PRACTICA No. 6

PRUEBA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA (SUERO DE COOMBS)

ANTECEDENTES.

Esta prueba fue descrita por primera vez en 1908 por Moreschi, quien aconsejo su empleo para acelerar y reconocer la aglutinación bacteriana. En 1945 Coombs, Mourant y Race, en Inglaterra, volvieron a descubrir la prueba y la aplicación a la "Identificación de aglutininas Rh débiles e incompletas.

Es casi seguro que la prueba de Coombs de la antiglobulina es el método más sensible conocido para la identificación de anticuerpos. Los anticuerpos demostrados mediante esta técnica, pero que no pueden encontrarse por otros métodos, se llaman a veces criptaglutinoides.

De los sistemas serológicos usados para demostrar la presencia de antígenos ó antoicuerpos de grupos sanguíneos, la prueba de Coombs es considerada como la más eficiente y de mayor valor en el banco de sangre

El fundamento de esta prueba se basa en lo siguiente:

1.- Los anticuerpos son globulinas y además son diferentes a las de otras especies; por lo tanto, se comportan como antígenos cuando se inyectan en otros organismos

1.- Si un animal (conejo, chivo) es inyectado con globulina humana purificadas o con el suero total, este animal las reconoce como extrañas y elabora anticuerpos contra ellas; estos anticuerpos tienen especifidad antiglobulina humana.

2. - El suero antiglobulina humana obtenido reaccionara específicamente con las globulinas humanas.Si moléculas de globulinas, sean anticuerpos o complemento se fijan en la membrana del glóbulo rojo, el suero antiglobulina se combinara con ellos y causara aglutinación de las células.En cambio, si los glóbulos ro están sensibilizadas, no habrá aglutinación, (figura A Y B).En resumen ce puede decir que el principio de la prueba de antiglobulina humana o de Coombs es muy simple: detecta inmunoglobulinas de la clase IgG y/o fracciones del complemento (C3D), unidos a los glóbulos rojos^

FIGURA A. Una molécula de antiglobullna detecta y se combina con dos moléculas de IgG unidas al eritrocito, causando así la aglutinación.

ANTIGLOBULINA DE COOMBS /

FIGURA B. En esta figura se muestra la actividad anticomplementaria (ANTI- C3d).

LAS APLICACIONES MAS COMUNES DE LA PRUEBA DEJX)OMBS SON LAS SIGUIENTES:

1. Dx Y PROFILAXIS DE LA ERITROBLASTOSIS FETALt Se emplea la prueba directa para diagnosticar el trastorno estudiando la sensibilización de los glóbulos de la sangre umbilical. Como profilaxis de la enfermedad se buscan los anticuerpos antes del parto en el suero de la madre mediante la prueba directa.

2. PRUEBA CRUZADA. Es frecuente el empleo de la prueba Coombs indirecta en la búsqueda de anticuerpos incompletos en el suero receptor. Permite reconocer la presencia de anticuerpos RHESUS, KELL, KIDD, DUFFY Y MNSs, sobre todo cuando se emplea suero de Coombs de amplio espectro.

3. TIPO DE SANGRE. La prueba de Coombs indirecta es indispensable para identificar el ALELO Du

4. ESTUDIO DE LAS REACCIONES TRANSFUCIONALES. En este caso, se pueden emplear tanto la prueba directa como la indirecta (la primera en caso de que todo el anticuerpo haya sido absorbido sobre los glóbulos administrados).

5. ESTUDIO DE ANEMIA HEMOLÍTICA.6. ANTICUERPOS CONTRA PLAQUETAS O LEUCOCITOS.

INTRODUCCIÓN.

La prueba de antiglobulina humana se divide en dos:

a. PRUEBA DE COOMBS DIRECTA. En este caso permite establecer la sensibilización de los eritrocitos que tuvo lugar in vivo, o sea en el organismo (por ejemplo: eritroblastosis fetal)

b. PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA. Se sensibilizan los eritrocitos in vitro, por ejemplo, en el tubo de ensayo, exponiéndolos a un suero que contenga anticuerpos incompletos. Si se trabaja con un suero cuyo contenido de anticuerpos se conoce, puede establecerse el contenido del antígeno (fenotipo) en los glóbulos. Inversamente si se trabaja con glóbulos de fenotipo conocido, puede saberse si un suero problema contiene los anticuerpos correspondientes.

