9a. micobacterias

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  • I

    Procedimientos en Microbiologa Clnica

    Recomendaciones de la Sociedad Espaola de EnfermedadesInfecciosas y Microbiologa Clnica

    Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantn

    Coordinador: Fernando Alcaide Fernndez de VegaAutores: Fernando Alcaide Fernndez de Vega

    Jaime Esteban MorenoJulin Gonzlez MartnJuan Jos Palacios Gutirrez

    ISBN: 84-609-7032-9

  • II

    INDICE:INDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO1. Introduccin.2. Consideraciones microbiolgicas.3. Clasificacin y consideraciones clnicas.

    3.1. Complejo Mycobacterium tuberculosis3.2. Mycobacterium leprae.3.3. Micobacterias no tuberculosas de crecimiento lento3.4. Micobacterias no tuberculosas de crecimiento rpido3.5. Otras micobacterias no tuberculosas

    4. Muestras: seleccin, recogida, transporte y conservacin.4.1. Eleccin de la(s) muestra(s)4.2. Muestras respiratoras4.3. Sangre4.4. Lquidos estriles (cefalorraqudeo, articular, peritoneal, pleural, pericrdico, etc.).4.5. Tejidos (biopsias)4.6. Orina4.7. Heces.

    5. Microscopa.5.1. Tinciones5.2. Sensibilidad y especificidad5.3. Observacin microscpica5.4. Interpretacin y expresin de los resultados.5.5. Falsos resultados

    6. Pretratamiento de las muestras: digestin y descontaminacin.7. Cultivo.

    7.1. Medios slidos.7.2. Medios bifsicos7.3. Medios lquidos.7.4. Condiciones de incubacin

    8. Identificacin.8.1. Identificacin fenotpica.8.2. Identificacin cromatogrfica.8.3. Identificacin molecular.

    9. Deteccin directa de Mycobacterium tuberculosis en la muestra clnica.9.1. Sistemas de amplificacin comerciales9.2. Sistemas de amplificacin caseros.9.3. Micobacterifagos.

    10. Pruebas de determinacin de la sensibilidad.10.1. Pruebas de sensibilidad en Mycobacterium tuberculosis.10.2. Pruebas de sensibilidad en micobacterias no tuberculosas de crecimiento lento.10.3. Pruebas de sensibilidad en micobacterias no tuberculosas de crecimiento rpido.

    11. Epidemiologa molecular.11.1. Epidemiologa molecular de M. tuberculosis11.2. Epidemiologa molecular

    12. Estructura, dotacin y seguridad del laboratorio de micobacterias.12.1. Niveles de los laboratorios de micobacteriologa12.2. Bioseguridad en el laboratorio de micobacterias

    13. Bibliografa.

  • III

    INDICE DE LOS DOCUMENTOS TCNICOS1. Tincin de Ziehl-Neelsen.2. Digestin y descontaminacin de las muestras clnicas con N-acetil-L-cistena e hidrxido de sodio para el cultivo

    de micobacterias.3. Cultivo de micobacterias en medio slido de Lwenstein-Jensen.4. Cultivo de micobacterias en medios lquidos mediante sistemas automatizados.5. Identificacin fenotpica de las micobacterias6. Identificacin de micobacterias mediante cromatografa lquida de alta presin (HPLC).7. Identificacin molecular de micobacterias mediante PCR-RFLP del gen hsp65 (PRA).8. Deteccin directa de Mycobacterium tuberculosis en muestras clnicas mediante amplificacin genmica (PCR de

    la IS6110).9. Pruebas de sensibilidad en Mycobacterium tuberculosis mediante el mtodo de las proporciones en agar.10. Pruebas de sensibilidad en Mycobacterium kansasii a los frmacos de primera lnea mediante el sistema Bactec

    460.11. Pruebas de sensibilidad en micobacterias de crecimiento rpido mediante microdilucin en caldo.12. Epidemiologa molecular de Mycobacterium tuberculosis mediante spoligotyping.13. Epidemiologa molecular de Mycobacterium tuberculosis mediante RFLP de la IS6110 (ver documento tcnico

    PNT-MMT-02 en el Procedimiento n 18 de los Procedimientos en Microbiologa Clnica, SEIMC. 2 Edicin).

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    Procedimientos en Microbiologa ClnicaRecomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades

    Infecciosas y Microbiologa Clnica

    Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantn

    9a. MICOBACTERIAS. 2005

    Coordinador: Fernando Alcaide Fernndez de Vega

    Autores: Fernando Alcaide Fernndez de Vega Jaime Esteban Moreno

    Julin Gonzlez MartnJuan Jos Palacios Gutirrez

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    1. INTRODUCCINLas micobacterias son un grupo de

    microorganismos de gran importancia clnica, ya queexisten mltiples especies que son agentes causalesde diversas infecciones humanas con una importantemorbilidad y mortalidad. Algunas enfermedades, comola tuberculosis y la lepra, han ido ligadas a la historiadel hombre. A pesar de los esfuerzos realizados parasu control, en la actualidad constituyen uno de losproblemas sanitarios de mayor gravedad a nivelmundial. Segn datos de la OMS, cerca de dosmillones de personas murieron de tuberculosis en 2002.Se calcula que alrededor de un tercio de la poblacinmundial est infectada por el bacilo tuberculoso y quecada segundo se infecta una persona ms. De estaforma las previsiones son desoladoras, ya que seestima que entre 2002 y 2020, cerca de 150 millonesde personas enfermarn y 36 millones fallecern poresta enfermedad. No obstante, hay que considerar queexiste una gran variabilidad geogrfica; el mayornmero de casos ocurren en el Sudeste Asitico yfrica, seguidos por Amrica Latina y el Este deEuropa. Este hecho est directamente relacionado conlas condiciones socioeconmicas y el impacto de laepidemia de la infeccin por el virus de lainmunodeficiencia humana (VIH) en dichas zonas. Aello se une la aparicin, en los ltimos aos, de cepasresistentes y multirresistentes a los agentesantimicrobianos.

