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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Instituto de Química de São Carlos

Desenvolvimento e Validação de Metodologia para Determinação Multirresíduo

de Glifosato e AMPA via CG-EM em Amostras Ambientais

Fernanda Benetti

São Carlos

2011

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Instituto de Química de São Carlos

Desenvolvimento e Validação de Metodologia para Determinação Multirresíduo

de Glifosato e AMPA via CG-EM em Amostras Ambientais

Dissertação apresentada ao Instituto de

Química de São Carlos, Universidade

de São Paulo, para a obtenção do título

de mestre em Ciências – Química

Analítica.

Orientada: Fernanda Benetti

Orientadora: Profa. Dra. Maria Olímpia

de Oliveira Rezende

São Carlos

2011

“Viver é a coisa mais rara do mundo... a maioria

das pessoas apenas existe”.

(Oscar Wilde)

“Quero conhecer os pensamentos de Deus...

O resto é detalhe”.

(Albert Einstein)

“Todos os homens, por natureza, desejam saber”

(Aristóteles)

AGRADECIMENTOS

- a Deus, pela coroa da vida eterna que Ele me dará nos céus se eu for uma filha

firme e fiel até o fim;

- a meus pais, pelo amor incondicional;

- ao meu irmão Felipe, sempre companheiro;

- a minha família, pelo apoio e incentivo;

- à Profa. Maria Olímpia de Oliveira Rezende, pela orientação e confiança;

- à Dra Maria Diva Landgraf, pelo carinho, ensinamentos e ajuda;

- ao Prof. Dr. João Alberto da Silva Sé, pela disponibilidade e informações durante a

coleta das amostras

- aos colegas do Laboratório de Química Ambiental: Daniely, Livia, Leandro,

Rachide, Túlio, Régis, Isequiel, Livia e Bruno;

- ao Paulinho Roberto, pela disposição e pelos momentos hilários que passamos

juntos;

- ao meu amigo “quase” sãocarlense Josias;

- aos amigos araraquarenses e paulistanos;

- ao Oscar, do Laboratório de Geotecnia da EESC, pela ajuda nos ensaios ali

realizados;

- ao pessoal da Oficina de Vidros do IQSC, pela paciência e disposição em me

atender;

- à Sílvia e a Andréia, da Seção de Pós Graduação, por sempre me ajudar;

- a Veroneide, por seu bom humor;

- ao IQSC, pelo apoio institucional.

Muito Obrigada!

RESUMO

O glifosato é o herbicida mais usado em todo o mundo. Sendo assim, é necessário

que se tenham programas de monitoramento do seu uso, para garantir o bem estar

da lavoura e da população. O seu metabólito principal é o ácido aminometilfosfônico

(AMPA) que apesar de possuir baixa toxicidade, é mais persistente que o glifosato.

O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma metodologia de análise

para o glifosato e o AMPA por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de

massas (CG/EM), a fim de avaliar possíveis contaminações em amostras ambientais

nas imediações do Rio Monjolinho, em São Carlos. Para a faixa estudada (1,0 ug L-1

a 500 ug L-1, os limites de detecção e quantificação para o AMPA foram de 0,15 e

0,45 ug L-1 e para o glifosato, 0,67 e 2,02 ug L-1. As recuperações em água variaram

entre 96,2 e 121% e para solo 70,1 a 119%. O método proposto apresentou boa

linearidade, exatidão, seletividade e sensibilidade. A robustez foi avaliada de acordo

com o teste de Youden. O procedimento de extração foi baseado em reações ácido-

base e realizou-se etapa de clean-up para água e sedimento. Para os pontos

amostrados, houve resíduo de AMPA em dois pontos (4,19 e 6,22 ug L-1). Os

resultados encontrados para DBO foram altos, estando acima do limite estabelecido

para um corpo d’água Classe 3, de acordo com a CONAMA 357. Isso pode ter

ocorrido devido à grande quantidade de esgoto despejado no leito do rio. Os valores

de nitrogênio e fósforo também estão elevados, o que indica uma alta eutrofização

do leito do rio. Vale ressaltar a necessidade de se ter uma legislação que estabeleça

um limite máximo permitido para o AMPA, visto que ele é mais persistente no

ambiente do que o glifosato.

