banco de sangre

INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES

RESPIRATORIAS “ISMAEL COSÍO VILLEGAS”

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICO DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE

FEBRERO, 2008

Código: NCDPT 06 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS

DEL SERVICIO DE BANCO DE SANGRE Rev. 1

INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS

“ISMAEL COSÍO VILLEGAS”

Hoja: 1 De: 129

CONTROL DE EMISIÓN Elaboró: Revisó: Autorizó: Nombre

DR. LUIS MALDONADO NORIEGA C. LILIANA E. MORALES SUAREZ

LIC. MARGARITA S. DEL VALLE CASTILLO

DR. JOSÉ R. VELÁZQUEZ SERRATOS

DR. ENRIQUE BALTAZARES LIPP

Firma Fecha 29/FEBRERO/2008 29/FEBRERO/2008 29/FEBRERO/2008

ÍNDICE

HOJA I. INTRODUCCIÓN 2

II. OBJETIVO DEL MANUAL 3 III. MARCO JURÍDICO 4

IV. PROCEDIMIENTOS 12 1. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BANCO DE SANGRE. 13 2. LAVADO DE MATERIAL 16 3. METODOS PARA OBTENER MUESTRAS DE SANGRE. 21 4. FLEBOTOMIAS DE 500 ML. EN BOLSAS COLECTORAS. 24 5. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS. 26 6. DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS ABO. 34 7. DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS RH. (D) 39 8. PRUEBAS CRUZADAS DE COMPATIBILIDAD. 43 9. IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS IRREGULARES. 48 10. TÉCNICA DEL DESPEGADO DE ANTICUERPOS 62 11. ESTUDIOS OBLIGADOS DE HEMODERIVADOS. 67 12. BRUCELLA. 70 13. DETERMINACION DEL TREPONEMA PALLIDUM 75 14. DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH. 81 15. HEPATITIS VIRAL B 92 16. HEPATITIS C 102 17. IDENTIFICACIÓN DE CHAGAS 112 18. FRACCIONAMIENTO DE SANGRE 120

V. GLOSARIO DE TÉRMINOS 128





Hoja: 2 De: 129







I. INTRODUCCIÓN

El manual de procedimientos técnicos del Servicio de Banco de Sangre integra las políticas y

normas que el personal adscrito a este servicio deberá tomar en cuenta para el buen

desempeño de las actividades.

La integración de este documento ha sido logrado con la participación del titular del mismo y

sancionado por el Departamento de Planeación antes de ser presentado para su aprobación

a la Subdirección de Servicios Auxiliares de Diagnóstico y Paramédicos y posteriormente por

la Dirección Médica.

Este manual deberá ser revisado y actualizado periódicamente según las necesidades del

servicio y/o por cambio en los lineamientos dictados por autoridades superiores.





Hoja: 3 De: 129







II. OBJETIVO DEL MANUAL

• Conducir de forma ordenada el desarrollo de las actividades de servicio de Banco de

Sangre.

• Uniformar criterios en los procedimientos que permitan el correcto desempeño de las

actividades.

• Establecer los mecanismos básicos para contribuir al objetivo institucional del INER.





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III. MARCO JURÍDICO

Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos. D.O.F. 07-IV-06

LEYES

Ley Orgánica de la Administración Pública Federal D.O.F. 02-VI-2006

Ley Federal del Trabajo D.O.F. 17-I-06

Ley Federal de las Entidades Paraestatales D.O.F. 21-VIII-06

Ley de los Institutos Nacionales de Salud D.O.F. 26-V-06 Ref. 22-VI-06

Ley Federal de Responsabilidades Administrativas de los Servidores Públicos D.O.F. 21-VIII-06

Ley Federal de Presupuesto y Responsabilidad Hacendaría D.O.F. 03-05-06





Hoja: 5 De: 129







Ley Federal de Transparencia y Acceso a la Información Pública Gubernamental D.O.F. 06-06-2006

Ley General de Salud D.O.F. 19-IX-2006

Ley Federal de los Trabajadores al Servicio del Estado Reglamentaria del apartado B del Artículo 123 Constitucional D.O.F. 03-V-06

Ley de Información, Estadística y Geografía D.O.F. 27-12-2006

Ley de Amparo, Reglamentaria de los artículos 103 y 107 de la Constitución Política de los Estados Unidos Mexicanos D.O.F. 24-IV-06

Ley Federal para la Administración y Enajenación de Bienes del Sector Público D.O.F. 23-II-05

Ley de Planeación D.O.F. 13-VI-06





Hoja: 6 De: 129







REGLAMENTOS

Reglamento de la Secretaria de Salud D.O.F. 12-I-04

Reglamento de la Ley Federal de Presupuesto y Responsabilidad Hacendaría D.O.F. 28-VI-06.

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Prestación de Servicios de Atención Médica. D.O.F. 14-V-1986

Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud. D.O.F. 16-I-1987.

Reglamento General de Seguridad Radiológica. D.O.F. 22-XI-1988, Aclaración: D.O.F. 14-XII-1988

Reglamento de la Ley de Información, Estadística y Geografía D.O.F. 24-03-2004

Reglamento de la Ley Federal de Entidades Paraestatales D.O.F. 26-I-1990, Ref. D.O.F. 7-IV-1995





Hoja: 7 De: 129







Reglamento para la Protección de los No Fumadores en el Distrito Federal D.O.F. 6-VIII-1990.

Reglamento Interior de la Secretaría de Salud D.O.F. 6-VIII-1997, Ref. D.O.F. 4-VIII-1999

Reglamento de Insumos para la Salud D.O.F. 4-II-1998

Reglamento de Procedimientos para la Atención de Quejas de la Comisión Nacional de Arbitraje Médico D.O.F. 29-IV-1999

Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios D.O.F. 9-VIII-1999

Reglamento sobre consumo de tabaco D.O.F. 27-VII-01

CONVENIOS

Convenio relativo a las Estadísticas de las causas de defunción D.O.F. 23-II-1938 Decreto de Promulgación y Protocolo de firma.





Hoja: 8 De: 129







DECRETOS

Decreto por el que se da a conocer la forma oficial de los certificados de defunción y muerte fetal D.O.F. 21-XI-1986

Decreto del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias D.O.F. 4-VIII-1988

Decreto por el que se da a conocer en forma oficial el nombre del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Cosío Villegas D.O.F. 22-VI-2006

Decreto por el que se establece la Cartilla Nacional de Salud de la Mujer D.O.F. 6-III-1998

PROGRAMAS

Plan Nacional de Desarrollo 2007-2012

ACUERDOS DEL EJECUTIVO FEDERAL Acuerdo por el que se dispone que el Archivo General de la Nación será la entidad central y de consulta del Ejecutivo Federal en el manejo de los archivos administrativos e históricos de la Administración Pública Federal D.O.F. 14-VIII-1978





Hoja: 9 De: 129







Acuerdo número 71 por el que se crea el Sistema de Capacitación y Desarrollo del Sector Salud D.O.F. 20-IV-1987

Acuerdo número 79 relativo a la aplicación, instrumentación y actualización del manual para la referencia y contrarreferencia de pacientes y envío de muestras y especimenes

CODIGOS

Código civil para el Distrito Federal en materia común y para toda la República en materia federal D.O.F. 26-V-1928 y sus reformas.

Código Federal de Procedimientos Civiles D.O.F. 24-II-1943

NORMAS OFICIALES

Norma Oficial Mexicana NOM-168-SSA1-1998 del expediente clínico D.O.F. 14-IX-1999

Norma Oficinal Mexicana para la Práctica de la Anestesiología NOM-170-SSA1-1998 D.O.F. 1-VII-1994





Hoja: 10 De: 129







Norma Oficial Mexicana NOM-019-SCFI-1993. Seguridad de equipo de procesamiento de datos D.O.F. 20-X-1993

Resolución por la que se modifica la Norma Oficial Mexicana NOM-168-SSA1-1998 del expediente clínico D.O.F 22-08-2003

Norma Oficial Mexicana NOM-017-STPS-1993, Relativa al equipo de protección personal para los trabajadores en los centros de trabajo D.O.F. 24-V-1994 y sus reformas

Norma Oficial Mexicana NOM-002-STPS-1994 relativa a las condiciones de seguridad para la prevención y protección contra incendio en los centros de trabajo D.O.F. 20-VII-1994 y su aclaración

Norma Oficial Mexicana NOM-019-SCFI-1994 Seguridad de equipo de procesamiento de datos D.O.F.27-III y su aclaración.

Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSAS2-1993, para la prevención y control de la infección por virus de la inmunodeficiencia humana D.O.17-I-1997





Hoja: 11 De: 129







Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-040-SSA2-2003 en materia de información en salud D.O.F. 04-03-2004

OTRAS DISPOSICIONES ADMINISTRATIVAS Oficio circular que fija las normas a que se sujetará la administración de los bienes muebles y el manejo de almacenes D.O.F. 21-VI-1988

LINEAMIENTOS Lineamientos Generales para la organización y conservación de archivos de las dependencias y entidades de la Administración Pública Federal D.O.F. 20-02-2004

Lineamientos Generales para la clasificación y desclasificación de la información de las dependencias y entidades de la Administración Pública Federal D.O.F. 18-08-2003





Hoja: 12 De: 129







IV. PROCEDIMIENTOS

Código : NCDPT 06 MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS


1. Medidas de Seguridad en el Laboratorio de Banco de Sangre

Hoja: 13 De: 129







1. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BANCO DE SANGRE




Hoja: 14 De: 129







MEDIDAS GENERALES

1. Usar bata.

2. Utilizar guantes cuando se maneja sangre y otros líquidos corporales.

3. Lavarse las manos con los guantes puestos y otra vez al quitárselos, e inmediatamente

después del contacto de la piel sana con productos contaminados.

4. Se deben identificar con una etiqueta especial todos los productos que pudieran estar

contaminados.

5. Evitar punciones con agujas u objetos punzocortantes.

6. No reinstalar el protector en la aguja después de haberla autorizado, depositarla en un

recipiente rígido.

7. No pipetear con la boca, utilizar perilla o pipeta manual.

8. No maquillarse en el área de laboratorio.

9. No correr, comer, fumar o llevarse objetos a la boca en el laboratorio.

10. El material contaminado (jeringas, agujas, cajas de Petri, toallas de papel, etc.) previamente

identificado con la etiqueta específica, se deberá depositar en un contenedor para ser

desechado.




Hoja: 15 De: 129







MEDIDAS PARA LIMPIAR LIQUIDOS CORPORALES

Los líquidos corporales que se hayan derramado en superficies inertes (mesa, lavabo, etc.) deben

ser limpiados como sigue:

1. La secreción o líquido corporal que se haya derramado deberá diluirse con desinfectante (de

preferencia hipoclorito de sodio concentrado).

2. Se debe retirar la secreción diluida con desinfectante.

3. Limpiar escrupulosamente con un trapo humedecido, de preferencia en hipoclorito diluido del

0.5% al 1% en caso de utilizar alcohol deberá limpiarse varias veces, dado que éste se

evapora rápidamente.

4. Utilizar guantes gruesos durante todo el procedimiento.

MANEJO DEL MATERIAL CONTAMINADO

1. Sumergir el material contaminado en desinfectante químico (por ejemplo en hipoclorito de

sodio diluido del 0.5% al 1%, por lo menos durante media hora).

2. Lavar cuidadosamente el material con agua y jabón utilizando guantes gruesos para retirar

todas las partículas orgánicas.

3. Someter el material al método de esterilización o desinfección seleccionado.



2. Lavado de material Hoja: 16 De: 129







2. LAVADO DE MATERIAL










LAVADO DE MATERIAL La limpieza escrupulosa e impecable del material que se utiliza en el banco de sangre es

fundamental, ya que la presencia de restos de jabón o proteína en el material puede dar resultados

falsos negativos, tanto en pruebas de escrutinios a donadores como en pruebas de escrutinio a

donadores como en pruebas de inmunohematología y control de calidad, con la consecuencia fatal

par la vida de los pacientes.

Por esto tenemos que valorar que el trabajo de servicios básicos es vital para obtener resultados

confiables aunque este personal no se encuentre aparentemente tan cerca del paciente.

A Continuación se presenta en forma de gráficas de flujo los pasos fundamentales del lavado de

material y su control de calidad.




CONTROL DE EMISIÓN

MATERIAL GENERAL

Remojo en agua más cloro comercial para

obtener una dilución final del 2%

Cepillado con escobillón adecuado al tamaño de material al chorro del

agua aproximadamente 6 veces .

Verificación visual de la limpieza.

Clasificación por tamaños y clase de

material en cubetas de acero inoxidable .

Remojar en detergente de Ph neutro al 2% calentar sin llegar a

ebullición.

Reposo 12 horas .

INICIO

Reposo 12 horas .

15 enjuagues a chorro de agua corriente .

15 enjuagues a chorro de agua corriente .

Hervir con agua bidestilada 15 a 20

minutos .

Clasificación en canastillas .

Secado en horno a 200ºC durante 2 horas .

Control de calidad .

Material listo para su uso.

FIN

Elaboró: Revisó: Autorizó: Nombre









CONTROL DE EMISIÓN

MATERIAL LIBRE DE HIERRO

INICIO

Remojo en HCL 1N, durante 4 horas .

Enjuague con agua bidestilada

desmineralizada de Fe .

Deposito en cubetas plásticas y secado a

temperatura ambiente y cubierto con gasa .

FIN

CONTROL DE CALIDAD

a. Observar la presencia de residuos o manchas dentro y fuera del material.

b. Comprobar la eliminación de detergente y agentes limpiadores, agregando una

gota de solución indicadora y gah.










CONTROL DE EMISIÓN

Jabón líquido neutro .

Ph por lote o por cambio de marca.

Agua bidestilada

Ph y conductividad mensual previo

enjuague y último enjuague .

Prueba de consumo de GAH

Diario materialListo para su uso .

Prueba de fenolftaleina

Diario materialListo para su uso .

PRODUCTO LOTE Y MARCA

CADUCA PH GAH FENOLFTALEINA









3. Métodos para obtener muestras de sangre Hoja: 21 De: 129







3. MÉTODOS PARA OBTENER MUESTRAS DE SANGRE










Extracción Capilar: Se utiliza fundamentalmente en recién nacidos e infantes, para obtener volúmenes pequeños de

sangre.