    La lepra tambin representa un problema de primerorden. La OMS (2001) ha constatado que, aunqueexiste una disminucin en la prevalencia de laenfermedad, se ha observado un incremento en laincidencia de la misma (>700.000 casos). La mayorade los pacientes se encuentran en Asia, frica ySudamrica, especialmente en seis pases (83%),siendo la India donde se concentran la mayora de loscasos.

    Por otro lado, las micobacteriosis o enfermedadesproducidas por otras micobacterias diferentes deMycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae,han ido tomando un mayor protagonismo. Se haobservado fundamentalmente en los pases con unmayor desarrollo econmico y tambin con la aparicinde la infeccin por el VIH. As, en la ltima dcada enEspaa, en muchos laboratorios de microbiologa estasespecies han supuesto entre el 15 y el 30% de losaislamientos micobacterianos. Todo ello junto alcreciente desarrollo de nuevas tcnicas de cultivo,diagnstico y pruebas de sensibilidad, estcondicionando la metodologa a emplear por loslaboratorios de micobacteriologa.

    2. CONSIDERACIONES MICROBIOLGICASEl gnero Mycobacterium es el nico que pertenece ala familia Mycobacteriaceae y al orden Actynomicetales.Las especies de este gnero presentan un elevadocontenido de G+C (61-71%) en su ADN. Esto es

    compartido por otros gneros relacionados que tambinposeen cidos miclicos en la pared celular, como sonGordona, Tsukamurella, Nocardia y Rhodococcus.

    Las micobacterias son microorganismos aerobiosestrictos, inmviles, de morfologa variable (bacilar ococoide), que no forman esporas y no poseen flagelosni cpsula. En cambio, poseen una pared celulargruesa y con un elevado contenido lipdico que suponeel 60% del peso seco de la misma. Esta pared constade cuatro capas: la ms interna es el peptidoglicanocon molculas de N-acetilglucosamina y cido N-glucolilmurmico con cadenas cortas de alanina oglicina en el caso de M. leprae. Esta capa da rigidez yforma a la bacteria. La segunda poseearabinogalactanos que se encuentran unidos a loscidos miclicos de la tercera capa. Se trata de cidosgrasos de cadena larga (60-90 tomos de carbono) degran importancia taxonmica. La capa ms externa seencuentra constituida por lpidos como el cord factor(trehalosa 6,6-dimicolato) y por mucsidos. Enconjunto, esta composicin de la pared le confiere a lamicobacteria una escasa permeabilidad celular, que esresponsable, entre otras cosas, de la ineficacia demltiples agentes antimicrobianos, as como de lacaracterstica cido-alcohol resistencia condeterminadas tinciones para su visualizacinmicroscpica. Adems, determinados componentes dela pared, como el lipoarabinomanano, intervienen en lapatogenia y favorecen la supervivencia delmicroorganismo en el interior de los macrfagos.

    La gran mayora de las micobacterias de intersclnico tienen un crecimiento muy lento con un tiempode multiplicacin de 15 a 18 horas en condicionesfavorables. De ah que sean necesarias de 1 a 3 o mssemanas de incubacin para obtener un crecimientoapreciable en los medios de cultivo convencionales. Noobstante existe un grupo de especies que tienen uncrecimiento algo ms rpido que les permite, entreotras cosas, diferenciarlas del resto.

    En general las necesidades nutritivas de lasmicobacterias son sencillas, requiriendo una fuente decarbono (glicerol) y nitrgeno (amonio o aminocidos)as como determinadas sales minerales. Tan sloalgunas especies (Mycobacterium genavense oMycobacterium haemophilum) precisan unossuplementos especiales como son micobactina, heminau otros componentes frricos. Por otro lado, elcrecimiento de las micobacterias se ve estimulado porla presencia de CO2 y cidos grasos. Un caso aparte esM. leprae que slo es capaz de crecer en cultivoscelulares.

    Aunque la temperatura ptima de crecimientogeneral suele ser de 35-37C, existen determinadasespecies que precisan temperaturas de 30C(Mycobacterium marinum, Mycobacterium ulcerans, M.haemophilum), 42C (Mycobacterium xenopi) o 52C(Mycobacterium thermoresistibile) para obtener unamejor tasa de crecimiento.

    DOCUMENTO CIENTFICO

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    Un aspecto relevante de estos microorganismos essu mayor resistencia, respecto a otras bacterias noformadoras de esporas, a los cidos, lcalis ydeterminados desinfectantes qumicos. Adems sonmuy resistentes a la desecacin o congelacin, lo queles permite sobrevivir durante semanas o meses en elmedio ambiente, tanto en superficies de objetosinanimados como en el suelo o el estircol. Sinembargo, deben permanecer al abrigo de la luz del solya que los rayos ultravioletas son letales para losmismos. Tambin, el calor (pasteu