Métodos de cultura• Desde a década de 50, os métodos clássicos de cultura utilizados no laboratório

são manuais. Utilizam meios de cultura sólidos e incubação em estufas bacterioló-

gicas convencionais. A leitura das colônias de micobactérias é feita a olho nu e, em

vista disso, o tempo de detecção de positividade da cultura varia de 14 a 28 dias até 8

semanas. • As formas disseminadas e rapidamente progressivas de tuberculose e de outras

micobacterioses, encontradas com frequência em pacientes com Aids, exigiram um

diagnóstico mais rápido. A partir de 1980, os métodos de cultura tiveram avanços

tecnológicos com o desenvolvimento dos sistemas comerciais. Esses sistemas utilizam

um método de processamento e semeadura de amostras muito similar aos métodos

clássicos, de maneira que não diminui o trabalho prévio. Assim o que acelera é a leitura, pois a incubação é monitorada por sistema informatizado que acusa quando há

crescimento celular e, portanto, o tempo de detecção da positividade é menor que o

exigido para os clássicos.• A cultura em meio líquido utilizando sistemas automatizados não radiométricos

e com monitoração contínua são os recomendados para laboratórios que recebem um

grande volume de amostras clínicas, como hospitais e Laboratórios de Referência.

A opção do laboratório pela utilização de um sistema comercial automatizado de

cultura deve levar em consideração vários aspectos como:

• Orçamento regular e contínuo para cobrir as prioridades da cultura.

• Eficiência com que se comercializam os insumos necessários.

• Treinamento dos técnicos no equipamento.

• Rapidez com que se processam as amostras após a coleta.

• Assistência técnica.

• Custo/complexidade/risco biológico.

Etapas da cultura O exame de cultura abrange 5 etapas: • (1) pré-tratamento das amostras clínicas: prepara as amostras,

de acordo com suas características, para as demais etapas metodológicas;

• (2) fluidificação-descontaminação: utiliza agentes químicos para homogeneizar a amostra clínica e eliminar outros microrganismos da mesma;

• (3) semeadura em meio de cultura: proporciona o contato das micobactérias existentes na amostra com as substâncias nutritivas;

• (4) incubação: fornece a temperatura correta e constante, necessária para a multiplicação das micobactérias;

• (5) leitura dos tubos semeados e registro dos resultados: verifica a presença de colônias ou de turvação e/ou de contaminação, como sinal de presença de micobactérias e registra a ocorrência.

Pré-tratamento das amostras• Essa etapa inclui o preparo das amostras clínicas quanto à necessidade

de centrifugação e/ou maceração, de acordo com as suas características.

• As amostras consideradas contaminadas são aquelas provenientes de sítios não

estéreis, tais como escarro, urina, secreções, lavado brônquico, lavado gástrico e fragmento de tecido cutâneo.• As amostras consideradas não contaminadas são aquelas provenientes

de sítios

estéreis, tais como LCR, líquidos (pleural, sinovial, peritonial, pericárdico), fragmentos de órgãos, sangue e medula óssea. Para estas, não é necessário descontaminar. No

entanto, para garantir que a cultura não seja perdida por contaminação, caso as amostras não tenham sido acondicionadas em condições estéreis, é recomendável, após os procedimentos de pré-tratamento, semear metade da amostra diretamente nos meios de cultura e descontaminar a outra metade conforme o método escolhido.

Procedimentos de pré-tratamento de amostras clínicas para cultura de micobactérias

Agentes fluidificantes descontaminantes

• Os agentes químicos (ácidos, bases) liberam as micobactérias do muco e da fibrina (fluidificando o escarro) ou dos tecidos em que estão incluídos, homogeneizando a amostra clínica e eliminando outros microrganismos da mesma (Quadro 2). A eliminação destes proporciona o crescimento das micobactérias sem a competição pelos nutrientes contidos nos meios de cultura. Portanto, essa etapa é realizada apenas nas amostras contaminadas por microbiota associada ou ambiental.

• A escolha do agente fluidificante descontaminante e do meio de cultura está relacionada com o tipo de amostra clínica a ser processada. Para as amostras de escarro, a concentração do Hidróxido de sódio pode estar em concentrações de até 4%, e para as outras amostras pulmonares e extrapulmonares a concentração não deve ser superior a 2%.