ABSTRACT

The glyphosate is the most widely used herbicide worldwide. Therefore, it is

necessary to have programs for monitoring their use to ensure

the welfare of the farming and population. Its main metabolite is the acid

aminomethylphosphonic (AMPA) that despite having low toxicity, is more

persistent than glyphosate. This study aimed to develop a methodology for analyzing

glyphosate and AMPA by gas chromatography coupled to mass spectrometry

(GC/MS) in order to assess possible contamination of samples

environment in the vicinity of Monjolinho River in São Carlos. In the range

studied (1.0 ug L-1 to 500 ug L-1, limits of detection and quantification

were 0.15 and 0.45 ug L-1 for AMPA and 0.67 and 2.02 ug L-1 for glyphosate. The

recoveries in water varied between 96.2 and 121% and for soil from 70.1 to

119%. The proposed method showed good linearity, accuracy, selectivity and

sensitivity. The robustness was evaluated according to the Youden test. The

extraction procedure was based on acid-base reactions and included a

clean-up step for water and sediment. For the sampling sites, it was determined

residual AMPA at two points (4.19 and 6.22 ug L-1). The results for BOD

were high, being above the limit set for a waterbody Class

3, according to CONAMA 357. This may be due to large

amount of sewage dumped into the river bed. The values of nitrogen and

phosphorus are also high, which indicates a high eutrophication of the bed

river. It is worth emphasizing the need of having a legislation that establishes a

maximum allowed value for AMPA, whereas it is more persistent in

environment than glyphosate.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – FÓRMULA ESTRUTURAL DO GLIFOSATO (COUTINHO; COUTINHO;

MAZO, 2009) ...................................................................................................... 20

FIGURA 2 - MECANISMO DE AÇÃO DO HERBICIDA GLIFOSATO (TONI;

SANTANA; ZAIA, 2006) ..................................................................................... 23

FIGURA 3 – ESTRUTURA QUÍMICA DO ÁCIDO AMINOMETILFOSFÔNICO

(COUTINHO; COUTINHO; MAZO, 2009) .......................................................... 24

FIGURA 4 – ROTAS DE DECOMPOSIÇÃO MICROBIOLÓGICA DO GLIFOSATO

(ADAPTADO DE AMARANTE JÚNIOR ET AL, 2002A) ..................................... 27

FIGURA 5 – ESQUEMA SIMPLIFICADO DE CONVERSÃO DO GLIFOSATO E

AMPA EM SEUS RESPECTIVOS DERIVADOS (ADAPTADO DE SOUZA ET

AL, 2006)............................................................................................................ 30

FIGURA 6 – ESQUEMA DE UM CROMATÓGRAFO TÍPICO A GÁS CAPILAR,

ACOPLADO A UM ESPECTRÔMETRO DE MASSAS (ADAPTADO DE

SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2006) ................................................................... 31

FIGURA 7 – ESQUEMA ILUSTRATIVO DE UMA FONTE DE ÍONS POR IMPACTO

DE ELÉTRONS (ADAPTADO DE SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2006) ............. 32

FIGURA 8 – FRAGMENTAÇÃO PROPOSTA PARA ANÁLISE DE GLIFOSATO E

AMPA POR CG – EM ........................................................................................ 33

FIGURA 9 – ESQUEMA DAS REAÇÕES DE ABRANDAMENTO E

DESMINERALIZAÇÃO POR RESINA DE TROCA CATIÔNICA ........................ 34

FIGURA 10 – ESQUEMA DA REAÇÃO OCORRIDA NA RESINA DE TROCA

ANIÔNICA .......................................................................................................... 34

FIGURA 11 – BACIA DO TIETÊ-JACARÉ EM DESTAQUE NO ESTADO DE SÃO

PAULO (ADAPTADO DE CTPI, 2008) ............................................................... 49

FIGURA 12 – CIDADES PERTENCENTES À BACIA DO TIETÊ-JACARÉ

(ADAPTADO DE CPTI, 2008) ............................................................................ 49

FIGURA 13 – FOTO REAL E IMAGEM DE SATÉLITE – RIO MONJOLINHO

(PONTO 1) ......................................................................................................... 51

FIGURA 14 – FOTO REAL E IMAGEM DE SATÉLITE – RIBEIRÃO ÁGUA QUENTE

(PONTO 2) ......................................................................................................... 51

FIGURA 15 – FOTO REAL E IMAGEM DE SATÉLITE – RIBEIRÃO ÁGUA FRIA

(PONTO 3) ......................................................................................................... 51


(PONTO 4) ......................................................................................................... 52


(PONTO 5) ......................................................................................................... 52

FIGURA 18 – BACIA DO RIO MONJOLINHO COM SEUS AFLUENTES E

LOCALIZAÇÃO DOS PONTOS AMOSTRADOS (ADAPTADO DE DORNELLES,

2006). ................................................................................................................. 53

FIGURA 19 – FLUXOGRAMA DE DERIVATIZAÇÃO DE AMOSTRAS .................... 67

FIGURA 20 – FLUXOGRAMA PARA PREPARO DE AMOSTRAS AQUOSAS ........ 69

FIGURA 21 – FLUXOGRAMA DO PROCESSO DE EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS

SÓLIDAS............................................................................................................ 71

FIGURA 22 - GRÁFICO DE DADOS DE CARACTERIZAÇÃO VERSUS PONTOS

DE COLETA (SEDIMENTO) .............................................................................. 75

FIGURA 23 – CURVAS ANALÍTICAS USADAS PARA A DETERMINAÇÃO DE

CARBONO TOTAL EM ÁGUA (ESQUERDA) E SEDIMENTO (DIREITA)......... 75

FIGURA 24 – CURVA DE DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA (PONTO 1) ......... 77





