Técnicas de identificación de micobacterias diferentes a M tuberculosis

Servicio MicobacteriasInst. Nacional de Enfermedades InfecciosasANLIS “Dr. C. G. Malbrán”

Identificación de cultivos positivos en medio sólido

Características culturales

Colonias como migas de pan, secas, sin pigmentación y desarrollo lento

características culturales compatibles con M tuberculosis

Se encauza para tipificación

Niacina Catalasa Nitrato reductasa

Pruebas bioquímicasCaracterísticas microscópicasCaracterísticas microscópicas

Niacina

Características microscópicas

Cabinas de seguridad biológica tipo IIA con salida al exterior, UPS y validación anual

Antesala que separe el área de trabajo del resto del laboratorio

Bioseguridad

Identificación de cultivos positivos en medio sólido

Características culturales

Colonias lisas y pigmentadas o que toman el color del medio

No es M tuberculosis

Se encauza para tipificación si es necesario

Identificación de cultivos positivos en medio líquido

Si se observan grumos se puede sospechar en M tuberculosis

Si se observa turbidez pareja se puede sospechar de micobacteria ambiental

Características microscópicas

Precisión de la observación de cuerdas en extendidos de caldos positivos para la identificación de M tuberculosis

1. Yagupsky PV et al. J Clin Microbiol, 1990, 28:1451-53 2. Morris AJ, Reller LB. J Clin Microbiol, 1993, 31: 2353 – 54 3. Badak FZ et al. J Clin Microbiol, 1999, 37:4189-91 4. Attorri S et al J Clin Microbiol, 2000, 38:1426 – 29 5. Coelho AGV et al J Bras Pneumol,2007, 33: 707-11

Un resultado de sensibilidad a isoniacida da mayor precisión a la identificacion

* Es un sistema de doble anticuerpo

* Test disponibles:

CAPILIA TB (Tauns laboratorios, Inc., Numazu, Japan) Tibilia rapid test (Hangzhou, China) SD bioline Ag MPT 64 rapid test (Standad Diagnostic, South Korea) MGIT TBc ID test (Becton Dickinson)

*Se puede realizar de medio líquido y sólido

* Límite de detección: 105 UFC/ml

Tests inmunocromatograficos de flujo lateral (ICA : Immunochromatographic assay

) para la identificación del complejo Mycobacterium tuberculosis

Tests inmunocromatograficos de flujo lateral (ICA : Immunochromatographic assay

) para la identificación del complejo Mycobacterium tuberculosis

Algunas cepas de BCG (Glaxo, Pasteur, Tice) no expresan MPB64 Se encontraron mutantes de M. tuberculosis que no expresan el Ag

Raton anti MPB64 conjudado con partículas de oro coloidales

Segundo anticuerpo raton anti MPB64 (reconoce otro epitope del antígeno) inmovilizado en la membrana

Anticuerpo policlonal anti inmunoglobulina de raton inmovilizado en la membrana (captura el exceso de monoclonal indica que está en buenas condiciones y que ha migrado correctamente)

80 – 100 µl de suspensión bacteriana

15 minutos

Capilia, Tauns Japon ,Nippon BD Co Ltd Standards Diagnostics, Corea

M.kansasiiM. avium M.tuberculosis M.tuberculosis M.tuberculosis

Evaluación del test de inmunocromatografía lateral para la identificación de Mycobacterium tuberculosis en medio lìquido

Brent A. et al journal of Clinical Microbiology Dec 2011, 4343-4346

Test comercial

N Sensibilidad (95% CI)

Especificidad (95% CI)

VPP (95% CI)

VPN (95% CI)

CAPILIA TB

2565 (49,8% TBC)

98,8 (98,1-99,3) 99,1 (98,3-99,6) 99,4 (98,9-99,8) 98,2 (97,1-98,9)

BIOLINE SD

242 (83% Tbc)

97,0 (93,6-98,9) 100 (91,4-100) 100 (98,8-100) 87,2 (74,3-95,2)

MGIT TBcID

1002 (60,7% Tbc)

97,9 (96,4-98,9) 99,5 (98,2-99,9) 99,7 (98,8-100 96,8 (94,6-98,3)

Datos del poster CAPILIANuestra experiencia

1º etapa: Capilia TB test (Tauns Laboratories, Japan) vs PRA. Participaron 3 laboratorios de referencia de CABA y LNR. Se investigaron: - 349 cultivos positivos en MGIT 960 - 192 aislamientos de micobacterias ambientales Resultados discordantes investigados por métodos bioquímicos.

Sensibilidad= 99,1% (IC 95% 97,8 -100)

Especificidad= 100% (IC 95% 99,8 -100)

Aislamientos (n)

CMT Otra micobacteria

Total

CMT 320 0 320

Negativo 3 218 321

Total 323 218 541

ICL CAPILIA TB

PRA

3 aislamientos dieron falsos negativos un Mycobacterium tuberculosis y dos de M bovis-BCG. 2 de los 323 (0,6%) cultivos de M. tuberculosis contenían también M. aviumTiempo requerido para crecimiento e identificación: Muestras B (+) (n= 203): 11 (2-30) días. Muestras B (-) (n= 138): 17 (5–39) días.

2º etapa: MGIT TBCID test vs PRA Se estudiaron 97 aislamientos de pacientes con riesgo de micobacteriosis o tuberculosis resistente a drogas , en LRN. Resultados discordantes investigados por métodos bioquímicos.