El sitio de elección en el recién nacido suele ser el talón, mientras que en niños más grandes y en

adultos, se recomienda el pulpejo del dedo o en lóbulo de la oreja.

Técnica: Se desinfecta la superficie elegida para la punción con una torunda de algodón empapada en una

solución de alcohol yodado, alcohol etílico o éter (de ser necesario calentar ligeramente la zona

para evitar la vasoconstricción y favorecer la vasodilatación).

Mediante un movimiento rápido y seguro, dar un pinchazo con una lanceta estéril, enjuagando la

primera gota de sangre, para después colectar las siguientes en una pipeta o tubo capilar

heparinizado, sin realizar presión.

Extracciones venenosas: Proporcionan de forma sencilla volúmenes suficientes de sangre. Los lugares habituales de

extracción son de las venas del pliegue del codo.










Técnica:

Después de colocar un torniquete, se procede a desinfectar la superficie cutánea, realizándose la

punción con una aguja hipodérmica montada en una jeringa de plástico se va tirando lentamente

del émbolo, hasta obtener la cantidad necesaria de sangre, posteriormente se retira primero el

torniquete y después la aguja.

Actualmente se emplea también el sistema Vacutainer, cuya modificación consiste en que la

aguja tiene doble punta, una en cada extremo, se introduce una de ellas a la vena y la otra está

montada en un soporte de plástico, en el cual se introduce un tubo de ensaye al vacío con tapón

de plástico, de manera que al empujarlo sea perforado por el otro extremo de la aguja y mediante

el vacío, la sangre penetre libremente al tubo. La ventaja de esta técnica consiste en que es

posible la toma sucesiva de varios volúmenes de sangre en diferentes tubos, a partir de un mismo

paciente, en una sola punción.



4. Flebotomías de 500 ml en bolsas colectoras Hoja: 24 De: 129







4. FLEBOTOMÍAS DE 500ML. EN BOLSAS COLECTORAS



4. Flebotomías de 500 ml en bolsas colectoras Hoja: 25 De: 129







1. No usar ninguna bolsa si la solución anticoagulante no está transparente.

2. Identificar la unidad con el paciente.

3. Colocar un torniquete unos tres centímetros por arriba del pliegue del brazo; palpar bien la

vena.

4. Se procede a desinfectar la superficie cutánea con torundas con jabón quirúrgico, isodine

o alcohol.

5. Tomar la bolsa colectora y pinzar el tubo piloto para evitar la entrada de aire contaminado,

una vez hecho esto, se quita el protector de la aguja en forma vertical y se realiza la

punción en el área desinfectada, dar posición y fijar la aguja con una tela adhesiva,

despinzar el tubo piloto para que fluya la sangre hacia la bolsa colectora.

6. Homogenizar el conservador de la bolsa colectora con la sangre.

7. Pesar la bolsa y una vez que tenga el volumen adecuado (para el caso de Baxter, triple

ACD, 630 grs.), pinzar la bolsa por el tubo colector y quitar el torniquete al paciente, retirar

la aguja y colocar una torunda con alcohol en el sitio donde se puncionó, indicar al

paciente que doble el brazo y lo mantenga así por 15 minutos.

8. Dirigir la sangre dentro del tubo colector hacia la bolsa, con la pinza rodillo. mezclar y

permitir que el tubo se llene nuevamente. Sellar las marcas “X“ sobre el tubo colector

colector con un sellador dieléctrico para preparar alicuotas numeradas de sangre

anticoagulada para tipificación o pruebas cruzadas.



5. Control de calidad de reactivos Hoja: 26 De: 129







5. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS










Los reactivos que se utilizan en el Banco de Sangre deben controlarse cotidianamente con

células y sueros testigos antes de efectuar cualquier prueba como son: grupos sanguíneos o

pruebas cruzadas, etc. Para dicho control es ideal usar células y sueros testigos enviados por el

Banco Central de Sangre. Este control consiste en enfrentar los antisueros con células control

conocidas, y los parámetros a evaluar son especificidad, avidez y potencia.

Material:

• Tubos 10x75, pipetas pasteur, gradillas.

• Sueros anti-A, anti-AB, anti-B, leticinas anti-A, anti-H, anti-D (Rho), Suero de coombs,

albúmina bovina.

• Células conocidas A1, A2, B, O. al 3%.

• Células sensibilizadas con anti-D al 3%.

• Células no sensibilizadas al 3%.

• Células R1r y rr al 3%.










Método: A) Para control de sueros ABO, leticinas anti-A, anti-H.

1. Colocar tres series de cuatro tubos de 10x75 en una gradilla.

2. A la primera serie adicionar 2 gotas de suero anti- A, a la segunda serie 2 gotas de anti-AB,

a la tercera serie 2 gotas de suero anti-B.

3. - Adicionar una gota de células, A1, A2, B, O, a los tubos de cada serie (Ver fig. 1).

4. Homogenizar y centrifugar 30 seg. A 3000 rpm

5. Leer y reportar en “hoja de control de calidad de reactivos” (INER-BS-06).

B) Control de Lectinas Anti A1 y Anti H

1. Colocar dos series de dos tubos de 10x75 en una gradilla.

2. Adicionar una gota de anti-A a cada tubo de la primera serie.

3. Adicionar una gota de anti-H a cada tubo de la segunda serie.

4. Adicionar una gota de células A1 al primer tubo de las dos series.

5. Adicionar una gota de células A2 al segundo tubo de las dos series.

6. Homogenizar y centrifugar a 3000 rpm. (Ver figura 2).

7. Leer y reportar en formato INER-BS-06.




CONTROL DE EMISIÓN

FIGURA 1 CONTROL DE CALIDAD DE SUELOS ABO A1 A2 B O

FIGURA 2 CONTROL DE CALIDAD DE LECTINAS A1 A2

FIGURA3 CONTROL DE CALIDAD DE ANTI-D Y ALBUMINA Rir rr
















A) Para control de Anti-D y albúmina.

1. Colocar dos series de dos tubos de 10x75 mm. en una gradilla.

2. A la primera serie, adicionar una gota de reactivo Anti-D (Rho).

3. Ala segunda serie adicionar dos gotas de albúmina al 33% (auto T).

4. Al primer tubo de cada serie, adicionar una gota de células R1 al 5%.

5. Al segundo tubo de cada serie, adicionar una gota de células rr al 5%.

6. Homogenizar, centrifugar a 3000 rpm durante 90 segundos, leer y reportar en la forma BS-

06 (Figura 3).

7. Para control de sueros de Coombs. (antiglobulina humana)

8. Preparar diluciones del suero de Coombs al doble de la siguiente manera:

9. Numerar tres series de tubos de 10x75 mm. o de 12x75 mm. de la siguiente manera.




CONTROL DE EMISIÓN

Fig. 4

FILA 1 2 3 4 5 6 7 8 9
















Fila S. A. H.: (Suero Antiglobulina Humana)

1. Coloque en los tubos No. 1 y 2, 6 gotas de suero de Coombs. (Fig. 4), los reactivos

serán utilizados de acuerdo al fabricante.

2. Coloque en el tubo No. 9, 6 gotas de solución salina.

3. A partir del tubo No. 2, de la primera serie hasta el No. 8, colocar 6 gotas de solución

salina

4. Mezcle el contenido del tubo No. 2 y pase 6 gotas al tubo No. 3 y así sucesivamente

hasta el número 8 de donde se descartan 6 gotas.

5. Del tubo No. 8, pasar con una pipeta limpia 2 gotas de los tubos 8 C. S. y 8 N. S.

6. Saque la pipeta

7. Pase del tubo No. 7, 2 gotas a los tubos 7 CS y 7NS, y del No. 6, a los tubos 6 CS, 6 NS

y así sucesivamente hasta los tubos No. 2 CS Y 2 NS.

8. Con otra pipeta, pase del tubo, No. 1, 2 gotas de suero de Coombs a los tubos (de la

serie 1) 1CS y 1CNS.

9. Cambie de pipeta y coloque del tubo NO. 9, 2 gotas de solución salina a los tubos de la

serie 9.

10. Agregue a la fila CS, una gota de eritrocitos sensibilizados al 3% a todos los tubos.

11. Una gota de eritrocitos no sensibilizados a la fila CNS.

12. Mezcle cuidadosamente.

13. Centrifugar a 3000 rpm. Durante 30 segundos.

14. Leer y reportar en formato BS-06.










Reportar

Titulo Computo

Donde 4+ = 10 puntos 3+ = 8 puntos 2+ = 5 puntos 1+ = 3 puntos G = 1 puntos



6. Determinación de grupos sanguíneos ABO Hoja: 34 De: 129







6. DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS ABO










1. Fundamento: Los grupos sanguíneos son sustancias antigénicas que se encuentran en

membrana eritrocitaria.

En la actualidad se han descrito más de 400 antígenos de diferentes sistemas de grupos

sanguíneos en la membrana eritrocitaria.

Es de primordial importancia la determinación de la presencia o ausencia de los antígenos del

sistema A B O, ya que en este sistema se encuentran de manera natural anticuerpos antitéticos a

los antígenos eritrocitarios.

Por lo anterior debemos entender que una determinación correcta de grupos sanguíneos debe

constar de:

Grupo Directo: Determinación de los antígenos eritrocitarios con antisueros conocidos, Anti-A,

Anti-AB, Anti-B.

Grupo Inverso: Determinación de anticuerpos antitéticos, con células de fenotipo conocido, A1,

A2, B, O.

TECNICA EN TUBO

Material:

• Sueros hemoclasificadores Anti-A, Anti-AB.

• Eritrocitos de fenotipo conocido, A1, A2, B, O, suspendidos al 5%.










• Tubos de vidrio de 10x75 mm, Pipetas Pasteur, Centrífugas serológicas, Centrífugas

clínicas.

• Gradillas, soluciones fisiológicas. (Salina al 0.9%)

Material Biológico:

(-7) ml. De sangre venosa del paciente sin anticoagulante.

Método:

1. Extraer la sangre por punción venenosa y colectarla en un tubo de 13x10 sin anticoagulante,

dejar que se coagule.

2. Retraer cuidadosamente el coágulo y centrifugar la muestra a 3000 rpm. Durante 5 minutos

para separara el suero de los eritrocitos.

3. Colocar en una gradilla 8 tubos en sentido horizontal y colocar 2 gotas de antisueros Anti-A,

Anti-AB, y Anti-B en los primeros tres tubos (grupo directo), el cuarto tubo autotestigo AT.

4. Adicionar una gota de eritrocitos al 5% conocidos A1, A2, B, O, en los siguientes cuatro tubos,

(grupo inverso)

5. Con la misma pipeta tomar de la muestra del suero sobrenadante de la muestra problema y

colocar dos gotas en los tubos A1, A2, B, O, (grupo inverso) y en el tubo número 4 autotestigo

(AT) fig. 5










6. Con la misma pipeta preparar una suspensión al 5% de eritrocitos problema con su propio

suero o con solución salina fisiológica.

7. Adicionar una gota de esta suspensión en los primeros cuatro tubos Anti-A, Anti-AB, Anti-B, y

Auto T.

8. Homogenizar suavemente los tubos y centrifugar a 3000 rpm durante 30 segundos.

9. Leer aglutinación y/o hemólisis.

4+ - Botón compacto.

3+ - Botón con Gránulos satélites.

2+ - Gránulos separados.

1+ - Gránulos separados más pequeños.

(+) - Gránulos más pequeños.

G - Gránulos muy pequeños.

Prueba Directa Prueba Indirecta (inversa)

Anti A Anti AB Anti B AT A1 A2 B O Gpo

Sanguíneo

+ + - - - - + - A - + + - + + - - B - - - - + + + - O + + + - - - - - AB




CONTROL DE EMISIÓN

DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO ABO ESTUDIO EN ERITROCITO ESTUDIO EN SUERO RESULTADO (PRUEBA DIRECTA) (PRUEBA INVERSA) (GRUPO) ANTI ANTI ANTI AUTO CEL CEL CEL CEL A AB B T A1 A2 B O

“A”

“B”

“O”

“AB”









7. Determinación de grupos sanguíneos RH (D) Hoja: 39 De: 129







7. DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS RH (D)










El siguiente sistema sanguíneo en importancia por su frecuencia en la población mundial es el

sistema Rh-Hr, el cual consta de más de 40 antígenos eritrocitarios de los cuales el mosaico

CcDEe, reviste mayor importancia. Dentro de estos, el antígeno D (Rho) tiene relevancia porque

éste nos permite clasificar a los individuos en Rh positivos cuando esta presente, y Rh negativos

cuando está ausente. Una mala tipificación de este antígeno nos podría provocar una

sensibilización en un individuo Rh negativo y la probabilidad de que esté antígeno provoque una

respuesta de anticuerpo es muy alta, esté antígeno también ha sido asociado con mayor

frecuencia en la enfermedad hemolítica del recién nacido.

Material y Equipo:

• Tubos de 10 x 75 mm.

• Gradillas

• Pipetas Pasteur

• Aplicadores de madera

• Solución fisiológica

• Centrifuga sexológica

• Centrifuga clínica

• Suero Anti D (Rho)

• Control albuminoso


• 7 ml. De sangre venosa sin anticoagulante.










Método:

1. Centrifugar la muestra problema a 3000 rpm.

2. hacer suspensión al 3% de eritrocitos problema con el mismo suero del paciente.

3. Colocar dos tubos de 10 x 75 mm en una gradilla.

4. Al primer tubo debidamente rotulado (D), adicionar una gota de reactivo anti D (Rho) ver fig. 6.

5. Al segundo tubo agregar 2 gotas de control albuminoso (AT).

6. Adicionar a ambos tubos una gota de la suspensión preparada en el punto 2.

7. Homogenizar ambos tubos (D) y /AT) y centrifugar a 3000 rpm, durante 90 segundos.

8. Agitar el tubo suavemente para resuspender el botón formado, observar si existe aglutinación.

9. Anote sus resultados.

10. Si obtiene una prueba negativa, realizar la prueba “D” para descartar esta variable.

Variante D débil

Antes llamado Du. A todas las muestras que den negativos o un positivo muy dudoso, se le debe

realizar la prueba de la antiglobulina humana.

