EK-11

ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

KESİN RAPORU

Proje Başlığı

Deneysel glioma modellerinde sürekli intrakranial suberoylanilide hydroxamic asid inhibitörlerinin

infüzyonu ve yüksek grade’li glial tümörlerde mevcut gen defektlerine yönelik kemoterapi

protokollerinin geliştirilmesi

Proje Yürütücüsünün İsmi

Prof.Dr.Yücel Kanpolat

Türkiye Bilimler Akademisi, Başkan

Yardımcı Araştırmacıların İsmi

Doç.Dr.Hasan Çağlar Uğur

Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroşirürji Ana Bilim Dalı/

Öğretim Üyesi

Prof.Dr.Ali Savaş

Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroşirürji Ana Bilim Dalı/

Öğretim Üyesi

Doç.Dr.Aylin Okçu Heper

Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı/ Öğretim Üyesi

Uzm.Dr.Mevci Özdemir

Diyarbakır Ergani Devlet Hastanesi/ Beyin ve Sinir Cerrahi Kliniği

Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2010"

Projenin Türkçe ve İngilizce Adı: Deneysel glioma modellerinde sürekli intrakranial suberoylanilide

hydroxamic asid inhibitörlerinin infüzyonu ve yüksek grade’li glial tümörlerde mevcut gen defektlerine

yönelik kemoterapi protokollerinin geliştirilmesi

Continuous intracranial administration of suberoylanilide hydroxamic acid in an orthotopic glioma

model and improvement of chemotherapy protocols in terms of gentic defects in human malignant

gliomas

Özet

Gliomalar primer beyin tümörlerinin %60’ını oluştururlar (1, 2). Dünya Sağlık Örgütü (WHO)

bu tümörleri atipi, mitoz, endotelial proliferasyon ve nekroz gibi histopatolojik özelliklerine göre

evrelendirmiştir. Tümör bu özelliklerden hiçbirisini taşımıyorsa evre 1, birisini (genellikle atipi)

taşıyorsa evre 2, ikisini taşıyorsa evre 3, daha fazlasını taşıyorsa evre 4 olarak evrelenmektedir. Grade I

tümörler, tanım gereği bu histopatolojik özelliklerden bağımsız olarak değerlendiren özel glial tümör

tipleridir (pilositik astrositom gibi). Tümörde hafif sellülarite artışı ve hafif atipi bulunuyorsa evre 2,

belirgin sellülarite artışı, atipi bulguları, mitoz sayısında artış içeriyorsa evre 3, nekroz ve endotelyal

proliferasyon gösteriyor ise evre 4 olarak değerlendirilmektedir. Evre 1 ve 2, düşük evreli tümörler

olarak tanımlanmıştır. Bu tümörler yavaş büyürler ve iyi sınırlıdırlar. Grade I olarak kabul edilen

juvenil pilositik astrositoma, pleomorfik ksantoastrositoma ve subependimal dev hücreli astrositoma iyi

sınırlı astrositomlar olarak değerlendirilirler. Tümörlerin grade’i arttıkça daha infiltratif bir görünüm

sergilerler. Grade III ve IV glial tümörler ise yüksek grade’li glial tümörler olarak değerlendirilir, bu

grup içinde de anaplastik astrositoma, glioblastoma multiforme, anaplastik oligodendroglioma ve

anaplastik ependimoma yer alır (1, 3, 4, 5, 6, 7, 8).

Epidemiyolojik çalışmalar ailesel kanser hikâyesinin olmasının, SSS de tümör gelişme riskini

arttırdığını göstermektedir. SSS tümörlü hastaların ortalama %15’inde ailesel malignite hikayesi

bulunmaktadır (6, 9, 10, 11).

Hücre siklusundaki özellikle DNA sentezinin olduğu S fazında pek çok genin düzenlediği

karmaşık supresyon ve aktivasyon noktaları mevcuttur. Malignite gelişim sürecinde tümör süpresor

genlerde allel kaybı onkogenlerde ise amplifikasyon olmaktadır. Önce retinoblastoma geni ve p53

sonrasında da bir çok tümör supressör gen (p16, p15, PTEN….) bulunmuştur. Onkogenler

protoonkogenlerin mutasyonel varyasyonlarıdır ve hücre proliferasyonunu uyarırlar. Bunların

başlıcaları Ras, MDM-2, PDGF, CDK-4’tür. Tümor süpressor genler, özelikle DNA sentezi

aşamasında mutasyonel DNA ortaya çıktığı dönemde apopitozu indükler. Tümör supressor

genlerindeki fonksiyon kaybı için genin karşılıklı her iki allelinin mutasyona uğraması gerekir (10, 12,

13, 14, 15, 16, 17).

Erişkin yaş grubundaki primer beyin tümörlerinin % 40-45’ini yüksek gradeli astrositomalar

oluşturur. Bu sebeple çalışma grubunda sadece yüksek gradeli tümörler ele alınmıştır (18).