Aislamientos (n)

CMT Otra micobacteria

Total

CMT 84 0 84

Negativo 2 11 13

Total 86 11 97

PRA

ICL MGIT TBc ID

Falsos negativos 2 aislamientos de M tuberculosis.

1 de 84 (1.2%) aislamientos de M tuberculosis también contenía M intracellulare.

Sensibilidad= 97,7% (IC 95% 93,9 -100)

Especificidad= 100% (IC 95% 95,5 -100)

Identificación molecular de especies de micobacterias a partir de cultivo

Moléculas útiles para identificación de especies de micobacterias Blancos específicos para Complejo M tuberculosis - IS6110 - MPB 64 Blancos comunes a las micobacterias 16S rRNA, ITS 16S – 23S rRNA, 16S rDNA

Proteína de shock térmico (hsp 65)

DNA Girasa B (gyr B)

RNA polimerasa (rpoB)

Superóxido dismutasa (sodA)

Sistema de reparación y recombinación de DNA (recA)

Métodos: -PCR / nested PCR

-PCR real time

- Accu Probe (Gen Probe)

- LIPAs

- PRA

AccuProbe:

Se basa en la hibridación del rRNA de las micobacterias a sondas DNA especie específicas.

Solo nos permite identificar las micobacterias más importantes desde el punto de vista clínico

RIBOSOMAS

*****

ARNr

SONDA

ADN-ESTER

DE ACRIDINA

LUZ

+ H2O2 + OH-

destrucción química de la

marca no hibridizada

S y E > 90%

1) Extracción ADN

Hervir a 100ºC 30 min

Centrifugar 20’ a

14000 rpm

2) Amplificación de blancos específicos con primers biotinilados• ITS 16S-23S rRNA• rRNA 23S•16S

LIPAs hibridación en tiras con sondas

3) Hibridación sobre tiras de nitrocelulosa

Especial cuidado con la temperatura de hibridación, máxima desviación tolerada +/-1 ºC. Orientar bien la tira y ver que queda totalmente sumergida.

4) Reacción colorimétrica 5) Interpretación de resultados

INNO-LiPA MYCOBACTERIA (Innogenetics, Belgium)

Amplifica la región espaciadora entre los genes RNA ribosomal 16S - 23 S

16 especies prevalentes

se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada especie

GenoType Mycobacterium (Hain, Germany)

Amplifica la región 23 S del gen RNA ribosomal

13 especies prevalentes

se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada micobacteria

CM

identificación 16 especies raras AS

Concordancia 86% 90-96%

Makinen J, et al Clin Microbiol Infect 2006, 12:481-483.

InnoLIPA GenoType

Safianowka A, et al. Pneumonol Alergol Pol. 2010;78:363-8.

Lee AS, et al J Med Microbiol, 2009,58:900-4.

PCR-reverse dot blot hybridization (RDBH)

Xueqiong Wu,l, et al J. Clin. Microbiolo 45: 1898, 2007

Amplifica la región 16 S del gen RNA ribosomal

se hibrida frente a segmentos que corresponden a cada especie

22 especies

99% de concordancia con secuenciación

340 aislamientos

Restricción enzimática

Electroforesis en gel de agarosa

Hae IIIBste II

Tinción de ADN (bromuro de etidio)

Amplificación de un fragmento del gen hsp65

PRA

Segmentos cortados por la Enzima BstE II

Enzima

Hae III

Mycobacterium abscessus

Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

Evaluación en la rutina de trabajo

Experiencia I (2004)

todos los aislamientos recibidos n: 633

93% de los aislamientos que llegan a nuestro laboratorio en un lapso de 3-7 días

Especie N° aislamientos % concordanciaComplejo M tuberculosis 268 100M avium 80 99M intracellulare 65 100M fortuitum 23 100M peregrinum 25 100M chelonae 12 100M abscessus 35 100M kansasii

Otras especies

1371

10082

Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”Servicio de Micobacterias. INEI. ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

Especie N° aislamientos % concordanciaM gordonae tipo VII 19 100M lentiflavum tipo I 13 100M simae tipo I 13 100M simae nuevo tipo 19 100M marinum 10 100M xenopi 10 100

Evaluación en la rutina de trabajo

Experiencia II (2005-2007)

aislamientos de especies no resueltas en la experiencia anterior n: 170

84

Secuenciación:

Para la identificación molecular de micobacterias además de la secuenciación del gen 16S rRNA, considerado gold stsndard, se han propuestos otros genes: ITS 16s – 23S rRNA, y los genes 23S rRNA, hsp65, rpoB, sodA, recA.

Kit comercial MicroSeq 500 (Aplied Biosystem)

Comparación con base de datos

GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbanklindex.html) EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/) DNA Data Bank of Japan (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)

Es un técnica que requiere equipamiento y reactivos muy costoso, y personal muy entrenado

* El uso de test moleculares para diferenciar entre CMTBC y otras micobacterias es importante para elegir un tratamiento adecuado sobretodo en países donde la prevalencia de tuberculosis es baja y la enfermedad por otras micobacterias son más frecuentes. El uso en países con alta prevalencia de tuberculosis donde la mayoría de los casos son B(+) es menos útil

* En pacientes con inmunosupresión severa el uso de estas técnicas permite discernir entre tuberculosis y micobacteriosis