1. Agregue una gota de AntiD en un tubo debidamente marcado.

2. Agregar una gota de suspensión al 3% de eritrocitos problema.

3. Mezclar, e incubar el tubo a una temperatura de 37º por 15 minutos, centrifugar a 3000

rpm por 90 seg. Leer.

4. Si el resultado anterior es negativo, lavar 3 veces con solución salina.

5. Agregar suero de Coombs, homogeneizar, centrifugar a 3000 rpm. Leer.

6. Agregar una gota de eritrocitos sensibilizados al 3% para observar el consumo.

7. Reportar en la forma de grupo sanguíneo.




CONTROL DE EMISIÓN

DETERMINACION DE Rho (D) Figura 6

Muestra sin

Anticoagulante

Anti- D Auto testigo Albuminoso

Rh Positivo Rh Negativo Rh Negativo Rh Positivo

(+) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+)









8. Pruebas cruzadas de compatibilidad Hoja: 43 De: 129







8. PRUEBAS CRUZADAS DE COMPATIBILIDAD










Fundamento:

El objeto de las pruebas cruzadas de compatibilidad, es investigar anticuerpos específicos activos

a 37° C en el suero del paciente contra los eritrocitos del donador y viceversa.

La Prueba Cruzada se divide en tres partes:

1. Prueba mayor.- Que contiene el suero del paciente y eritrocitos del donador (D).

2. Prueba menor.- Que contiene el suero del donador y los eritrocitos del paciente. (R).

3. El autotestigo.- Que contiene el suero y eritrocitos del paciente (AT).

Material:

• Tubos de 13x100 mm

• Tubos de 10x75 mm

• Solución salina isotónica (0.9%).

• Suero antiglobulina humana (AGH, “suero de Coombs”).

• Albúmina bovina al 22%.

• Baño maría para incubación a 37°C


• Sangre del donador.

• -Todas las bolsas de sangre para transfusión, llevan segmentos de tubos de plástico (pilotos)

de la sangre que esté en la bolsa, (sangre anticoagulada con ACD ó CPDA).










Sangre del Receptor:

De 5 a 10 ml de sangre fresca sin anticoagulante en un tubo rotulado con nombre completo del

enfermo, expediente, fecha, edad, pabellón, cama y hora de extracción.

TÉCNICA

Preparación:

• Centrifugar el tubo del receptor 5 minutos a 3500 rpm., para separar completamente el suero

de los eritrocitos del coagulo.

• Deben de anotarse los datos completos del paciente en la hoja de reporte y anotar sus

resultados como se indicará mas adelante y separar el suero en un tubo rotulado con los

datos del paciente como se indicó anteriormente.

• Cortar un segmento del tubo “piloto” de la bolsa de sangre, pasar todo el contenido de 12x75

mm. y centrifugarlo a 3500 rpm durante tres minutos, este tubo contiene plasma y eritrocitos

del donador.

• Colocar las 2 o 3 gotas de sangre remanente del tubo piloto en otro tubo de 12x75 mm. y

adicionar la solución salina.

• Realizar tres lavados por un tiempo de tres minutos a 3000 rpm. Decantando y volviendo a

centrifugar.

• Después de los lavados, hacer una solución de eritrocitos al 5% con solución salina. (Este

tubo contiene eritrocitos “lavados” de la sangre del donador)

• Colocar en una gradilla 3 tubos de 10x75 mm previamente rotulados como se indica en la

figura No. 7.




CONTROL DE EMISIÓN

Receptor Donador

Solución de eritrocitos

al 5%.

Prueba Mayor

(D) Menor

(R)

Prueba (T)

Autotestigo

Figura 7.

• Con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de suero del paciente. En el tubo de prueba mayor

(D), una gota de eritrocitos del donador previamente lavados.

• Con otra pipeta Pasteur, colocar 2 gotas de suero o plasma del donador y una gota de

células o eritrocitos del paciente en el tubo de la prueba menor (R).

• Colocar con una pipeta en el tubo del autotestigo (T), dos gotas de suero del paciente y una

gota de eritrocitos del mismo (paciente).

• Mezclar perfectamente el contenido de los tubos. Centrifugar durante 30 segundos a 3400

rpm.

• Leer y reportar en la hoja de anotaciones (SR) salina rápida.
















• Si en algunos de los tubos (D. R. A. T.) se observa hemólisis o aglutinación, debe

rectificarse de inmediato el grupo sanguíneo, tanto del donador como del receptor.

• Si las lecturas son negativas, continuar con el procedimiento e incubar los tubos (D. R. A.T.)

en el baño maría a 37°C durante una hora (checar la temperatura cada 5 o 10 minutos).

• Una vez terminada la incubación, centrifugue rápidamente todos los tubos durante 30

segundos a 3400 RPM.

• Leer y reportar los resultados en la hoja de reporte BS-7, BS-5, (Pruebas Cruzadas).

• Si se observa aglutinación o hemólisis, la prueba es incompatible, si el resultado es

negativo:

• Lavar los tubos tres veces con solución salina: decantando y secando después de cada

centrifugación (tiempo de centrifugación, 3 minutos a 3400 RPM).

• Resuspender suavemente el botón (agitando el tubo).

• Agregar a cada tubo, 1 gota de suero de Coombs (AGH), mezclar y centrifugar durante 30

segundos a 3400 RPM.

• Leer los resultados y anotarlo en la hoja de reporte (S/C).

• Si se observa aglutinación la prueba es incompatible, si es negativa:

• Adicionar 1 gota de células sensibilizadas, centrifugar durante 30 segundos a 3400 RPM.

• Leer y reportar en la hoja de reporte (CONS)



9. Identificación de cuerpos irregulares Hoja: 48 De: 129







9. IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS IRREGULARES










La detección de un anticuerpo y su identificación constituyen una de las prácticas más

importantes en el campo de la inmunohematologia.

Se le llama anticuerpo irregular porque en contraste con los anticuerpos del sistema ABO, el cual

se encuentra regularmente en todos los individuos sanos, estos anticuerpos solo se encuentran

en algunos. La incidencia de estos anticuerpos irregulares se ha calculado entre un 0.3 a2%,

dependiendo del grupo de individuos examinados y de las técnicas utilizadas para la

investigación.

La investigación de anticuerpos irregulares nos sirve para:

1. Aclarar discrepancias séricas en el sistema ABO.

2. En mujeres embarazadas, para detectar anticuerpos que puedan causar enfermedad

hemolítica del recién nacido o discrepancias en la prueba cruzada para el momento del

parto, en caso de que la paciente requiera ser trasfundida.

3. En el estudio de reacciones hemolíticas transfusionales.

4. En el estudio de anemias hemolíticas auto inmunes.

Por lo tanto los anticuerpos irregulares sen encuentran como hemolizantes, aglutinantes y

sensibilizantes.

Aquellos anticuerpos llamados irregulares como Lea , Anti P, Anti M, no están relacionados ni con

transfusiones, ni con embarazos, en cambio los llamados irregulares inmunes como el anti D, anti

C, anti F, sí lo están.










La presencia de anticuerpos irregulares se evidencian a diferentes temperaturas in Vitro y pueden

requerir para su observación, substancias que favorezcan su demostración como: medios de alta

concentración proteica, medios enzimáticos, de baja fuerza iónica, con la prueba de la

antiglobulina indirecta o suero de Coombs.

La albúmina ha sido usada para potenciar la aglutinación de los glóbulos rojos por anticuerpos de

la clase IgG. Las soluciones de fuerza iónica baja (LISS) acortan el tiempo de incubación e

incrementan la captación de anticuerpos.

La utilización de substancias que contengan enzimas, son útiles para potenciar la reactividad de

algunos anticuerpos como los pertenecientes a los sistemas Rh, Lewis, Kidd; pero las enzimas

también modifican o destruyen otros antígenos como: MNS, Duffy Pr, Xga , Yta, Csa y Cha,

propiedad que facilita la identificación de los correspondientes anticuerpos.

La observación de la reacción antígeno anticuerpos se lleva a cabo sólo en condiciones óptimas

según la naturaleza del anticuerpo, ( cantidad del reactivo, técnica apropiada, etc. ) debiendo

considerar que cuando se demuestra la presencia de un anticuerpo irregular en el suero de una

persona, podemos afirmar que existe un problema, en cambio en caso negativo no se puede

asegurar, aún en condiciones óptimas, que el paciente pudo haber sido estimulado y producir un

anticuerpo en el momento de la investigación. Por esta razón se debe tener comunicación entre el

servicio clínico y el laboratorio. Para saber si el paciente ha tenido embarazos o ha sido sometido

a hemoterapias.










En la búsqueda de los anticuerpos irregulares fuera del sistema ABO, se emplean varias células

de grupo sanguíneo “o” a las que se les ha tipificado los siguientes sistemas de grupo sanguíneo:

• Rh-Hr

• MN

• SS

• P

• Duffy

• Kell-cellano

• Kidd

• Diego

• Lewis

• Lutheran

a) Prueba de Pantalla (Semipanel)

Las muestras de sangre con los siguientes fenotipos como:

PANEL I

R1R1, MN, SS, P, Fy (a+b- ), Di (a b), Le ( a-+, b- ) Lub.

PANEL II

R2R2, MN, SS, P-Fy ( a-b+ ) KK, JK (a-b+ ) Di ( a- b+ ) Lub.










PANEL III

rr, MN, SS, P, Fy (a+ b+) KK JK (a+ b+) Di (a- b+) Lub.

b) En el caso de que en la prueba de pantalla se obtuvieran resultados positivos se estudiará la especificidad del anticuerpo contra 10 muestras separadas (panel) con las mismas técnicas que se emplearon en la prueba de pantalla.

Material y Reactivos:

1. 8 ml. de muestra fresca de sangre del problema, de menos de 2 horas de extraída, sin

anticoagulante.

2. Células de los paneles 1,2,3, al 2% en solución salina isotónica.

3. Células de los paneles 1,2,3, suspendidas al 5% en Buffer de baja fuerza iónica ( Liss ).

4. Células del panel (10 células) suspendidas al 2% en solución salina.

5. Células del panel (10 células) suspendidas al 5% en Buffer (Liss).

6. Suero antiglobulina humano (suero de Coombs).

7. Albúmina bovina al 22% y/o al 30%.

8. Medio enzimático (ejemplo, Bromelina).

9. Pipeta Pasteur.

10. Tubos de ensaye de 10x75mm.

11. Baño maría 20°C.

12. Baño maría o estufa a 37°C.

13. Solución amortiguadora de baja fuerza iónica (Liss).










Método:

1. Colocar y marcar los tubos de 10x75mm. como se indica en el cuadro No. 1.

2. Poner en cada uno de los tubos de las series I, II, III, 2 gotas de suero problema, más 1 gota

de los eritrocitos correspondientes, suspendidos al 2% en solución salina.

3. En las serie IV, poner 1 gota de suero, más 1 gota de eritrocitos, correspondientes,

suspendidos al 5% en Buffer de Liss y llevar a cabo la siguiente técnica:

SERIE I

1. Mezclar y centrifugar 30” a 3400 rpm. Leer aglutinación y/o hemólisis. Anotar = sr

2. Colocar todos los tubos a 37°C durante 60’, centrifugar 30” a 3400 rpm. Leer aglutinación

y/o hemólisis y anotar = S 37°C.

3. Al contenido negativo de los tubos, lavarlo 3 veces (tubo lleno) con solución salina estéril,

“secando” los eritrocitos después de la tercera lavada.

4. Agregar de 1 a 2 gotas (según instructivo) de suero de coombs.

5. Mezclar, centrifugar 30” a 3400 rpm, leer y anotar = s/coombs.

6. A los tubos negativos, obligatoriamente agregarle 1 gota de “eritrocitos testigo coombs

positivo”.

7. Mezclar, centrifugar 30” a 3400 rpm y leer.

8. Este resultado debe ser positivo = consumo de la antiglobulina humana, (coombs).










SERIE II

1. Agregar a todos los tubos 1 gota de Bromelina.

2. Mezclar y dejar reposar a temperatura ambiente 15’.

3. Centrifugar 30” a 3400 rpm, leer aglutinación y/o hemólisis, anotar = Br.

4. Colocar todos los tubos a 37°C por 15’.

5. Centrifugar todos los tubos a 30” a 3400 rpm y leer, anotar = Br 15’ = 37°C.

SERIE III

1. Agregar a todos los tubos de 2 a 3 gotas de albúmina (según instructivo del proveedor).

2. Mezclar perfectamente.

3. Centrifugar 90” a 3400 rpm. ( según instructivo del proveedor )

4. Leer aglutinación y/o hemólisis, anotar = Ar.

5. Colocar todos los tubos a 37°C durante 60’, centrifugar y reportar =A 37°C

6. Lavar todos los tubos negativos 3 veces con solución salina y continuar como en la técnica

s/coombs= A Coombs

SERIE IV

1. Colocar todos los tubos 10’ a 37°C.

2. Centrifugar 30” a 3400 rpm, leer y anotar = Liss 10’ 37°C.

3. Lavar todos los tubos negativos 3 veces con solución salina y continuar como en la técnica

s/coombs = Liss/coombs.










Cuadro No. 8

SERIE ERITROCITOS PROBLEMA

ERITROCITOS PANEL No. 1

ERITROCITOS PANEL No.2

ERITROCITOS PANEL No. 3

I ATS IS 25 35 = Salina

rápida

II ATB IB 2B 3B =

Bromelina

III ATA 1A 2A 3A = Albúmina

IV ATL 1 L 2L 3L = Liss

ATS = Autotestigo en Salina.

ATB = Autotestigo en Bromelina.

ATA = Autotestigo en Albúmina.

ATL = Autotestigo en Liss.

Cuando un suero contiene dos o más anticuerpos, su identificación puede complicarse.

El patrón de aglutinación del panel se caracteriza por:

1. No define la presencia de un determinado anticuerpo.

2. Todas las células del panel o la mayoría son aglutinadas.

3. Puede haber variaciones en el grado de aglutinación, en los diferentes medios.

4. Bajo estas circunstancias se debe considerar que existan:

o Anticuerpos múltiples o bien.

o Presencia de anticuerpos contra antígenos de alta frecuencia.