Anaplastik astrositomalar gliomların yaklaşık %30’unu oluşturur, ortalama görülme yaşı 46’dır

ve belirtilerin ortaya çıkış süresi ortalama 16 aydır. Astrositomalarda 17. kromozomun kısa kolundaki

(17p) p53 geninin (telomerden yaklaşık 15-20 santimorgan uzaklıkta 53 kiloDalton ağırlığında, 11

ekson ve 10 introndan oluşan protein sentezleyen supressor gen) inaktivasyonunun gliomun

gelişmesinde önemli bir yeri vardır. Yedinci kromozomda aberasyon ve fazlalık sıklıkla saptanır.

Ayrıca 1. kromozomda TP73 geni (p53 benzeri tümör supressör gen), 9. kromozomda MTS 1 ve 2

geni, 13. kromozomda VEGF reseptörleri ve retinablastom tümör süpressör geni yitimi söz konusudur.

Yirmiikinci kromozomun PDGFb trombosit orjinli büyüme faktörü yanı sıra NF-2 gen lokusuna göre

daha telometrik yerleşimli “c-sis” onkogeni ve 10. kromozomun supressor genlerinin kaybının da rolü

büyüktür. Onuncu kromozomun her iki kolunda sekans kayıplarıda bildirilmiştir (11, 19, 20, 21, 22).

Epidermal biüyüme faktörü olarak da bilinen ve 7. kromozomda yer alan “Erb Bl” onkogeni ile

birlikte “src”, “ros”, “n-myc”, “c-myc”, “ets”, “erb A2” ve “mel” onkogenlerinin aktivasyonları da

gösterilmiştir. Anaplastik astrositomun tipik moleküler biyolojik özelliği 17. ve 7. kromozomlardaki

anomalilere eşlik eden ARFtümör supressor geni aberasyonudur. Ayrıca retinoblastoma supressor gen

lokusu E2F transkripsiyon faktörünü regüle eder. Anaplastik astrositomalarda bunun kaybı söz

konusudur. Bütün bunlardan ayrı olarak 20. , 3. , 6. , 9. , 11. ve hatta seks kromozomlarında bile

morfolojik kayıplar bildirilmiştir (23, 24, 25, 26, 27, 28).

Glial tümörlerin tedavisi cerrahi eksizyon, post-operatif radyoterapi ve kemoterapiden oluşur.

Rekürrensinde re-operasyon, kemoterapi, interstisyel brakiterapi yada radyocerrahi uygulanabilir. Tüm

tedavi seçenekleri uygulandığında glioblastomalarda ortalama yaşam süresi ne yazık ki 1 yıldan

kısadır. Kesin tedavisi yoktur. Cerrahiye eklenen her tip ek tedavi ile yaşam süresi ortalama 2 yılı

aşmaz. Median yaşam süresi sadece cerrahi uygulananlarda 4 ay, cerrahi+radyoterapide 9,25 ay,

cerrahi+radyoterapi+kemoterapi uygulananlarda ise 10 aydır. Reoperasyon ve/veya ek tedaviler yaşam

süresini 9-12 aya kadar uzatabilir (29, 30).

Glioblastoma multiforme tüm beyin tümörlerinin % 20-25’ini oluştururlar. Kromozom anomali

çalışmaları sonucunda GBM Tip I ve Tip II olmak üzere klinik prognozları da farklı olan iki ayrı

antiteden bahsedilmektedir. Tip I GBM (sekonder GBM), daha çok genç yaş (30-40) grubunda ortaya

çıkar ve düşük grade’li glial tümörlere sekonder olarak gelişir. 17p(-) ve 10q(-) tarzındaki kromozom

anomalilerinin gelişiminin basamaklı seyrettiği ve astrositom- anaplastik astrositom- GBM şeklindeki

oluşumdan sorumlu olduğu düşünülmektedir. Tip II GBM (GBM de novo, primer GBM ), Tip I’e göre

daha ileri yaşlarda (60) ortaya çıkar ve öncesinde bir glioma öyküsü yoktur. Onuncu kromzomun uzun

kolunda delesyon ve 7. kromozomda EGFR artışı söz konusudur (31, 32, 33, 34, 35, 36).

