma grande variedade de tipos. A separação em cromatografia líquida pode

ser encontrada explorando a variedade de processos existentes, dos quais

os mais importantes são: cromatografia no modo normal, no modo reverso,

de compostos iônicos, de troca iônica, cromatografia de exclusão e

cromatografia quiral. Neste trabalho foi utilizada a Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência no modo reverso.

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência no modo reverso constitui

a modalidade cromatográfica na qual a fase móvel é mais polar do que a

fase estacionária. Salienta-se ainda que tal processo é o mais utilizado nos

laboratórios de pesquisas industriais e acadêmicas, além do seu amplo

emprego em análises de rotina [30]. A grande utilização desta modalidade

cromatográfica dá-se à existência de uma grande variedade de fases

estacionárias disponíveis comercialmente, que permitem ao usuário alcançar

a seletividade desejada [31]. Ressalta-se ainda que a fase móvel é em

grande parte composta por água, um solvente não tóxico e barato.

O princípio da retenção no modo reverso é a hidrofobia. A separação

no modo reverso se deve principalmente a interações entre a parte não-polar

do soluto e a fase estacionária, isto é, à repulsão desta parte do soluto pela

fase móvel aquosa [24].

Dentro da CLAE no modo reverso, a maioria das fases utilizadas

atualmente são baseados em silanos C8 ou C18 quimicamente ligados à

superfície de sílica. Como fase móvel são utilizados solventes com caráter


16

polar, geralmente uma mistura de água e solventes orgânicos miscíveis com

a água [32].

A força da fase móvel na cromatografia no modo reverso depende do

tipo de solvente orgânico escolhido (solvente B) e sua porcentagem em água

(solvente A). Os solventes orgânicos comumente usados são: acetonitrila

(ACN), metanol (MeOH) e tetraidrofurano (THF) [33].

1.2- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE – Solid Phase Extraction)

A extração em fase sólida é uma técnica de extração que tem se

popularizado devido ao fato de ser rápida, consumir menores volumes de

solvente e de amostra e ser de fácil mecanização [34].

Atualmente é muito empregada, sendo utilizada, principalmente, no

pré-tratamento de amostras para análise por CLAE e Cromatografia a Gás

(CG) [35].

A extração em fase sólida emprega sorventes empacotados em

cartuchos, nas formas de barril ou seringa, e os mecanismos de retenção

são idênticos àqueles envolvidos em cromatografia líquida em coluna. Um

cartucho típico é formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de 50

a 500 mg de sorvente, com 40-60 µm de tamanho de partícula, retidos no

tubo através de dois filtros [36].

Os materiais de recheio são muito semelhantes às fases estacionárias

das colunas utilizadas na CLAE, porém com tamanho de partícula maior.

Esses materiais são, na sua maioria, à base de sílica modificada com grupos

octadecil (C18), octil (C8), amino (NH2), ciano (CN) ou à base de resinas

poliméricas, carbono grafitizado e alumina [31].

As características de fase sólida podem diferenciar, dependendo do

fabricante, do suporte, do tamanho de partículas, do tamanho de poros e

área superficial levando a uma imensa variedade de materiais disponíveis

comercialmente [36].


17

Beltrame et al. [37] utilizaram a extração em fase sólida para obter um

composto puro do extrato hidroalcoólico da Catuaba. Nesta pesquisa, a

cinchonaína Ib foi isolada pela passagem do extrato em um cartucho C18,

sendo em seguida usado como padrão externo para o desenvolvimento e

validação de um método por CLAE-DAD para quantificação deste composto

em amostras de Catuaba vendidas em todo o Brasil.

Em outro estudo, Genovese et al. [38] relataram a utilização da

extração em fase sólida para a obtenção das isoflavonas, daidzeína e

genisteína, em derivados protéicos de soja e alimentos industrializados.

No nosso trabalho, a extração em fase sólida foi muito útil para o pré-

tratamento dos extratos metanólicos das folhas e caules dos genótipos de

Lippia gracilis para, em seguida, serem analisados por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência.

1.2.1- Etapas da Extração

Existem quatro etapas básicas que devem ser seguidas em um

procedimento de SPE, as quais são descritas abaixo (Figura 4) [34, 39, 40].

1- Condicionamento: esta etapa tem o objetivo de preparar o leito do

sorvente, previamente à extração, para permitir um contato efetivo da

solução líquida da amostra, geralmente polar, com a superfície do sorvente,

geralmente apolar. Esta etapa envolve a passagem de um solvente orgânico

(metanol ou acetonitrila) através do sorvente e depois a remoção do solvente

por um líquido de composição similar a amostra (água);

2- Aplicação da amostra: nesta etapa a amostra é passada através

do sorvente, que é responsável pela extração, com a ajuda de vácuo, no

caso de seringas, cartuchos ou discos. A amostra pode, dependendo de sua

interação com o sorvente, ser constituído de quatro tipos diferentes de

substâncias: o primeiro tipo não tem nenhuma afinidade pelo sorvente e não

interage com este; o segundo tem fraca interação com o sorvente e é

arrastado na etapa de lavagem; o terceiro apresenta uma interação


18

adequada com o sorvente e é eluído na etapa de eluição, o quarto apresenta

uma afinidade muito grande pelo sorvente e permanece retido neste mesmo

após a etapa de eluição;

3- Lavagem: o propósito da lavagem é permitir que algumas

impurezas fracamente retidas sejam eliminadas pela passagem de um

solvente fraco (água);

4- Eluição: na etapa de eluição as espécies de interesse são

removidas do sorvente e retornam para a fase líquida. Normalmente

emprega-se metanol ou acetonitrila.

Figura 4: Esquema do procedimento de SPE; A) Condicionamento do cartucho; B)

Aplicação da amostra; C) Lavagem; D) Eluição.

1.3- ANÁLISE MULTIVARIADA

Os métodos de análise de dados multivariados foram desenvolvidos

por pesquisadores da área de psicometria. A gênese desse método remete

ao século XIX, porém a sua crescente popularidade só se tornou possível

com o advento do computador [41].

Somente a partir dos anos sessenta do século XX é que os métodos

de análise de dados multivariados foram paulatinamente ganhando espaço

nos diferentes campos de pesquisa que tradicionalmente não os usava, em

uma razão que crescia em ritmo semelhante ao do desenvolvimento de

máquinas de processamento de dados cada vez mais potentes [41].


19

Nesse panorama surgiu a quimiometria, que é considerada uma área

da química destinada à análise de dados de natureza multivariada [35,36].

Embora a quimiometria seja uma área relativamente nova, ela já produz um

impacto de tal modo que existem diversos softwares comerciais disponíveis

para o processamento dos mais diversos métodos quimiométricos [42, 43].

O termo só apareceu na década de 1970, na química analítica, como

decorrência dos progressos na instrumentação (que produz dados) e nos

microcomputadores (que permitem processar esses dados) [44].

A quimiometria pode ser definida como uma área da química que usa

métodos matemáticos, estatísticos e de lógica formal para planejar ou

selecionar procedimentos ótimos de medidas e experimentos e extrair o

máximo da informação química relevante, com a análise de dados [45].

Hoje em dia, muitos químicos passaram a ter como objetivo de estudo

e pesquisa, o desenvolvimento e utilização de ferramentas matemáticas e

estatísticas para extrair maior informação dos dados. Isso acabou por gerar

procedimentos e domínios de informações que não seriam possíveis, ou não

teriam sentido sem o conhecimento dessas ferramentas matemáticas para a

análise de dados [46].

Chen et al. [47] demonstraram as vantagens de se utilizar a

cromatografia fingerprint aliado a métodos quimiométricos para controle de

qualidade de plantas medicinais. Nesta pesquisa, amostras de diferentes

regiões na China de Ganoderma lucidum foram analisadas por CLAE e, em

seguida, submetidas à análise quimiométrica. No estudo foi possível

demonstrar as semelhanças e diferenças das espécies, quantificar os

principais marcadores químicos que influenciam nessa diferenciação e

utilizar o método para o controle de qualidade desta espécie.

1.3.1- Análise Exploratória dos Dados

O principal objetivo de uma análise exploratória é extrair o máximo de

informações dos dados experimentais, estabelecendo relações entre objetos


20

e variáveis. Os objetos químicos típicos são as amostras analíticas ou

compostos químicos. As variáveis são, muitas vezes, derivadas das

quantidades de constituintes químicos nos objetos, tais como a

concentração, a intensidade das bandas em perfis cromatográficos,

comprimento de onda em perfis espectroscópicos, etc [46, 48].

A análise exploratória dos dados é usada para determinar algumas

relações gerais entre os dados, agrupando as amostras com características

semelhantes. Esta técnica também auxilia na identificação de amostras que

não seguem o padrão da maioria [49].

Os métodos multivariados de análise de dados podem ser divididos

em dois grupos; a aprendizagem não supervisionada e a aprendizagem

supervisionada.

Na aprendizagem não supervisionada o objetivo é encontrar

agrupamentos naturais das amostras num espaço bidimensional. Os

métodos mais utilizados são a análise de agrupamentos hierárquicos (HCA)

e análise de componentes principais (PCA). Já na aprendizagem

supervisionada o objetivo é desenvolver modelos baseados nas informações

da origem das amostras, para que estas sejam classificadas corretamente e

então aplicar esta regra para amostras de origem desconhecidas visando

sua classificação. Um método muito utilizado para modelagem é o modelo

independente de similaridade utilizando componentes principais (SIMCA)

[41, 50-52].

A seqüência básica da análise de dados multivariados por métodos

quimiométricos está ilustrada na figura 5.


21

Figura 5: Esquema da seqüência usada na análise multivariada de dados

experimentais.

Neste capítulo trataremos somente da PCA, que foi utilizada no

tratamento dos dados a serem apresentados neste trabalho.

1.3.2- Análise dos Componentes Principais (PCA)

A PCA é a base principal de diversos métodos de análise multivariada

e seu grande objetivo é reduzir a dimensão dos dados originais, permitindo a

fácil visualização das informações mais importantes em um número menor

de fatores, ou componentes principais (PC). Desta forma, as principais

vantagens da PCA estão na simplificação, modelamento, detecção de

amostras anômalas, classificação e previsão [53].


22

Um procedimento básico para melhorar a análise de modo a reduzir a

dimensão dos dados é a escolha do número de componentes principais a

serem utilizadas na descrição do sistema. A escolha do número de

componentes principais permite descrever até mais de 90% da variância dos

dados com um número muito menor de fatores do que das variáveis

originais. A escolha das componentes principais a serem utilizadas na

descrição dos dados é feita levando-se em conta a porcentagem de

variância descrita pelas PC‟s e a variância residual [54, 55].

A primeira componente principal, PC1, é a combinação linear de

máxima variância das variáveis originais, ou seja, os auto vetores, num

determinado eixo. A segunda componente, PC2, de segunda maior

variância, é ortogonal a PC1, isto é, não correlacionada a ela. A terceira

apresenta maior variância e é ortogonal às duas primeiras PC, portanto

também não correlacionadas. Como esses eixos são calculados em ordem

decrescente de importância, a informação relevante fica concentrada nas

duas ou três primeiras PC, que podem ser então confrontadas com padrões

de características conhecidas [46, 56].

A partir dos PC‟s são gerados dois novos conjuntos de dados

chamados de scores e loadings. Os scores fornecem a composição das

PC‟s em relação aos objetos (amostras) enquanto os loadings fornecem

essa mesma composição em relação às variáveis. Como as PC‟s são

ortogonais, é possível examinar as relações entre os objetos através dos

gráficos de scores projetados nas primeiras PC‟s, e entre as variáveis

através dos gráficos de loadings [57].

Utilizando a notação matricial, as componentes principais são obtidas

por meio de transformações lineares conforme a equação:

XP = T

em que X é a matriz original do dados, T é a matriz de escores que

contêm as coordenadas das amostras no novo sistema de eixos e P é a


23

matriz dos pesos (loadings) onde os elementos de cada coluna

correspondem aos coeficientes das combinações lineares das variáveis

originais [53].

Os dados originais podem não ter uma distribuição adequada para a

análise, dificultando a extração de informações úteis e interpretação dos

mesmos. Nestes casos, antes de se aplicar a PCA a dados numéricos, é

necessário efetuar um pré-processamento nos dados originais. Os principais

tipos de pré-processamento são o Centrado na média – CM e o

Autoescalonamento – AS [58].

No CM calcula-se a média dos valores experimentais para cada

variável e subtrai-se cada valor experimental do respectivo valor médio.

Autoescalar significa centrar os dados na média e dividi-los pelo respectivo

desvio-padrão, sendo um para cada variável [48].

Gan et al. [12] relataram com êxito a utilização da PCA para avaliar a

similaridade dos cromatogramas fingerprint de Chuanxiong obtidas de três

regiões diferentes da China. Neste estudo foi possível diferenciar as

amostras pelo gráficos de escores (PC1 versus PC2) de Chuanxiong e o

método desenvolvido será útil para o controle de qualidade destas espécies.

1.4 – DOR E NOCICEPÇÃO

A dor é definida pela Associação Internacional para Estudo da Dor

como uma experiência sensorial e emocional desagradável associada com o

dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de lesão [58]. É

importante salientar que sempre que qualquer tecido estiver lesado, o

organismo reage para desencadear o estímulo doloroso como um

mecanismo de proteção [60, 61].

Entretanto, a dor é uma experiência complexa que não envolve

apenas a transdução do estímulo nociceptivo ambiental, mas também

cognitivo e emocional processado pelo cérebro [62].


24

Em termos de duração, uma sensação dolorosa pode ser transitória,

aguda ou crônica. No tipo transitória, a ativação dos nociceptores é feita na

ausência de qualquer dano tecidual. Na dor aguda, ocorre geralmente lesão

e ativação dos nociceptores no sítio lesado. Já a dor crônica é causada

geralmente por uma lesão ou patologia, sendo que com o passar do tempo,

pode ser perpetuada por fatores que não os causadores iniciais da dor [63-

66].

O componente sensorial da dor denomina-se nocicepção [65]. Assim,

enquanto a dor envolve a percepção de um estímulo aversivo, a nocicepção

refere-se às manifestações neurofisiológicas geradas pelo estímulo nocivo

[65, 66]. A função de alerta da dor reflete a ativação fásica de receptores

denominados nociceptores, os quais são sensibilizados quando o estimulo é

potencialmente perigosos, ou seja, excedem uma determinada faixa

considerada fisiológica [61, 69].

Uma vez que os animais não são capazes de verbalizar os

componentes subjetivos da dor, neles não se avalia dor, mas nocicepção.