Unas de las técnicas utilizadas en estos casos son: Absorción y elución selectiva.

Absorción:

La técnica de absorción se usa:

1. Para remover anticuerpos y facilitar la identificación de otro.

2. Confirmar la especificidad (de un anticuerpo).

Las técnicas de elución son usadas para confirmar la especificidad de los anticuerpos removidos

por absorción. En este procedimiento las moléculas de anticuerpos son liberadas de la membrana

del glóbulo rojo, ya sea mediante la destrucción del antígeno o cambiando las condiciones que

favorecen la disociación del complejo antígeno anticuerpo.

Existen varias técnicas de elución:

Por calor, con eter, digitonina acida, congelamiento, xileno y cloroformo.

Interpretación de resultados:

La interpretación del panel se hace por exclusión o descarte de posibles anticuerpos, basándose

en la no reactividad del anticuerpo con aquellas células del panel que poseen determinados

antígenos, es decir, si el suero no reacciona con una determinada célula del panel en todas las

fases de la prueba.










Significa que el anticuerpo presente en el suero no está dirigido contra los antígenos presentes en

célula. En cambio el anticuerpo tendrá especificidad contra el o los antígenos presentes en las

células que resultan aglutinadas.

Sin embargo es posible llegar a conclusiones erróneas, en la identificación de anticuerpos. Por lo

cual para poder determinar la especificidad de un anticuerpo al realizar el panel, lo cual consta de

8 a 10 células, por lo menos 3 de ellas que contienen el antígeno correspondiente, deben dar

reacción positiva otras 3 en las cuales el antígeno está ausente, no deben reaccionar.

Si esta regla se cumple, el nivel de probabilidad de certeza es mayor del 95%.

Prueba de la Antiglobunina Humana Directa o Coombs Directo y del Despegado de Anticuerpos

La destrucción precoz de los eritrocitos como en la Enfermedad Hemolítica del Recién Nacido

(EHRN), en las reacciones transfusionales hemolíticas o en la Enfermedad Hemolítica autoinmune,

es debida a anticuerpos (Acs) específicamente dirigidos a Antígenos (Ags), contra los eritrocitos del

bebé, quien posee Ags heredados del padre y de los que la madre carece. En el segundo caso, los

pacientes sometidos frecuentemente a transfusiones de eritrocitos, pueden desarrollar también

Aloanticuerpos.

Por el contrario en el último de los casos, el paciente afectado por una regulación defectuosa de su

respuesta inmune, es capaz de desarrollar Acs (Autoanticuerpos) contra sus propios eritrocitos.










Una prueba de laboratorio muy útil para demostrar anticuerpos ligados al eritrocito, es la prueba de

la antiglobulina humana directa o prueba de coombs directa. Esta cuando es positiva nos indicaría

solamente la presencia de Acs ligados al eritrocito.

Posteriormente, debe obtenerse al Ac en solución por medio de las técnicas del despegado

(elusión) para poder estudiar su especialidad. Estas técnicas se basan en procedimientos físicos

y/o químicos aplicados al eritrocitos recubierto de Ac y que rompen su unión.

PRUEBA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA DIRECTA (AGHD) O DE COOMBS DIRECTO

Material:

1. Sangre problema anticoagulada con EDTA (EP)

2. Eritrocitos sensibilizados con IgG (testigo positivo de coombs TPC).

3. Eritrocitos no sensibilizados (testigo negativo de coombs TNC)

4. Suero Antiglobulina Humana o Suero de Coombs (SAH)

Preparación de los eritrocitos:

1. Tome 3 tubos de 13 x 100, en uno coloque 1 gota de EP, en otro 1 gota de TPC y en el

tercero 1 gota de TNC.

2. Lávelos con solución salina isotónica, (SSI), tubo lleno, por 3 veces.

3. Resuspéndalos al 2.55 con SSI.

4. Colóquelos a 20°C mientras prepara el siguiente material.










Preparar diluciones del suero de Coombs al doble de la siguiente manera:

1. Numerar tres series de nueve tubos de 10 x 75 mm., como se indica en la figura 8.

Donde:

SAH= Suero Antihumano

EP= Eritrocitos problema

TPC= testigo positivo de Coombs

TNC= Testigo negativo de Coombs.

FILA S.A.H.:

1) Coloque en los tubos No. 1 y 2, 8 gotas de suero de coombs.

2) Coloque en el tubo No. 9, 8 gotas de solución salina.

3) A partir del tubo No. 2 hasta el No. 8, coloque 8 gotas de solución salina.

4) Mezcle el contenido del tubo No.2 y pase 8 gotas al tubo No.3 y así sucesivamente hasta el

No.8 en donde se descartan 8 gotas.

5) Del tubo No.8, pasar con una pipeta limpia 2 gotas a los tubos 8 EP, 8 TPC y 8 TNC.

6) Saque la pipeta.

7) Pase del tubo No.7, 2 gotas a los tubos 7 EP, 7 TPC, 7 TNC y del No. 6, a los tubos, 6 EP, 6

TPC y 6 TNC, y así sucesivamente hasta los tubos No. 2 EP, 2 TPC y 2 TNC.

8) Con otra pipeta, pase del tubo No.2, 2 gotas de suero de coombs a los tubos de la serie 1.

9) Cambie de pipeta y coloque de tubo No.9, 2 gotas de solución salina a los tubos de la serie

9.










10) Agrege a la serie EP 2 gotas de eritrocitos EP al 2.5% a todos los tubos.

11) 1 gota de eritrocitos TPC a la serie TPC y 1 gota de eritrocitos TNC a la serie TNC.

12) Mezcle cuidadosamente.

13) Centrifugue todos los tubos.

14) Lea.

Ejemplo de resultados:

Diluciones del Suero de Coombs

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

E.P. 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ (+) g - -

T.P.C. 2+ 2+ 1+ (+) g - - - -

T.N.C. - - - - - - - - -




CONTROL DE EMISIÓN

Preparación de Sueros de Coombs Numere tres series de tubos de 10 x 75 mm o de 12 x 74 mm de la siguiente manera.







FILA 1 2 3 4 5 6 7 8 9

S. A. H.

E. P.

T. P. C.

T. N. C.



10. Técnica del despegado de los anticuerpos Hoja: 62 De: 129







10. TÉCNICA DEL DESPEGADO DE LOS ANTICUERPOS










TECNICA DEL DESPEGADO DE LOS ANTICUERPOS CON CLOROFORMO (ELUIDO)

Material:

1) El habitual en el laboratorio.

2) Sangre total del problema, anticoagulada con EDTA

Despegamiento con cloroformo

Reactivos:

1) Cloroformo

2) Albúmina bovina al 22% ó 33%

3) Solución salina isotónica (NaCL 0.9%) (SSI)

Método:

Coloque el volumen necesario de eritrocitos en un tubo de 13 x 100 de acuerdo con la intensidad

de la reacción del coombs directo, (cómputo).










EJEMPLOS: S/P 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/28 1/256

No.1 2+ 2+ + + (+) (+) g - - = 33 puntos

COMPUTO 8 8 5 5 3 3 1 0 0

No.2 4+ 4+ 3+ 2+ + (+) g - - = 51 puntos

COMPUTO 12 12 10 8 5 3 1 0 0

La intensidad de la reacción nos indica, aunque de manera gruesa, la cantidad de anticuerpos

pegados al eritrocito. Se necesitará una mayor cantidad de eritrocitos del ejemplo No. 1 que del

No. 2 para obtener una cantidad apropiada de anticuerpo despegado, ejemplo: Del No. 1, 0.2 ml.

de paquete de eritrocitos y del No. 2, 0.1.

Técnica:

1) Lavar 3 veces los eritrocitos problema con SI a 4°C.

2) Preparar una solución de albúmina al 6% con solución salina.

3) En un tubo 13 x 100, poner volumen a volumen la solución anterior y el paquete de

eritrocitos lavados. Agregar un volumen equivalente de cloroformo.

4) Tapar con tapón de caucho, mezclar vigorosamente por 15 seg., mezclar por inversión

durante un minuto.

5) Destapar con mucho cuidado para que no se proyecte el contenido. Poner el tubo a 56°C

durante 5 minutos exactos, mezclando constantemente con un aplicador (pipeta pasteure).

Centrifugar 5 minutos, pasar el sobrante a un tubo de 12x 75, centrifugar 2 minutos,

decantar el sobrante.

6) Coloque el total del eluido, distribuido equitativamente en los tubos donde se va a probar su

especialidad.










7) Agrege las células de fenotipo conocido al 2.5% en SSI.

8) Incube a 37°C de 30 a 60¨.

9) Lave 3 veces con SSI (tubo lleno).

10) “Seque” los eritrocitos.

11) Suspéndalos suavemente.

12) Agregue el suero antiglobulina humana.

13) Centrifugue y lea aglutinación.

14) Si los resultados son negativos, agregar una gota de eritrocitos control positivo de Coombs.

(Consumo)

Técnica del Despegado de los Anticuerpos A 45°C (Baño Maria)

1) Los eritrocitos problema se lavan como en el caso de la técnica del cloroformo.

2) Agregue la mitad del volumen de eritrocitos de SSI o albúmina bovina a 6% en SSI.

3) Mezcle perfectamente bien.

4) Coloque el tubo en un baño maría de 45°C durante 20’.

5) Agite la mezcla vigorosamente de 4 a 5 veces durante este tiempo de incubación.

6) Centrifugue la mezcla durante 5’ a 4000 R.P.M.

7) Separe cuidadosamente el sobrenadante (Ac eluido o despegado).

8) Recentrifugue el sobrenadante durante 3’ a 4000 R.P.M.

9) Decántelo sobre un tubo limpio.

10) Reparta de inmediato y equitativamente todo el eluido en tubos de 10 x 75 ó 12 x 75 mm.

11) Agregue los eritrocitos de fentipo conocido necesario y,

12) Lleve la prueba hasta coombs.

13) Realizar consumo de coombs.










DESPEGADO POR TRICLOROETILENO-CLOROFORMO 1) Lavar 3 veces los eritrocitos problema con SI a 4°C.

2) En un tubo de 13 x 100 poner volumen a volumen con solución salina eritrocitos lavados,

agregar igual volumen del reactivo, tapar el tubo, incubar a 37°C durante 5 a 10 minutos

rotando constantemente con una inclinación de 45°C hasta que se observe la hemólisis

total.

3) Centrifugar 5 minutos, con pipeta pasteure recuperar el sobrenadante procurando no tocar

la interfase ni el reactivo porque entonces todo se hemiolizará.

4) Centrifugar nuevamente por 2 minutos, decantar y realizar el estudio de anticuerpos ( como

en el paso No. 5 de la técnica de cloroformo).

5) Reportar resultados en INER-BS 18 98.



11. Estudios obligados de hemoderivados Hoja: 67 De: 129







11. ESTUDIOS OBLIGADOS DE HEMODERIVADOS










A todas las unidades de sangre y hemoderivados se les tienen que practicar obligatoriamente las

pruebas siguientes:

A. -Prueba serológica para identificación de reaginas contra sífilis ( RPR )

B. -Determinación de Brucella mediante la técnica de Rosa de Bengala.

C. -Prueba serológica para el antígeno de superficie de la hepatitis “B” (HbsAg).

D. -Prueba serológica para la determinación de anticuerpos anti-HIV.

E. -Prueba serológica para la determinación de anticuerpos anti-HCV.

A continuación se describirá cada una de las técnicas detalladamente; son en general pruebas de

floculación, aglutinación e inmunoensayo enzimáticos y antes de empezar la ejecución de cada

técnica es necesario hacer las siguientes consideraciones.

Recomendaciones Generales

Todas las técnicas son sumamente sensibles y para tener la fiabilidad de los resultados depende

en gran parte del correcto cumplimiento de las normas de laboratorio establecidas.

• No utilizar reactivos caducados.

• No mezclar reactivos de diferentes lotes en una serie de pruebas determinadas.

• Antes de comenzar las pruebas, esperar 30 minutos para estabilizar los reactivos a

temperatura ambiente.

• Reconstruir los reactivos cuidadosamente.

• Verificar las pipetas y el equipo para una operación correcta y precisa.










Acerca de las Muestras:

1. Obtener las muestras de acuerdo con las prácticas habituales.

2. Se deben separar lo antes posible las muestras para evitar hemólisis.

3. No usar muestras lipémicas, hemolizadas y que visiblemete presenten contaminación

(bacteriana), si no se puede obtener una muestra fresca, las muestras existentes deben ser

clasificadas mediante filtración.(0.45um).

4. No se deben utilizar muestras que se hayan congelado y descongelado en múltiples

ocasiones.

5. Toda las muestras y controles de origen humano deben manejarse como potencialmente

infectantes.



12. Brucella Hoja: 70 De: 129







12. BRUCELLA










Las brucelas son cobacilos gram negativos. El género comprende 3 especies importantes

patógenos para el hombre, que se diferencian originalmente sobre la base de sus principales

reservorios animales: Cabras y ovejas para B. mellitensis, ganado vacuno para B. abortus y los

cerdos para B. suis. Esta división ha sido apoyada por diferencias metabólicas y antigénicas. El

hombre se infecta a través de la ingestión de leche no pasteurizada o de queso, o bién del

contacto con los tejidos de animales infectados.

La respuesta inicial de los anticuerpos es la aparición de IgM, seguida después de IgG. Las

pruebas de aglutinación se realiza con suspensiones fenoladas de bacilos lisos, muertos por el

calor, Se utiliza para esto una cepa normalizada de B. abortus (n° 456), que es avirulenta para el

hombre; detecta igualmente bien los anticuerpos frente a las tres especies principales.

Interpretación: Los títulos superiores de 1:80 se considera una indicación de la existencia de una

infección o de una infección anterior.

Material y Equipo:

• 1 placa de vidrio

• Aplicadores

• Antígeno de Brucella Abortus

• Suero control positivo para Brucella Abortus

• Suero control negativo para Brucella Abortus

• 1 agitador rotatorio










Procedimiento:

1. Colocar 1 gota de suero problema en cada división de la placa de vidrio, colocar también 1

gota de suero control positivo y de control negativo respectivamente.