Plazminlerle ve amplifiye edilmiş genlerle moleküler kolonileştirme yöntemleri kullanılarak

glioblastoma multiformede 12.kromozomda “gli” isimli bir onkogenin varlığı gösterilmiştir. Yine

12.kromozom kaynaklı p53’ü inaktive eden bir onkoprotein olan MDM 2’nin de glioblastoma

oluşumunda rol aldığı gösterilmiştir. Glioblastomada ayrıca erbBl, sis, ros, neu, onkogenlerinin varlığı

ve 9.kromozomun kısa kolunda kayıp gösterilmiştir. Glioblastoma multiforme olgularının yaklaşık

%80’inde 10.kromozomda tam ya da kısmi kayıplar bildirilmiştir. Kısmi kayıplardaki bu defektif

bölgenin 10.kromozomun uzun kolunun distalinde prostat kanseri ve melanom için de defektif olarak

bildirilen 24-26 arası bölümdür. Glioblastoma supressor geni de 1997 yılında iki ayrı araştırıcı grubu

tarafından tanımlanmıştır. Bunlar PTEN (phosphate-tensin) ve MMAC 1 (mutated in multiple

advanced cancers-1) genleridir. Bunlaradan PTEN daha yaygın bir kullanım alanı bulmuştur. Son

çalışmalar ile bu lokusun kesin tanımı 10q23.3 olarak tescil edilmiştir (37, 38, 39, 40).

Son dönemlerde bu hastalığın ortalama yaşam süresini arttırmak için birçok yeni tedavi histon

deasetilaz (HDAC) inhibitörlerinin kullanımı gündeme gelmiştir. HDAC inhibitörleri akciğer, kolon,

mesane, meme, prostat, over, endometrium ve hematolojik sistem malignitelerinde kullanılmıştır. Buna

rağmen HDAC inhibitörlerinin gliomalar üzerine etkisi hakkında çok az yayın bulunmaktadır. HDAC

ve histon asetil transferaz (HAT) histonlardaki asetilasyon basamağını düzenlemektedir. Histon

deasetilaz ve histon asetil transferaz tarafından yapılan spesifik histonların amino gruplarının reversibl

asetilasyonu gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmasındaki en önemli basamaktır. HDAC

aktivitelerinin inhibisyonu asetile edilmiş nükleer histonların deasetilasyonu ile sonuçlanır. SAHA

(suberoylanilide hydroxamic acid) Bcl-2 familyasının preapopitotik üyelerinden olup apopitozisi

selektif olarak arttırır ve aynı zamanda proliferasyonuda engeller. Endotelyal hücrelerde ve kanser

hücrelerinde anjiogenezis inhibisyonu ile ilgili genlerin SAHA inhibitörlerinde varlığı gösterilmiştir

(41, 42, 43).

Delesyon veya mutasyonlarla inaktive edilmiş HAT varlığında insan tümörlerinin artışının

bağlantılı olduğu gösterilmiştir. Bu bağlamda bakıldığında SAHA ilerde klinik uygulamaları olma

potansiyeli olan bir ajan olarak görülmektedir (44, 45, 46).

Oligodendrogliomaların genetik analizi sonrasında elde edilen sonuçlar göstermiştirki 1p 19q

delesyonuna sahip tümörler kemoterapiye çok iyi yanıt vermektedir ve beklenen yaşam süresi 1p 19q

delesyonu olmayan tümörlere göre çok daha uzundur. Projenin ikinci basamağının amacı yüksek evreli

glial tümörlerin tedavisinde benzer bir ilişkiyi açığa koyabilmektir (47, 48, 49).

II. Amaç ve Kapsam

İnsan kaynaklı yüksek grade’li glial tümörlerde CGH ile genetik analiz yapılması. Bu tümör

dokularından cell line oluşturulması ve tespit edilen genetik anomaliler ile değişik kemoteropatiklere

olan yanıt arasında fark olup olmadığının araştırılması.

III. Materyal ve Yöntem

İnsan glioblastoma cell line oluşturulması:

Glioblastoma multiforme ön tanısı ile ameliyat edilmesi kararlaştırılan hastalara ameliyat öncesi

çalışmaya katılabilmeleri konusunda bilgi aktarılmıştır. Çalışmaya katılmak isteyen bireylere etik kurul

tarafından onayı alınmış bilgilendirilmiş hasta onam formları imzalatılmıştır.

Tümör parçasının tümörijenik hücre populasyonu içerebileceği ve hücre kültürü yapılabileceği patolog

tarafından saptandıktan sonra ilgili doku materyali 30 dakika içerisinde hücre kültürü laboratuarına

getirilerek primer kültür protokolü uygulanmaya başlanmıştır. Bazı hastalardan tümör dokusu yanında

ameliyat sırasında tümöre ulaşmak için çıkartılan normal doku örnekleri de alınmıştır. Bu durum

hakkında da hastalara ameliyat öncesinde bilgilendirme yapılmıştır.

Protokol:

Tümör dokusunun bir kısmı hücre kültürü amacıyla laminar flow kabin içerisinde ayrılmıştır. Ayrıca,

tümör ve normal beyin dokusuna ait parçaların bir kısmından Trizol protokolüyle RNA elde edilmiştir.

Geri kalan kısımlar ise azot muamelesini takiben -80°C’ye kaldırılmıştır.