Sendo assim, tem sido proposto que os termos dor e analgesia são mais

apropriadamente utilizados para o ser humano, enquanto nocicepção e

antinocicepção são mais adequados para animais [70].

A nocicepção desencadeia no animal comportamentos típicos, como

lamber ou massagear a área lesada, vocalização, ou reflexo de retirar a

parte do corpo agredida do contato com o estímulo nocivo. Tais

comportamentos evidenciam ao experimentar a nocicepção, e são

denominados comportamentos nociceptivos. Portanto, as drogas que

suprimem os comportamentos nociceptivos são denominados

antinociceptivas, e aquelas que induzem o comportamento nociceptivo são

chamada de pró-nociceptivas, ou algogênicas. É importante esclarecer,

contudo, que as drogas antinociceptivas não são, obrigatoriamente,

analgésicas, visto que a supressão do comportamento nociceptivo pode ser

desencadeado por outros fatores, como prejuízo motor e sedação, que

diferem de analgesia [71].


25

1.4.1 – Nociceptores – os receptores da dor

O termo nociceptor é uma abreviatura de „‟nocirreptor‟‟, e denota um

receptor para o estímulo nociceptivo [72]. Os nociceptores estão localizados

na porção distal dos neurônios aferentes sensoriais que estão amplamente

distribuídos na pele, vasos, músculos, articulações e vísceras e são

sensíveis a estímulos térmicos, mecânicos ou químicos [61].

A percepção da dor se inicia na periferia pela estimulação dos

nociceptores, cujos corpos celulares encontram-se nos gânglios das raízes

dorsais e projetam seus axônios até o corno dorsal da medula (Figura 6). Os

nociceptores são inervados pelas fibras aferentes primárias C ou fibras A .

As fibras A são fibras mielinizadas, de condução rápida (2,5 a 36 m/s) e as

fibras C não são mielinizadas e transmitem o estímulo de forma mais lenta

(0,7 a 1,5 m/s) [56, 68-70]. É importante ressaltar que o estímulo, seja ele

térmico, químico ou mecânico, deve exercer um certo limiar para que seja

interpretado pelo sistema sensorial como nociceptivo [76].

Figura 6: Aferências modulares dos nociceptores: corte transversal da medula

espinhal, mostrando sinapses das fibras C e A .


26

As fibras C e A transferem a informação nociceptiva para a lâmina

superficial (lâmina I e II) e para a lâmina profunda (lâmina V e VI) no corno

dorsal, como também para a lâmina circumcanular (lâmina X). Por outro

lado, as fibras A são fibras de maior calibre, mielinizadas e de rápida

conduntância e transmitem a informação de estímulos mecânicos inócuos

para lâmina profunda (III-IV) [77].

As fibras aferentes primárias (PAFs) podem estimular diretamente

neurônios de projeção, os quais retransmitem a mensagem para o cérebro,

ou indiretamente enviam a mensagem para outros neurônios de projeção via

interneurônios excitatórios. Além disso, as PAFs também podem estimular

interneurônios inibitórios os quais interagem com os neurônios de projeção

[77].

Pode-se afirmar que a dor não é uma sensação uniforme, pois o início

das respostas de projeção é determinado por muitos fatores dentro da

medula espinhal e estrutura do cérebro envolvidas na integração e

modificação da sinalização nociceptiva [59].

Neste sentido, existem várias fontes importantes onde os mediadores

que participam da resposta nociceptiva são gerados como: tecido lesado,

sistema vascular, células imunes, tecidos adjacentes, nervos sensoriais e

simpáticos. Esses mediadores atuam em receptores amplamente

distribuídos no organismo. Alguns desses receptores são acoplados a

proteína G e induzem a informação de segundos mensageiros. Outros

receptores são acoplados a canais iônicos que regulam a permeabilidade e

a concentração celular de íons [59].

Alguns desses mediadores que estimulam o tipo químico de dor

incluem: os metabólitos derivados do ácido araquidônico (prostaglandinas -

PGs e leucotrienos), bradicinina (BK), serotonina (5-HT), histamina,

citocinas, íons potássio, óxido nítrico (NO) e enzimas proteolíticas. Além

desses, outros mediadores, tais como os aminoácidos excitatórios

(glutamato, aspartato), acetilcolina e outros que podem ser liberados após a


27

lesão tecidual ou ainda irritantes exógenos (formalina, capsaicina, ácido

acético), são também responsáveis pela multiplicidade de eventos que

ocorrem durante a transmissão da dor, tanto no sistema periférico quanto

central [59, 77].

O modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em

camundongos é descrito como um modelo típico de nocicepção inflamatória

visceral, sendo amplamente utilizado como ferramenta para detecção e

avaliação de novos agentes com propriedades analgésicas e

antiinflamatórias [85]. Os prótons oriundos da dissociação do ácido acético

podem ativar diretamente canais de cátions não seletivos localizados nas

fibras aferentes primárias [61]. Além disso, a injeção de ácido acético na

cavidade peritoneal de camundongos promove a liberação de diversos

mediadores inflamatórios como, por exemplo, PG, BK, os quais estimulam

neurônios aferentes primários, aumentando a liberação de aspartato e

glutamato no fluido cerebroespinhal. Em função disso, este modelo

apresenta uma boa sensibilidade, embora pouca especificidade. Neste

contexto, a nocicepção induzida por ácido acético pode ser prevenida por

agentes antiinflamatórios, analgésicos, relaxantes musculares e sedativos

[85-89].

O teste de formalina é o modelo de dor mais utilizado e é dividido em

duas fases de sensibilidade dolorosa [66, 78]. A primeira fase ocorre durante

os primeiros cinco minutos após a injeção da formalina, na qual resulta de

estímulo químico direto das fibras aferentes nociceptivas mielinizadas e não

mielinizadas, principalmente a fibra C, a qual pode ser suprimido por drogas

analgésicas opióides como a morfina [79-81]. Estudos demonstram que a

substância P e a bradicinina participam da primeira fase [80].

A segunda fase ocorre entre quinze a trinta minutos após a formalina,

na qual os mediadores formados nos tecidos periféricos, como as

prostaglandinas, serotonina, histamina e bradicinina, induzem mudanças

funcionais nos neurônios, do corno dorsal que, ao longo do tempo promove

a facilitação da transmissão em nível espinhal. Esta evidência sugere que o


28

processo de inflamação periférica está envolvido na segunda fase [78, 83,

84].

O gênero Lippia apresenta um grande número de espécies com

atividades farmacológicas comprovadas. Dentre as espécies, a Lippia alba,

L. geminata, L. citriodora, L. dulcis, L. graveolens, L. javanica e L. nodiflora

apresentaram atividade analgésica, antiinflamatória e antipirética [19].

Um estudo realizado por Soares [90] avaliou as atividades

antinociceptivas das soluções extrativas hidroalcoólicas de L. alba a 40% e a

80% obtidas por maceração, sendo que a solução extrativa a 40%

apresentou melhor ação antinociceptiva.

No nosso trabalho, o extrato metanólico das folhas de Lippia gracilis

Schauer foi analisado quanto ao seu efeito antinociceptivo através dos testes

de contorções abdominais induzidas por ácido acético e formalina.

Capítulo

29


30

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1- GÊNERO LIPPIA

O uso de plantas com fins terapêuticos é uma tradição milenar

presente nas culturas de várias nações constituindo, ainda hoje, um recurso

alternativo de grande aceitação [92].

Entre as plantas utilizadas como medicinais, destacam-se as espécies

da Família Verbenaceae pertencente à ordem Lamiales. Esta Família

compreende 35 gêneros e 1.035 espécies, muitos exclusivamente

brasileiros, com distribuição tropical e subtropical. Os gêneros mais

representativos em número de espécies são: Verbena, Lippia, Citharexylum,

Stachytarpheta, Glandularia e Duranta [93].

O gênero Lippia, o segundo maior da família Verbenaceae, possui

aproximadamente 200 espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores,

cujos maiores centros de dispersão se encontram em países das Américas

do Sul e Central, como também em territórios da África tropical [19, 94].

Os principais centros de diversidade específica do gênero Lippia

estão localizados no Brasil e México. No Brasil, o maior número de espécies

se encontra na Cadeia do Espinhaço, localizada nos estados de Minas

Gerais, Bahia e Goiás [95].

No Brasil encontram-se aproximadamente 120 espécies de Lippia

distribuídas no cerrado e caatinga, onde se destacam por seu aspecto

chamativo no período da floração e por seu aroma forte e geralmente


31

agradável. Destas espécies, a L. alba (Mill.) N. E. Brown (erva cidreira) é a

mais conhecida e utilizada devido as suas propriedades medicinais [96].

No nordeste do país as espécies de Lippia são usadas na medicina

popular para o tratamento de resfriados, gripes, bronquites e tosse. Em

muitos casos, as partes usadas são as folhas e flores na forma de infusão ou

decocto administradas oralmente ou através de emplastos [19, 96].

Inúmeras espécies de Lippia são empregadas na medicina tradicional

no tratamento de patologias diversas e como resultado muitas têm sido

investigadas do ponto de vista farmacológico, revelando importantes

propriedades como ação sedativa, antiespamódica, estomáquica,

antiinflamatória e antipirética da L. alba (Mill.) N. E. Brown [97]; efeito

antisséptico, antiinflamatório e cicatrizante do extrato aquoso de L. sidoides

Cham [96]; ação contra a malária, no tratamento de hipertensão e combate à

sarna da L. multiflora Moldenke [99, 100]; tratamento da tosse e bronquite da

L. dulcis Trevir [101].

Além de suas propriedades medicinais, as folhas da maioria das

espécies são utilizadas na preparação de alimentos [102]. Neste aspecto é

interessante ressaltar a importância da L. dulcis Trevir., cujo principal

componente é a hernandulcina (1), uma molécula 1.000 vezes mais doce

que a sacarose [19, 101, 103].

O

H

OH

1

Algumas espécies de Lippia têm sido utilizadas também no

reflorestamento de áreas mineradas. L. origanoides H.B.K., por exemplo,

tem sido usada como espécie pioneira em regiões de minério de ferro que

foram desativadas ou abandonadas na Venezuela [148].


32

Segundo Pascual et al. [19], algumas espécies de Lippia, ao longo

dos anos, tem apresentado problemas de nomenclatura botânica devido à

dificuldade em torno da correta identificação de certas espécies causando a

utilização de diversas sinonímias para uma mesma espécie em artigos

científicos. L. alba (Mill.) N. E. Br., por exemplo, apresenta várias sinonímias

e pode receber o nome de L. geminata, L. microphylla Griseb, L. germinata

H.B.K, L. globiflora Kuntze, L. lantanoides Coult, Lantana alba Mill e Phyla

germinata H.B.K..

Com o propósito de contribuir para uma solução, a sistematização das

informações referentes à denominação botânica de espécies do gênero

Lippia foi realizada pela revisão do registro dessas espécies no INPI (The

International Plant Names Index). Nesta revisão algumas espécies vêm

classificadas, ora como binômio válido, ora como sinonímias. Dentre estas

espécies, a L. gracilis apresentou dois binômios válidos, sendo eles: L.

gracilis Schauer e L. gracilis Phil.

2.2- LIPPIA GRACILIS SCHAUER

Lippia gracilis Schauer é uma planta aromática endêmica do nordeste

brasileiro, próprio da vegetação semi-árido, conhecida popularmente como

‘’alecrim-da-chapada’’ ou ‘’alecrim-de-serrote’’. É encontrada

predominantemente nos estados da Bahia, Sergipe e Piauí [105]. Apresenta-

se como um arbusto de aproximadamente 2,5 cm de altura, bem ramificada,

de folhas pequenas e flores brancas, ambas bastante odoríferas (Figura 7).


33

Figura 7: Lippia gracilis Schauer

As folhas de L. gracilis são ricas em óleo essencial que apresenta

forte atividade antimicrobiana contra fungos e bactérias [106]. Além disso,

elas são bastante usadas nas infecções da garganta e boca, problemas

vaginais, tratamento da acne, panos brancos, impigens, caspa, queimaduras

e feridas [107].

2.3 - CONSTITUINTES QUÍMICOS DO GÊNERO LIPPIA

Os estudos referentes à composição química das espécies de Lippia

evidenciam, principalmente, os constituintes voláteis. Entretanto, outras

substâncias como flavonóides, iridóides e naftoquinonas também são citados

com freqüência [108-111, 112-114].

Alguns alcalóides foram identificados na L. dulcis Trevir, L. geminata

H.B.K., L. nodiflora (L.) Michx e L. turbinata Griseb [115-117] enquanto que

taninos são encontrados na L. alba (Mill.) N.E. Brown [117, 118].


34

Triterpenos e derivados de esteróides, usualmente identificados como

saponinas, foram relatados na L. alba (Mill.) N.E. Brown, L. javanica

(N.L.Burm.) Spreng., L. rehmani H.H.W. Pearson e L. turbinata Griseb [115,

117-120].

Atualmente existe um grande número de estudos fitoquímicos e

farmacológicos da L. alba (Mill.) N.E. Brown e L. multiflora Moldenke, no

entanto para as outras espécies os estudos são poucos no que diz respeito

aos aspectos químicos.

2.3.1 - Óleo essencial

A composição química do óleo essencial de muitas espécies de Lippia

tem sido investigada através de Cromatografia Gasosa e, com base nos

dados publicados, percebe-se que limoneno (2), -cariofileno (3), p-cimeno

(4), cânfora (5), linalool (6), α-pineno (7) e timol (8) são os componentes que

aparecem com maior freqüência [19, 121].

CH2

CH3

H3C

CH3

O

2 3 4 5

H3C OH

OH

6 7 8


35

Além destes, foi isolado da L. dulcis o (+)-hernandulcina (9), (+)-4- -

hidroxihernandulcina e (-)-epihernandulcina (10) [101, 102]. Outro estudo da

mesma planta relatou a presença de seis novos sesquiterpenos do tipo

bisabolano das partes áreas, o peroxilippidulcinas A-C (11-13),

peroxilippidulcinas B (14), epilippidulcinas B (15) e C (16), lippidulcina A (17)

e epilippidulcina A (18) [122].

H

OHO

H

OHO

9 10

O

H

OH R

O

H

OH

R1 R2

11: R = OOH 17: R = OH

12: R1 = OOH R2 = H

13: R1 = H R2 = OH

O

H

OH

R1 R2

H

OHO

OH

14: R1 = OOH R2 = H

15: R1 = H R2 = OOH

16: R1 = H R2 = OH

18

No gênero Lippia, a secreção de óleos essenciais tem sido associada

à presença de tricomas. Normalmente os tricomas secretores são de formas

variadas entre grupos vegetais, mas em geral uniformes dentro de um

mesmo táxon [123].