2. Depositar en el lado opuesto donde está la gota de suero , 1 gota de antígeno de B. Abortus.

3. Con un aplicador, unir las dos gotas de cada división y homogenizar la mezcla.

4. Agitar durante 6 minutos a velociada media.

5. Interpretar resultados.

Se utiliza antígeno Brucella Abortus 99 inactivado por calor y fenol en buffer de lactato de sodio y

teñido con Rosa de Bengala.

Material:

• Gradilla

• Placa-soporte desechable

• Pipeta-agitador desechable

• Rotor

• Cronómetro


• Muestra (s) de sangre venosa sin anticoagulante centrifugada y separada en suero y paquete

globular.










Reactivos:

• Antígeno rosa de bengala

• Control positivo (suero)

• Suero control negativo

Procedimiento:

1. Llevar reactivos a temperatura ambiente.

2. Con ayuda de las pipetas, tomar una gota de suero problema y colocarla en la placa

desechable. Hacer lo mismo con cada uno de los controles.

3. Homogenizar perfectamente el antígeno de rosa de bengala y adicionar una gota en la placa

desechable que contiene la muestra problema y proceder del mismo modo con cada uno de

los controles.

4. Mezclar ambas gotas con la punta de una pipeta desechable.

5. Colocar en el rotor y accionarlo durante 4 minutos

6. Observar, leer y reportar.

7. Interpretación de resultados.

Aglutinación: Prueba positiva.

No Aglutinación : Prueba negativa




CONTROL DE EMISIÓN

Interpretación de resultados para rosa de bengala. 1. Control positivo mas antigeno rosa de bengala. (4+)

2. Control negativo mas antigeno rosa de bengala. ( - )

3. -6 suero problema mas antigeno rosa de bengala. ( - )









13. Determinación de treponema pallidum Hoja: 75 De: 129







13. DETERMINACIÓN DE TREPONEMA PALLIDUM










Determinación de Treponema Pallidum Sifilis por el Método de Reagina Rapida (RPR).

La sífilis, principal enfermedad venérea del hombre, encausada por la espiroqueta (treponema

pallidum) y suele transmitirse por contacto sexual, aunque la entrada estragenital está bién

demostrada.

La respuesta inmune a esta invasión se divide en :

1) Anticuerpos reagínicos biológicamente no específicos.

2) Anticuerpos específicos a treponema pallidum que producen aglutinación, adherencia inmune,

fijación de complemento.

Para la determinación de estos anticuerpos existen dos tipos de pruebas: Las no treponémicas

(VDRL y RPR) que utilizan como antígenos cardiolipinas sensiblizadas por colesterol para

detectar anticuerpos reagínicos y las treponémicas que sí utilizan antígeno o extractos de

treponema pallidum para detectar anticuerpos especificos (las más frecuentes son: la prueba de

inmovilización de treponema pallidum TPI la prueba de fijación de proteinas complemetarias de

Reiter (RPCF).

Sin embargo hablaremos aquí específicamente de la prueba reagínica de RPR .

Esta prueba se basa en la floculación visible (macroscópica) del antígeno artificial combinación

de cardiolipina, colesterol, lecitina y colorante en solución alcohólica estabilizado con ácido

benzóico ante la presencia del anticuerpo en el suero del paciente.










Material:

• Gradilla

• Placa de reacción con anillos grabados

• Pipetas desechables

• Aguja sin bisel

• Agitadores

• Rotor


• Muestra (s) de sangre venosa sin anticoagulante, centrifugada y con suero separado.

Reactivos:

• Antígeno en suspensión.

• Control positivo.

• Suero control negativo.

• Agitador Rotatorio




CONTROL DE EMISIÓN

Método cualitativo:

1. Depositar con ayuda de la pipeta desechable una gota (0.05ml) de suero problema, en un

anillo de la placa de reacción . Se procederá del mismo modo con cada una de las

muestras y controles. Extender perfectamente la gota sobre la superficie del anillo.

2. Añadir con la ayuda de la aguja sin bisel una gota de la suspensión del antígeno una vez

homogenizado a cada una de las muestras.

3. Colocar la placa en el rotor y agitar por un espacio de 8 minutos a 180 rpm.

4. Leer resultado.


• Presencia de flóculos (grumos)- Positivo.

• No presencia de flóculos (grumos)- Negativo.

DIAGRAMA
















Método Cuantitativo:

1. Seleccionar los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa.

2. Colocar en una gradilla 4 tubos de 12X75mm y numerarlos.

3. Agregar a cada uno de ellos 0.5ml de solución salina.

4. Depositar 0.5ml. de suero problema en el tubo No. 1 y mezclar.

5. Pasar 0.5ml. del tubo No.1 al tubo No. 2 y mezclar.

6. Continuar esta operación hasta el tubo No.4.

7. Depositar 0.05ml de cada una de las diluciones sobre anillos diferentes de la placa de

reacción . Extender la muestra sobre la superficie del anillo.

8. Añadir una gota de la suspensión de antígeno , previamente resuspendido utilizando el

frasco gotero al que se le ha insertado la aguja sin bisel.

9. Colocar la placa de reacción sobre el rotador mecánico a 180 RPM durante 8 minutos.

10. Leer resultados microscópicamente.

Interpretación:

El título de suero problema será la última dilución que presente grumos, ejemplo:

Tubo # Dil. Suero Resultado

1 1:2 positivo

2 1:4 positivo

3 1:8 positivo

4 1:16 negativo










El título del suero problema será 1:8

NOTA: Las limitaciones del procedimiento serán con :

• Sueros extremadamente turbios o hemolizados son insatisfactorios para realizar la

prueba.



14. Determinación de anticuerpos Anti-VIH Hoja: 81 De: 129







14. DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-VIH










Pruebas para detectar la presencia de anticuerpos anti-VIH, por el método de

Hemaglutinación pasiva y el ensayo inmunoenzimático (ELISA)

Hemoaglutinación Pasiva

Dicha prueba es un procedimiento sencillo que no requiere de instrumentos especiales para su

realización; esta prueba utiliza antígeno de VIH obtenido por cultivo del virus en células linfoides

(VIH I). El virus es inactivado y desintegrado y con el se cubren partículas que actúan como

soporte (eritrocitos humanos estabilizados, partículas de gelatina). El principio de esta prueba se

basa en que estas partículas sensibilizadas son aglutinadas por la presencia de anticuerpos de

HIV en muestras de suero o plasma.

Material:

• Tubos de 13X100.

• Pipetas graduadas de 1ml.

• Micropipeta de 25ml.

• Puntas para micropipeta.

• Agitador rotatorio.

• Placas con fondo en “U”.

• Reactivo del Kit en uso.










Procedimiento:

1. El kit serodia cuenta con dos viales; uno de partículas control y otro con patículas

sensibilizadas, ambos viales vienen liofilizados. Reconstituir ambos frascos con Buffer

(reconstituyente). Dejar hidratar durante 30 minutos. (Adicionar el volumen necesario de

Buffer de acuerdo a la presentación del Kit).

2. Se manejan 3 pozos por cada muestra; se agregan 75 Microllitros de diluyente de muestras

en el primer pozo y 25 Microlitros en el segundo y tercer pozo

3. Agregar 25 Microlitros de muestra al primer pozo.

4. Homogenizar la muestra en el primer pozo y transferir 25 Microlitros al segundo pozo,

homogenizar con una micropipeta y transferir al pozo 3, homogenizar y descartar los

últimos 25 Microlitros.

5. Proporcionar en el pozo 2, 25 Microlitos. de partículas no sensibilizadas.

6. Colocar en el pozo 3,25 Microlitos de partículas sensibilizadas.

7. Homogenizar en un agitador rotatorio durante 5 minutos (a 180 rpm), cubrir e incubar 2

horas a temperatura ambiente (15-25°C) en una superficie libre de vibraciones.

8. Correr un control positivo en cada ensayo.

9. Leer resultados.

10. Registrar número de lote del reactivo y fecha de caducidad.


- Resultado negativo: Formación de un botón compacto.

- Resultado positivo: Formación de un Halo (anillo) aglutinado.




CONTROL DE EMISIÓN

El VIH como cualquier otro agente infeccioso estimula la respuesta inmune provocando la

formación de anticuerpos específicos. Entre los métodos comunes de detencción de estos

anticuerpos se encuentra el ensayo ELISA . Dicha prueba se basa en la reacción inmunológico

que se presenta entre un antígeno y su anticuerpo específico ; el antígeno de VIH se encuentra

fijo en una superficie (fase sólida), el cual reacciona con el anticuerpo específico al adicionar

alguna muestra seropositiva. Posteriormente se lleva a cabo una segunda reacción en la cual se

adiciona un anticuerpo marcado con una enzima (conjugado), dicho anticuerpo va dirigido al

primer anticuerpo; enseguida se adiciona un sustrato el cual desarrolla color para visualizar la

reacción positiva.

Principio de la prueba

HIV Anti-HIV (Ig anti-humano)-HRP+ sustrato

Antígeno en fase

sólida

Muestra

Positiva

Anticuerpo marcado con

enzima

Material:

• Reactivos del Kit en uso.

• Incubador.

• Lavador de microtiras.

• Lector.

• Micropipetas. (50-200 Microlitos).

• Puntas para micropipeta.

• Tubos de 13X100 para muestra.
















PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA Seguir estríctamente el procedimiento propuesto.

Utilizar los controles negativos, positivos y el valor umbral en cada serie de pruebas, para validar

los resultados.

Seguir estrictamente las normas de laboratorio establecidas:

1. Cuidadosamente establecer la distribución de las muestras y el plan de identificación.

2. Preparar la solución de lavado. (concentrada 10X)

3. Sacar la placa soporte con los módulos de la bolsa de protección.

4. Distribuir directamente sin lavados previos de la microplaca y en serie:

4.1- 80 µl. de diluyente en cada pocillo.

4.2- 20 µl. de suero control negativo en los pocillos –a A

- 20 µl. de suero valor umbral en los pocillos B1, C1 y D1

- 20 µl. de suero contro positivo en el pocillo E1.

- 20 µl. de la muestra No.1 en el pocillo F1.

- 20 µl. de la muestra No.2 en el pocillo G1, etc.

4.3 – Adicionar dos muestras control interno negativo y positivo

Aspirar y expµlsar al menos tres veces para homogenizar la mezcla. También es posible, distribuir

100 µl. de la muestra previamente diluida 1:5.

5. Cubrir la microplaca con plástico adhesivo. Apretar firmemente sobre toda la microplaca para

asegurar una firme adhesión.

6. Incubar la microplaca en un baño maría a 40°C ≠ 1° durante 30 minutos ≠ 5.










7. Quitar el plástico adhesivo. Aspirar el contenido de los pocillos a un recipiente de residuos

desechables ( contenido hipoclorito sódico ), añadir 0.3 µl. de la solución de lavado en cada

pocillo. Aspirar otra vez.

Repetir este procedimiento dos veces ( ej. un total de 3 lavados ), a continuación secar la

microplaca volteando hacia abajo sobre papel absorvente. Si se utiliza un lavador automático,

seguir el mismo procedimiento.

8. Distribuir 100 µl. de la solución de conjugado en todos los pocillos.

Agitar el frasco del conjugado antes de utilizarlo. Cubrir con un plástico adhesivo nuevo e

incubar durante 30 minutos a 40°C ≠ 1°.

9. Quitar el plástico adhesivo, vaciar todos los pocillos por aspiración y lavar cuatro veces como

se indica en el párrafo No. 7. A continuación secar la microplaca volteando hacia abajo sobre

un papel absorbente.

10.Preparar la solución de substrato justo en el momento de usarlo. (Una tableta de OPD en 10ml

de Buffer). Esta solución no deberá exponerse a la luz directa, y no usarla después de 10

minutos.

11.Evitando la luz directa distribuir rápidamente 100 µl. de la solución de revelado (preparada en

el punto 10), en todos los pocillos. Dejar que se desarrolle la reacción en un lugar oscuro

durante 30 ≠ 5’ minutos a temperatura ambiente. (18°-25°C)

No utilizar el plástico adhesivo durante esta incubación.

12.Añadir 50 µl. de la solución de parada (H2SO44N) utilizando la misma secuencia de distribución

a la empleada para la solución de revelado.










13.Secar cuidadosamente la base de la microplaca. Realizar la lectura de las densidades ópticas

a 492/620 nm, utilizando un lector de microplacas dentro de los 30 minutos después de la

parada de la reacción (los módulos se deberán mantener fuera del alcance de la luz intensa

antes de la lectura).

14.Verificar todos los resultados y la correspondencia entre la lectura y la distribución de la

muestra y el plan de identificación.

15.Guardar registro de lecturas.

OBSERVACIONES Precauciones:

EVITAR LA CONTAMINACION DURANTE EL ENSAYO

EN CASO DE CONTAMINACION (derrames, generales...)

• Los derrames no ácidos, se deberán limpiar a fondo con solución de hipoclorito sódico a 5%.

• Los derrames ácidos, se deberán limpiar en seco. El área derramada se deberá limpiar con

una solución de hipoclorito sódico al 5%. El material utilizado para limpiar, se deberá desechar

en un contenedor para material contaminado y desechar de acuerdo con las normas de

seguridad establecidas.

• NUNCA USAR EL MISMO CONTENEDOR PARA DISTRIBUIR EL CONJUGADO Y LA

SOLUCION DE REVELADO.

• RESPETAR EL NUMERO DE CICLOS DE LAVADO PRESCRITOS.




CONTROL DE EMISIÓN

• VERIFICAR LA SOLUCION DE REVELADO ENZIMATICA. (tampón sustrato y cromógeno)

ANTES DE DISTRIBUIR deberá estar incolora ó, a lo máximo amarillo pálido.

La aparición de un color amarillo-naranja a los pocos minutos después de la reconstitución, indica

que el reactivo no puede utilizarse y se deberá reemplazar.

El tampón sustrato, el cromógeno, la solución de revelado y la solución de parada, pueden

contaminarse por iones metálicos.

Por esta razón, es preferible utilizar contenedores y equipos de distribución de plástico o vidrio,

previamente lavados con ácido clorhídrico 1N y enjuagados cuidadosamente con agua destilada

y secados.