Doku kültürü:

1-Doku parçaları laminar flow kabin içerisinde %10 Fetal Bovine Serum (FBS), 4mM L-glutamin,

100U/ml penisilin, 10µg/ml streptomycin içeren medyum (yüksek glikoz) içerisinde 1mm3 hacme

kadar kesilerek küçültülmüştür. Bu işlem sırasında damar parçaları ve nekrotik bölgeler çıkarılmıştır.

2-Doku parçaları içerisinde 10ml %10 FBS’li medyum içeren 50ml’lik falkona aktarılmıştır. Falkon

içerisinde pastör pipeti kullanılarak yapılan karıştırma ve pipetaj yardımıyla parçaların daha iyi

ayrılması sağlandı.

3-Parçalar bu medyum içerisinde 15 dakika bekletildi.

4-15 dakika sonunda parçalar falkon tüpünün alt kısmına çöktü ve üst kısım parçalara yaklaşılmadan

pastör pipeti yardımıyla atıldı. Tekrar 10ml’ye kadar ilgili medyum eklendi, 2. ve 3. basamak işlemleri

tekrar edildi. Bu yıkama işlemleri en az 3 kez tekrarlandı.

5- Son yıkama işlemi sonunda doku parçalarının üzerine 4 ml %40 FBS içeren (yüksek glikoz)

medyum eklendi ve karıştırıldı. Bu karışımın en fazla 1ml’si 25cm2’lik flasklara aktarıldı. Her flaskta

ortalama 20-25 doku parçası olmalıdır. Flasklar %5 CO2’li nemlendirilmiş, 37 ˚C’lik etüve kaldırıldı.

6- Hücreler 48 saat her hangi bir müdahale yapılmaksızın etüv içerisinde bekletildi. Bu aşama doku

parçalarının yüzeye tutunmalarını sağlamak içindir. Doku parça sayısının 25’in üzerinde olması doku

parçalarının homojen biçimde dağılmalarını ve tutunmalarını, medyum miktarının 1ml’nin üzerinde

olması doku parçalarının tutunmalarını engellemektedir.

7- 48 saat sonunda inverted mikroskop yardımıyla hücreler incelendi. Tututan doku parçaları var ise

flaskta yer alan medyumun üst kısmı atılır ve 2ml %40 FBS içeren medyum eklenir.

8-Bu işlem 48 saatte bir yenilendi. Doku parçalarında çıkan hücreler çoğalarak flaskın %50-60’ını

kapladığı zaman pasaj işlemi yapıldı.

9- %0,05’lik Tripsin/EDTA kullanılarak yapılan pasaj işlemi sonrasında ve hücreler %10’luk FCS

içeren medyuma konuldu ve bu aşamada standart hücre kültürü işlemleri uygulandı.

10- Birinci pasaj sonrasında hücrelerde immünositokimyasal yöntemle GFAP (Glial Fibrillary Acidic

Protein) boyaması yapıldı. Bu işlem çoğaltılan hücrelerin gerçek tümör hücresi olduğunu göstermek

amacıyla yapıldı. Bu boya yalnızca glial kökenli hücrelere özgü bir proteini işaretlemektedir.

11- İlk 2 pasaj sonrasında hücreler aynı şartlarda 75cm2’lik flasklara aktarılmış ve sonraki pasajlarda bu

flasklar kullanılmıştır. Deney başlangıcında yer alan kan, epitel ve fibroblastlar pasaj sayısı arttıkça

ortadan kaybolmuş ve glial kökenli hücreler seçilmiştir.

12- Pasajı yapılan hücrelerden bir kısmı likit nitrojen (%90 FBS / %10 DMSO) içinde dondurulmuştur.

Sitotoksisite ve Canlılık Analizleri

Hastalardan elde edilen ve immün boyamayla glial kökenli hücre olduğu saptananlarda çeşitli ilaçlar

kullanılarak MTT ile sitotoksisite ve Trypan mavisiyle de canlılık analizi yapılmıştır. Bu çalışma GBM

olduğu bilinen ticari hücre serilerinde de yapılmıştır. Hücre serilerine GBM tedavisinde en çok

kullanılan Temozolomide (Temodal, Schering-Plough) verilerek MTT ve canlılık analizi yapılmıştır.

Real-Time PCR (Gerçek Zamanlı PZR)

MTT ve Trypan mavisi boyama sonuçlarına göre hücrelere çeşitli dozlarda ilaç kombinasyonları

uygulanmıştır. Özellikle uygulamalar 48 saat üzerinden temozolomid kullanılarak yapılmıştır. 48.saatin

sonunda hücrelerden RNA elde edilmiştir. Elde edilen RNA’lar spektrofotometrik olarak ölçüldükten

sonra cDNA sentezi yapılmıştır. Elde edilen cDNA’lar kullanılarak GBM tedavisinde ilaç direncinden

sorumlu bazı genlerin ekspresyonları araştırılmıştır. Bu analizde kullanılan Real-Time cihazına ait

optimizasyon görüntüleri aşağıda gösterilmektedir.