FIGURA 29 – GRÁFICO DE DADOS DE CARACTERIZAÇÃO VERSUS

PARÂMETROS AVALIADOS (ÁGUA). .............................................................. 82

FIGURA 30 - COMPARAÇÃO COM VALORES DA CONAMA 357 .......................... 84

FIGURA 31 – CROMATOGRAMA DAS SOLUÇÕES PADRÃO DE DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES (1 A 75 UG L-1) DE GLIFSOSATO E AMPA PARA A

CONSTRUÇÃO DA CURVA ANALÍTICA ........................................................... 88

FIGURA 32 – CROMATOGRAMA DAS SOLUÇÕES PADRÃO DE DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES (100 A 500 UG L-1) DE GLIFOSATO E AMPA PARA A

CONSTRUÇÃO DA CURVA ANALÍTICA ........................................................... 89

FIGURA 33 – SOPREPOSIÇÃO DOS CROMATOGRAMAS DAS DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DA SOLUÇÃO PADRÃO DE GLIFOSATO E AMPA ........ 90

FIGURA 34 – CURVAS ANALÍTICAS OBTIDAS PARA O AMPA E O GLIFOSATO.91

FIGURA 35 – CROMATOGRAMA BRANCO PARA ÁGUA. ..................................... 93

FIGURA 36 – CROMATOGRAMA BRANCO PARA SOLO ARENOSO .................... 93

FIGURA 37 – SOBREPOSIÇÃO DOS CROMATOGRAMAS DE UMA AMOSTRA DE

ÁGUA ISENTA DE CONTAMINAÇÃO E DE OUTRA DOPADA COM 500 µG L-1

DE AMPA E GLIFOSATO. ................................................................................. 94

FIGURA 38 – SOBREPOSIÇÃO DOS CROMATOGRAMAS DE UMA AMOSTRA DE

SOLO ISENTA DE CONTAMINAÇÃO E DE OUTRA DOPADA COM 500 µG L-1

DE AMPA DE GLIFOSATO. ............................................................................... 94

FIGURA 39 – INFLUÊNCIA DE CADA FATOR MODIFICADO NO TESTE DE

ROBUSTEZ PARA ANÁLISE DE GLIFOSATO E AMPA. ................................ 104

FIGURA 40 – CROMATOGRAMA PONTO 02 (ÁGUA) COM 4,19 µG L-1 DE AMPA.

......................................................................................................................... 106

FIGURA 41 – CROMATOGRAMA PONTO 03 (ÁGUA) COM 6,22 µG L-1 DE AMPA.

......................................................................................................................... 107

FIGURA 42 – CROMATOGRAMA PONTO 03 (SEDIMENTO). .............................. 107

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO CONFORME O TIPO DE ENSAIO

(INMETRO, 2010) .............................................................................................. 37

TABELA 2 - AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE (INMETRO, 2010) ............................ 38

TABELA 3 – FATORES QUE DEVEM SER CONSIDERADOS NA DETERMINAÇÃO

DA ROBUSTEZ DO MÉTODO ANALÍTICO (BRASIL, 2003) ............................. 46

TABELA 4 – MATRIZ DOS FATORES PARA A DETERMINAÇÃO DA ROBUSTEZ

(INMETRO, 2003) .............................................................................................. 47

TABELA 5 – PONTOS DE COLETA E LOCALIZAÇÃO DO MATERIAL

AMOSTRADO .................................................................................................... 50

TABELA 6 – PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS DE ÁGUA DE ACORDO COM A

CETESB (CETESB, 2001) ................................................................................. 54

TABELA 7 – PRESERVAÇÃO DE AMOSTRAS DE SOLO DE ACORDO COM A

CETESB (CETESB, 2001) ................................................................................. 54

TABELA 8 – LISTA DE PADRÕES E REAGENTES UTILIZADOS ........................... 55

TABELA 9 – DETERMINAÇÃO DE PH, TEOR DE MATÉRIA ORGÂNICA, UMIDADE

E CTC EM SEDIMENTO .................................................................................... 74

TABELA 10 – DETERMINAÇÃO DE CARBONO ORGÂNICO, FÓSFORO TOTAL,

NITROGÊNIO KJEDAHL, NITROGÊNIO AMONIACAL E RAZÃO C/N EM

SEDIMENTO ...................................................................................................... 74

TABELA 11 – CARACTERIZAÇÃO GRANULOMÉTRICA DAS AMOSTRAS DE

SEDIMENTO ...................................................................................................... 76

TABELA 12 – DETERMINAÇÃO DE PH, TEMPERATURA, CONDUTIVIDADE E

CARBONO ORGÂNICO EM ÁGUA ................................................................... 80

TABELA 13 – DETERMINAÇÃO DE MATÉRIA ORGÂNICA, COR, TURBIDEZ,

DQO, DBO, SÓLIDOS TOTAIS EM ÁGUA ........................................................ 81

TABELA 14 – DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS TOTAIS DISSOLVIDOS,

