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Monitorización de la Limpieza y Desinfección. Proyecto BioliSME

Monitorización de la limpiezay desinfección. Proyecto BIOLISME

ainia

Zaragoza, 17 de noviembre de 2010


HIGIENE: “Todas las condiciones y medidas necesarias paragarantizar la seguridad y buena condición de los alimentos a lolargo de toda la cadena de producción”(Codex Alimentarius rev. 4/2003)

Sistema de Análisis de Peligros y Puntos Control Crítico (APPCC)

• El R.852/2004 exige que todos los operadores de alimentación(producción, procesado o distribución de alimentos), deben instaurar,i l t t di i t b d l i t APPCCimplantar y mantener un procedimiento basado en el sistema APPCC.

• Uno de los requisitos del sistema APPCC limpieza y desinfección

Evaluación del programa de L+D método de muestreo ycontrol de superficies en contacto con los alimentos.



Plan de Control

La Seguridad Microbiológica de los alimentos requiere:

Buenas PrácticasDiseño efectivo

Buenas Prácticas de Fabricación

(BPF)Análisis Peligros yPuntos Control Crítico

(APPCC)

Su aplicación no impide totalmente que el alimento

(APPCC)

p p qpueda contaminarse cuando queda expuesto al entorno

Establecimiento de PLANES DE CONTROL


Establecimiento de PLANES DE CONTROL para evaluar el control del entorno


Plan de control

- Manipulación- Transporte- Almacenamiento- Distribución

son oportunidades para la contaminación del producto- Distribución

- Envasado

p

Plan de Muestreo y Análisis

• Microbiota presente en superficies y equipos (patógenos, indicadoresde higiene o alteración del producto)

• Efectividad de las prácticas de limpieza y desinfección.

• Resistencia o persistencia de determinados contaminantes


• Resistencia o persistencia de determinados contaminantes.

• Origen de contaminantes (nichos), contaminaciones cruzadas.


Plan de control

Plan de control en Planta de producción

Muestreo Método Analítico Interpretación Resultados

Plan de muestreo Sensible y eficiente

Tratamiento estadísticode datos



Detección y control de la contaminación en zonas de riesgoDetección y control de la contaminación en zonas de riesgo utilizando equipos y técnicas apropiados y según un PLAN.

Vestimenta(ropas y guantes)

Aire

Suelos y paredes

Aire

Equipos

AguaMuestreo

Microbiológico

Detección y Cuantificación

Superficies Equipos

Detección y Cuantificación de microorganismos


Estimación de la cantidad microbiana del entorno

Determinación y evaluación de tendencias


Definir puntos de muestreo

Definir métodos

Diseño del muestreoDefinir métodos

de muestreo

Plan de muestreoPlan de muestreo

Definir límitesDefinir límites

Indicadores de calidad (ej. presencia de Listeria spp en planta)

QuéListeria spp en planta)

Fuentes de contaminación (materias primas, producto final, superficies de máquinas, suelos,…)

Dónde

Cuándo


Frecuencia de muestreos.

Métodos de análisisCómo


fi i dDefinir puntos de muestreo

La selección de puntos y frecuencia de muestreo depende de:

• diseño de las plantas• diseño de las plantas• nº líneas producción y productos• ubicación de equipos de procesado• flujo de producto.

Definir métodos de muestreo

Puntos muestreo designados a partir del análisis de riesgos (APPCC)

Definir métodos de muestreo

• Su elección dependerá:

- Microorganismo a controlar: Tipo de célula (bacteria, espora, hongo),g p ( , p , g ),sensibilidad, viabilidad.

- Umbral de detección, capacidad, eficacia.

- Tipo de superficie y condiciones del entorno

• Factores que afectan al muestreo: Tipo de superficie nivel de


• Factores que afectan al muestreo: Tipo de superficie, nivel decontaminación de la muestra, condiciones ambientales, biofilms.


Plan de control

• Puntos de muestreoá• Tamaño del área de la muestra

• Frecuencia y momento del muestreo(Nivel de control, tipo producto, actividad y disponibilidad de la zona)

• Técnica/s de toma de muestras/• Acciones de seguimiento en caso de muestras positivas

-limpieza a fondo de zonas sospechosas y equipo-intensificación/ampliado de pruebas

Definir límites

• Falta de criterios legales de valoración.• Cada usuario fijará sus propios límites (según la clasificación de zonade riesgo, requisitos cliente, etc)• El establecimiento de los valores límite dependerán de la muestra y


• El establecimiento de los valores límite dependerán de la muestra yel método utilizado.


Criterios microbiológicos

• Rto de bacterias aerobias mesófilas• Rto. de bacterias aerobias mesófilas• Rto. de bacterias aerobias psicrotrofas• Rto. de enterobacterias• Rto. de Staphilococcus aureus

Microorganismos indicadores dep

• Rto. de mohos y levaduras• Rto. indicadores fecales (E. Coli) o enterococos• Rto. de bacterias esporuladas

indicadores de higiene o alterantes

del producto

• Investigación de Salmonellaó d Microorganismos

patógenos

• Investigación o Recuento de L. monocytogenes• Investigación de Campylobacter• Legionella,…



Métodos de muestreo de superficies y ambiente

M t d fi iMuestreo del ambiente

Sedimentación

Recogida en medio líquido

Placas de contacto

Paletas de contacto

Muestreo de superficies

Filtración

Impactación (aereobiocolectores)

Paños estériles

Torundas

BioluminiscenciaBioluminiscencia

Técnicas de derramamiento

Técnicas de enjuagadoTécnicas de enjuagado

Muestreador de aire SAS


ISO 18593:2004. Horizontal methods for sampling techniques from surfaces using contact plates and swabs.