Os óleos essenciais são muito instáveis a presença de luz, calor e

umidade, conseqüentemente o horário de colheita do material vegetal pode

influenciar direta ou indiretamente os processos do metabolismo secundário


36

que resultam em variações quantitativas e qualitativas do óleo essencial

[123].

A composição química do óleo de L. gracilis Schauer mostra

flutuações quantitativas dos componentes majoritários, provavelmente

devido a condições genéticas, ao local e condições em que a planta é

cultivada.

Neves et al. [124] realizaram por CG e CG/EM a determinação dos

compostos químicos presentes no óleo essencial de L. gracilis Schauer em

dois locais da caatinga de Pernambuco, Buíque e Ouricuri.

O estudo mostrou a presença de carvacrol (19) e p-cimeno como

constituintes principais em Buíque e em Ouricuri a presença de timol, -

terpineno (20) e 4-metoxi-acetofenona (21) como compostos majoritários.

OH

O

CH3O

19 20 21

O óleo essencial de L. gracilis também tem sido investigado em outros

estados do nordeste do Brasil, como Ceará, Piauí e Sergipe. No Ceará o

óleo essencial foi caracterizado por timol (30,6%) e p-cimeno (10,7%) como

componentes majoritários, enquanto que no Piauí tem-se o carvacrol

(47,7%) e o p-cimeno (19,2%) [124] e em Sergipe, carvacrol (23,52%), p-

cimeno (15,82%), -terpineno (14,17%) e mentol (10,97%) (22) [125].


37

OH

22

Os compostos químicos presentes no óleo essencial, principalmente

os monoterpenos carvacrol e timol, das espécies do gênero Lippia tem

apresentado forte ação contra bactérias e fungos. Neste contexto, a L.

origanoides H.B.K. apresentou atividade frente a bactérias como

Staphylococcus aureus meticilino resistente e L. sidoides Cham.contra

Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonela enteritidis, Serratia

marcescens, Candida albicans e Mycobacterium smegmatis [102, 106, 107,

126, 127].

Um estudo realizado por Albuquerque et al. [128] mostrou que o óleo

essencial da L. gracilis Schauer possui atividade antimicrobiana contra

fungos e bactérias endofíticas de helicônias. O óleo apresentou uma inibição

de 100% contra os fungos Geotrichum candidum, Trichoderma viride, Torula

herbarum, Paecillomyces sp, Aspergillus nidulans, Fusicoccum sp,

Aspergillus flavus, Paecillomyces aeruginens; 95,58% contra Curvularia

lunata e de 89,40% contra Aspergillus niger.

As bactérias Salmonela choleraceuis-diarizonae, Enterobacter

asburiae, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Kleibsiella pneumoniae,

Enterobacter hormaechei e Bacillus cereus foram todas inibidas na presença

do óleo essencial. Essa ação foi associada à presença de dois

monoterpenos fenólicos, o carvacrol (41,77%) e o timol (10,13%).

2.3.2 - Fitoconstituintes

Considerando a grande quantidade de trabalhos voltados para a

determinação do óleo essencial das espécies deste gênero, é importante


38

perceber a grande necessidade de trabalhos que enfoquem outras classes

de substâncias.

2.3.2.1 – Flavonóides

Compostos flavonoídicos aparecem com relativa freqüência em

espécies deste gênero. Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos

mais importantes e diversificados entre os produtos de origem vegetal.

Possuem a capacidade de modular a atividade de enzimas e afetar o

comportamento de muitos sistemas celulares, sugerindo que muitas

espécies podem possuir efeitos anti-hepatotóxico, antialérgico,

antiinflamatório, antiosteoporótipo e até antitumoral [129].

A maioria dos flavonóides identificados no gênero Lippia são flavonas.

As mais freqüentes são 6-hidroxiflavonas, metoxiflavonas e alguns sulfatos

de flavonas (mono e disulfatos) [19].

Pascual et al. [19] relataram a presença de duas flavanonas,

naringenina (23) e pinocembrina (24), na espécie L. graveolens. Em 2007

Lin et al. [108] identificaram nove novas flavanonas do extrato MeOH:H2O

(70:30 v/v) das folhas de L. graveolens por LC-DAD-ESI/MSD.

O

O

HO

OH

OH

O

O

HO

OH

23 24

O estudo a respeito dos flavonóides foi realizado principalmente nas

espécies L. citriodora (Ort.) H.B.K. e L. nodiflora (L.) Michx. São

aproximadamente 56 ocorrências de flavonóides no gênero Lippia, sendo 45

com derivados de flavonas (25) e 11 com derivados de flavanonas (26),

como mostrado na tabela 1.


39

O

O

2

34

5

6

7

8

2'3'

4'

5'

6'

O

O

2

34

5

6

7

8

2'3'

4'

5'

6'

25 26

Tabela 1: Flavonóides isolados de espécies do gênero Lippia

COMPOSTO ESPÉCIES [REFERÊNCIAS]

apigenina

(5,7,4’-OH flavona)

L. citriodora

L. graveolens

108-110, 112

apigenina-7-O-glicosil L. graveolens 108

apigenina-7-glucoronil-glicosil L. triphylla 130, 131

apigenina-6-OMe-7-metil éter L. sidoides 132

cirsiliol

(5,3’,4’-OH-6,7-OMe flavona)

L. citriodora 109, 110, 112

cirsimaritina

(5,4’-OH-6,7-OMe flavona)

L. citriodora

L. sidoides

L. dulcis

109, 110, 112, 122,

132, 133

crisoeriol

(5,7,4’-OH-3-OMe flavona)


diosmetina

(5,7,3’-OH-4’-OMe flavona)


diosmetina-7-glucoronil-glicosil L. triphylla 130, 131

eupafolina

(5,7,3’,4’-OH-6-OMe flavona)

L. citriodora 109, 110

eupatorina

(5,3’-OH-6,7,4’-OMe flavona)

L. citriodora

L. dulcis

109, 110, 112, 122

eupatilina

(5,7-OH-6,3’,4’-OMe flavona)

L. dulcis 122

galangina

(3,5,7-OH flavona)

L. graveolens 108


40

Tabela 1: continuação


metil-galangina L. graveolens 108

jaceosidina

(luteolina-6-OMe-3’-metil éter)

L. nodiflora 130

jaceosidina-7-sulfato L. nodiflora 130

jaceosidina-7,4’-disulfato L. nodiflora 130

luteolina

(5,7,3’,4’-OH flavona)

L. citriodora

L. graveolens

L. sidoides

108-110, 112, 132-

134,

luteolina 6-OH

L. citriodora

L. graveolens

L. nodiflora

108-110, 112, 130

luteolina-7-O- -glicosil L. citriodora

L. graveolens

108-110, 112

luteolina-6-OH-6-sulfato L. citriodora 109, 110, 112

luteolina-6-OH-7-sulfato L. citriodora 109, 110, 112

luteolina-6-OH-6,7-disulfato L. citriodora 109, 110, 112

luteolina-6-OH-7-O-hexosil L. graveolens 108

luteolina-6-OH-7-O-ramminosil L. graveolens 108

luteolina-glucoronil-glucosil L. triphylla 130, 131

lippiflorina A

(luteolina-6-OH-7-arabinosil)


lippiflorina B

(luteolina-6-OH-7-arabinosil-4’–

ramnosil)


luteolina-7-glicosil L. citriodora 109, 110, 112

luteolina-6-OH-7-apiosídeo L. citriodora 109, 110, 112

nepetina

(luteolina-6-OMe)

L. nodiflora 130

nepetina-3’,4’-disulfato L. nodiflora 130

nepetina-7-sulfato L. nodiflora 130

nodifloretina

(luteolina-6-OH-3’-metil éter)

L. nodiflora 130

nodifloretina-7-sulfato L. nodiflora 130

nodifloretina-6,7-disulfato L. nodiflora 130


41



pectolinarigenina

(5,7-OH-6,4’-OMe flavona

L. citriodora

L. dulcis

109, 110, 112, 122

salvigenina

(5-OH-6,7,4’-OMe flavona)

L. citriodora

L. dulcis

109, 110, 112, 122

scutellarein

(5,6,7,4’-OH flavona)

L. graveolens 108

scutellarein-7-O-hexosil L. graveolens 108

scutellarein-6-metil L. graveolens 108

scutellarein-6,7-dimetil L. graveolens 108

5-4-OH-6,7- OMe flavona L. sidoides 112, 132, 134

5,3’-OH-6,7,4’,5’-OMe flavona L. dulcis 122

quercetina

(3,5,7,3’,4’-OH flavona)

L. aff. gracilis

L. dulcis

L. graveolens

L. sidoides

108-110, 113, 122,

132-134

eriodictiol

(5,7,3’,4’-OH flavanona)

L. graveolens 108

eriodictiol-7-O-glicosil L. graveolens 108

naringenina

(5,7,4’-OH flavanona)

L. graveolens 108, 111

pinocembrina

(5,7-OH flavanona)

L. graveolens 108, 111

sakuranetina

(5,4’-OH-7-OMe flavanona)

L. graveolens 108

5,6,7,3’,4’-OH flavanona L. graveolens 108

5,6,7,3’,4’-OH-7-O-hexosil flavanona L. graveolens 108

3,5,6,7,4’-OH flavanona L. graveolens 108

3,5,6,7,4’-OH-7-O-hexosil flavanona L. graveolens 108

3,5,6,7,4’-OH-2-O-hexosil flavanona L. graveolens 108

taxifolina

(3,5,7,3’,4’-OH flavanona)

L. graveolens

L. sidoides

108, 132, 133


42

2.3.2.2 - Naftoquinonas

As naftoquinonas não são freqüentes nas espécies do gênero Lippia.

No entanto, no extrato metanólico das folhas e ramos de L. sidoides foi

isolado o lapachenol (27), isocatalponol e 6-oxo-3,4,4a,5-tetrahidro-3-hidroxi-

2,2-dimetilnafto-1,2-pirano (28) [135]. O lapachenol também foi relatado na

L. graveolans e L. aff. gracilis [111, 113].

OCH3

O

O

O

H

H H

OH

12

34

5

67

8

9

10

27 28

Na L. sidoides também foi isolado uma nova naftoquinona dimérica

prenilada, a lippidoquinona (29) [134].

O

OH

H

O O

HO

29

Algumas naftoquinonas são antibacterianas e fungicidas, outras

apresentam atividade antiprotozoários e antivirais. Entretanto, nenhuma


43

naftoquinona natural é atualmente utilizada com fins terapêuticos [127, 136,

137].

2.3.2.3 - Iridóides

Outro componente presente em espécies de Lippia são os iridóides

glicosilados. Eles são produtos do metabolismo secundário de alguns grupos

vegetais e desempenham um papel de proteção contra predadores,

principalmente herbívoros, por serem venenosos ou amargos. [19, 138].

Nas plantas os iridóides apresentam uma pronunciada distribuição em

angiospermas notadamente nas Lamiaceae, Verbenaceae,

Scrophulariaceae e Plantataginaceae. Sendo não raro, utilizados como

marcadores taxonômicos a níveis de gênero e subgênero [139].

Inúmeras publicações demonstram as propriedades biológicas dos

iridóides como antiviral, antimicrobiana, antitumoral, hemodinâmica,

vasoconstritora, hepatoprotetora e antiinflamatória [140-144].

Rastrelli et al. [145] investigaram as folhas de L. graveolens da

Guatemala e isolaram dez iridóides, sendo alguns deles secoiridóides

glicosilados. Os menos freqüentes foram secologanina (30), secoxiloganina

(31), dimetilsecologanosida (32), ácido logânico (33), loganina (34), ácido 8-

epi-loganina (35), carioptosida (36) e os majoritários foram 6’-O-caffeoil (37),

6’-O-p-coumaroil (38) e ácido carioptosídico (39).

O

COOCH3

O_Glu

R

OHO

COOR

O_Glu

OHO

COOH

O_Glu

30: R = CHO

31: R = COOH 32: R = COOCH3

33: R = H 34: R = CH3

35


44

OHO

COOH

O_GluHO

OHCHCH

OH

CR

O

36 37

OHCHCHCR

O

O

O

COOH

HO

HO

O

OH

OH

HO

OH

38 39

Os iridóides teviridosídeo (40) e tevesídeo-Na (41) foram isolados das

espécies L. alba, L. javanica, L. turbinata, L. angustifolia, L. arechavaletae, L.

ramboi e L. thymoides [146, 147].

O

O

COOR2R1

HHO

O

OH

OH

HO

OH

40: R1 = OH R2 = Na 41: R1 = OH R2 = CH3

Na L. citriodora e L. nodiflora foram identificados genoposídeo (42),

ácido genoposídeo-Na (43) e mussaenosídeo (44). O genoposídeo também

é relatado na L. alba [19].


45

O

O

COOR2R1

HHO

O

OH

OH

HO

OH

O

O

COOCH3

H

HO

H

HCH3

H

O

OH

OH

HO

OH

42: R1 = H R2 = CH3 43: R1 = H R2 = Na

44

Em 2006, Barbosa et al. [114], isolaram do decocto das folhas de L.

alba um novo iridóide chamado shanzshida (45). Sena Filho et al. [139]

isolaram da mesma planta o teviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo

(46).

O

O

COOH

HO

H

H

HO H

O

OH

OH

HO

OH

O

O

COOHH

H

HO

H3C

O

OH

OH

HO

OH

45 46

Capítulo

46


47

3. OBJETIVOS

3.1- OBJETIVO GERAL

Controle químico de qualidade de plantas medicinais.

3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolvimento de método por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência para diferenciação de genótipos de Lippia gracilis Schauer;

Isolamento e identificação de marcadores químicos;

Capítulo

48


49

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 - EQUIPAMENTOS E MATERIAIS

As folhas e caules dos genótipos de Lippia gracilis foram secas em

estufa de circulação, modelo FIC. 0.5 – FAMO®.

O material vegetal foi triturado em moinho de facas da marca

MARCONI®.

Os extratos dos genótipos das folhas foram preparados com metanol

grau P.A. da marca Quimex® e os extratos dos genótipos dos caules foram

preparados com metanol grau HPLC da marca Carlo Erba®.

Os extratos metanólicos foram concentrados em evaporador rotatório

da marca Heidolph®.

As pesagens foram realizadas em balança analítica da marca

OHAUS®.

A acetonitrila utilizada nas análises cromatográficas de alta eficiência

foi de pureza analítica e grau HPLC (JT Baker, Philipsburg, PA, EUA).