NITROGÊNIO KJEDAHL, NITROGÊNIO AMONIACAL E FÓSFORO TOTAL EM

ÁGUA ................................................................................................................. 81

TABELA 15 – CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS PARA DETERMINAÇÃO DO

GLIFOSATO E DO AMPA. ................................................................................. 86

TABELA 16 – RECUPERAÇÃO DO AMPA EM ÁGUA ............................................. 95

TABELA 17 – RECUPERAÇÃO DO GLIFOSATO EM ÁGUA ................................... 96

TABELA 18 – RECUPERAÇÃO DO AMPA EM SOLO ARENOSO .......................... 96

TABELA 19 – RECUPERAÇÃO DO GLIFOSATO EM SOLO ARENOSO ................ 97

TABELA 20 – RECUPERAÇÃO DO AMPA EM LATOSSOLO VERMELHO ............ 97

TABELA 21 – RECUPERAÇÃO DO GLIFOSATO EM LATOSSOLO VERMELHO .. 98

TABELA 22 – TESTE HIPÓTESE PARA AMPA EM ÁGUA ...................................... 99

TABELA 23 – TESTE HIPÓTESE PARA GLIFOSATO EM ÁGUA ........................... 99

TABELA 24 – TESTE HIPÓTESE PARA AMPA EM SOLO ARENOSO ................. 100

TABELA 25 – TESTE HIPÓTESE PARA GLIFOSATO EM SOLO ARENOSO ....... 100

TABELA 26 – TESTE HIPÓTESE PARA AMPA EM LATOSSOLO VERMELHO ... 100

TABELA 27 – TESTE HIPÓTESE PARA GLIFOSATO EM LATOSSOLO

VERMELHO ..................................................................................................... 101

TABELA 28 – CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS A SEREM VARIADAS NO

TESTE DE ROBUSTEZ ................................................................................... 102

TABELA 29 – VARIAÇÃO DA ÁREA E DO TEMPO DE RETENÇÃO DE ACORDO

COM OS ENSAIOS REALIZADOS PARA A AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ .... 102

TABELA 30 – CONCENTRAÇÃO OBTIDA PARA GLIFOSATO E AMPA DE

ACORDO COM AS MODIFICAÇÕES REALIZADAS NO TESTE DE ROBUSTEZ

......................................................................................................................... 103

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas

AMPA – Ácido aminometilfosfônico

CETESB – Companhia Ambiental do Estado de São Paulo

CG – Cromatografia gasosa

CG/EM – Cromatografia gasosa acoplapa à espectrometria de massas

CL – Cromatografia líquida

CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência

CMD – concentração média determinada

COT – Carbono orgânico total

CTC – Capacidade de troca catiônica

CV – coeficiente de variação

DBO – Demanda bioquímica de oxigênio

DVB – Divinilbenzeno

DL – Dose letal

DP – desvio padrão

DPR – Desvio padrão relativo

DQO – Demanda Química de Oxigênio

DTPMP – Dietilenotriamina penta-metileno-ácido-fosfônico

EC – Eletroforese capilar

EDTMP – Etileno fosfonato tetrametileno diamina

EFS – Extração em fase sólida

ELL – Extração líquido-líquido

EPA – Environmental Protection Agency

EPSPS – Enzina 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintetase

ETE – Estação de Tratamento de Esgoto

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial

IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada

LD – Limite de detecção

LQ – Limite de quantificação

NBR – Norma Brasileira

NMDA – N-metil-d-aspartase

NKT – nitrogênio Kjedahl total

NPK – fertilizante nitrogênio – fósforo – potássio

NTU – Nephelometric Turbity Unit

POEA – Polietoxietileno amina

SIM – Singular Ion Monitoring

TFAA – Anidrido trifluoroacético

TFE – Trifluoroetanol

UE – União Européia

uH – Unidade Hazen

SUMÁRIO

RESUMO..................................................................................................................... 5

ABSTRACT ................................................................................................................. 6

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 7

LISTA DE TABELAS ................................................................................................. 11

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... 14

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 19

1.1. Glifosato .......................................................................................................... 19

1.2. Degradação .................................................................................................... 25

1.3. Métodos de extração e determinação de glifosato e AMPA ........................... 28

1.4. Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas ...................... 30

1.5. Resinas de Troca Iônica ................................................................................. 33

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 35

3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS ............................................................................... 36

3.1. Validação ........................................................................................................ 36

3.2. Seletividade .................................................................................................... 37