Técnicas análisis

Técnicas clásicas Métodos rápidos

• Pruebas bioquímicasEXTRACCIÓN q

• Pruebas inmunológicas

• Pruebas enzimáticas

• Microscopía

CULTIVO

PREENRIQUECIMIENTO (no selectivo)

• Métodos eléctricos

• Amplificación molecular

• Citometría

(no selectivo)

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

AISLAMIENTO EN PLACA

CONFIRMACIÓN



Técnicas análisis

• Pruebas bioquímicas

• Pruebas inmunológicas

Sistemas miniaturizados, tiras catalasa, oxidasa...

• ELISAS ió i éti

Pruebas inmunológicas

Reacción antígeno-anticuerpo

• Pruebas enzimáticas

• Separación inmunomagnética• Inmunoensayo en fase sólida• Sistemas inmunológicos en latex

Determinación ATP

• Microscopía

• Métodos eléctricos: Impedancia

105

104

103SEÑAL

p

• Técnicas base genética

Cit t í

TIEMPO DE DETECCIÓN

- Hibridación con sondas- Técnicas PCR: PCR-RT, rep-PCR.


• Citometría


Interpretación de resultados

Puntos críticos de contaminaciónPuntos críticos de contaminación

16 1980%

100%4

2

960%

80%

100%PRESENC.

19%

26

23

23

13

0%

20%

40%

60%

PROCESADO ENVASADO

L. monocytogenes Listeria spp No detectado

13

3 2

2

2

0%

20%

40%

60%

SUELO PUERTAS OPERARIOS CONDENSADOS

L. monocytogenes Listeria spp No detectado

AUSENCIA81%

Evolucion Presencia de Listeria spp en maquinas en funcionamiento

Valor Puntual

Tendencias

253035404550

cia

List

eria

spp

Acumulado


05

101520

01 03 05 07 09 11 13 15 17 19 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52

% P

rese

nc


H i t A t l

Caracterización genética mediante REP-PCR

Herramientas Actuales para la interpretación de resultados

Caracterización genética mediante REP PCR

Interpretación de los resultados mediante un potente software deanálisis vía web (Diversilab System v.3)

Tipificación: permite el análisiscomparativo entre cepas paraver similitudes y diferencias.

Clasificación: identificación de cepasmediante la comparación de los perfilesgenéticos con una base de datos.

• Estudios epidemiológicos (comparación de muestras procedentes dediferentes pacientes, lugares y/o fechas).

ó

Aplicaciones

• Trazabilidad de microorganismos patógenos y alterantes en lacadena alimentaria.

• Autentificación de microorganismos de interés y estudio evolutivo.

• Confirmación de resultados analíticos.


• Identificación de especies y serotipos (Salmonella, Listeria…).


H i t A t l

Gel de Agarosa, muestra la talla de los fragmentos

Herramientas Actuales para la interpretación de resultados

Té i d l t f i d ADN di t

1000bp

Técnica de electroforesis de ADN en gradiente (DGGE)

• Técnica de separación de ácidos nucleicos. (“ l l fi i ti ”)

p

500

250bp

(“molecular fingerprinting”)

• Estudio de la evolución de la diversidad microbiana de una instalación, equipo o proceso.

Zaragoza, 17 de noviembre de 2010 Gel de gradiente, permite separar las bandas en base a su secuencia.


Limitaciones de los métodos de control

• Tipo de superficie

• Sensibilidad de las técnicas

• Especificidad de las técnicas

Las células pueden crecer en capas, formando biopelículas (biofilms)

Generalmente, las técnicas utilizadas • Adhesión microbiana

• Otros factores

,subestiman el nºmicroorganismos en una superficie.

Problemas de repetibilidad y reproducibilidad

Es necesario el desarrollo de nuevos métodos de control- Rápidos- fiables- con una sensibilidad similar (o mayor) que los métodos convencionales



P E Bi liSME i iProyecto Europeo BioliSME ainia



Proyecto financiado por la Comisión Europea (7º programa Marco)htt // bi lihttp://www.biolisme.eu

BIOLISME es el acrónimo del proyecto "Speedy system for sampling anddetecting Listeria monocytogenes in agri-food and related Europeande ec g s e a o ocy oge es ag ood a d e a ed u opeaindustries".

Objetivo del proyecto: Sistema de monitorización de los niveles de Listeriamonocytogenes en superficies en contacto con alimentos.y g p

Consorcio del proyecto: 7 socios de 5 países de la EU (especializados en elcampo de la bioquímica, microbiología de alimentos, biosensores, óptica, higieney desinfección industrial)y )



Esquema del proyecto:

Preparación de superficies

contaminadas

Desarrollo del inmuno-ensayo

Desarrollo del sistema de muestreo y

Desarrollo del Immunosensor

Integración y

muestreo y recuperación de

Listeria

Immunosensor

Integración y Pruebas piloto



Mayor tasa de recuperación de microorganismos en el muestreo de superficies.

Beneficios que aportará el sistema:

Mejora de los niveles de detección del microorganismo.

Integración de las etapas de análisis (muestreo, procesamiento de la muestra y

detección).

Facilidad de uso Sistema semi-automatizado, mínima manipulación.

Reducción de la duración y el coste por análisis.

Aumento del nivel de seguridad alimentaria para el consumidor

Con este sistema, las empresas podrán realizar sus propias determinaciones, li d á i i d f á id ill fi bl

Aumento del nivel de seguridad alimentaria para el consumidor.

Ventaja competitiva para las empresas usuarias.

analizando más muestras in situ y de una forma rápida, sencilla y fiable.



Gracias por su atenciónGracias por su atención.

Sonia PortaL b t i d BiLaboratorio de Bioensayos

ainia Centro Tecnoló[email protected]


y desinfección. proyecto biolisme - betelgeux. garantía de … · para la interpretación de...

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