O metanol utilizado na preparação das amostras para extração em

fase sólida (SPE) foi de pureza analítica e grau HPLC (Carlo Erba, Duque de

Caxias, RJ, Brasil).

O ácido fórmico (88%) foi grau analítico (JT. Baker, Philipsburg, PA,

EUA).


50

Os solventes utilizados nas análises cromatográficas de alta eficiência

foram previamente filtrados utilizando membrana filtrante da marca MFS de

nylon de 47mm (diâmetro da membrana) e 0,45 µm (diâmetro do poro).

A água deionizada utilizada na composição da fase móvel e no

preparo das amostras para extração em fase sólida (SPE) foi obtida em um

sistema MILLI-Q (Millipore, São Paulo, SP, Brasil).

Para realização das extrações em fase sólida (SPE) foram avaliados e

utilizados cartuchos C18 de 1,0 mL/100 mg de sorvente das marcas Varian®,

Supelco® e JT Baker® .

Nas análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência foram

testadas diferentes colunas analíticas para a otimização da separação dos

constituintes dos extratos de Lippia gracilis, sendo elas: coluna C18 LUNA®

(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm,

15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158) e coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x

0,46 cm, Phenomenex).

Nas análises por CLAE semipreparativa foi utilizada coluna hexil-fenil

LUNA® (10 µm, 25,0 x 1,0 cm, Phenomenex).

A cromatografia em coluna foi realizada com resina amberlite XAD-2

da Supelco®.

4.2 - TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

4.2.1 - Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Sistema 1: Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto,

Japão), modelo Prominence, para eluição gradiente, composto de uma

bomba LC-20AT, com válvula solenóide de quatro linhas, degaseificador

DGU-20A5, auto injetor SIL-10A, detector UV com arranjo de diodos SPD-

M10Avp ligado a uma interface CBM 20A. O equipamento foi gerenciado

pelo software LC Solution. Aparelho pertencente ao Laboratório de Síntese

Orgânica e CLAE do Departamento de Química da UFSCar.


51

Sistema 2: Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto,

Japão), modelo Prominence, para eluição gradiente, composto de duas

bombas LC-6A, degaseificador DGU-20A3, auto injetor SIL-10A, detector UV

com arranjo de diodos SPD-M20Avp conectado a uma interface CBM 20A. O

equipamento foi gerenciado pelo software LC Solution. Aparelho pertencente

ao Departamento de Química da UFS.

4.3 - MATERIAL VEGETAL

As folhas e caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) da

espécie de Lippia gracilis foram coletados no mês de maio de 2007 no

Campus Rural da Universidade Federal de Sergipe (UFS) e exemplares

foram depositados no herbário da UFS (Tabela 2).

Tabela 2: Dados dos genótipos da espécie Lippia gracilis

CÓDIGO LOCAL

DE

ORIGEM

ESTADO ESPÉCIE DADOS

GEOGRÁFICOS

(lat; long; alt.)

NÚMERO DO

HERBÁRIO

UFS

106 Tomar do

Geru

SE Lippia

gracilis

11 19' 16,7'' S; 37

55' 09,2'' W; 215 (m)

9205

107 Tomar do

Geru

SE Lippia

gracilis

11 19' 20,1" S; 37

55' 13,5" W; 214 (m)

9203

108 Tomar do

Geru

SE Lippia

gracilis

11 19' 22,4" S; 37

55' 12,6" W; 209 (m)

9404

109 Tomar do

Geru

SE Lippia

gracilis

11 19' 0,7" S; 37 55'

16,9" W; 207 (m)

9207

110 Tomar do

Geru

SE Lippia

gracilis

11 19' 1,1" S; 37 55'

14,9" W; 205 (m)

9208

201 Rio Real BA Lippia

gracilis

11 23' 38,7" S; 38

00' 54,1" W; 200 (m)

9206

202 Rio Real BA Lippia

gracilis

11 23' 45,3" S; 38

00' 51,3" W; 197 (m)

9209

Após a coleta, as folhas e caules foram separados, secos em estufa

de circulação de ar e, posteriormente, triturados em moinho de facas,

obtendo-se as quantidades descritas na tabela 3.


52

Tabela 3: Quantidade de material vegetal seco e triturado

GENÓTIPO FOLHAS (g) CAULES (g)

106 350,12 645,02

107 557,21 972,39

108 180,37 577,05

109 397,62 1070,66

110 262,57 887,37

201 255,28 801,31

202 478,07 718,63

Os genótipos 106-110 são provenientes do estado de Sergipe,

município de Tomár do Geru, e os genótipos 201 e 202 são provenientes do

estado da Bahia, município de Rio Real. Essas amostras foram coletadas

nestes municípios e cultivadas no Campus Rural da UFS, onde estão sendo

supervisionadas pelo laboratório de Culturas de Tecidos Vegetais e

Melhoramento Vegetal do Departamento de Engenharia Agronômica (DEA)

da UFS, sob coordenação do Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank (Figura 8).

Figura 8: Mudas da espécie de Lippia gracilis no DEA


53

4.4 - PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS

O procedimento de obtenção dos extratos das folhas e caules foi

padronizado. Sobre o material vegetal moído foi adicionado metanol (1:5

p/v), o qual ficou sob maceração por uma semana.

Após este tempo, a mistura foi filtrada a pressão ambiente em papel-

filtro, concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida a 30°C, até

a completa remoção do solvente, resultando nos respectivos extratos brutos

(Tabela 4). Depois da primeira extração, o procedimento foi repetido por

mais três vezes.

Para a preparação dos extratos das folhas foram utilizadas as

quantidades descritas na tabela 3 e para os caules foram utilizados 200 g.

Tabela 4: Rendimento dos extratos metanólicos das folhas e caules

GENÓTIPO FOLHAS (g) CAULES (g)

106 15,831 6,356

107 18,749 6,740

108 12,146 7,766

109 27,844 6,816

110 19,625 5,597

201 19,356 5,316

202 20,764 5,137

4.5 - PREPARO DAS AMOSTRAS PARA CLAE ANALÍTICA

4.5.1 - Extração em Fase Sólida

A análise cromatográfica de extratos de plantas, em geral, requer um

pré-tratamento da amostra. A extração em fase sólida é umas das

ferramentas mais empregadas para o pré-tratamento de analitos presentes

em matrizes complexas, como extratos de plantas. Essa técnica permite que

a análise dos componentes de interesse se torne possível de forma que se

obtenha uma separação cromatográfica livre de interferentes [149].


54

Visando coletar as amostras dos genótipos de Lippia gracilis isentas

de clorofilas para posterior análise cromatográfica, dois métodos de extração

foram estudados com três marcas de cartuchos C18 (Varian®, Supelco®, JT

Baker®). Todos os passos de otimização foram realizados no extrato

metanólico do genótipo 108 das folhas.

A amostra a ser aplicada no cartucho foi preparada solubilizando 15

mg do extrato metanólico do genótipo 108 em 1 mL de metanol.

No primeiro método, o cartucho foi condicionado com 3 mL de

metanol, seguido de 1mL de água. Posteriormente, foi aplicado 100µL da

amostra a qual foi eluída seqüencialmente com 1 mL de : 5%, 10%, 15%,

20%, 30%, 50%, 60% de MeOH:H2O e 3 mL de 100% MeOH.

No segundo método, o cartucho foi condicionado com 3 mL de

metanol, seguido por 1 mL de água. Posteriormente foi aplicado 100µL da

amostra a qual foi eluída seqüencialmente com 1 mL de solução a 5%

MeOH:H2O e 3 mL de 100% MeOH (Figura 9).

Figura 9: Esquema com as etapas da extração em fase sólida

É importante mencionar que as três marcas de cartuchos testadas

foram submetidas igualmente aos dois métodos de extração.


55

Após análise por CLAE de todas as amostras (discutidas no item 5.1)

foi observado que as melhores condições foram obtidas com a utilização do

segundo método sobre o cartucho da marca JT Baker®, as quais foram

também aplicadas para preparação das amostras oriundas dos outros

genótipos das folhas e caules (106-110, 201 e 202).

Para cada genótipo das folhas e caules foram preparadas

quintuplicatas a partir dos extratos metanólicos, com a repetição completa do

processo de pré-tratamento acima descrito.

Os experimentos foram realizados com o auxílio de um dispositivo de

extração acoplado a uma bomba de vácuo (Figura 10).

Figura 10: Dispositivo para extração em fase sólida

4.6 - CONDIÇÕES ANALÍTICAS DOS CROMATOGRAMAS

FINGERPRINT

As frações obtidas por extração em fase sólida (SPE) foram reunidas,

concentradas em evaporador rotatório e dissolvidas em 500 µL de metanol

para serem, posteriormente, utilizadas nas análises por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência.

Os genótipos das folhas foram analisadas usando um sistema de

eluição que empregou um gradiente de solvente no qual a porcentagem de

acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%(v/v) (A) variaram de 15% a 40% (B)

em 50 min, 40% a 70% (B) em 20 min e mantida constante em 70% (B) até


56

75 min. Ao término da corrida cromatográfica empregou-se um gradiente de

volta de 70% a 15% (B) em 5 min e o tempo de espera para

recondicionamento da coluna foi de 30 min. A vazão empregada foi de 0,5

mL/min e em cada análise foram injetados 25 µL da amostra.

Para a análise dos genótipos dos caules, o sistema de eluição

empregou um gradiente de solvente no qual a porcentagem de acetonitrila

(B) e de ácido fórmico 0,5% (v/v) (A) variaram de 15% a 20% (B) em 25 min,

20% a 40% (B) em 45 min e mantida constante em 40% (B) até 75 min. Ao

término da corrida empregou-se um gradiente de volta de 40% a 15% (B) em

5 min e o tempo de espera para recondicionamento da coluna foi de 30 min.

A vazão empregada foi de 0,5 mL/min e em cada análise foram injetados 25

µL da amostra.

4.7 - CROMATOGRAFIA COM RESINA AMBERLITE XAD-2

A resina amberlite XAD-2 (poliestireno-divinil-benzeno) é utilizada em

procedimentos de separação devido às suas propriedades, tais como:

porosidade, alta área superficial, durabilidade e pureza [149]. São muito

úteis na purificação de compostos químicos de origem vegetal,

principalmente flavonóides [150].

Os extratos metanólicos do genótipo 107 das folhas (6,0 g) e caules

(6,0 g) foram submetidos à cromatografia em coluna (35,0 cm x 3,50 cm de

d.i) com resina amberlite XAD-2 (170,0 g).

A resina foi deixada em repouso com metanol e, em seguida, a coluna

foi empacotada cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar que

interferissem o fluxo da fase móvel na coluna.

A eluição foi feita com 500 mL de MeOH:H2O nas proporções: 5%,

15%, 25%, 35%, 50%, 70%, 85% de MeOH:H2O e 100% MeOH. Foram

coletadas oito frações num volume de 500mL. Todas as frações eluídas da

coluna amberlite XAD-2 foram secas a temperatura ambiente, obtendo-se as

quantidades descritas na tabela 5. Em seguida, as frações foram


57

submetidas à análise por CLAE utilizando as mesmas condições analíticas

dos cromatogramas fingerprint das folhas e caules (item 4.6).

Tabela 5: Rendimento das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2

FRAÇÕES FOLHAS (mg) CAULES (mg)

5% MeOH:H2O 450,00 122,90

15% MeOH:H2O 268,70 36,90

25% MeOH:H2O 358,40 60,70

35% MeOH:H2O 365,70 23,70

50% MeOH:H2O 712,10 39,00

70% MeOH:H2O 382,90 48,50

85% MeOH:H2O 133,60 38,50

100% MeOH 162,40 96,90

4.8 - ANÁLISE EM CLAE SEMIPREPARATIVA DAS FOLHAS

Após a obtenção dos cromatogramas fingerprint de todas as frações

obtidas da coluna cromatográfica em resina amberlite XAD-2, foram

selecionadas as frações 50% e 85% MeOH:H2O para o isolamento dos

compostos químicos por CLAE semipreparativa.

Para isso foi usada uma coluna semipreparativa hexil-fenil LUNA®

(25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), vazão de 4 mL/min e detecção em 280 nm.

1. Fração 50% MeOH:H2O: Parte da fração 50% MeOH:H2O (200

mg) foi dissolvida em 2 mL de ACN/HCOOH 0,5% 25:75 (v/v) e adicionado

em um vial de 2mL para ser utilizado na análise por CLAE semipreparativa.

O isolamento dos compostos foi obtido utilizando um gradiente de

solvente na qual a porcentagem de acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%

(v/v) (A) variaram de 8% a 40% (B) em 50 min. Em cada análise foram

injetadas amostras na concentração de 10 mg/100 µL.

Da análise em CLAE semipreparativa foram obtidas dez amostras

denominadas LGRA 1, LGRA 2, LGRA 3, LGRA 4, LGRA 5, LGRA 6, LGRA


58

7, LGRA 8, LGRA 9 e LGRA 10. Destas amostras, somente a LGRA 1,

LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9 e LGRA 10 foram enviadas para análises por

RMN.

2. Fração 85% MeOH:H2O: Parte da fração 85% MeOH:H2O (100

mg) foi dissolvida em 2 mL de ACN/HCOOH 0,5% 35:65 (v/v) e adicionado

em um vial de 2mL para ser utilizado na análise por CLAE semipreparativa.

O isolamento dos compostos foi obtido utilizando um gradiente de

solvente na qual a porcentagem de acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%

(v/v) (A) variaram de 35% a 53% (B) em 15 min. Em cada análise foram

injetadas amostras na concentração de 10 mg/200 µL.

Da análise em CLAE semipreparativa foram obtidas cinco amostras

denominadas LGRA 11, LGRA 12, LGRA 13, LGRA 14, LGRA 15. Destas

amostras, a LGRA 12 e 13 foram enviadas para análise por RMN.

Todas as amostras foram secas a temperatura ambiente, obtendo-se

as quantidades descritas na tabela 6.

Tabela 6: Rendimento das amostras obtidas por CLAE

semipreparativa

AMOSTRAS MASSA (mg)

LGRA 1 7,6

LGRA 2 9,2

LGRA 3 28,2

LGRA 4 3,1

LGRA 5 1,9

LGRA 6 8,0

LGRA 7 3,3

LGRA 8 3,3

LGRA 9 4,3

LGRA 10 7,5

LGRA 11 0,5

LGRA 12 4,9


59


AMOSTRAS MASSA (mg)

LGRA 13 4,8

LGRA 14 2,2

LGRA 15 0,4

4.9 - ANÁLISES POR RMN

A identificação estrutural dos compostos isolados foi realizada através

do uso da técnica de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e

Carbono-13 e por comparação com dados da literatura.