3.3. Sensiblidade ................................................................................................... 38

3.4. Recuperação .................................................................................................. 39

3.5. Limites de detecção e quantificação ............................................................... 40

3.6. Linearidade ..................................................................................................... 41

3.7. Precisão .......................................................................................................... 42

3.8. Exatidão .......................................................................................................... 43

3.9. Robustez ......................................................................................................... 45

4. EXPERIMENTAL ................................................................................................... 48

4.1. Amostragem ................................................................................................... 48

4.2. Materiais ......................................................................................................... 55

4.2.1. Lista de reagentes .................................................................................... 55

4.2.2. Lista de Equipamentos ............................................................................. 55

4.2.3. Outros Materiais ....................................................................................... 56

4.3. Caracterização físico-química das amostras ................................................. 56

4.3.1. Determinação da acidez ........................................................................... 57

4.3.1.1. Água .................................................................................................. 57

4.3.1.2. Sedimento ......................................................................................... 57

4.3.2. Condutividade elétrica .............................................................................. 58

4.3.2.1. Água .................................................................................................. 58

4.3.2.2. Sedimento ......................................................................................... 58

4.3.3. Determinação da taxa de umidade e matéria orgânica (MO) ................... 58

4.3.3.1. Água .................................................................................................. 58

4.3.3.2. Sedimento ......................................................................................... 58

4.3.4. Determinação da capacidade de troca catiônica (CTC) ........................... 59

4.3.4.1 Água ................................................................................................... 59

4.3.4.2. Sedimento ......................................................................................... 59

4.3.4.2.1. Cátions metálicos totais trocáveis ............................................... 60

4.3.4.2.2. Acidez trocável ............................................................................ 60

4.3.5. Determinação de carbono orgânico total .................................................. 61

4.3.5.1 Água ................................................................................................... 61

4.3.5.2 Sedimento .......................................................................................... 62

4.3.6. Sólidos totais e sólidos totais dissolvidos ................................................. 62

4.3.6.1. Água .................................................................................................. 62

4.3.6.1.1. Sólidos Totais .............................................................................. 62

4.3.6.1.2. Sólidos Totais Dissolvidos........................................................... 63

4.3.6.2. Sedimento ......................................................................................... 63

4.3.7. Determinação de Nitrogênio Kjedahl e Fósforo Total ............................... 63

4.3.7.1. Água .................................................................................................. 63

4.3.7.2. Sedimento ......................................................................................... 64

4.3.8. Análise granulométrica do sedimento ...................................................... 65

4.4. Validação da metodologia ............................................................................... 66

4.4.1. Preparação das amostras padrão (real e fortificada) ............................... 66

4.5. Preparo das amostras para análise em CG-EM ............................................. 67

4.5.1. Água ......................................................................................................... 67

4.5.2. Sedimento ................................................................................................ 69

4.5.3. Recuperação ............................................................................................ 71

4.5.4. Robustez .................................................................................................. 72

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 73

5.1. Caracterização das amostras de sedimento ................................................... 73

5.2. Caracterização das amostras de água ........................................................... 80

5.3. Validação da Análise Química do Glifosato e AMPA ...................................... 85

5.3.1. Linearidade .............................................................................................. 90

5.3.2. Limites de detecção e quantificação ........................................................ 91

5.3.3. Branco ...................................................................................................... 92

5.3.4. Seletividade .............................................................................................. 94

5.3.5. Sensibilidade ............................................................................................ 95

5.3.6. Recuperação ............................................................................................ 95

5.3.7. Exatidão ................................................................................................... 98

5.3.8. Robustez ................................................................................................ 101

5.3.9. Amostras reais ....................................................................................... 105

6. CONCLUSÕES E CONTINUIDADE .................................................................... 109

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 110

Introdução

19

1. INTRODUÇÃO

1.1. Glifosato

Os herbicidas são usados nas lavouras com o intuito de controlar as plantas

invasoras e aumentar a eficiência na produção agrícola. Neste contexto, a produção

agrícola moderna depende consideravelmente de seu uso, seja na pré ou pós

emergência das culturas (TONI; SANTANA; ZAIA, 2006).

A produção e o uso de inseticidas têm permanecido estáticos nos últimos

anos, mas, com relação aos herbicidas, tem ocorrido um aumento do uso na

agricultura, sendo que hoje, estes constituem a principal porção de vendas de todos

os pesticidas no sistema de produção agrícola no mundo industrializado (TADEO et

al 2000; PROCÓPIO et al, 2005).

Os herbicidas podem ser agrupados por atividade, uso, modo de ação, grupo

químico ou tipo de vegetação controlada. Seu modo de ação pode ser através do

xilema da planta, após absorção pela raiz (herbicidas sistêmicos) ou por absorção

pelas folhas (herbicidas de contato). Quanto ao uso, os herbicidas podem ser pré-

emergentes (aplicados antes do plantio) ou pós-emergentes (aplicados após a

germinação) (MARCHI; MARCHI; GUIMARÃES, 2008).