Quadro 2 : Agentes fluidificantes-descontaminantes usados no tratamento de amostras clínicas para cultura de micobactérias

Meios de cultura

• As micobactérias são exigentes para sua multiplicação em meios de cultura e requerem meios específicos. Os meios de cultura podem ser de consistência sólida à base de ovos ou de agar e de consistência líquida.

• Os meios líquidos são mais enriquecidos que os sólidos e por isso são indicados para amostras paucibacilares, como sangue, LCR e macerados de tecidos. Também são utilizados para subcultivos e armazenamento de cepas em freezer. Os sistemas comerciais de cultura utilizam meios líquidos especiais, desenvolvidos a partir do Middlebrook 7H9.

MEIOS SÓLIDOS

LOWENSTEIN-JENSEN

• Composição: ovos coagulados, verde malaquita, sais, glicerol, farinha de batata

• Inoculação: 0,5 a 1,0 ml do material clínico • Incubação: 37°C em estufa com 5% a 10% de CO2, na ausência de luz,

com exceção de amostras de pele em que o meio deve ser incubado a 30°C, por até 8 semanas. Nas 2 primeiras semanas manter os tubos na posição horizontal com as tampas um pouco desrosqueadas, depois colocar na vertical e apertar as tampas.

• Leituras: ler duas vezes durante as duas primeiras semanas (fazer a segunda leitura da primeira semana sempre com 7 dias exatos, já que é um parâmetro importante para a identificação posterior) e depois uma vez por semana até completar 8 semanas. Observar o pigmento da colônia. Se o �meio estiver contaminado com outros microrganismos, desprezar o meio e preparar outra cultura se o material estiver ainda estocado. Descontaminar novamente o material antes de inocular no meio.

MIDDLEBROOK 7H10, 7H11

• Composição: sais, vitaminas, cofatores, ácido oléico, albumina, catalase, glicerol, glicose

(7H10), acrescido de hidrolizado de caseína (7H11)

• Inoculação: semear 0,5 a 1,0mL do sedimento tratado na placa. Utilizar uma alça descartável

para espalhar bem todo o material sobre a superfície da placa. Não utilizar a técnica normal de

semeadura em placas, semear em todas as direções.

• Incubação: a 37°C em estufa com 5% a 10% de CO2 no escuro por até 8 semanas.

• Leituras: ler duas vezes durante as duas primeiras semanas (fazer a segunda leitura da

primeira semana sempre com 7 dias exatos, já que é um parâmetro importante para a

identificação posterior) e depois uma vez por semana até completar 8 semanas.

• Os meios sólidos são importantes para observar amostras que possuem mais de um tipo de �micobactéria

MEIOS LÍQUIDOS

MIDDLEBROOK 7H9

• Composição: sais, vitaminas, cofatores, albumina, catalase, glicerol

• Inoculação: inocular a amostra de biópsia ou fragmento de pele diretamente no meio

• Incubação: incubar a 37°C em estufa contendo 5 a 10% de CO2. Se forem inoculados fragmentos de pele no meio incubar um tubo a 37°C e outro a 30°C.

• Leitura: examinar os tubos duas vezes durante as duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes até completar 8 semanas.

BACTEC 12B

Antes de serem inoculados com amostras clínicas ou cepas bacterianas os frascos devem ser colocados no equipamento Bactec 460TB para que sejam inoculados com uma quantidade determinada de C02.• Composição (Middlebrook 7H12): caldo 7H9, albumina bovina, hidrolizado de caseína,

catalase, substrato marcado com 14C(1µCi/ml). • Inoculação: inocular 0,5 ml do sedimento tratado pelo método de NALC, com uma seringa tipo

insulina. Adicionar 0,1 ml de uma solução de antibióticos (PANTA, Becton Dickinson) nas amostras que podem apresentam alguma contaminação bacteriana.

• Incubação: 37°C; amostras de tecidos ou fragmentos de pele devem ser incubados também a 30°C (preparar 2frascos). Não é necessário incubar no escuro.

• Leituras: ler 2 vezes nas duas primeiras semanas de incubação e uma vez nas semanas seguintes até completar 6 semanas. Frascos com índices de crescimento (GI) maior que 10 devem ser separadas e testadas diariamente.