Sonuçlar

Doku ve Hücre Kültürü:

Elde edilen primer kültürlere ait bazı şekiller aşağıda sunulmuştur.

Şekil I- Doku kültüründe flaska tutunmuş bir tümör parçasından çıkan hücrelerin görünümü-1

Şekil II- Doku kültüründe flaska tutunmuş bir tümör parçasından çıkan hücrelerin görünümü-2

Şekil III- Doku kültüründe flaska tutunmuş bir tümör parçasından çıkan hücrelerin görünümü-3

Şekil IV- Doku kültüründe flaska tutunmuş bir tümör parçasından çıkan hücrelerin görünümü-4

Şekil V: Farklı hastalara ait dokularadan elde edilen astrsoit kökenli hücreler

Şekil VI- a) GFAP İmmün boyama öncesinde glial hücreler b) GFAP İmmün boyama sonrasında glial hücreler

a b

a b

Şekil VI- a) GFAP İmmün boyama öncesinde glial hücreler b) GFAP İmmün boyama sonrasında glial hücreler

MTT ve Canlılık Testi

Hastalara ait hücrelere ve ticari olarak alınan hücre serilerinde Temozolomide ait sitotoksisite ve

canlılık testi sonuçları birbirine yakın bulunmuştur. Temozolomid’in 250, 500 ve 1000µM’lık

konsatrasyonlarının toksik olduğu yapılan 24, 48 ve 72. saat testlerinde gösterilmiştir. Hastalar ait

hücrelerin IC50 değerleri Graphad Prizm programı ile hesaplanmıştır.

Real-Time PCR (Gerçek Zamanlı PZR)

PZR sonucunda Temozolomide direnç gösteren bazı genlerin ekspresyonunun anlamlı olarak düştüğü

saptanmıştır. Ekspresyon analizlerine ait tablolar ileride sunulacaktır. Araştırılan gen sayısı arttırılarak

çalışmaya devam edilmektedir. Aşağıda gerçek zamanlı PZR’ın optimizasyonuna ait grafikler

verilmiştir. PZR etkinliği 1.93 olarak saptanmıştır.

Şekil- a) Real-Time amlifikasyon ve b) standart eğrinin optimizasyon görüntüsü

Sitogenetik ve CGH:

Elde edilen tümör dokusunun hangi kromozomal bölgelerinde defekt içerdiğinin saptanması için

elde edilen materyallerden sitogenetik analiz yapıldı. Elde edilen verilere göre gen bölgelerinin

daraltılması için CGH veya aCGH yapıldı.

a b

Sitogenetik analiz:

Her bir flasktan 5 ml süspanse kültür alınarak 15 ml’lik konikal tüplere aktarıldı. 0.04µg/ml son

konsantrasyonda kolşisin eklenen tüpler 4 saat 37°C'de bekletildi. Örnekler 900 rpm'de 10' santrifüjde

çevrildikten sonra üst faz atıldı ve gevşetilen çökelti üzerine konulan hipotonik (0.075 M KCl) ile 5

ml'ye tamamlandı. Otuz dakika 37°C'de bekletilen tüpler yine aynı devirde 10' çevrilip ve üst faz

atıldıktan sonra çöküntü bu kez Carnoy fiksatifi (metanol: asetik asit 3:1, Merck #6008 ve #56) ile 5

ml'ye tamamlandı. Fiksatif ile yıkama işlemi 3 kez tekrarlandı. Son üst faz atıldıktan sonra çöküntü

temiz, ıslak ve soğuk lamlar üzerine yayıldı. %5 Giemsa ile boyanan preparatlarda 20 metafaz

değerlendirildi (Rooney ve Czepulkowski, 1992b).

CGH:

Test ve referans DNA’ların “Nick Translation” (NT) yöntemi ile işaretlendi. Fragman

boylarının 300-3000 bç arasında olduğundan emin olmak için, NT ürünlerinin 8’er µl’si, %1’lik agaroz

jele yüklenecek 90 V’da yaklaşık 45 dakika olacak şekilde elektroforez işlemi gerçekleştirildi.

CGH hibridizasyonu için CGH Hybridization Reagents Kit’i kullanıldı. Normal bir bireye ait lenfosit

kültüründen elde edilmiş hedef preparatlar (Vysis, 30-806010) inverted mikroskop (Olympus) altında

metafaz yoğunluğu ve kalitesi açısından değerlendirildi ve optimum hibridizasyon için uygun alanlar

belirlendi. Preparatlar dehidrate ve denatüre edildi ve 55°C’deki “hot plate”de kurutuldu. Her bir prob

karışımı 10µl olacak şekilde, preparat üzerinde daha önceden belirlenmiş alanlara uygulandı ve

üzerlerine 22x22mm lamel kapatılarak 37 °C’lik etüvde, nemli ve ışık almayan kapalı bir kutuda

yaklaşık 96 saat inkübe edildi. Lamellerin uzaklaştırılmasından sonra, preparatlar, 75°C’deki su

banyosunda bulunan yıkama solüsyonlarından geçirildi. Kurumuş prepratlar üzerinde prob uygulanan

bölgelere 10 µl DAPI II konarak lamel ile kapatıldı.