Os espectros de RMN 1H e 13C foram obtidos em um espectrômetro

BRUKER, modelo DRX400 de 9,4 Tesla (400 MHz para freqüência do

hidrogênio), pertencente ao Departamento de Química da UFSCar. Os

experimentos foram realizados a temperatura ambiente, sendo as amostras

LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9, LGRA 10 e LGRA 13 solubilizadas em

metanol deuterado e LGRA 12 em DMSO deuterado, utilizando como

referência interna o tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos ( )

são indicados em ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).

4.10 - ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA

As análises quimiométricas foram realizadas pelo Prof. Dr. Edenir

Rodrigues Pereira Filho, da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar).

empregando o software PIROUETTE®, versão 4.0 (Informetrix).

4.11 - ESTUDO FARMACOLÓGICO DO EXTRATO METANÓLICO

DAS FOLHAS DE LIPPIA GRACILIS

Dois testes farmacológicos foram realizados com o extrato metanólico

das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis para verificar um possível efeito

antiinflamatório do extrato, uma vez que existem indicações desta atividade

em outras espécies de Lippia como, por exemplo, na L. dulcis [151].


60

4.11.1 - Animais

Foram 80 camundongos (Mus musculus) Swiss, machos, albinos

pesando de 25 - 33 gramas, oriundos do Biotério Central da Universidade

Federal de Sergipe (UFS). Todos os animais foram mantidos até o dia dos

experimentos em gaiolas de polipropileno, com temperatura ambiente de 23

± 2 ºC e ciclo claro-escuro de 12:00 horas, sendo que a fase de luz tinha

início às 6:00 e término às 18:00 horas. Os animais tiveram livre acesso a

alimentação do tipo "pellets" (Labina) e água, disponível em frascos de vidro

com bicos apropriados, até 60 minutos antes dos experimentos.

O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em pesquisa com Animal

para avaliação sob o protocolo de número 07/09. Vale ressaltar que todos os

protocolos experimentais propostos respeitam os critérios éticos de

experimentação animal preconizados pelo Colégio Brasileiro em

Experimentação Animal (COBEA).

4.11.2 – Drogas

- Extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis

(EMLG);

- Tween (Sigma, USA);

- Formaldeído 37% (Reagen, Brasil);

- Ácido acetilsalicílico (Sigma, USA);

- Solução de cloreto de sódio, 0.9% (Merck, Brasil);

- Ácido acético glacial PA (Synth, Brasil).

4.11.3 – Avaliação da Atividade Antinociceptiva

4.11.3.1 - Teste de contorção abdominal induzida pelo ácido

acético a 0,85%

Esta metodologia foi realizada com camundongos (n=8/grupo) que

receberam o pré-tratamento com veículo (solução salina/Tween), EMLG

(100, 200 e 400 mg/Kg, v.o.) e ácido acetilsalicílico (200 mg/Kg). Após 60


61

minutos todos os animais foram tratados com solução de ácido acético a

0,85%, pela via intraperitoneal (i.p.). Posteriormente, os animais foram

observados individualmente quanto à apresentação de contorções

abdominais seguidas de extensões dos membros posteriores, durante um

período de 15 minutos [152].

4.11.3.2 - Formalina

O comportamento espontâneo indicativo de nocicepção foi

quantificado após a administração subcutânea de 20 l/animal de uma

solução de formalina a 1,5% no dorso da pata traseira direita do animal

[152]. Para tanto, camundongos foram divididos em 5 grupos de 8 animais

(n=8) e pré-tratados com o veículo (solução salina/Tween), EMLG (100, 200

e 400 mg/Kg, v.o.) e ácido acetilsalicílico (200 mg/Kg, i.p.). A resposta

nociceptiva foi avaliada através da quantificação do tempo que o animal

executou o ato de lamber a pata que recebeu o estímulo, em dois períodos.

O primeiro deles, entre 0-10 minutos e o segundo período de observação, de

20-40 minutos [153, 154].

Os percentuais de inibição foram determinados através da fórmula

seguinte [155]:

% Inibição = 100. (controle - experimental)

controle

62

Capítulo


63

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 - DESENVOLVIMENTO DOS CROMATOGRAMAS FINGERPRINT

5.1.1 - Otimização do procedimento de pré-tratamento

Devido à alta concentração de clorofila nos extratos brutos de Lippia

gracilis, inviabilizando as análises por cromatografia líquida, foi necessário

realizar um pré-tratamento por SPE nos extratos para posterior análise

cromatográfica.

Desta forma, foram testados dois métodos de extração em fase sólida

com o extrato metanólico das folhas do genótipo 108, descrito no item 4.5.1.

Os cartuchos de fase C18 de diferentes marcas (Varian®, Supelco® e JT

Baker®) foram avaliados quanto ao seu poder de retenção da clorofila

(visualmente) na fase sólida e, principalmente, com relação à recuperação

dos metabólitos de interesse presentes na amostra.

O primeiro método utilizado para o pré-tratamento foi testado nas três

marcas de cartuchos. Durante o procedimento do método percebeu-se que

as clorofilas ficavam retidas no cartucho enquanto as substâncias de

interesse eram eluídas e coletadas em tubos de ensaio.

A análise visual permitiu constatar a melhor retenção da clorofila pelo

cartucho da marca JT Baker . Também foi realizada a análise por

cromatografia líquida para verificar a composição química das frações

extraídas por SPE nas três marcas de cartuchos. Para estas análises foi

utilizada uma coluna C18 LUNA® de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i).


64

As frações 5% de MeOH:H2O e 100% de MeOH extraídas dos três

cartuchos foram analisadas separadamente no cromatógrafo líquido de alta

eficiência (CLAE) da marca SHIMADZU acoplado a um detector UV com

arranjo de diodos pertencente ao Laboratório de Síntese Orgânica e CLAE

do Departamento de Química da UFSCar (Sistema 1 - item 4.2.1), utilizando

um gradiente exploratório linear de ACN (B) e H2O (A), nas condições de 5%

a 100% (B) por 60 min e mantida constante em 100% (B) até 65 min, vazão

de 1 mL/min, volume de injeção de 50 µL, detecção em = 280nm em

coluna C18 LUNA® de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i) (Figuras 11, 12 e 13).

Figura 11: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100% MeOH após

tratamento por extração em fase sólida (Varian ). Condições cromatográficas: gradiente

linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão = 1mL/min, =280nm, Vinj.= 50µL.


tratamento por extração em fase sólida (Supelco ). Condições cromatográficas: gradiente



65


tratamento por extração em fase sólida (JT Baker ). Condições cromatográficas: gradiente


Analisando os cromatogramas é possível perceber claramente a

diferença entre o perfil químico das frações do cartucho da Supelco® e os

perfis químicos das frações dos cartuchos da Varian® e JT Baker®. Isso

demonstra que a maioria dos constituintes químicos não eluíram com a

passagem da solução 5% de MeOH:H2O e 100% de MeOH no cartucho da

Supelco®.

Diante do exposto, optou-se por realizar o restante das análises com

o cartucho da marca JT Baker®, uma vez que nele houve uma melhor

retenção das clorofilas na fase estacionária e uma boa resposta nas análises

cromatográficas das frações.

Além da análise anterior, foi avaliada a composição química dos

extratos reunindo-se as frações de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% e 60%

de MeOH:H2O e 100% de MeOH coletadas no SPE, com o objetivo de

comparar os compostos presentes nas frações isoladas de 5% MeOH:H2O e

100% MeOH realizadas anteriormente (Figuras 10 a 12). Para isso, repetiu-

se o mesmo processo de eluição de gradiente exploratório linear de ACN (B)

e H2O (A), nas condições de 5% a 100% (B) por 60 min, vazão de 1 mL/min,

volume de injeção de 50 µL, detecção em =280nm em coluna C18 LUNA®

de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i). O cromatograma pode ser visualizado na

figura 14.


66

0 10 20 30 40 min

0

25

50

75

100

125mAU

Figura 14: Cromatograma das frações reunidas de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%

e 60% MeOH:H2O e 100% MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker®).

Analisando o cromatograma da figura 14 foi possível observar que

ele apresenta um perfil cromatográfico similar ao cromatograma (a) da

figura 13. Isto comprova que os compostos eluíram apenas com a

passagem da solução de 5% MeOH:H2O e 100% MeOH no cartucho. O

cromatograma da figura 15 evidencia esta observação, pois trata-se de um

cromatograma obtido pela análise das frações reunidas de 5% MeOH:H2O e

100% MeOH.


67

Figura 15: Cromatograma das frações reunidas 5% MeOH:água e 100% MeOH

após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker®). Condições cromatográficas:

gradiente linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, Vinj.=

50µL.

Desta forma, o segundo método para o pré-tratamento dos extratos

brutos das folhas e caules dos genótipos de L. gracilis foi selecionado, na

qual o cartucho C18 da marca JT Baker® é condicionado com 3 mL de

metanol, seguido por 1 mL de água. Posteriormente, é aplicado 100µL da

amostra a qual é eluída seqüencialmente com 1 mL de solução a 5%

MeOH:H2O e 3 mL de 100% MeOH.

5.1.2 – Cromatograma fingerprint das folhas de Lippia gracilis

As condições cromatográficas foram otimizadas utilizando-se a

amostra obtida após a extração em fase sólida. Para a otimização das

condições de análise foram avaliados os efeitos dos seguintes fatores:

natureza do modificador orgânico (ACN ou MeOH), fase estacionária, vazão,

volume de injeção e condições de eluição gradiente.

Todas as análises para a obtenção do cromatograma fingerprint das

folhas de Lippia gracilis foram realizadas no Cromatógrafo líquido da marca


68

SHIMADZU (Kyoto, Japão) pertencente ao Laboratório de Síntese Orgânica

e CLAE do Departamento de Química da UFSCar (Sistema 1 – item 4.2.1).

O uso da eluição gradiente em condições de ampla faixa de força da

fase móvel é tido como exploratório e pode ser usado de modo a fornecer

um cromatograma fingerprint (impressão digital) da amostra em análise.

SYNDER e DOLAN relatam que a mistura ACN:H2O como fase móvel é

menos viscosa e permite a utilização de valores baixos de comprimento de

onda no UV para detecção de compostos [29].

O primeiro passo do trabalho foi a realização de um gradiente

exploratório para visualizar a complexidade da amostra e identificar a fase

móvel mais eficiente para separação dos componentes da amostra.

Inicialmente, foi empregado um gradiente exploratório binário usando

a mistura ACN (B) e H2O (A) como solventes, em uma coluna analítica C18

LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex). Foi variada a concentração

do modificador orgânico (ACN) de 5% a 100% durante 60 minutos, com

vazão de 1mL/min, acompanhado pelo detector UV-Vis com arranjo de

diodos.

A figura 16 mostra o cromatograma na qual a maioria dos compostos

eluíram entre 6 a 34 min.


69

0 10 20 30 40 min

0

25

50

75

100

125mAU

Figura 16: Cromatograma do extrato metanólico da Lippia gracillis. Condições

cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min,

=280nm, Vinj.= 50µL.

A análise cromatográfica permitiu verificar que os compostos

presentes na amostra apresentavam baixa interação com a fase

estacionária, além disso não foi possível obter uma adequada separação

das bandas cromatográficas.

Através deste cromatograma fingerprint foi possível determinar a

inclinação do gradiente (%B/min) e correlacionar a afinidade dos

constituintes presentes na amostra com as fases móvel e estacionária

empregadas através da seguinte fórmula:

% B/min = Δ%B = 95 = 1,58%B/min

tg 60

%B/min = variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente)

Δ%B = diferença entre a % de B final e inicial

tg = tempo de gradiente


70

Desta forma, diferentes otimizações de condições de separação foram

testadas variando os fatores inicialmente mencionados com o intuito de

melhorar a separação dos compostos. Estas diferentes condições são

demonstradas com seus respectivos perfis cromatográficos na tabela 7 e

nas figuras 17.

Tabela 7: Condições cromatográficas avaliadas para separação dos

compostos químicos, com detecção em = 280 nm.

Condição Eluição

gradiente

(B)

Solventes Coluna

cromatográfica

(15,0 x 0,46 cm)

Vazão

(mL/min)

Vol. de

injeção

(µL)

%B/min

1 5-60% por

60min

ACN:H2O C18 LUNA®

(Phenomenex)

1,0 50,0 0,92

2 5-60% por

60min

ACN:HCOOH

0,5% (v/v)

C18 LUNA®

(Phenomenex)

1,0 50,0 0,92

3 5-90% por

60min

MeOH:HCOOH

0,5% (v/v)

C18 LUNA®

(Phenomenex)

1,0 50,0 1,42

4 15-90%

por 60min

MeOH:HCOOH

0,5% (v/v)

C18 LUNA®

(Phenomenex)

0,5 50,0 1,25

5 5-100%

por 60min

MeOH: H2O C18 LUNA®

(Phenomenex)

1,0 50,0 1,58

6 5-100%

por 60min

MeOH: H2O Hexil-fenil LUNA®

(QC-UFSCar-

158)

1,0 50,0 1,58

7 20-100%

por 60min

MeOH:HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(QC-UFSCar-

158)

0,5 25,0 1,33

8 35-85%

por 60min

MeOH:HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(QC-UFSCar-

158)

0,5 25,0 0,83

9 5-90% por

60 min

ACN: HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(QC-UFSCar-

158)

0,5 25,0 1,42


71



gradiente

(B)

Solventes Coluna

cromatográfica

(15,0 x 0,46 cm)

Vazão

(mL/min)

Vol. de

injeção

(µL)

%B/min

10 1) 20-40%

por 40min;

2) 40-70%

por 20min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil

LUNA® (QC-

UFSCar-158)

0,5 25,0 1) 0,5

2) 1,5

11 1) 10-30%

por 40min;

2) 30-70%

por 25min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil

LUNA® (QC-

UFSCar-158)

0,5 25,0 1) 0,5

2) 1,6

12 1) 15-40%

por 50min;

2) 40-70%

por 20min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil

LUNA® (QC-

UFSCar-158)

0,5 25,0 1) 0,5

2) 1,5


72

Figura 17: Cromatogramas para seleção de condições para o método em CLAE. Os

números correspondem às condições apresentadas na tabela 3.

Observando os cromatogramas das figuras 17, nota-se que não

houve uma boa separação das bandas cromatográficas utilizando as

misturas MeOH:H2O ou MeOH:solução de ácido fórmico (HCOOH) 0,5%

(v/v) com a coluna de fase estacionária C18, apresentando muitas bandas

em co-eluição (condições cromatográficas de 1 a 5).