• Frascos que apresentarem GI superiores a 10 devem ser considerados como suspeitos de �serem positivos, quando o GI chegar a 50 preparar uma lâmina e corar pelo método de Ziehl-Neelsen.

• Algumas vezes pode ser difícil visualizar as micobactérias com um GI tão baixo; aguardar para �fazer outra lâmina quando o frasco apresentar um GI maior.

• Algumas vezes o meio 12B não adere bem à lâmina e solta do esfregaço, adicionar uma gota �de albumina na lâmina antes de colocar a gota do 12B para fixar o esfregaço.

• Se o frasco apresenta além de bacilos álcool-ácido outras bactérias, descontaminar a amostra �diretamente do 12B removendo todo o conteúdo e processando pelo método de 4% de NaOH. Inocular o sedimento tratado novamente em um novo 12B.

BACTEC 13A • Composição (Middlebrook 7H13): caldo 7H9, albumina

bovina,hidrolizado de caseína, catalase, substrato marcado com 14C(1µCi/ml), Tween 80, polianetolsulfonato de sódio (SPS).

• Inoculação: colocar até 5 ml de sangue diretamente no frasco. Adicionar no laboratório 0,5 ml da solução de enriquecimento que vem junto com os frascos Bactec 13A.

• Incubação: 37°C por até 6 semanas. • Leituras: ler os frascos duas vezes nas duas primeiras semanas

e uma vez nas semanas seguintes até completar 6 semanas. • Os frascos 13A não necessitam ser passados no Bactec 460 �

para colocar C02, pois estes já vem preparados com a quantidade certa de C02.

MGIT • Composição: caldo Middlebrook 7H9, sensor fluorescente embebido em

silicone sensível ao oxigênio.

• Inoculação: 0,5 ml do material tratado, adicionar 0,5 ml de OADC

(acompanha o kit) e PANTA (solução de antibióticos, Becton Dickinson).

• Incubação: 37°C.

• Leituras: realizar a primeira leitura após 48 horas de incubação. Ler duas

vezes nas duas primeiras semanas e uma vez nas semanas seguintes até

completar 8 semanas. A leitura é feita com uma luz ultravioleta e a

fluorescência emitida é comparada com um controle positivo e negativo.

• Amostras de sangue não devem ser colocadas neste meio. �• Existe disponível um equipamento automatizado (MGIT 960) que realiza as �

leituras automaticamente.

ESP MYCO• Composição: caldo Middlebrook 7H9 e esponjas de celulose. • Inoculação: 0,5 ml da amostra clínica. São adicionados OADC e

uma mistura de antibióticos (MycoPVNA). • Incubação: Os frascos são incubados no aparelho ESP Difco por

um período de 6 semanas. • Leituras: O equipamento automatizado vai realizar as leituras

continuamente e medir o consumo e produção de gases.

Este sistema permite o processamento de qualquer amostra clínica �inclusive sangue.

MB/BACT • Composição: Middlebrook 7H9, caseína pancreática digerida, catalase,

albumina bovina. • Inoculação: 0,5 ml do material clínico tratado. Uma mistura de antibióticos é

adicionada. • Incubação: 37°C no equipamento automatizado MB BacT/Alert por 6

semanas. • Leituras: os frascos são lidos automaticamente e constantemente pelo

equipamento.

BACTEC MYCO LYTIC• Composição: caldo Middlebrook 7H9, sensor fluorescente sensível ao

oxigênio. • Inoculação: 5 ml da amostra. • Incubação: 37°C no equipamento Bactec 9420 durante 42 dias • Leituras: o equipamento realiza as leituras e o monitoramento contínuo dos

frascos.

Estes frascos são apenas para processamento de amostras de sangue. Para �amostras respiratórias o equipamento usado é o Bactec 9000MB e o frasco é o Myco/F.

BIBLIOGRAFIA• Anvisa, 2004. Detecção e Identificação de Micobactérias de Importância Médica.

Disponível em : <http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_6_2004.pdf>

• Portal Saúde, 2008. MINISTÉRIO DA SAÚDE; Secretaria de Vigilância em Saúde; Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual Nacional de VIGILÂNCIA LABORATORIAL da TUBERCULOSE e outras MICOBACTÉRIAS. Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_laboratorio_tb.pdf