Um dos herbicidas mais empregados na atualidade, representando 60% do

mercado mundial de herbicidas não seletivos é o glifosato (SOUZA et al, 2006).

O glifosato, N-(fosfonometil)-glicina, é pertencente ao grupo das glicinas

substituídas, é um herbicida pós emergente, classificado como não seletivo e de

ação sistêmica, com grande eficiência na eliminação de plantas invasoras,

apresentando baixa toxicidade aos que o manipulam (AMARANTE JÚNIOR et al

Introdução

20

2002a, GALLI; MONTEZUMA, 2005). É o ingrediente ativo do herbicida comercial

Roundup®, comercializado pela Monsanto, e Touchdown, comercializado pela

Zeneca Produtos Ag (KHROLENKO; WIECZOREK, 2005). Sua estrutura química é

mostrada na Figura 1.

Figura 1 – Fórmula estrutural do glifosato (COUTINHO; COUTINHO; MAZO, 2009)

O glifosato possui caráter polar, com grande tendência em formar espécies

iônicas, tem fórmula molecular C3H8NO5P (mm = 169,1 gmol-1) e, na forma de sal de

isopropilamônio, apresenta-se com a adição do grupo (CH3)2CHNH3+ (mm = 228,2

gmol-1) (RODRIGUES et al, 2009). Possui comportamento zwiteriônico (é

eletricamente neutro, mas tem cargas opostas em diferentes átomos) e seus pkas

são de 0.78, 2.29, 5.96 e 10.98 respectivamente (LLASERA et al, 2005).

O herbicida é muito sensível ao escoamento superficial, que é devido à sua

alta solubilidade em água (10,1 g L-1 a 20 °C) e sorção elevada (> 1.000 L kg-1) para

as partículas do solo. As chuvas de alta intensidade aumentam a transferência de

glifosato por enxurrada em superfícies duras (BOTTA et al, 2009).

Sua pressão de vapor a 45ºC é de 1,87 x 10-7 mmHg e é estável a altas

temperaturas (60ºC) (CASTRO JÚNIOR, 2006).

É comercializado desde 1974 e sua utilização é suscetível a aumentar ainda

mais, pois é um dos herbicidas mais usados em culturas de plantas geneticamente

modificadas. A soja Roundup Ready (RR) da Monsanto foi a primeira planta

Introdução

21

transgênica a ser aprovada para alimentação humana e animal e para cultivo no

Brasil. A soja RR foi modificada por técnicas de DNA recombinante (DNAr) pela

inserção de um gene da bactéria Agrobacterium sp., que a torna resistente ao

herbicida glifosato (ABREU; MATTA; MONTAGNER, 2008). Atualmente também tem

sido usado para o controle das plantações ilícitas de coca e papoula (ANADÓN et al,

2009).

Nos últimos anos muitos estudos têm mostrado o impacto no uso urbano, o

que é importante em escala local, devido à aplicação em superfícies impermeáveis,

como ruas, calçadas e gramados (BOTTA et al, 2009).

A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA) fixou um nível

máximo de glifosato em água potável a 0,7 µg mL-1. O nível máximo de resíduos de

glifosato na maioria das culturas é fixado em 0,1 µg g-1 pela União Europeia

(UE). Em Taiwan, esse nível de resíduos foi fixado para água e culturas em 1,0 µg

mL-1 e 0,1 – 1,0 µg g-1, respectivamente (HSU; WHANG, 2009). A UE estabelece

que glifosato e AMPA (ácido aminometil fosfônico, seu principal metabólito) sejam

monitorizados não só em água e solos, mas também em outras matrizes, tais como

frutas, legumes e produtos de origem animal, devido à sua presença na cadeia

alimentar (CORBERA et al, 2005).

No Japão, foi usado como pesticida nos anos 80. Depois disso, muitos casos

de intoxicação acidental e suicida foram relatados devido à sua ingestão

(MOTOJYUKU et al, 2008). Em Paris, o programa de monitoramento de pesticidas

(Phyt’Eaux Propres) observou um aumento significativo das concentrações de

glifosato e AMPA em águas superficiais (BOTTA et al, 2009).

Nas condições ambientais, tanto o glifosato quanto seus sais são sólidos

cristalinos muito solúveis em água e quase insolúveis em solventes orgânicos

Introdução

22

(AMARANTE JÚNIOR et al, 2002b). O glifosato também pode ser classificado como

um herbicida organofosforado, sem, no entanto, afetar o sistema nervoso do mesmo

modo que outros pesticidas organofosforados.

As aplicações do produto devem ser dirigidas sobre as plantas invasoras

seguindo as recomendações técnicas das boas práticas agrícolas. Se for utilizado

dessa forma, não causará qualquer interferência no desenvolvimento e

produtividade das culturas para as quais é recomendado (GALLI; MONTEZUMA,

2005).