73

A mudança da coluna de fase estacionária C18 para uma de fase hexil-

fenil utilizando as misturas MeOH:H2O ou MeOH:solução de ácido fórmico

(HCOOH) 0,5% (v/v) permitiu obter uma melhor separação das bandas

cromatográficas (condições cromatográficas 6 a 8); no entanto, ainda foi

observado sobreposição de bandas.

Contudo, ao variar o modificador orgânico de MeOH para ACN e

também as condições de eluição gradiente, pôde-se obter cromatogramas

com melhor separação das bandas cromatográficas (condições

cromatográficas 9 a 12).

Dentre as condições testadas, a condição 12 foi a que apresentou o

melhor cromatograma. Tanto a composição da fase móvel ACN: solução de

HCOOH 0,5% (v/v), quanto à fase estacionária hexil-fenil LUNA® (10 µm,

15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158) foram eficazes na separação dos

compostos presentes no extrato metanólico (Figura 18).

10 20 30 40 50 60 70 min

0

50

100

150

200

250mAU

Figura 18: Cromatograma obtido com a condição de eluição gradiente: 15-40%

ACN (B):solução de 0,5% HCOOH (A) em 50 min; 40-70% (B) em 20 min, vazão 0,5 ml/min,

=280nm, Vinj.= 25µL, coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158).

As análises posteriores deste trabalho foram realizadas no

Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto, Japão) pertencente ao


74

Departamento de Química da UFS (Sistema 2 – item 4.2.1). A coluna

cromatográfica que passou a ser utilizada nas análises foi uma hexil-fenil

LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), uma coluna comercial e não

mais manufaturada como a anterior.

Após a otimização do gradiente, na qual se obteve a melhor condição

cromatográfica para separação dos compostos químicos, foi realizado a

análise cromatográfica nas mesmas condições com os extratos metanólicos

das folhas dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis,

utilizando coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex),

volume de injeção 25 µL, vazão 0,5 mL/ min e detecção em 280 nm. Os

cromatogramas podem ser visualizados na figura 19.

Figura 19: Cromatogramas fingerprint das folhas dos sete genótipos (106-110, 201

e 202) de Lippia gracilis.

Observando os perfis cromatográficos dos sete genótipos (106-110,

201 e 202) expostos na figura 19, é possível perceber que os tempos de

retenção das bandas cromatográficas não são os mesmos quando

comparados com os tempos de retenção do cromatograma da figura 18.

Além disso, as bandas cromatográficas correspondentes aos tempos de


75

retenção 58,91 e 60,00 minutos, presentes no cromatograma da figura 18,

não são visualizados nos cromatogramas da figura 19.

Isto se deve ao fato de que, provavelmente, a mudança de uma

coluna manufaturada hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-

158) para uma coluna comercial hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm,

Phenomenex) e a utilização de outro aparelho de Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência devem ter influenciado a separação dos compostos químicos.

Após as análises, fez-se a seleção do comprimento de onda através

da projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra do genótipo

108 de Lippia gracilis, conforme apresentado na figura 20. O comprimento

de onda de 280 nm foi selecionado por apresentar uma absorção máxima

dos compostos presentes na amostra.

Figura 20: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra das folhas do

genótipo 108 de Lippia gracilis.

Na Figura 22 são apresentados os espectros de UV das principais

bandas cromatográficas, numeradas no cromatograma fingerprint da figura

21, do genótipo 108 de Lippia gracilis.


76

Figura 21: Cromatograma da amostra do genótipo 108 das folhas de Lippia gracilis.

Numeração referente aos picos registrados no espectro de UV-Vis (CLAE-DAD) da figura

22.


77

Figura 22: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD)

correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 20, da amostra do


Na Figura 23 estão apresentados os cromatogramas das folhas dos

sete genótipos de Lippia gracilis realizados em quintuplicata para serem

utilizados na análise quimiométrica.


78

Figura 23: Cromatogramas dos sete genótipos das folhas de Lippia gracilis em

quintuplicata.


79

5.1.3 – Cromatograma fingerprint dos caules de Lippia gracilis

Similarmente ao que foi feito com as análises por CLAE dos genótipos

das folhas de Lippia gracilis, também foram realizados estudos com os

caules com o objetivo da aquisição de um cromatograma fingerprint ou

‘’impressão digital’’ que o caracterizasse quimicamente.

A primeira etapa foi realizar o pré-tratamento dos extratos metanólicos

dos caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202), utilizando a extração

em fase sólida com cartucho C18 da marca JT Baker®, descrito no item 4.5.1.

Em seguida, foi efetuada a análise utilizando as mesmas condições

de eluição gradiente do cromatograma fingerprint das folhas de Lippia

gracilis (figura 21) com o objetivo de conhecer o perfil químico do extrato

metanólico dos caules.

Para essas análises foi empregado o gradiente de eluição linear

constituído pela mistura ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (A) como

solventes em uma coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm,

Phenomenex). Foi variada a concentração do modificador orgânico (ACN) de

15-40% durante 50 min; 40-70% (B) durante 20 min; 70% (B) por 5 min, 70-

15% (B) para o retorno do gradiente, isocrático em 15% (B) para o

recondicioamento da coluna, vazão de 0,5 mL/min, volume de injeção de

25µL e detecção em =280nm. O cromatograma pode ser visualizado na

figura 24 (a).

A análise foi realizada no Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU

(Kyoto, Japão) pertencente ao Departamento de Química da UFS (Sistema

2 – item 4.2.1).


80

Figura 24: Cromatograma (a) extrato metanólico dos caules do genótipo 108 da

Lippia gracilis e (b) extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis.

Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de

HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.=

25µL.

Comparando-se o cromatograma do extrato metanólico das folhas do

genótipo 108, figura 24 (a), com o cromatograma do caule genótipo 108,

figura 24 (b), verifica-se que os perfis cromatográficos apresentam-se de

forma distinta, o que leva a inferir que a os constituintes químicos dos caules

apresentam características mais polares do que os constituintes das folhas,

pois eluíram nos vinte minutos iniciais da corrida cromatográfica.

Essa condição inicial não foi adequada para se obter o cromatograma

fingerprint do caule, pois apresentou co-eluição de algumas bandas

cromatográficas.

Para obtermos uma melhor separação das bandas, diferentes

otimizações de gradiente foram testadas variando somente o percentual do

modificador orgânico (alteração na inclinação do gradiente), como mostrado

na tabela 8 e nas figuras 25.


81

Tabela 8: Condições cromatográficas para otimização do gradiente

com detecção em = 280 nm.


gradiente

(B)

Solventes Coluna

cromatográfica

(15,0 x 0,46 cm)

Vazão

(mL/min)

Vol. de

injeção

(µL)

%B/min

1 15-36% em

60 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 0,35

2 1) 15-25%

em 30 min;

2) 25-40%

em 30 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 1) 0,33

2) 0,50

3 1) 15-25%

em 40 min;

2) 25-40%

em 30 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 1) 0,25

2) 0,50

4 1) 15-23%

em 40 min;

2) 23-38%

em 50 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 1) 0,20

2) 0,30

5 1) 15-23%

em 30 min;

2) 23-40%

em 25 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 1) 0,26

2) 0,68

6 1) 15-25%

em 50 min;

2) 25-40%

em 25 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 1) 0,20

2) 0,60

7 1) 15-20%

em 25 min;

2) 20-23%

em 30 min

3) 23-40%

em 25 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 1) 0,20

2) 0,10

3) 0,68

8 1) 15-20%

em 25 min;

2) 20-40%

em 45 min

ACN:

HCOOH

0,5% (v/v)

Hexil-fenil LUNA®

(Phenomenex)

0,5 25,0 1) 0,20

2) 0,40


82

Figura 25: Cromatogramas para seleção de condições cromatográficos para análise

dos extratos dos caules de Lippia gracilis. Os números correspondem às condições

apresentadas na tabela 8.

Dentre as condições cromatográficas testadas, a condição 8 foi a que

apresentou a separação mais adequada dos constituintes do caule de Lippia

gracilis.

Após a otimização do gradiente na qual se obteve a melhor condição

cromatográfica para separação dos compostos químicos, foi realizado a

análise cromatográfica nas mesmas condições com os extratos metanólicos

dos caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis,

utilizando coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex),

volume de injeção 25 µL, vazão 0,5 mL/ min e detecção em 280 nm. Os

cromatogramas podem ser visualizado na figura 26.


83

Figura 26: Cromatogramas fingerprint dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de

Lippia gracilis.

Após as análises fez-se a seleção do comprimento de onda através

da projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra do genótipo

108 de Lippia gracilis, conforme apresentado na figura 27. O comprimento

de onda de 280 nm foi selecionado por apresentar uma absorção máxima

dos compostos presentes na amostra.

Figura 27: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra dos caules do



84

Na figura 29 são apresentados os espectros de UV das principais

bandas cromatográficas, numeradas no cromatograma fingerprint da figura

28, do genótipo 108 de Lippia gracilis.

Figura 28: Cromatograma da amostra do genótipo 108 dos caules de Lippia gracilis.

Numeração referente aos picos registrados no espectro de UV-Vis da figura 29.


85

Figura 29: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD)

correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 28, da amostra do


Na figura 30 estão apresentados os cromatogramas dos caules dos

sete genótipos de Lippia gracilis realizados em quintuplicata para serem

utilizados na análise quimiométrica.


86

Figura 30: Cromatogramas dos sete genótipos dos caules de Lippia gracilis em

quintuplicata.


87

5.2 - ISOLAMENTO DOS MARCADORES QUÍMICOS

5.2.1 – Fracionamento do extrato das folhas do genótipo 107 de

Lippia gracilis com Amberlite XAD-2

Após a obtenção dos cromatogramas fingerprint dos sete genótipos

de Lippia gracilis iniciou-se a etapa de isolamento dos marcadores químicos.

Havendo a possibilidade de existir flavonóides no extrato, devido à presença

comum destes compostos em espécies do gênero Lippia, optou-se por usar

a resina amberlite XAD-2 por ser um polímero orgânico não-iônico, apolar,

hidrofóbico e muito utilizado no isolamento de compostos fenólicos, como

flavonóides.

Lianda et al. [156], por exemplo, relataram o isolamento de um

flavonol, a morina (47), a partir do fracionamento do mel de Apis melifera em

coluna amberlite XAD-2 com metanol.

47

O

OH

O

HO

OH

HO

OH

Desta forma, o extrato metanólico das folhas do genótipo 107 de

Lippia gracilis foi submetido à cromatografia em coluna com a resina

amberlite XAD-2. Esse extrato foi escolhido por ser um dos genótipos com

maior rendimento para realizar o fracionamento.

Para a cromatografia em coluna com a resina amberlite XAD-2 foram

utilizados 6,0g do extrato metanólico do genótipo 107 das folhas, o qual foi

eluído com 500 mL de MeOH:H2O nas proporções: 5%, 15%, 25%, 35%,

50%, 70%, 85% de MeOH:H2O e 100% MeOH, obtendo-se oito frações que

foram analisados por CLAE-DAD, utilizando uma coluna hexil-fenil LUNA®


88

(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), volume de injeção 25µL, vazão 0,5

mL/min e detecção em 280 nm.

Nas análises das frações foram empregadas as mesmas condições

dos cromatogramas fingerprint das folhas, na qual foi utilizado um sistema

de eluição gradiente de solvente onde a porcentagem de ACN (B) e solução

de HCOOH 0,5%(v/v) (A) variaram de 15% a 40% (B) em 50 min, 40% a

70% (B) em 20 min, obtendo-se os cromatogramas mostrados na figura 31.


89

Figura 31: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5%

MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d) 35% MeOH:H2O; e) 50%

MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85% MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição

gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B)

por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL.

Observando os cromatogramas da figura 31, verifica-se que os

compostos químicos com características polares eluíram nas frações 5%,


90

15%, 25%, 35%, 50% MeOH:H2O e foram detectados na primeira rampa de

eluição gradiente de 15% a 40% de ACN:solução de HCOOH 0,5% (v/v) por

50 min.

A fração 70% MeOH:H2O apresentou compostos químicos que

eluíram em toda a corrida cromatográfica, enquanto que a fração 85%

MeOH:H2O mostrou os compostos de mais baixa polaridade, pois eluíram na

segunda rampa de eluição gradiente de 40% a 70% de ACN: solução de

HCOOH 0,5% (v/v) por 20 min.

É importante mencionar que as clorofilas ficaram retidas na resina

durante quase todo o fracionamento, com exceção do momento em que

MeOH foi adicionado no final, provocando o arraste das clorofilas e, por isso,

impossibilitando a análise desta fração no cromatógafo líquido.

As frações 50% e 85% MeOH:H2O obtidas da coluna com a resina

amberlite XAD-2 foram escolhidas para a análise por CLAE semipreparativa

por apresentarem constituintes polares e de baixa polaridade divididos em

ambas as frações.

5.2.2 – Fracionamento do extrato dos caules do genótipo 107 de

Lippia gracilis com Amberlite XAD-2

Seguindo o mesmo objetivo exposto para o fracionamento do extrato

das folhas de Lippia gracilis, o extrato metanólico dos caules do genótipo

107 também foi submetido à cromatografia em coluna com a resina

amberlite XAD-2 para a obtenção de frações a serem utilizadas no

isolamento dos marcadores químicos.

As oito frações (5%, 15%, 25%, 35%, 50%, 70%, 85% MeOH:H2O e

100% MeOH) obtidas do fracionamento do extrato com a resina foram

analisadas por CLAE-DAD, utilizando uma coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm,

15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), volume de injeção 25µL, vazão 0,5 mL/min e

detecção em 280 nm.


91

As condições utilizadas para a análise foram as mesmas dos

cromatogramas fingerprint dos caules, na qual utilizou um sistema de eluição

gradiente de solvente onde a porcentagem de ACN (B) e solução de

HCOOH 0,5% (v/v) (A) variaram de 15% a 20% (B) em 25 min, 20% a 40%

(B) em 45 min, obtendo-se os cromatogramas da figura 32.


92

Figura 32: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5%

MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d) 35% MeOH:H2O; e) 50%

MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85% MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição

gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B)

por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL.


93

Nos cromatogramas das frações é possível verificar que a eluição dos

compostos químicos ocorreram basicamente nas frações 50%, 70% e 85%

MeOH:H2O.