CALCULO E INTERPRETACION DE RESULTADOS

La presencia o ausencia de anticuerpos frente a VIH-1 y/o VIH-2, se determina comparando la

lectura de absorbancias para cada muestra contra el Valor Umbral calculado.

1) Calcular la media de absorbancias del Suero Control del Valor Umbral: DOR4 = DO (B1)+DO (C1)+DO (D1)

3

2) Calcular el Valor Umbral







El Valor Umbral viene dado por




CONTROL DE EMISIÓN

Valor umbral = DO = V.U.

10

3) Validación de la prueba

El suero control Negativo, deberá ser inferior al 70% del Valor Umbral:

D.O. (Control Negativo)< 0,7 V.U

La medida del Suero Control Valor Umbral, deberá ser superior a 0.6:

DO > 0,6

El Valor D.O. Control pos fuerte / D.O. DO de V.U deberá ser igual o superior a 1.3:

DO

> 1,3

DO
















4) Interpretación de los resultados

Las muestras con un valor de absorbancias inferiores al Valor Umbral, deben considerar

negativas por la prueba de GENELAVIA MIXT.

Los resultados con un valor justo inferior al Valor Umbral:

D.O. VU - 10% < D.O. UV, deberán ser interpretados con mucha precaución y a las muestras

correspondientes, se les repetirá la prueba en duplicado.

Las muestras con valor de absorbancias igual o superior al Valor Umbral, inicialmente se

consideran positivas por la prueba GENELAVIA MIXT. Se deberá repetir la prueba por duplicado

antes de emitir el resultado final.

Si después de repetir una muestra, los valores de absorbancias de la prueba por duplicado son

inferiores al Valor Umbral, el resultado inicial no es considerado reproducible y la muestra se

declara como negativa.

Reacciones no reproducibles son a menudo causadas por:

• Lavado insuficiente

• Contaminación de las muestras negativas por sueros con un título alto de anticuerpos.

• Contaminación de la solución de revelado por agentes oxidantes (lejía, iones metálicos, etc..)

• Contaminación de la solución de parada.










Si después de repetir, las absorbancias de uno de los duplicado es igual o superior al Valor

Umbral, el valor inicial es reproducible, y la muestra se declara positiva.

Un resultado negativo indica que la muestra ensayada no contiene anticuerpos VIH.

REALIZACION

La sensibilidad de HIV-1 es 100% para 300 pacientes diagnosticados de SIDA y con complejos de

SIDA (ARC).

La sensibilidad para HIV-2 es 100% para 67 muestras confirmadas por Western Blot.

La sensibilidad de HIV-1 subtipo 0 es 100% para 9 muestras.

La especificidad es 99.82% (5545/5555) en una población de donantes. No ha sido observada en

muestras hemolizadas o pacientes con otras enfermedades virales o autoinmunes.



15. Hepatitis Viral B Hoja: 92 De: 129







15. HEPATITIS VIRAL B










Técnicas de Elisa para Hepatitis “B” y Hepatitis “C”

Hepatitis Viral

Introducción y Fundamento:

La Hepatitis Viral es una de las enfermedades en las que se desarrolla un cuadro

clínico común , pero los agentes causantes son etimológicamente y epidemiológicamente

distintos.

Los diferentes tipos de Hepatitis tienen importancia significativa en la salud pública, no solo en

términos de morbilidad y mortalidad, también en términos de consecuencias económicas (CDC de

ATLANTA).

La Hepatitis B ha sido reconocida y estudiada desde los 40´S y en el laboratorio es diagnosticada

por pruebas serológicas específicas. El agente causal es un virus con ADN de filamento doble y

miembro de la familia Hepadnaviridae, mide 40nm.

El VHB posee una parte central que es el corazón , rodeado de una cubierta viral que contiene la

proteína de superficie ó el Ag HBS. El ADN viral y una Polimerasa participantes en su replicación

se encuentran dentro del Núcleo. La transmisión ocurre, en especial por vía parenteral o sexual.

La Hepatitis B puede presentarse como aguda o crónica. Se calcula que 50 a 60% de los

individuos infectados se mantienen asintomáticos, mientras que el resto presenta signos clínicos

de hepatitis aguda. Los pacientes con síntomas más importantes en la fase aguda pueden

presentar una respuesta inmunitaria más exitosa que provoca la eliminación del virus.










La mayoría de los pacientes que desarrollan hepatitis B crónica presentan una enfermedad

inicialmente asintomática o relativamente leve. Es por eso la importancia de conocer e interpretar

los marcadores del VHB en el laboratorio desde el punto de vista clínico. (Para llegar a un

diagnóstico).

HBsAG es la proteína predominante de la cubierta viral, presente en suero indica infección viral

aguda ó crónica. Puede ser detectado en suero 30 a 60 días después de la exposición al virus

es el primer marcador serológico, precede a los síntomas. Alcanza una concentración máxima

durante los estadíos agudos de la infección por hepatitis B después declina, de manera gradual a

niveles no perceptibles en un lapso de cuatro a seis meses en infecciones de curación

espontánea.

El HBeAg se libera durante periodos de replicación viral activa y se relaciona con aumento de

infectividad. Aparece simultáneamente con el HBsAg y disminuye justo antes de que se reduzcan

los títulos de HBsAg. Cuando el resultado de la prueba de HBeAg es positivo , el riesgo de

transmisión perinatal es de 75 a 90%, sin embargo existe un riesgo de 5% cuando el resultado es

negativo.

El antígeno (HbcAg), es un componente proteínico de la (nucleocápside) y se encuentra cubierto

por el HBsAg, no penetra en suero y no se cuenta con alguna prueba comercial para

determinarlo. El huésped , al reconocer al HBcAg como extraño producirá anticuerpos

específicos IgM contra esta proteína (ANTI-HBc).










El ANTI-HBc IgM es el primer parámetro serológico visible de la respuesta inmunitaria del

huésped contra el VHB y suele presentarse entre la 6 y 10 semana después de la infección inicial.

Por lo que se le considera un indicador de Hepatitis Aguda y desaparece después de la

recuperación.

El ANTI Hbc IgG, aparece después y es visible indefinidamente. El ANTI Hbc IgG es el mejor

indicador de una exposición previa con el VHB y sobre todo es de suma importancia durante el

período de VENTANA ya que se ausenta el HBsAg de circulación y por lo tanto se le considera

como un indicador de previo contacto.

El ANTI Hbs los anticuerpos específicos contra el HBs Ag se forman unos seis meses después de

la infección inicial. En un porcentaje reducido de pacientes (5 a 15%) no se presenta anti HB.

Estos anticuerpos también se forman como respuesta a la vacuna de Hepatitis B y podría persistir

después de una inmunización con gamaglobulina inmune.

Podemos resumir, la presencia de HBsAg y ANTI HBc-IgM son indicadores de una infección

aguda causada por el VHB.

La pérdida de HBsAg y HBeAg y la presencia de anti Hbs son indicadores de inmunidad. Los

individuos no inmunizados contra el virus y expuestos al VHB, incluida la exposición a piquete de

aguja, maternoneonatal y sexual deben recibir una combinación de inmunoterapia pasiva y activa.

La inmunoglobulina de hepatitis B (HBIG) debe administrarse lo antes posible durante los siete

días después de la exposición y de nuevo a los (14 a 30 días, junto con la administración de la

vacuna de hepatitis B.




CONTROL DE EMISIÓN

Principio y Procedimiento

Microplaca sensibilizada con un anticuerpo

monoclonal

Lavar la placa.

Dispensar 100 ul. de muestras y controles.

Dispensar 50 ul. de conjugado.

Incubar por 90 minutos a 40ªC

Lavar 5 veces.

Dispensar 100ul de solución reveladora.

- Incubar 30 minutos en la oscuridad.

- Dispensar 50 microlitos de H2SO4 4N

Leer a 492/620 nm.
















MÉTODO

Tres métodos para la detección de Ags HB son disponibles.

Para cada método 1,2 ó 3 el procedimiento es el siguiente:

1. Preparar la solución de lavado

2. Tomar de la bolsa el número de tiras necesarias, las restantes dejarlas dentro de la bolsa y

sellar.

3. Llenar los pozos con 370ml. de solución de lavado.

3.1 Aspire el contenido de los pozos dentro de un recipiente.

3.2 Repita el procedimiento una vez más y seque la placa sobre papel absorbente.

3.3 Si se emplea sistema de lavado automático, realizar los mismos ciclos de lavado.

4. Distribuir los pozos en el siguiente orden:

Pozos A1, B1 C1 y D1: 100 microlitros de control negativo.

Pozos E1 y F1: 100 microlitros de control positivo

Pozos G1, H1, etc.: 100 microlitros de muestras no conocidas.

5. Distribuidas 50 microlitros de solución de conjugado en los pozos, cubrir con un tira

adhesiva.

6. Método 1.- Incubar por 90 minutos a 40°C en baño maría.

Método 2.- Incubar por 90 minutos a 40°C en un incubador seco con agitación.

Método 3.- Incubar por 45 minutos a 40°C en un incubador seco con agitación.

7. Remover la tira adhesiva y vaciar los pozos lavar 5 veces como indica en el punto 3.

8. Preparar la solución de desarrollo enzimático unos minutos antes.

9. Dispense 200 microlitros de la solución de desarrollo en cada pozo, incubar 30 minutos en

la oscuridad a temperatura ambiente.










10. Adicionar 50 microlitros de solución de paro 4N en cada pozo.

11. Leer la placa a una densidad óptica de 492/620 nm. dentro de los 30 minutos siguientes de

la interrupción de la reacción.

12. Guardar registro de resultados.

Según Técnica del Fabricante Material y Equipo:

1. Reactivos del Kit en uso.

2. Lavador de Microplacas.

3. Micropipeta para toma variable.

4. Punta para Micropipetas.

5. Incubadora para 40ºC.

6. Lector de tiras Microelisa.

7. Impresora




CONTROL DE EMISIÓN

CALCULO E INTERPRETACION DE RESULTADOS

1. Calcular el promedio de la densidad óptica de los controles negativos: DO

EJEMPLO:

Control negativo D.O.

1 0.010

2 0.011

3 0.012

4 0.015

D.O TOTAL 0.048

= = 0.012 = D.O.

4 4

2. Calcular el promedio de la densidad óptica de los controles positivos D.O.

EJEMPLO:

Control positivo D.O.

1 0.980

2 0.964
















D.O TOTAL 1.944

= = 0.972 =D.O

2 2

3. Calcular el valor de corte.

Para cada método el valor de corte es igual a : D.O + 0.025

EJEMPLO: D.O = 0.012

VALOR DE CORTE = 0.012 + 0.025 = 0.037

4. Condiciones de validación de la prueba.

Todos los valores de los controles negativos deben ser menores que 0.100 unidades de

densidad óptica.

Si el valor promedio de los controles negativos (D.O) es mayor que 0.010, es posible eliminar

cuando más un valor aberrante cuando el valor se desvía más de un 40% con respecto al valor

promedio.

Si el valor promedio de los controles negativos (D.O) es menor ó igual a 0.010, todos los valores

individuales de control negativo deben estar dentro del intervalo de -0.005 a +0.005 del

promedio. Es posible eliminar cuando más un valor aberrante.

Cuando el valor aberrante se ha eliminado, calcular nuevamente el valor promedio de los

controles negativos (D.O) con lo otros tres valores.










El valor promedio de los controles positivos (D.O) deben ser mayor 0.400 para los métodos 1 y

3 y mayor que 0.800 para el método 2.

5. Interpretación de resultados.

- Muestras con una densidad óptica menor que el valor de corte son negativos.

- Muestras con una densidad óptica mayor ó igual que el valor de corte son positivas.



16. Hepatitis C Hoja: 102 De: 129







16. HEPATITIS C










La primera vez que se identificó el virus de hepatitis C (VHC), cuya clasificación formal es no A,

no B, fue en 1988. Existen dos clases, siendo la más común la encontrada en sangre que se

relaciona en forma estrecha, con transfusiones.

También se describió una variedad existente en agua y se le relaciona con epidemias en India,

Asia y América Central. Desde el punto de vista epidemiológico, el VHC semeja el VHA y en

ocasiones se le denomina hepatitis entérica o VHE.

Los anticuerpos aparecen entre el primero y tercer mes del surgimiento del antígeno HCaG. La

infectividad es reducida por contacto personal, razón por la que se le relaciona, en especial , con

transfusión sanguínea. El periodo de incubación varía entre dos semanas y seis meses. las

pruebas que en forma directa identifican el virus están en desarrollo pero encuentran el

obstáculo de resultados falsopositivos y falsonegativos desproporcionados.

Antigeno Codificado del Virus de la Hepatitis “C” (Recombinantes c22-3, c200y NS5), ORTHO

En el sistema de prueba ELISA ORTHO HCV 3.0, se utilizan tres antígenos recombinantes

codificados del virus de la hepatitis C. Los tres antígenos recombinantes, desarrollados por

Chiron Corporation , son los c22, c200 y NS5.

Procedimiento de la Prueba - Incubación ESTANDAR:

1. Treinta minutos antes del comienzo del procedimiento, aproximadamente, deje que los

componentes del equipo adquieran la temperatura de la habitación ( de 15 a 30°C ). Voltee

suavemente los reactivos varias veces, pero evite que se forme espuma. Compruebe la

temperatura del incubador: manténgala a 37°C + 1°C.










2. Determine el número total de micropocillos necesarios para el ensayo. Además de las

muestras, en cada placa o en cada placa parcial, se deberá incluir un sustrato blanco, tres

controles negativos y dos controles positivos. Si no se necesita la tira entera, puede separarse

el número adecuado de pocillos que se vayan a utilizar. Los pocillos que no se utilicen

deberán almacenarse entre 2 y 8°C en la bolsa de aluminio que se suministra, con desecante,

firmemente sellada y habrán de usarse dentro de los cuarenta y dos días siguientes a la

apertura de la bolsa de aluminio. Anote en el espacio destinado para ello en la bolsa de

aluminio la fecha en la que se abre la misma y la fecha de caducidad de los pocillos que no se

usen. La realización de la prueba en una placa más pequeña que la placa entera se permite

siempre y cuando se cumplan las siguientes condiciones:

Las tiras de micropocillos de diferentes placas pueden mezclarse para formar placas completas

o parciales siempre y cuando pertenezcan a un mismo lote, no hayan caducado y provengan

de placas que han demostrado con anterioridad una respuesta adecuada a los controles del

equipo.