Preparatların değerlendirilmesi Olympus BX61 mikroskobunda yapıldı. Görüntü analizi için

Cytovision 3.1 yazılım programı (Applied Imaging) kullanıldı. Her bir hücre için sırasıyla DAPI,

spectrum-green ve spectrum-red filtreleri kullanılarak 3 ayrı görüntü elde edildi ve kalite kontrol

kriterlerini geçen hücreler analize dahil edildi. Her örnekte optimum 20 metafaz için bu işlem

tekrarlandı. Her hücre için karyotip işlemi bitirildikten sonra, çalışılan örneğin elde edildiği kişinin

cinsiyetine uygun standart referans aralığı seçilerek %95 güven aralığında CGH profilleri

değerlendirildi.

Sitotoksite çalışması:

Oluşturulan cell line’larda günümüzde kullanılan kemoteropatikler ve deneysel olarak deneme

aşamasında olan diğer ajanların insan glioma cell line’larındaki etkileri CCK-8 assay ile saptandı.

Sitogenetik analizlerden elde edilen veriler ile sitotoksisite çalışmalarından elde edilen istatisiksel

olarak değerlendirildi ve farklı yolakların etkilendiği durumlar için farklı kemoterapi kullanımının

klinik sonuçlarını etkileyip etkilemediği konusunda veri oluşturulmaya çalışıldı.

IV. Analiz ve Bulgular

Çalışmaya alınan hastalar tamamlanmış olup testler devam etmektedir. Bulguların daha sağlıklı

yorumlanması için testlerin neticelenmesi ile birlikte kesin sonuç bildirilecektir.

V. Sonuç ve Öneriler

Çalışmanın tamamlanması ile birlikte glioma tedavisine ışık tutacak yeni bulgulara ulaşılması

beklenmektedir. Testlerin tamamlanması ile birlikte sonuç ve öneriler ek rapor halinde

sunulacaktır.

VI. Kaynaklar

1. Baek SY, Kim SR, Bae MK, Hwang JW, Kim JS, Choi YH, et al: Trichostatin A increases the

thermosensitivity of human glioblastoma A172 cells. Neurosci Lett 396:230-234, 2006

2. Bansal K, Liang ML, Rutka JT: Molecular biology of human gliomas. Technol Cancer Res

Treat 5:185-194, 2006

3. Burzynski SR, Janicki TJ, Weaver RA, Burzynski B: Targeted therapy with antineoplastons

A10 and AS2-1 of high-grade, recurrent, and progressive brainstem glioma. Integr Cancer

Ther 5:40-47, 2006

4. Butler LM, Agus DB, Scher HI, Higgins B, Rose A, Cordon-Cardo C, et al: Suberoylanilide

hydroxamic acid, an inhibitor of histone deacetylase, suppresses the growth of prostate cancer

cells in vitro and in vivo. Cancer Res 60:5165-5170, 2000

5. Canes D, Chiang GJ, Billmeyer BR, Austin CA, Kosakowski M, Rieger-Christ KM, et al:

Histone deacetylase inhibitors upregulate plakoglobin expression in bladder carcinoma cells and

display antineoplastic activity in vitro and in vivo. Int J Cancer 113:841-848, 2005

6. Chinnaiyan P, Vallabhaneni G, Armstrong E, Huang SM, Harari PM: Modulation of radiation

response by histone deacetylase inhibition. Int J Radiat Oncol Biol Phys 62:223-229, 2005

7. Chintagumpala MM, Friedman HS, Stewart CF, Kepner J, McLendon RE, Modrich PL, et al:

Open-label simultaneous radio-chemotherapy of glioblastoma multiforme with topotecan in

adults. J Neurooncol 77:193-198, 2006

8. Cohen LA, Marks PA, Rifkind RA, Amin S, Desai D, Pittman B, et al: Suberoylanilide

hydroxamic acid (SAHA), a histone deacetylase inhibitor, suppresses the growth of carcinogen-

induced mammary tumors. Anticancer Res 22:1497-1504, 2002

9. Combs SE, Heeger S, Haselmann R, Edler L, Debus J, Schulz-Ertner D: Treatment of Primary

Glioblastoma Multiforme with Cetuximab, Radiotherapy and Temozolomide (GERT) - Phase