A etapa de isolamento dos marcadores químicos utilizando as frações

obtidas da coluna amberlite XAD-2 não foi realizado, uma vez que o

rendimento das frações foram insuficientes para serem utilizadas no

isolamento dos compostos químicos.

5.2.3 – CLAE semipreparativa das frações 50% e 85% MeOH:H2O

das folhas de Lippia gracilis

Uma vez conhecidos os perfis cromatográficos das frações 50% e

85% MeOH:H2O, iniciou-se a etapa de isolamento dos marcadores químicos

empregando-se um procedimento cromatográfico (CLAE) em escala

semipreparativa. Para a realização deste estudo, as condições

cromatográficas estabelecidas para a separação analítica foram

escalonados.

O escalonamento tem por finalidade os ajustes dos parâmetros

cromatográficos (diâmetro e comprimento da coluna, fase estacionária

empregada, dimensões das partículas de sílica, vazão) de forma a conseguir

reproduzir em escala preparativa ou semipreparativa os resultados obtidos

em escala analítica.

Desta forma, a transferência do método analítico para o semi-

preparativo foi feito basicamente ajustando as condições em que a coluna

semipreparativa (maior dimensão) seria submetida. Na prática isto significa

ajustar a vazão da fase móvel e a carga que seria injetada por análise

(concentração da amostra) utilizando a fórmula:

S = R2p. Lp : (1,00 cm)2 . 25 cm = 7,87

R2a. La (0,46 cm)2 . 15 cm

Rp : diâmetro das coluna preparativa ou semipreparativa


94

Ra: diâmetro da coluna analítica

Lp: comprimento da coluna preparativa ou semipreparativa

La: comprimento da coluna analítica

S: fator de escalonamento

A vazão a ser utilizada na CLAE semipreparativa foi definida

multiplicando o fator de escalonamento pela vazão utilizado na CLAE

analítica.

Definida a vazão a ser empregada na separação semipreparativa,

iniciou-se o isolamento dos compostos químicos das frações 50% e 85%

MeOH:H2O obtidas da coluna cromatográfica com resina amberlite XAD-2.

A fração 50% MeOH:H2O foi submetida a isolamento dos compostos

químicos utilizando coluna de fase estacionária hexil-fenil LUNA® de 10 µm

(25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), nas seguintes condições: vazão 4 mL/ min,

volume de injeção 100 µL, eluição gradiente no modo reverso utilizando

ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (v/v) (A) de 8% a 40% (B) por 50 min.

A detecção foi acompanhada pelo detector UV-Vis com arranjo de diodos em

280 nm. Em cada análise foram injetados 10 mg/ 100 µL e um total de doze

injeções. Os compostos que eluíram em 20 a 36 minutos foram coletados e

denominados LGRA 1 a LGRA 10, conforme a figura 33.


95

Figura 33: Cromatograma da fração 50% MeOH:H2O para isolamento dos

compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição

gradiente de 8% a 40% de ACN (B) em 50 min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 100 µL,

minj = 10 mg.

As amostras LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9 e LGRA 10 foram

enviadas para análise por Ressonância Magnética Nuclear.

Depois do isolamento dos compostos químicos presentes na fração

50% MeOH:H2O iniciou-se o estudo com a fração 85% MeOH:H2O.

A fração 85% MeOH:H2O foi submetida ao isolamento dos

compostos químicos utilizando coluna de fase estacionária hexil-fenil LUNA®

de 10 µm (25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), nas seguintes condições: vazão 4

mL/ min, volume de injeção 200 µL, eluição gradiente no modo reverso

utilizando ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (v/v) (A) de 35% a 53% (B)

por 15 min. A detecção foi acompanhada pelo detector UV-Vis com arranjo

de diodos em 280 nm. Em cada análise foram injetados 10 mg/ 200 µL e um

total de doze injeções. Os compostos que eluíram em 9 a 14 minutos foram

coletados e denominados LGRA 11 a LGRA 15, figura 34.


96

Figura 34: Cromatograma da fração 85% MeOH:H2O para isolamento dos

compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição

gradiente de 35% a 53% de ACN (B) em 50 min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 200 µL,

minj = 10 mg.

As amostras LGRA 12 e LGRA 13 foram enviadas para análise por

Ressonância Magnética Nuclear.

5.3 – IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL

Sete amostras (LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9, LGRA 10, LGRA

12 e LGRA 13) foram isoladas por CLAE semipreparativa e enviadas para

análise por Ressonância Magnética Nuclear. Destas amostras, somente a

LGRA 12 teve a sua estrutura elucidada e as outras ainda estão em

processo de identificação estrutural.

5.3.1 – Identificação da substância LGRA 12

A substância LGRA 12 foi isolado através de CLAE semipreparativa

da fração 85% MeOH:H2O obtida do fracionamento com resina amberlite

XAD-2 do extrato metanólico das folhas do genótipo 107 de Lippia gracilis. A

substância possui aspecto de cristal e apresenta coloração amarela. A


97

identificação foi baseada na análise dos dados espectrais de RMN 1H e 13C

e por comparação com os dados da literatura [157].

O espectro de RMN 1H e 13C para LGRA 12, realizado em DMSO-d6,

apresentou sinais compatíveis para um flavonóide. Com base nesses

espectros foi possível sugerir a presença da flavanona naringenina (48)

(5,7,4’-triidroxiflavanona).

48

O

O

OH

OH

HO

2

34

5

6

7

8

2'3'

4'

5'

6'9

10

1'

No espectro de RMN 1H (Espectros 1 e 2) foi observado,

primeiramente, a presença de dois singletos em 12,16 (1H) e 8,36 (1H),

que são característicos dos hidrogênios das hidroxilas em C-5 e C-4’,

respectivamente.


98

Espectro 1: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz)


99

Espectro 2: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da

região entre 12,45 ppm e 11,7 ppm.

Ao ampliarmos a região entre 7,60 e 6,37 ppm, espectro 3,

observamos a presença de dois dubletos, um em 7,31 (2H; d; J = 8,53 Hz;

H-2’ e H-6’) e outro em 6,78 (2H; d; J = 8,53 Hz; H-3’ e H-5’) que

comprovam a presença de um anel B para-substituído por uma hidroxila.


100



Em 5,84 foi observado a presença de dois dubletos com um

acoplamento meta (J = 2,04 Hz), atribuídos aos dois hidrogênios aromáticos

pertencentes ao anel A, H-6 e H-8 (Espectro 4).


101



A presença de três duplos dubletos em 5,42 (1H; dd; J = 2,98 e

12,84 Hz), 3,24 (1H; dd; J = 12,84 e 17,10 Hz) e 2,66 (1H; dd; J = 2,98 e

17,10 Hz) indicam a estrutura de uma flavanona, sendo o primeiro duplo

dubleto atribuído ao H-2 e os outros dois duplos dubletos aos hidrogênios H-

3ax e H-3eq do anel C (Espectro 4 e 5).

O O

H3ax

H3eq

H2

Conformação preferida do anel C de flavanonas


102



O esqueleto de uma flavanona foi também confirmado pelo espectro

de 13C (Espectro 6) pelos sinais em C 78,4 (CH), C 41,9 (CH2) e 195,9 (Co)

relativos, respectivamente aos carbonos C-2, C-3 e C-4 do anel C. Os sinais

em C 95,8 (CH) e C 95,0 (CH) são atribuídos aos carbonos C-6 e C-8 do

anel A; C 128,2 (2CH) e C 115,0 (2CH) relativos, respectivamente aos

carbonos C-2’/C-6’ e C-3’/C-5’ do anel B.

O espectro de RMN de 13C também auxiliou na confirmação dos

sinais dos carbonos quarternários em C 195,9 (C=O), 163,4 (C-5), 167,4 (C-

7), 162,8 (C-9), 101,4 (C-10), 128,8 (C-1’) e 157,6 (C-4’).


103

Espectro 6: Espectro de RMN 13

C da amostra LGRA 12 (400 MHz)

Pelos dados acima apresentados, confirma-se para LGRA 12 a

estrutura de uma 5,7,4’-triidroxiflavanona, também conhecida como

naringenina. Os dados de RMN de 1H e 13C são coincidentes com os dados

da literatura [157], apresentados na tabela 9.


104

Tabela 9: Correlações observadas no espectro de RMN 1H e 13C da

substância LGRA 12 e dados da naringenina da literatura [157].

H/C c LGRA 12

(ppm)

H LGRA 12 (ppm)

(mult., int, J=Hz)

c Lit.

(ppm)

H Lit. (ppm)

(mult., int, J=Hz)

2 78,2 5,42 (dd, 1H, 2,98 e

12,84 Hz)

79,0 5,43 (dd, 1H, 4,00 e

13,00 Hz)

3 eq 41,9 2,66 (dd, 1H, 2,98 e

17,10 Hz)

42,6 2,70 (dd, 1H, 2,80 e

17,00 Hz)

3 axial - 3,24 (dd, 1H, 12,84 e

17,10 Hz)

- 3,20 (m, 1H)

4 195,9 - 196,4 -

5 163,4 - 163,7 -

6 95,8 5,84 (d, 2,04 Hz) 96,4 5,88 (s,1H)

7 167,4 166,9

8 95,0 5,84 (d, 2,04 Hz) 95,5 5,88 (s,1H)

9 162,8 - 163,3 -

10 101,4 - 102,3 -

1' 128,8 - 129,4 -

2' 128,2 7,31 (d, 1H, 8,53 Hz) 128,7 7,32 (d, 1H, 9,00 Hz)

3' 115,0 6,78 (d, 1H, 8,53 Hz) 115,7 6,79 (d, 1H, 9,00 Hz)

4' 157,6 - 158,1 -

5' 115,0 6,78 (d, 1H, 8,53 Hz) 115,7 6,79 (d, 1H, 9,00 Hz)

6' 128,2 7,31 (d, 1H,8,53 Hz) 128,7 7,32 (d, 1H, 9,00 Hz)

5-OH - 12,16 (s, 1H) - 12,14 (s, 1H)

7-OH - - - 10,82 (s, 1H)

OH-4’ - 8,36 (s, 1H) - 9,60 (s, 1H)

No gênero Lippia a naringenina foi isolada pela primeira vez na L.

graveolens por Dominguez et al. [111].

Em 2007, Lin et al. [108] relataram a identificação e quantificação da

naringenina e de outros flavonóides do extrato hidroalcoólico da L.

graveolens (70:30 v/v) através da técnica de LC-DAD-ESI/EM.


105

O nosso trabalho traz o primeiro estudo sobre os constituintes fixos da

espécie Lippia gracilis, sendo a naringenina o primeiro composto a ser

identificado nesta espécie.

5.4 - ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA

Como os cromatogramas fingerprint são muito semelhantes, é difícil

identificar diferenças entre as amostras baseando-se em uma simples

análise visual. Desta forma, o emprego de técnicas quimiométricas de

análise multivariada tem auxiliado na interpretação dos resultados obtidos.

A base fundamental da maioria dos métodos modernos para

interpretação de dados multivariados é a Análise de Componentes Principais

– PCA, que consiste numa transformação da matriz de dados originais com

o objetivo de avaliar semelhanças e diferenças entre as amostras pela

projeção das mesmas em gráficos bidimensionais elaborados a partir de

cálculos de novos eixos denominados Componentes Principais (PC’s) [55].

Esta técnica tem sido utilizada com êxito, por exemplo, na

discriminação de espécies vegetais de Phyllanthus, conhecida popularmente

como ‘’quebra-pedra’’. MARTINS et al. [158] empregaram a Análise de

Componentes Principais para interpretar os cromatogramas fingerprint,

obtidos por CLAE-DAD de seis diferentes espécies de Phyllanthus, com o

objetivo de construir um modelo de classificação que pode ser utilizado para

verificar a autenticidade de amostras comerciais de ‘’quebra-pedra’’.

No nosso caso, a utilização desta técnica irá nos auxiliar na

diferenciação dos cromatogramas fingerprint dos extratos das folhas e

caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis obtidos por

CLAE-DAD. Para a análise quimiométrica foram utilizados os dados dos

cromatogramas fngerprint realizados em quintuplicata de cada um dos sete

genótipos com o objetivo de obtermos um maior número de amostras para a

análise. Os cromatogramas podem ser visualizados nas figuras 23 e 30.


106

É importante lembrar que os genótipos 106-110 são provenientes do

estado de Sergipe, município de Tomar do Geru, e os genótipos 201 e 202

são provenientes do estado da Bahia, município de Rio Real. Essas

amostras foram coletadas nestes municípios e cultivadas no Campus Rural

da UFS.

5.4.1 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint das

folhas

Os cromatogramas foram transformados em uma matriz numérica de

dados, contendo 35 linhas (amostras) e 2188 variáveis (tempos de

retenção), que foram alinhados utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised

Warping’’ (COW) [159]. A figura 35 mostra uma parte do cromatograma

antes e após o alinhamento, podendo-se perceber a grande necessidade de

se realizar o alinhamento antes da aplicação da análise quimiométrica.

Figura 35: Parte do cromatograma das folhas: a) antes do alinhamento, b) após o

alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW)

O método de análise exploratória utilizado foi a PCA. Antes de

empregar a PCA foi necessário um pré-processamento dos dados originais.


107

Os métodos de pré-processamento mais utilizados consistem basicamente

em centrar na média ou auto-escalar os dados. Neste caso, os dados foram

centrados na média, isto é, calculou-se a média dos valores experimentais

para cada variável e subtraiu-se cada valor experimental do respectivo valor

médio, o que está representado no gráfico de pré-processamento na figura

36.

Figura 36: Gráfico de pré-processamento centrado na média

Pela Análise dos Componentes Principais observou-se que 93,9% da

variância total dos dados foram explicados nas duas primeiras componentes

principais, tabela 10. A PC1 contém 89,2% e a PC2 contém 4,63% da

variância dos dados originais. As demais PC’s (de 3 a 10) não foram

consideradas para a interpretação de tendências dos dados. A figura 37,

mostra um gráfico da variância explicada em cada PC. Nesta figura pode-se

observar que, a partir da PC2, não há uma variação muito grande da

variância explicada, ou seja, ao se aplicar a PCA, foi possível reduzir a

dimensão dos dados de 2188 para 2 (2PC’s).


108

De acordo com Ferreira et al. [8], a primeira Componente Principal

PC1, tem uma direção tal que descreve o máximo de variabilidade das

amostras, mais que qualquer uma das variáveis originais, como apresentado

na tabela 10 e na figura 37.