Al ensamblar una placa que contengan tiras de una placa recién abierta y que no se ha

ensayado con anterioridad, deberá colocarse una de estas tiras al comienzo de la placa y

realizar todos los controles del equipo

ADVERTENCIA: Manipule las tiras de los micropocillos con cuidado.

No toque la superficie exterior del fondo de los pocillos.

NOTA: Una vez comenzado el ensayo , todos los pasos han

de completarse en orden.










3. Monte las tiras de micropocillos en el soporte para tiras Las tiras han de estar niveladas en

dicho soporte. Añada tiras de micropocillo negras o sin recubrir para formar una microplaca

completa.

4. Prepare una ficha en la que se identifique la disposición de los controles y de las muestras en

los micropocillos. Disponga los pocillos de control de ensayo de forma que el pocillo 1A sea el

sustrato blanco. Partiendo del pocillo 1A, disponga todos los controles en una configuración

horizontal o vertical, tal y como se indica a continuación . Esta configuración dependerá del

“soffware”.

Pozo 1A Sustrato Blanco Control Negativo

Control Negativo

Control Negativo

Control Positivo

Control Positivo

5. Añada los controles y las muestras a los micropocillos. Compruebe que el equipo dispensador

es capaz de pipetear los volúmenes especificados y las diluciones apropiadas tal y como se

indican en el procedimiento.

Verificar visualmente los pocillos después de la dispensación de muestras y sueros de control.

Un cambio de color marrón grisáceo hacia verde es indicativo de que la muestra o el control

ha sido correctamente dispensado en el pocillo. Si no se observa ningún cambio de color el

resultado correspondiente a esa muestra o control ( será invalidado y se le realizará un nuevo

ensayo.










Para la Adición de una Muestra Directa:

A) Al utilizar instrumentos automáticos para dispensar los controles y las muestras al

micropocillo, siga las instrucciones del fabricante para lograr los volúmenes y las diluciones

precisas.

Cuando se dispensen los controles y las muestras manualmente, deberán llevarse a cabo los

siguientes pasos:

I) Añada 200 µl de Diluyente de la Muestra a todos los pocillos, excepto al 1A.

II) Añada 10 µl de los controles a los pocillos correspondientes.

III) Añada 10 µl de cada muestra de suero o plasma que se vaya a ensayar a los pocillos

correspondientes.

IV) Coloque el soporte para tiras de micropocillos en un agitador de placas para que se

mezcle durante 5 ó 10 segundos a menos que utilice el Aparato Automático

Dilutor/Pipeteador ORTHO o material equivalente. El agitador deberá utilizarse a una

velocidad lenta o moderada , teniendo cuidado de no producir salpicaduras con el

contenido de los pocillos de prueba.

Para la adición de Muestras Prediluidas:

A. Añada 300 µl de Diluyente de Muestras a un tubo o recipiente.

B. Añada 15µl de control de la muestra al tubo. Mézclelo a fondo.

C. Transfiera a 210 ml de cada muestra o control , diluidos previamente, al pocillo

correspondiente.










6. Tape la microplaca con adhesivos de placas e incube a 37°C + 1°C durante 60 minutos + 5

minutos.

7. Nivele las tiras en el soporte. Utilizando un dispositivo aspirador/lavador, aspire y lave todos los

pocillos cinco veces consecutivas con Tampón de Lavado (1X).

ADVERTENCIA: El seguimiento escrito del procedimiento de lavado descrito es crucial para

asegurar la realización óptima de la prueba. Siga los pasos que se citan con

objeto de asegurar un lavado a fondo.

a) Aspire las soluciones de muestra de los micropocillos y proceda a llenarlos con Tampón de

lavado (1X). No deje que los pocillos rebosen. Deje transcurrir 20 segundos , aproximadamente,

desde el momento en que añada el Tampón de Lavado hasta la aspiración siguiente.

b) Realice la secuencia completa de aspirado y llenando otras cuatro veces.

c) Aspire los pocillos de manera completa. Déle la vuelta a la placa y golpee firmemente sobre

una toallita de papel limpia para eliminar el exceso de Tampón de Lavado.

8. Añada 200µl de Conjugado a todos los pocillos, incluir al 1A

9. Tape el soporte de tiras de micropocillo con adhesivo de placas nuevo e incube a 37°C +

1°C durante 60 minutos + 5 minutos.










10. Prepare suficiente Solución de Sustrato aproximadamente 10 minutos antes de que termine

la segunda incubación . Déjese transcurrir el tiempo suficiente para que las pastillas de

OPD se disuelvan adecuadamente. No es correcto utilizar más de una preparación de

Solución de Sustrato en una misma placa.

11. Tras la segunda incubación , lave los pocillos tal y como se describe en el paso 7.

12. Añada 200µl de solución de Sustrato a todos los pocillos, incluso el 1A.

13. Incube a la temperatura ambiente y en la oscuridad durante 30 minutos + 1minuto.

14. Añada 50µl de ácido sulfúrico (H2SO4) 4N a todos los pocillos, incluido el 1A. El ácido ha

de añadirse mediante un chorro enérgico y constante poniendo especial cuidado para no

producir salpicaduras entre pocillos.

15. Si existiera humedad, limpie cuidadosamente el fondo de las tiras con un papel absorbente

y suave para eliminarla antes de la lectura. Asegúrese de que las tiras están niveladas en

su soporte. Lea la placa con una longitud de onda de 490 ó 492nm. En el caso de lectores

de longitud de onda duales, ajuste la longitud de onda de referencia 620 ó 630 nm. Ajuste

el blanco de lectura en el pocillo 1A de acuerdo con las instrucciones del fabricante del

aparato.

16. Registrar el número de lote de los reactivos utilizados y la caducidad de los mismos en la

bitácora.

NOTA: Las microplacas han de leerse dentro de los 60 minutos que siguen a la dispensación del

ácido sulfúrico 4N. Las placas han de conservarse en la oscuridad hasta que sean leídas.

Importante: Al final de cada jornada, limpie el aparato aspirador/lavador con agua destilada o

desionizada (aproximadamente 500ml) siguiendo las instrucciones recomendadas por el

fabricante del aparato.




CONTROL DE EMISIÓN

Procedimientos de Control de Calidad -Incubación ESTANDAR 20,21.

1. Criterios de Aceptación del Sustrato Blanco. Se considera que una placa es válida con

respecto al sustrato blanco si el valor de absorbancia del pocillo con el Sustrato blanco (pocillo

1A) es mayor o igual a -0,020 y menor o igual a 0,050.

2. Criterios de Aceptación del Control Negativo.

a) Los valores individuales del control negativo deben ser menores o iguales a 0,120 y

mayores o iguales a -0,005 son válidas y deberán ser redondeadas a 0,000 para los

cálcµlos. Si uno de los tres valores control se encuentran fuera de alguno de estos

límites, recalcµle el volor medio del control negativo basándose en los dos valores

control aceptables. La placa no será válida y habrá de repetirse la prueba si dos o

más de los tres valores control se encuentran fuera de alguno de los límites.

b) Halle la media de los valores del control negativo.

Ejemplo:

Control Negativo Absorbancia

1 0,010

2 0,030

3 0,020

Absorbancia Total = 0,060

NCX = Absorbancia Total

= 0,020

3
















3. Cálculo del valor de la línea de Corte (“Cutoff”)

Valor de la línea de Corte = NCx + 0,600

Ejemplo:

Control Negativo Absorbancia

1 0,010

2 0,030

3 0,020

Absorbancia Total = 0,060

NCX = Absorbancia Total

= 0,020

3

Valor de la línea de Corte = 0.020 + 0.600 = 0.620

4. Criterios de Aceptación del Control Positivo.

El control positivo se utiliza para verificar que los compontentes del Kit son capaces de detectar

una muestra reactiva, siempre que se haya seguido estríctamente el procedimiento del ensayo.

Una placa se considera válida con respecto al control positivo si el valor de ambos controles

positivos es mayor o igual a 0.800 y no dfieren entre sí más de 0,600. Cualquier otro resultado

para el control positivo es considerado inválido. NOTA: Los resultados por encima del límite

superior del lector pueden aparecer como “OVER”, “***” O “ “.










1. Las muestras con valores de absorbancia menores de -0,025 deberán ser sometidas de nuevo

a la prueba en un único pocillo. La prueba deberá considerarse no reactiva si el valor de

absorbancia en la repetición de la prueba es inferior a 0,025.

2. Las muestras con valores de absorbancia inferiores al valor de la línea de corte se considera

negativos (no reactivos). No es necesario hacer más pruebas.

3. Las muestras con valor de observancia superiores o iguales al valor de la línea de corte se

consideran inicialmente reactivas y deberán ser sometidas a una nueva prueba por duplicado

antes de hacer una interpretación definitiva.

4. Al someter de nuevo a ensayo una muestra inicialmente reactiva, dicha muestra se

considerará repetidamente reactiva para el anticuerpo frente al HCV si alguno o los dos

valores de la prueba duplicada es (o son) reactivo (s), es decir mayor(es) o igual(es) al valor de

la línea de corte.

5. Tras la repetición de la prueba para una muestra inicialemte reactiva, dicha muestra se

considerará no reactiva para el anticuerpo frente al HCV si ambos valores de la prueba por

duplicado son negativos, es decir, inferiores a la línea de corte.



17. Identificación de Chagas Hoja: 112 De: 129







17. IDENTIFICACIÓN DE CHAGAS










PRUEBA DE ESCRUTINIO PARA Tripanosoma cruzi

OBJETIVO:

Identificar los anticuerpos (Acs) anti-T cruzi para disminuir, la posible transmisión de la

enfermedad de chagas a través de los componentes sanguíneos, determinando los Acs

producidos por el individuo (disponente) contra el Tripanosoma cruzi y para dar cumplimiento a la

Normatividad vigente.

FUNDAMENTO:

La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria producida por el Tripanosoma cruz. El

diagnostico de laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad. Durante la

fase aguda, se efectúa directamente mediante la comprobación de los parásitos en sangre o por

métodos inmunológicos como: reacción de fijación de complemento, aglutinacón de látex,

floculación, hemaglutinación, aglutinación directa, imnunofluorescencia o ELISA.

En ésta técnica cualitativa para la detección de anticuerpos anti-T.cruzi, la muestra se diluye en el

soporte en el que se encuentran inmovilizados antígenos recombinantes, obteniéndole un método

de 3ª. Generación. Estos antígenos se obtienen por técnica de ADN recombinante a partir de

proteínas específicas de los estadios epimastigote y tripomastigote del T.cruzi, correspondientes

a zonas altamente conservadas entre distintas cepas. La tecnología empleada permite asegurar

una mezcla antigénica de composición conocida y constante lote a lote, brindando resultados

reproducibles, específicos y con una elevada sensibilidad. Si la muestra contiene los anticuerpos

específicos, éstos formarán un complejo con los antígenos y permanecerán unidos al soporte. La

fracción no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos anti-inmunogloobina










humana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reacción en la primera etapa del proceso, se

unirá el conjugado con peroxidasa. Si se produjo la reacción en la primera etapa del proceso, se

unirá el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimático. En los casos en

que se haya unido el conjugado habrá aparición de color celeste. La reacción se detiene con

ácido sulfúrico, con lo que el color celeste vira al amarillo.

MUESTRA:

Suero o plasma

• Recolección: Obtener de la manera usual. No usar muestras inactivadas por el calor.

Sustancias interferentes conocidas: La hemólisis, hiperlipemia y otras causas de turbiedad

pueden provocar resultados erróneos.

MATERIAL Y EQUIPO:

• Micropipetas capaces de medir los volúmenes indicados.

• Reloj, alarma o cronómetro.

• Estufa a 37° C

• Espectrofotómetro para lectura de policubetas.

ETI-STAR. MARCA DIASORIN REACTIVOS PROVISTOS:

Policubetas sensibilizadas: policubeta de tiras removiles con pocillos que contienen antígenos

recombinantes de T.cruzi inmovilizados.










Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas (cabra) conjugadas con peroxidasa.

Revelador A: peróxido de hidrógeno de hidrógeno 60mmol/l en buffer citrato 50 mmol/l pH 3.2.

Revelador A: tetrametilbencidina (TMB) 0.01 mol/l en ácido clorhídrico 0.1N.

Stopper: ácido sulfúrico 2N.

Buffer de lavado concentrado: cloruro de sodio 1.4 mol/l en buffer fosfatos 100 mmol/l y

tensioactivo no iónico 0.1 g/l

Diluyente de muestras: albúmina bovina en solución fisiológica tamponada con buffer fosfatos pH

7.2.

Control Positivo: dilución de suero inactivado conteniendo anticuerpos contra Tripanosoma cruzi.

Control negativo: dilución de suero no reactivo, inactivado.

Los reactivos provistos son estables en refrigerador (2 - 10 °C) hasta la fecha de vencimiento

indicada en la caja. No congelar.

PROCEDIMIENTO:

Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. Una vez

iniciado el procedimiento debe completarse sin interrupción.

Procesar simultáneamente 2 Controles Positivos (CP) 3 Negativos (CN) y los desconocidos (D).

Al depositar la muestra y/o Controles sobre el Diluyente de Muestras, debe asegurarse de colocar

los mismos en el seno del líquido y no sobre las paredes o el fondo del pocillo. Enjuagar la pipeta

con el Diluyente dispensado en el pocillo para asegurar la correcta homogeneización.










En los pocillos a utilizar de la policubeta colocar:

D CP CN

Diluyente de muestras 200 ul 200 ul 200 ul

Control Positivos - 10 ul -

Control Negativo - - 10 ul

Muestra 10 ul - -

Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos una vez

cargadas las muestras en cada tira. Para evitar la evaporización, cubrir la placa e incubar en la

estufa 30 minutos a 37 °C. Luego espirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo recibiéndolo

en un recipiente para desechos biológicos que contenga 5% de hipoclorito sódico. A continuación,

lavar 5 veces con Buffer de lavado empleando aproximadamente 300 ul/vez/pocillo. Después de

cada lavado, el líquido se descartará también en el recipiente con hipoclorito. Opcionalmente,

emplear lavador automático. Al finalizar el último lavado, eliminar por completo el líquido residual,

invirtiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobre papel absorbente, ejerciendo una leve

presión con la mano sobre los laterales mayores del soporte, para evitar la caída de las tiras de

pocillos. Luego agregar en cada pocillo.