O glifosato é absorvido basicamente pela região clorofilada das plantas

(folhas e tecidos verdes) e transferido, preferencialmente, pelo floema, para os

tecidos meristemáticos (GALLI; MONTEZUMA, 2005).

O modo primário de ação do herbicida se dá através da interferência na

produção de aminoácidos aromáticos e outros compostos aromáticos em plantas,

que é possível devido à inibição competitiva da 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato

sintetase (EPSPS), que é responsável pela síntese de um intermediário na

biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano. Com isso, as plantas não

conseguem produzir os aminoácidos essenciais para sua sobrevivência, o que

provoca diminuição do crescimento, ruptura e morte celular (SOUZA, et al, 2006;

REDDY et al, 2008; ANADÓN et al, 2009). A Figura 2 mostra o mecanismo de ação

do glifosato.

Introdução

23

Figura 2 - Mecanismo de ação do herbicida glifosato (TONI; SANTANA; ZAIA, 2006)

O glifosato apresenta custo relativamente baixo e excelente eficiência

agronômica, o que se reflete na sua grande aplicação. Assim, os cuidados

relacionados à possibilidade de contaminação do ambiente com esta molécula

devem ser estudados cautelosamente porque há evidências de efeitos deletérios no

ambiente após seu uso prolongado. É importante preparar-se para outro risco, visto

que a formulação mais comercializada no país contém um surfactante com ação

irritativa dermatológica, conhecido como POEA (polietoxietileno amina) (SOUZA, et

al, 2006).

Introdução

24

A exposição cutânea ao glifosato tem sido analisada como agente de

contribuição para o Mal de Parkinson. Pesquisadores propõem que o glifosato pode

contribuir nessa patologia neurológica em virtude da sua semelhança química com a

glicina, um co-fator necessário para a ativação do N-metil-D-aspartase (NMDA), que

controla ações excitatórias no sistema nervoso central e também está envolvida na

memória e aprendizado (ANADÓN et al, 2009).

O ácido aminometilfosfônico (AMPA) é o metabólito principal do glifosato. Sua

solubilidade em água (20ºC) é maior que 105 mg L-1 (SANCHO et al, 1996),

conforme descrito na Figura 3.

Figura 3 – Estrutura química do ácido aminometilfosfônico (COUTINHO; COUTINHO; MAZO, 2009)

Também apresenta comportamento zwiteriônico e seus pkas são de 0.9, 5,6 e

10,2 respectivamente (LLASERA et al, 2005).

Embora tenha toxicidade baixa (DL50 é de 8300 mg kg-1), o AMPA é mais

persistente que o glifosato. Estudos estimam que a meia-vida do glifosato pode ser

inferior a 3 dias, enquanto a meia-vida do AMPA varia entre 119 e 958 dias (TONI;

SANTANA; ZAIA, 2006). No ambiente, as concentrações mais altas de glifosato e

AMPA são encontradas no solo. A aplicação direta de glifosato como herbicida em

águas superficiais pode ser responsável pela contaminação em água potável

(AMARANTE JÚNIOR, et al, 2002b).

O AMPA também é produto de degradação de alguns detergentes. Os

detergentes derivados do ácido fosfórico, como o ácido etileno diamina tetrametileno

Introdução

25

fosfônico (EDTMP) ou o ácido dietilenotriamina pentametileno fosfônico (DTPMP)

podem ser degradados em AMPA e encontrados no meio ambiente (BOTTA et al,

2009).

Apesar do glifosato não ser persistente, o conhecimento detalhado sobre a

sua biodegradação em solos brasileiros é relativamente pequeno. Além disso, o

aparecimento da soja transgênica, resistente ao glifosato, tem aumentado a

preocupação ambiental devido, principalmente, à maior dosagem na aplicação do

herbicida nos campos cultivados (ARAÚJO, 2002).

Mesmo possuindo grande eficiência, o glifosato não tem ação sobre as

sementes das plantas invasoras no solo e, portanto deve ser aplicado quando as

espécies a serem eliminadas estão em desenvolvimento, preferencialmente em solo

seco. Entretanto, esse herbicida pode ter várias aplicações, tais como no controle de

plantas invasoras, nas culturas de ameixa, banana, cacau, pêra, pêssego,

seringueira, entre outras. O glifosato pode ainda ser aplicado em corpos hídricos

para o controle de plantas aquáticas (ABREU; MATTA; MONTAGNER, 2008).

Para o aumento da eficiência do glifosato pode-se utilizá-lo misturado com

outros herbicidas, tais como formulados à base de 2,4D, terbutilazina, simazina,

alaclor e diuron (AMARANTE JÚNIOR et al, 2002a).