I/II Trial: Study Protocol. BMC Cancer 6:133, 2006

10. DeAngelis LM: Brain tumors. N Engl J Med 344:114-123, 2001

11. Entin-Meer M, Rephaeli A, Yang X, Nudelman A, VandenBerg SR, Haas-Kogan DA: Butyric

acid prodrugs are histone deacetylase inhibitors that show antineoplastic activity and

radiosensitizing capacity in the treatment of malignant gliomas. Mol Cancer Ther 4:1952-

1961, 2005

12. Eyupoglu IY, Hahnen E, Buslei R, Siebzehnrubl FA, Savaskan NE, Luders M, et al:

Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) has potent anti-glioma properties in vitro, ex vivo

and in vivo. J Neurochem 93:992-999, 2005

13. Fandy TE, Shankar S, Ross DD, Sausville E, Srivastava RK: Interactive effects of HDAC

inhibitors and TRAIL on apoptosis are associated with changes in mitochondrial functions and

expressions of cell cycle regulatory genes in multiple myeloma. Neoplasia 7:646-657, 2005

14. Giussani C, Carrabba G, Pluderi M, Lucini V, Pannacci M, Caronzolo D, et al: Local

intracerebral delivery of endogenous inhibitors by osmotic minipumps effectively suppresses

glioma growth in vivo. Cancer Res 63:2499-2505, 2003

15. Gui CY, Ngo L, Xu WS, Richon VM, Marks PA: Histone deacetylase (HDAC) inhibitor

activation of p21WAF1 involves changes in promoter-associated proteins, including HDAC1.

Proc Natl Acad Sci U S A 101:1241-1246, 2004

16. Hockly E, Richon VM, Woodman B, Smith DL, Zhou X, Rosa E, et al: Suberoylanilide

hydroxamic acid, a histone deacetylase inhibitor, ameliorates motor deficits in a mouse model

of Huntington’s disease. Proc Natl Acad Sci USA 100:2041-2046, 2003

17. Hsi LC, Xi X, Lotan R, Shureiqi I, Lippman SM: The histone deacetylase inhibitor

suberoylanilide hydroxamic acid induces apoptosis via induction of 15-lipoxygenase-1 in

colorectal cancer cells. Cancer Res 64:8778-8781, 2004

18. Kamitani H, Taniura S, Watanabe K, Sakamoto M, Watanabe T, Eling T: Histone acetylation

may suppress human glioma cell proliferation when p21 WAF/Cip1 and gelsolin are induced.

Neuro-oncol 4:95-101, 2002

19. Kelly WK, O'Connor OA, Krug LM, Chiao JH, Heaney M, Curley T, et al: Phase I study of an

oral histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid, in patients with advanced

cancer. J Clin Oncol 23:3923-3931, 2005

20. Kelly WK, Richon VM, O'Connor O, Curley T, MacGregor-Curtelli B, Tong W, et al: Phase I

clinical trial of histone deacetylase inhibitor: suberoylanilide hydroxamic acid administered

intravenously. Clin Cancer Res 9:3578-3588, 2003

21. Kim EH, Kim HS, Kim SU, Noh EJ, Lee JS, Choi KS: Sodium butyrate sensitizes human

glioma cells to TRAIL-mediated apoptosis through inhibition of Cdc2 and the subsequent

downregulation of survivin and XIAP. Oncogene 24:6877-6889, 2005

22. Kim MS, Blake M, Baek JH, Kohlhagen G, Pommier Y, Carrier F: Inhibition of histone

deacetylase increases cytotoxicity to anticancer drugs targeting DNA. Cancer Res 63:7291-

7300, 2003

23. Kim MS, Kwon HJ, Lee YM, Baek JH, Jang JE, Lee SW, et al: Histone deacetylases induce

angiogenesis by negative regulation of tumor suppressor genes. Nat Med 7:437-743, 2001

24. Komatsu N, Kawamata N, Takeuchi S, Yin D, Chien W, Miller CW, et al: SAHA, a HDAC

inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells.Oncol Rep

15:187-191, 2006.

25. Leon SP, Folkerth RD, Black PM: Microvessel density is a prognostic indicator for patients

with astroglial brain tumors. Cancer 77:362-372, 1996

26. Lin RJ, Nagy L, Inoue S, Shao W, Miller WH Jr, Evans RM: Role of the histone deacetylase

complex in acute promyelocytic leukaemia. Nature 391:811–814, 1998

27. Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK: Histone deacetylases and

cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer 1: 194–202, 2001

28. Munshi A, Kurland JF, Nishikawa T, Tanaka T, Hobbs ML, Tucker SL,et al: Histone

deacetylase inhibitors radiosensitize human melanoma cells by suppressing DNA repair

activity. Clin Cancer Res 11:4912-4922, 2005

29. Munster PN, Troso-Sandoval T, Rosen N, Rifkind R, Marks PA, Richon VM: The histone

deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid induces differentiation of human breast

cancer cells. Cancer Research 61: 8492–8497, 2001

30. O'Connor OA, Heaney ML, Schwartz L, Richardson S, Willim R, MacGregor-Cortelli B, Curly

T, et al: Clinical experience with intravenous and oral formulations of the novel histone

deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in patients with advanced hematologic

malignancies. J Clin Oncol 24:166-173, 2006

31. Qian DZ, Kato Y, Shabbeer S, Wei Y, Verheul HM, Salumbides B, et al: Targeting tumor

angiogenesis with histone deacetylase inhibitors: the hydroxamic acid derivative LBH589. Clin