FUNDAMENTO.

Cuando un anticuerpo dirigido contra un antígeno contenido en un eritrocito se inserta en la célula, puede ocurrir aglutinación eritrocítica. Ciertos anticuerpos no producen aglutinación a pesar de estar, adheridos a los eritrocitos, cuandose encuentran en medios salinos. Estos_son denominados anticuerpos bloqueadores o incompletos.

El suero de Coombs al ser agregado a los eritrocitos lavados, que están cubiertos con anticuerpos bloqueadores producen la aglutinación.

Las personas Rh negativas que por diversas razones han tenido exposición a eritrocitos Rh positivos, reaccionan produciendo anticuerpos anti-Rh.

En el suero, los anticuerpos bloqueadores pueden ser detectados mediante las pruebas de Coombs indirecta y la de pickles en tanto que los anticuerpos aglutinantes se detectan en soluciones salinas.

OBJETIVOS.

Al terminar la práctica el alumno será capaz de:

1- Realizar Coombs directa e indirecta

2- Identificar su utilidad clínica.

MATERIAL Y APARATOS.

POR EQUIPO.- Gradilla- Tubos 12 x 75 mm- Pipeta serológica de 5 mi:- Pipeta serológica de 1 mi:- Equipo para punción- Tubos al vacío con EDTA- Tubos al vacío sin anticoagulante- Algodón con alcohol (70%)

POR GRUPO.- Centrífuga- Baño María a 37° C

REACTIVOS.

- Suero antiglobulína humana (suero de Coombs)- Solución de tripsina al 1 %- Solución salina isotónica- Células control de Coombs

MATERIAL BIOLOGICO

Sangre obtenida con edtaSangre obtenida sin anticoagulanteEritrocitos O Rh positivos.

METODOLOGÍA.

Prueba de Coombs directa

1. En un tubo de ensayo, colocar 0.5 mi de sangre problema y lavar tres veces con solución salina isotónica.

2. - Después de ultimo lavado, resuspender los eritrocitos con 5 mi de solucion salina para que quede una suspensión aproximadamente de 2%

3. En otro tubo de ensayo, poner dos gotas de la suspensión de eritrocitos lavados, centrifugar y decantar el sobrenadante.

4. Añadir dos gotas de suero de Coombs. Mezclar y centrifugar durante un minuto a 3000 rpm.

5. Agitar suavemente el tubo observando si hay aglutinación al desprenderse el botón de eritrocitos del fondo del tubo. Si esta se observa, se informa la prueba como positiva.

6. En caso de ser negativa, verificar la potencia del suero de Coombs agregando una gota de células control de Coombs. Mezclar y centrifugar.

7. Agitar suavemente los tubos buscando aglutinación. En caso de no existir, se deberá repetir la prueba de Coombs con nuevos reactivos.

8. En la prueba Coombs directa se utiliza la sangre con EDTA. Para Coombs indirecta y Pickles se utiliza la sangre sin anticoagulante y secbtiene el suero (suero problema).

COMENTARIOS.

La prueba de Coombs directa es muy útil en el estudio de las anemias hemolíticas, en tanto que la prueba indirecta tiene su mayor utilidad en la investigación de sensibilización al Rh,

Sobre todo en embarazadas de grupo Rh negativo. Siempre es conveniente asegurarse de la eficacia de los reactivos con el uso de células control de Coombs.RESULTADO:

CUESTIONARIO:

CONCLUSIONES.

BIBLIOGRAFÍA.

Utilizada por el alumno:

BIBLIOGRAFÍA:

1.- Vargas Álvarez Mario. (1998). Manual de practicas para el Laboratorio de Análisis Clínicos. FES-Zaragoza, UNAM. México Pp. 191-193.