Conjugado 1 gota 1 gota 1 gota

En caso de utilizar micropipeta automática, dispensar 50 ul. Mezclar aplicando suaves golpes en

los laterales de la policubeta durante 10 seg. Para evitar la evaporización, cubrir la placa e

incubar 30 minutos en estufa a 37°C. luego aspirar el líquido de los pocillos, recibiéndolo en el

recipiente con hipoclorito y lavar según se indicó más arriba. Al finalizar el último lavado, eliminar

por completo el líquido residual, inviertiendo la policubeta y golpeándola varias veces sobre papel










absorbente, ejerciendo una leve presión con la mano sobre las laterales mayores del soporte,

para evitar la caída de las tiras de pocillos. Luego agregar en cada pocillo.

Re velador A 1 gota 1 gota 1 gota

Revelador B 1 gota 1 gota 1 gota


los laterales de la policubeta durante 10 segundos. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente y

luego agregar:

Stopper 1 gota 1 gota 1 gota


los laterales de la policubeta durante 10 segundos.

Leer en espectrofotómetro a 450 nm o dicromática a 450/620-650 nm o evaluar el resultado a

simple vista por comparación con los Controles Positivos y Negativos.

ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL

El color de la reacción es estable durante 30 min., por lo que los resultados deben observarse

durante ese lapso.










CRITERIOS DE VALIDACION DE LA CORRIDA

La corrida se considera válida si se cumplen simultáneamente las siguientes condiciones:

a) Las lecturas de al menos 2 de los 3 Controles Negativos corregidas contra el Blanco

de Reactivos deben ser menores o iguales a 0.150 D.O.

b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debe ser mayor o igual a 0.600

D.O.

Si una o ambas condiciones no se cumple, repetir la corrida, para ambos casos recordar que las

lecturas obtenidas dependerán de la sensibilidad del aparato empleado.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:

a) Con instrumental óptico:

La presencia o ausencia de anticuerpos anti-T.cruzi se determina relacionado la absorbacia de la

muestra respecto al valor Cut-off.

Cut-off=CN + 0.300 D.O.

Donde CN: promedio de las lecturas del Control Negativo.

Zona de indeterminación: Cut-off + 10%

Muestras No Reactivas: Se consideran aquellas con absorbancia menores al límite inferior de la

zona de indeterminación.

Muestras Reactivas: se consideran aquellas con absorbacias mayores al límite superior de la

zona de indeterminación.










Muestras indeterminadas: se consideran aquellas con absorbacias que caen dentro de la zona de

indeterminación. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.

b) Interpretación visual

Si se opta por este tipo de interpretación debe considerarse No reactiva toda muestra que no

presente una coloración mayor que la de los Controles Negativos. Por el contrario, una muestra

netamente amarilla se considera Reactiva.



18. Fraccionamiento de Sangre Hoja: 120 De: 129







18. FRACCIONAMIENTO DE SANGRE










FUNDAMENTO:

La elección cuidadosa del elemento a fraccionar favorece el aprovechamiento óptimo de la sangre,

es decir la donación de una persona puede beneficiar a cuatro pacientes al separarse en:

Concentrados eritrocitarios, plasma fresco congelado, plasma desprovisto de F-VIII, concentrado

plaquetario y concentrado de factor VIII ó crioprecipitado. La sangre y sus componentes se

indican para sustituir el elemento específico en déficit, los glóbulos rojos para transporte de O2,

plasma para restituir volumen, proteínas pro-coagulantes y poder onicótico , plaquetas para

trombocitopenia y factor VIII en hemofilia.

MATERIAL Y EQUIPO:

• Tijeras

• Centrífuga Refrigerada.

• Balanza.

• Prensa.

• Hematron.

• Bolsas de colección de sangre.

• Pinzas Rodillo.

• Pinzas de Kelly

PROCEDIMIENTO:

A) Preparación de glóbulos rojos (Bolsa doble) y plasma fresco congelado (P.F.C.). Para este

procedimento se debe de usar una unidad de recolección que tenga una bolsa de transferencia.

La separación del plasma de los glóbulos rojos puede ser o hacerse de la siguiente forma:










Por centrifugación entre (3000) RPM Durante 15 minutos la temperatura de la centrífuga debe ser

de 4°C.

TÉCNICA DE SEPARACIÓN:

Una vez centrifugadas las bolsas de sangre como se indicó anteriormente seguir los

siguientes pasos:

1. Colocar la bolsa de sangre centrifugada en el extractor de plasma.

2. Libere el mecanismo de presión suavemente.

3. Cierre con una pinza hemostática el tubo que comunica a una de las bolsas satélite.

4. Romper el sello de la bolsa madre y dejar fluir el plasma en la otra bolsa satélite. Se debe

usar una bolsa para medir la cantidad de plasma obtenido.

5. Cerrar con otra pinza hemostática el tubo de comunicación , por el cual esta fluyendo el

plasma , cuando haya pasado la cantidad estipulada, sellar el tubo piloto con un sellador

electrónico (hematrón).

6. Identificar la unidad de plasma con el mismo sistema que se usó para la bolsa madre, cortar

el piloto después de haber sellado.

7. Pilotear con una separación de 5 ó 10 cm. de separación todo el tubo piloto que quedó en

la bolsa del concentrado eritrocitario y colocarlo a un costado de la bolsa para pruebas

futuras.

8. Del mismo modo para el paquete de plasma como se indicó anteriormente , pilotear el

tubo y adicionarlo al extremo de la bolsa.










9. El concentrado eritrocitario debe ser guardado en un refrigerador especial a una

temperatura entre 4 y 6°C para su conservación.

10. El plasma se guarda o se debe mantener a una temperatura de -20°C para su

conservación.

Bolsa Triple

B) Preparación de Concentrados Plaquetarios:

En la recolección de sangre para preparar plaquetas, se debe observar la siguiente

recomendación:

- Dejar la sangre a temperatura ambiente que es entre 20-24°C , hasta que inicie el proceso de

separación.

- Es necesario practicar dos centrifugaciones, la primera a baja velocidad produce el plasma rico

en plaquetas (PRP) y la segunda a alta velocidad , produce un concentrado de plaquetas más

una unidad de plasma pobre en plaquetas (PRP).

- Se señalan tres factores importantes en este procedimiento:

1. El tiempo y la fuerza gravitacional de centrifugación .

2. La técnica de resuspensión de plaquetas después de la centrifugación.

3. El pH del plasma.










Técnica de Preparación.

1. La centrífuga refrigerante debe tener una temperatura de 20°C.

2. Centrifugar a 1800 RPM, durante 10 minutos.

3. Colocar la bolsa de sangre en el extractor y separar el plasma rico en plaquetas en una

bolsa satélite, pinzar el tubo piloto por donde fluye el plasma o sellar una vez terminado el

paso de separación de PRP y cortar.

4. Anotar datos del donador como son nombre, grupo sanguíneo y Rh. sin poner la etiqueta

que quedará al final. (Esto es para tener un mejor control en la identificación de los

productos a obtener.

5. Centrifugar el plasma rico en plaquetas P.R.P. a una velocidad de 3000 R.P.M. x 10

minutos , a una temperatura de 20°C.

6. Colocar la bolsa en el extractor y transferir el plasma sobrenadante a la segunda bolsa

satélite, dejar un volumen de plasma , no menor de 50ml., así las plaquetas serán

conservadas a 20°C.

7. Identificar los productos , tanto el PRP, como el C.P. con las etiquetas elevadas señalando

la fecha, hora de preparación y vencimiento.

8. Colocar los concentrados plaquetarios en un agitador para plaquetas a +20°C, (es

aproximadamente de 1 a 2 horas.) de 3 a 5 días de la bolsa colectora.

9. El plasma pobre en plaquetas se guarda y conserva a una temperatura de -20°C para su

almacenamiento por un año.










OBSERVACIÓN:

Los C.P. deben cumplir con tres parámetros:

1. Volumen de plasma 50ml.

2. Número d plaquetas, no menor de 5.5 x 1010.

3. PH = a 6 por lo menos en el 75% de las unidades preparadas al final del periodo de

expiración.

C) Crioprecipitado de Factor VIII.

El crioprecipitado de factor VIII o factor antihemofílico (FAH) (es la porción del plasma que

precipita en frio, después de que el P.F.C. ha sido descongelado bajo condiciones congeladas.)

Contiene la mayor parte del factor VIII y cierta cantidad de fibrinógeno, de los existentes en la

unidad original de plasma.

Es la proteína que precipita a temperatura de -120°C y posteriormente de descongelar el plasma.

Técnica de Preparación:

1. Colocar la sangre total del donador en bolsas triples y una vez obtenida y centrifugar a

3000 RPM durante 15 minutos.

2. Pasar con un extractor el plasma a una bolsa satélite , pesando en una balanza para

precisar el volumen, sellar el tubo piloto y separar el P.G. refrigerándolo de 2 a 6°C.

3. Poner los datos correspondientes a la bolsa del plasma (no etiqueta).










4. Congelar el plasma rápidamente con hielo seco y acetona para que de un proceso de

congelación (completa o dejar congelar a una temperatura de 20°C durante toda una

noche 14 a 18 Horas) de -120°C.

5. Una vez congelado el plasma, descongelarlo a una temperatura de 1 a 6°C.

6. Ya que estén descongelados, centrifugar el plasma a 4000 RPM durante 15 minutos, a

una temperatura de 4°C.

7. Terminada la centrifugación, colocar la bolsa en un extractor de bolsas y separar el plasma

en la segunda bolsa satélite.

8. Separado ya el plasma, etiquetar debidamente los productos ya fraccionados con todos

los datos.

9. Los plasmas y crioprecipitados se guardarán a una temperatura de -20°C para su

conservación.

CUADRO DE CONSERVACIÓN DE PRODUCTOS:

PRODUCTO ANTICUAGULAN DIAS DE CONSERVACIO

Concentrado Eritrocitario

ADSOL

41 días

Concentrado Eritrocitario C.P.D. ó A.C.D. 21 días

Concentrado Eritrocitario C.P.D.A. 35 días

Plasma Fresco Congelado 1 año

Plasma sin Factor VIII 1 año

Plasma Pobre en Plaquetas 1 año

Concentrado Plaquetario 3 días a 5 días

Factor VIII o crioprecipitado 1 año










Datos que debe contener la etiqueta:

Datos del Hospital ó Instituto

1. Nombre del donador.

2. Grupo y Rh.

3. Fecha de extracción.

4. Fecha de caducidad.

5. Hematocrito.

6. Volumen.

7. Producto. (C.E., P.F.C., C.P. Y (C.P.D.O.) (CPDO)

8. Número de registro.

9. Hora y tiempo de extracción.

C.E.: Concentrado Eritrocitario.

P.F..C.: Plasma Fresco Congelado.

P.P.P.: Plasma Pobre en Plaquetas.

C.P.: Concentrado Plaquetario.

C.P.D.O.: Crioprecipitado. (Factor VIII).

Las unidades fraccionadas deben mantenerse en una área perfectamente identificada con la

leyenda “No usar Falta Liberar”, en tanto este tiempo se estarán realizando las pruebas que nos

permiten liberar las unidades como son: HBsAg, HCV, HIV, RPR, BRUCELLA, una vez obtenidos

estos resultados, siendo negativos y rectificando el grupo sanguíneo se procede a etiquetar las

unidades con las siguientes etiquetas, y se colocan en su charola de grupo correspondiente.

NOTA: Si alguna prueba serológica sale positivo, se le dará destino final.





Hoja: 128 De: 129







IV. GLOSARIO DE TÉRMINOS

1. ANTICUERPO IRREGULAR DE IMPORTANCIA CLINICA: Inmunoglobulina inusualmente

presente en el plasma (o suero) que puede causar enfermedad a través de diferentes

mecanismos

2. CONCENTRADOS DE PLAQUETAS: Trombocitos recolectados por aféresis o preparados

mediante fraccionamiento de unidades de sangre fresca.

3. CONCENTRADOS ERITROCITARIOS: Fracción que contiene principalmente glóbulos

rojos, como resultante de la remoción casi completa de plasma.

4. CONTROL DE CALIDAD: método que se lleva a cabo para garantizar la efectividad y

funcionalidad de equipos, reactivos y técnicas, así como, la viabilidad y seguridad de la

sangre y de los componentes sanguíneos.

5. DISPONENTE ALTRUISTA: sujeto que proporciona su sangre o componente de esta, para

quien la requiere.

6. DISPONENTE FAMILIAR: persona que proporciona su sangre o componentes de esta, a

favor de un paciente vinculado con ella.

7. PACIENTE POLIGLOBULICO: Persona que por un proceso patológico primario o

secundario, tiene un incremento absoluto del volumen eritrocítico circulante.

8. PLASMA FRESCO: el que se encuentra en el lapso de las primeras 6 horas después de la

recolección.

9. PLASMA FRECO CONGELADO: el que se congela en el lapso de las primera seis horas,

después de la recolección y así se conserva.

10. PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD: estudio practicado in-vitro empleando muestras de

sangre del disponente y del receptor para comprobar la existencia de afinidad reciproca

entre las células de uno y el suero del otro, para efectos transfusionales.





Hoja: 129 De: 129







11. SANGRE FRESCA: tejido hemático no fraccionado, de menos de 6 horas después de su

recolección

12. SANGRE TOTAL: Tejido hemático no fraccionado, de más de 6 horas después de su

recolección

13. TRANSFUSIÓN AUTOLOGA: aplicación a un individuo, de la sangre o componentes

sanguíneos recolectados de el mismo.

14. TRANSFUSION AUTOLOGA MEDIANTE DEPOSITO PREVIO: disposición de sangre y

componentes sanguíneos que en forma anticipada se acopian para uso terapéutico del

propio disponente.

15. UNIDAD: Volumen de sangre o componente sanguíneo recolectado de un solo disponente.

banco de sangre

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