Cancer Res 12:634-642, 2006

32. Qian DZ, Wang X, Kachhap SK, Kato Y, Wei Y, Zhang L, et al: The histone deacetylase

inhibitor NVP-LAQ824 inhibits angiogenesis and has a greater antitumor effect in combination

with the vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor

PTK787/ZK222584. Cancer Res 64:6626-6634, 2004

33. Reardon DA, Rich JN, Friedman HS, Bigner DD: Recent advances in the treatment of

malignant astrocytoma. J Clin Oncol 24:1253-1265, 2006

34. Richon VM, Sandhoff TW, Rifkind RA, Marks PA: Histone deacetylase inhibitor selectively

induces p21WAF1 expression and gene-associated histone acetylation. Proc Natl Acad Sci U S

A 97:10014-10019, 2000

35. Sambucetti LC, Fischer DD, Zabludoff S, Kwon PO, Chamberlin H, Trogani N, et al: Histone

deacetylase inhibition selectively alters the activity and expression of cell cycle proteins leading

to specific chromatin acetylation and antiproliferative effects. J Biol Chem 274:34940-34947,

1999

36. Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, Weller M, Fisher B, Taphoorn MJ, et al: Radiotherapy

plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med 352:987-996,

2005

37. Schmidt KF, Ziu M, Schmidt NO, Vaghasia P, Cargioli TG, Doshi S, et al: Volume

reconstruction techniques improve the correlation between histological and in vivo tumor

volume measurements in mouse models of human gliomas. J Neurooncol 68:207-215, 2004

38. Schmidt NO, Ziu M, Carrabba G, Giussani C, Bello L, Sun Y, et al: Antiangiogenic therapy by

local intracerebral microinfusion improves treatment efficiency and survival in an orthotopic

human glioblastoma model. Clin Cancer Res 10:1255-1262, 2004

39. Suzuki T, Nagano Y, Kouketsu A, Matsuura A, Maruyama S, Kurotaki M, et al: Novel

inhibitors of human histone deacetylases: design, synthesis, enzyme inhibition, and cancer cell

growth inhibition of SAHA-based non-hydroxamates. J Med Chem 48:1019-1032, 2005

40. Takai N, Kawamata N, Gui D, Said JW, Miyakawa I, Koeffler HP: Human ovarian carcinoma

cells: histone deacetylase inhibitors exhibit antiproliferative activity and potently induce

apoptosis. Cancer 101:2760-2770, 2004

41. Takai N, Desmond JC, Kumagai T, Gui D, Said JW, Whittaker S, et al: Histone deacetylase

inhibitors have a profound antigrowth activity in endometrial cancer cells. Clin Cancer Res

10:1141-1149, 2004

42. Weidner N, Semple JP,Welch WR, Folkman J: Tumor angiogenesis and metastasis-correlation

in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 324:1-8, 1991

43. Wetzel M, Premkumar DR, Arnold B, Pollack IF: Effect of trichostatin A, a histone deacetylase

inhibitor, on glioma proliferation in vitro by inducing cell cycle arrest and apoptosis. J

Neurosurg 103(6 Suppl):549-556, 2005

44. Zhang C, Richon V, Ni X, Talpur R, Duvic M : Selective induction of apoptosis by histone

deacetylase inhibitor SAHA in cutaneous T-cell lymphoma cells: relevance to mechanism of

therapeutic action. J Invest Dermatol 125:1045-1052, 2005

45. Dai C., Holland E.C. Glioma Models Biochimica et Biophysia Acta 1551 M19-M27, 2001

46. Furnari B, Su Huang H.J., Caneve W.K : Molecular Biology of Malignant Degeneration of

Astrocytoma Pediatric Neurosurgery 24:41-49, 1996

47. Hegi M.E., Klein M.A., Rüedi D., Chene P, Hamou M.F., Aguzzi A: p53 Transdominance But

No Gain Of Function in Mouse Brain Tumor model. Cancer Research 60:3019-3024, 2000

48. Barker F.G, Chen P, Furman F, Aldape K.D, Michael S.B, Edwards And Mark A: P16 deletion

and mutation analysis in human brain tumors. Journal of Neuro-Onkoloji 31:17-23, 1997

49. Ugur HC, Sayan AE, Kanpolat Y, Ozturk M. Expression of TAP73 and ∆NP73 in malignant gliomas. Oncology Rep (B) 11(6): 13337-1341, 2004.