Tabela 10: Variância percentual das Componentes Principais

calculadas para os dados da matriz original centrados na média

Componente Principal % de Variância % de Variância Acumulada

PC1 89,2 89,2

PC2 4,63 93,9

PC3 2,04 95,9

PC4 1,15 97,1

PC5 0,91 97,9

PC6 0,53 98,5

PC7 0,45 98,9

PC8 0,34 99,3

PC9 0,24 99,5

PC10 0,16 99,7

Figura 37: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s)


109

Na figura 38 é apresentado o gráfico de escores de PC1 versus PC2.

O gráfico de escores traz informações sobre as amostras. Nesta figura é

possível notar que a PC1 separa as amostras 107 e 201 em valores de

escores positivos, da amostra 108 em valores de escores negativos e as

demais amostras apresentam valores próximos de zero. A PC2 por sua vez

consegue separar as amostras 201 e 202 em valores de escores negativos

das amostras 106, 110 e 107 em valores de escores positivos e as amostras

108 e 109 em valores próximos de zero. Percebe-se que a amostra 109

apresenta valor próximo de zero tanto no eixo da PC1 como PC2.

Figura 38: Gráfico de escores (PC1 versus PC2)

É possível observar a nítida separação das amostras e formação de

grupos coesos para os subtipos 107, 108, 109 e 202; as amostras 106 e 110

não apresentaram distinção entre si, porém se diferenciam das demais

amostras. Essa diferenciação entre as amostras pode ser explicada

observando o gráfico de loading (Figura 39) que demonstra a importância

(peso) que cada variável teve na construção de cada componente principal

e, conseqüentemente, na projeção das amostras pelos escores.


110

Figura 39: Gráfico de loading das folhas de Lippia gracilis

No gráfico de loading (Figura 39) a PC1 está representada pela cor

vermelha e a PC2 pela cor verde. É possível perceber, no gráfico acima, na

PC1 e PC2 algumas bandas cromatográficas que se destacam com valores

de loading positivo e outras com valores de loading negativos. Somente a

PC2 apresenta valores de loadings positivos e negativos, a outra PC só tem

valores positivos.

Os loadings da PC1 apresentam as bandas cromatográficas que

contém maior peso/influência na projeção das amostras, e só contém

variáveis com valores positivos. Sendo assim, as amostras que apresentam

as bandas cromatográficas mais intensas nas regiões com valores positivos

de loadings apresentarão valores positivos nos escores da PC1, como

ocorre com as amostras 107 e 201. Essas bandas cromatográficas

correspondem aos tempos de retenção 15,3; 19,8; 32,3; 33,0; 34,7 e 36,4

minutos (Figura 40).


111

Figura 40: Cromatogramas fingerprint sobrepostos das folhas dos sete genótipos

(106-110, 201 e 202) de Lippia gracillis.

A amostra 108 é muito distinta das demais, pois apresenta valores de

escores negativos e nenhuma banda cromatográfica intensa apresentada no

gráfico de loadings.

Os loadings da PC2 contêm variáveis com valores positivos e

negativos. Sendo assim, as amostras que apresentam as bandas

cromatográficas mais intensas nas regiões com valores negativos de

loadings apresentarão valores negativos nos escores da PC2, como ocorre

com as amostras 201 e 202, que correspondem aos tempos de retenção

30,4; 32,3; 33,0; 36,4; 47,7; 50,5; 55,4; 57,1 e 59,9 minutos. Já as amostras

que apresentam bandas cromatográficas mais intensas nas regiões de

loadings positivos, apresentarão valores positivos nos escores da PC2,

como ocorre com as amostras 106, 107 e 110. Essas bandas

cromatográficas correspondem aos tempos de retenção 15,3; 19,8 e 33,0

minutos, conforme apresentado na figura 40.

As amostras 108 e 109 apresentam variáveis com pesos próximos a

zero, isto significa que estas amostras não apresentam bandas

cromatográficos intensas no gráfico de loadings.


112

Como os valores da PC2 no gráfico de escores são negativos para as

amostras 201 e 202, procedentes do Rio Real (Bahia), e positivos ou

próximos de zero para as amostras 106-110, procedentes de Tomar do Geru

(Sergipe), foi possível através da análise quimiométrica diferenciar os

genótipos pelas suas procedências.

Desta forma, através da análise quimiométrica foi possível diferenciar

os cromatogramas fingerprint dos extratos das folhas dos sete genótipos de

Lippia gracilis e, principalmente, observar a dissimilaridade das amostras

procedentes de Tomar do Geru (106-110) das amostras procedentes do Rio

Real (201 e 202).

5.4.2 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint dos

caules

Os cromatogramas foram convertidos em uma matriz de 35 linhas

(amostras) e 2188 colunas (variáveis: tempos de retenção). Os

cromatogramas foram alinhados utilizando o algoritmo ‘’Correlation

Optimised Warping’’ antes da análise quimiométrica [156]. A figura 41

mostra uma parte do cromatograma antes e após o alinhamento.

Figura 41: Parte do cromatograma dos caules: a) antes do alinhamento, b) após o

alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW)


113

Em seguida, os valores foram submetidos a um pré-processamento.

Como apresentado na figura 42, os dados originais foram centrados na

média.

Figura 42: Gráfico de pré-processamento centrado na média

Pela Análise dos Componentes Principais (PCA), tabela 11,

observou-se que 96,2% da variância dos dados foram explicados nas três

primeiras componentes principais. A PC1 contém cerca de 77,2% da

variância dos dados originais e as PC’s 2 e 3 explicam 12,2% e 6,89%,

respectivamente. A figura 43 mostra um gráfico da variância explicada em

cada PC. Nesta figura pode-se observar que, a partir da PC3, não há uma

quantidade significativa de variância explicada.


114

Tabela 11: Variância percentual das Componentes Principais

calculadas para os dados da matriz original centrados na média.

Componente Principal % de Variância % de Variância Acumulada

PC1 77,2 77,2

PC2 12,2 89,4

PC3 6,89 96,2

PC4 1,96 98,2

PC5 0,68 98,9

PC6 0,35 99,2

PC7 0,29 99,5

PC8 0,15 99,7

PC9 0,12 99,8

Figura 43: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s)

Na figura 44 é apresentado o gráfico de escores de PC1 versus PC3.

Nesta figura é possível visualizar a separação das sete amostras, sendo que

PC1 separa as amostras 201 e 202 em valores de escores negativos das

amostras 106-108 em valores de escores positivos e as amostras 109 e 110

com valores próximos de zero. A PC3, por sua vez, consegue separar as


115

amostras 108, 109 e 110 em valores de escores negativos das amostras

106, 107, 201 e 202 em valores de escores positivos. A projeção das

amostras pode ser explicada analisando o gráfico de loading.

Figura 44: Gráfico de escores (PC1 versus PC3)

O gráfico de loading mostra a importância de cada banda

cromatográfica na projeção e diferenciação das amostras. No gráfico da

figura 45, a PC1 está representada pela cor azul e a PC3 pela cor vermelha.

A análise do gráfico demonstra que na PC1 algumas bandas

cromatográficas se destacam com valores de loading positivos e outras com

valores de loading negativos. A PC3 só apresenta valores de loading

positivos.


116

Figura 45: Gráfico de loading dos caules de Lippia gracilis

Os loadings da PC1 representam as bandas cromatográficas que

contém maior peso/influência na projeção das amostras, e contém variáveis

com valores positivos e negativos. Sendo assim, as amostras que

apresentam as bandas cromatográficas mais intensas nas regiões com

valores negativos de loadings apresentarão valores negativos nos escores

da PC1, como ocorre com as amostras 201 e 202, que corresponde ao

tempo de retenção 34,74 minutos. Já as amostras que apresentam bandas

cromatográficas mais intensas nas regiões de loadings positivos,

apresentarão valores positivos nos escores da PC1, como ocorre com as

amostras 106, 107, 108. Essas bandas cromatográficas correspondem aos

tempos de retenção 21,2; 25,4; 27,7; 36,6 e 62,8 minutos, conforme

apresentado na figura 46.

Os loadings da PC3 contêm variáveis com valores positivos. Sendo

assim, as amostras que apresentam as bandas cromatográficas mais

intensas nas regiões com valores positivos de loadings apresentarão valores

positivos nos escores da PC3, como ocorre com as amostras 106, 107 e


117

201. Essas bandas cromatográficas correspondem aos tempos de retenção

31,6; 36,6; 50,9; 53,9 minutos (Figura 46).

As amostras 108 e 109 apresentam valores de escores negativos e

nenhuma banda cromatográfica intensa apresentada no gráfico de loadings.

Figura 46: Cromatogramas fingerprint sobrepostos dos caules dos sete genótipos

(106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis.

Como os valores da PC1 no gráfico de escores são negativos para as

amostras 201 e 202, procedentes do Rio Real (Bahia), e positivos ou

próximos de zero para as amostras 106-110, procedentes de Tomar do Geru

(Sergipe), foi possível através da análise quimiométrica diferenciar os

genótipos pelas suas procedências.

Desta forma, através da análise quimiométrica foi possível diferenciar

os cromatogramas fingerprint dos extratos dos caules dos sete genótipos de

Lippia gracilis e, assim como nos resultados da análise quimiométrica das

folhas, observar a dissimilaridades entre as amostras procedentes de Tomar

do Geru (106-110) das amostras procedentes do Rio Real (201 e 202).


118

Além disso, estas análises quimiométricas mostraram que os

cromatogramas fingerprint dos caules, quando comparado com as folhas,

apresentaram uma melhor diferenciação entre os genótipos das

procedências, visto que no gráfico de escores (Figura 44) esta diferenciação

se dá pela PC1, a qual apresenta 77,2% da variância dos dados originais.

5.5 – ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA

Para a análise da possível atividade antinociceptiva do extrato

metanólico das folhas de Lippia gracilis (EMLG) realizou-se o teste das

contorções abdominais induzidas por ácido acético a 85%. Este protocolo é

o teste mais utilizado na triagem de substâncias com atividade

antinociceptiva [160].

Neste método, o ácido acético atua indiretamente no fluido do

peritônio, provocando a liberação de mediadores como, por exemplo, PGE2

e PGF2 , que sensibilizam e estimulam as terminações neuronais da região.

Drogas analgésicas, geralmente, reduzem ou até mesmo inibem este

comportamento, assim como antiinflamatórios não esteróides e anti-

histamínicos, o que demonstra a baixa especificidade deste teste [152]. O

tratamento dos animais com EMLG reduziu, de maneira dose dependente, a

resposta nociceptiva quando comparado com o controle, como mostrado na

figura 47.


119

Figura 47: Efeito do EMLG sobre as contorções abdominais induzidas por ácido

acético. Cada valor representa a média ± D.P.M. Os asteriscos denotam a significância

estatística, * p < 0,05 e ** p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.

A fim de verificar qual a via de inibição da nocicepção do EMLG, foi

realizado o teste da formalina, que consiste na estimulação de nociceptores

pela formalina.

Esse protocolo é um modelo de dor persistente que se caracteriza por

apresentar um comportamento bifásico indicativo de dor, sendo que nos

primeiros 5 minutos após a administração, é observada a primeira fase

(Fase 1) pela estimulação direta dos nociceptores; a inibição desta fase é

um indicativo de drogas analgésicas que atuam em nível central.

Após um intervalo de 10 minutos, ocorre a segunda fase (Fase 2) que

dura 20 minutos, caracterizada tanto pelo estímulo dos nociceptores como

pela liberação de mediadores inflamatórios, que encontram a medula

espinhal num estado de hiperexitabilidade, induzida pela fase 1 [153].

O tratamento com o EMLG inibiu a nocicepção mediada por

mecanismos centrais (Fase1), de forma significativa, apenas na dose de

400mg/Kg (p < 0,05), sugerindo uma possível atividade antinociceptiva pela

via central (Figura 48). Na Fase 2, houve uma inibição, de maneira dose

dependente, da resposta nociceptiva (p < 0,001), em todas as doses,


120

demonstrando que este extrato é capaz de inibir a produção de mediadores

inflamatórios, principalmente aqueles derivados da metabolização do ácido

araquidônico (Figura 49) [153, 161].

Figura 48: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 1ª

fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a

significância estatística, * p < 0,05 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.

Figura 49: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 2ª

fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a

significância estatística, * p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.


121

A análise dos constituintes químicos do extrato metanólico das folhas

de Lippia gracilis revelou a presença de um flavonóide, a naringenina. Um

estudo realizado por Fang et al. [162], demonstrou que a naringenina

apresenta atividade antiinflamatória, antioxidante e possui a capacidade de

inibir a proliferação de células cancerosas. Com isso, é possível afirmar que

a presença desse composto no extrato pode estar auxiliando na resposta

antiinflamatória conseguida neste trabalho. Além disso, existe a

possibilidade de outros flavonóides estarem presentes no extrato

contribuindo com essa atividade.

Desta forma, pode-se sugerir que o tratamento com EMLG, nas doses

testadas, apresenta atividade antinociceptiva provavelmente mediada pela

inibição de fatores pró-inflamatórios (via das ciclooxigenase). A presença de

flavonóides presentes no extrato, como a naringenina, pode estar

contribuindo com esse efeito. Outros estudos são requeridos para melhor

compreensão dos mecanismos celulares envolvidos nessa resposta.

122

Capítulo


123

6. CONCLUSÕES

Através das análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

acoplada ao detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) foi possível obter,

pela primeira vez, os cromatogramas fingerprint dos extratos metanólicos

das folhas e caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia

gracilis Schauer.

As análises quimiométricas de PCA foram essenciais para a

diferenciação dos cromatogramas fingerprint das folhas e caules dos sete

genótipos estudados, pois permitiram a separação das amostras conforme

as características apresentadas nos cromatogramas (dados químicos), o que

não seria possível apenas pela análise visual dos cromatogramas, bem

como permitiu a diferenciação dos genótipos das procedências de Tomar de

Geru (106-110) dos genótipos do Rio Real (201 e 202).

Além disso, as análises quimiométricas mostraram que os

cromatogramas fingerprint dos caules apresentaram uma melhor

diferenciação entre os genótipos das procedências.

Como o método analítico desenvolvido por CLAE-DAD mostrou

dissimilaridades entre os cromatogramas fingerprint das folhas e caules dos

sete genótipos, ele pode ser utilizado para o controle de qualidade desta

espécie.

A cromatografia líquida semipreparativa foi útil para o isolamento do

primeiro constituinte fixo das folhas de Lippia gracilis, a 5,7,4’-

triidroxiflavanona conhecida como naringenina, isolada da fração 85%

MeOH:H2O.


124

O extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis

apresentou atividade antinociceptiva através dos testes de contorções

abdominais induzidas por ácido acético e formalina, inédito para esta

espécie.

125

Capítulo


126

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