1.2. Degradação

De maneira geral, os solos são compostos de três fases: sólida (mineral e

orgânica); líquida e gasosa. Exibem conseqüentemente, propriedades resultantes

destas três fases e do equilíbrio físico e químico entre as mesmas. Além disto, não

apenas a composição química dos componentes sólidos do solo, mas também sua

Introdução

26

estrutura mineral e o estado de dispersão são fatores que influenciam as

propriedades do solo (WOLT, 1994).

De todos os componentes do solo, a matéria orgânica é um dos principais

constituintes e é definida nos seguintes termos: “a fração orgânica do solo incluindo

resíduos vegetais e animais em diferentes estados de decomposição, tecidos e

células de organismos e substâncias produzidas por habitantes do solo”, segundo

“SOIL SOCIETY OF AMERICA” (KABATA-PENDIAS, 2001).

A degradação de uma substância química no solo pode ser realizada de

diversas formas e por diversos agentes. Podem ocorrer por reações químicas por

meio de fotólise, ou por meio de catálise bioquímica, por microorganismos presentes

no meio. Este último caso, chamado de biodegradação, é a principal forma de se

degradar um composto orgânico, em especial os herbicidas, no solo e em águas

naturais (ARAÚJO, 2002; CASTRO, 2005).

A degradação do glifosato no solo é muito rápida e realizada por uma grande

variedade de microorganismos, que usam o produto como fonte de energia e

fósforo, por meio de duas rotas catabólicas, produzindo sarcosina como metabólito

intermediário na rota alternativa e o ácido aminometilfosfônico (AMPA) como o

principal metabólito (DICK; QUINN, 1995, AMARANTE JÚNIOR et al, 2002a).

Existem duas vias principais de degradação microbiana do glifosato; a

primeira envolve a clivagem da ligação C-N da molécula produzindo o AMPA. A

segunda é pela clivagem da ligação C-P do composto, produzindo sarcosina,

conforme mostra a Figura 4. Os microorganismos possuem a capacidade de

metabolizar esses compostos e transformá-los em energia e nutrientes para sua

sobrevivência (AMARANTE JÚNIOR et al, 2002a; ANADÓN et al, 2009).

Introdução

27

Figura 4 – Rotas de decomposição microbiológica do glifosato (adaptado de AMARANTE JÚNIOR et

al, 2002a)

Os herbicidas em geral, quando aplicados por vários anos, podem ter sua

degradação mais acelerada em relação ao produto aplicado pela primeira vez, pois

os microorganismos estão mais adaptados ao composto e possuem enzimas

específicas para metabolizar o composto (ARAÚJO, 2002).

Introdução

28

1.3. Métodos de extração e determinação de glifosato e AMPA

Devido ao grande uso do herbicida glifosato, faz-se necessário o emprego de

métodos confiáveis para o acompanhamento deste herbicida em lavouras, frutas e

legumes (KHROLENKO; WIECZOREK, 2005).

A determinação de glifosato e AMPA representa um desafio analítico, devido

às altas solubilidades, insolubilidade em solventes orgânicos e baixa volatilidade

(HSU; WHANG, 2009).

A extração de glifosato e AMPA do solo vem sendo cada vez mais estudada

visando ao aprimoramento de metodologias que apresentem boa recuperação do

herbicida. Devido a suas altas polaridade e solubilidade em água, a extração destes

compostos a partir de matrizes aquosas torna a recuperação de glifosato e seu

metabólito a principal dificuldade na sua análise (CORBERA et al, 2005).

A maioria dos procedimentos de extração do herbicida baseia-se em reações

ácido-base, em que o composto, inicialmente ligado a espécies iônicas do solo via

grupo fosfato, passa, então, a interagir com os íons da solução. Assim, são

geralmente utilizadas soluções de bases fortes, sais de bases fortes, bases fracas,

ou ácidos fracos para extração (SOUZA et al, 2006).

Para analisar amostras ambientais a baixas concentrações, o enriquecimento

e purificação dos analitos são obrigatórios. Eles incluem as técnicas bem

estabelecidas como: extração líquido-líquido (ELL), extração em fase sólida (EFS)

ou cromatografia de troca iônica (KHROLENKO; WIECZOREK, 2005; HSU;

WHANG, 2009).

Uma grande variedade de métodos de análise têm sido aplicados para a

determinação de glifosato. As cromatografias gasosa (GC) e líquida (CL) são as

Introdução

29

mais aplicadas, mas nos últimos anos a eletroforese capilar (EC) também se tornou

uma opção (KHROLENKO; WIECZOREK, 2005).

A determinação de glifosato por cromatografia necessita de adaptações que

permitam sua detecção. Tais adaptações incluem basicamente reações de

derivatização ou alteração de alguma propriedade física que possa ser relacionada à

quantidade de glifosato na amostra (SEE et al, 2010).

A EPA recomenda para a análise de glifosato a técnica de CLAE

(cromatografia líquida de alta eficiência) com detector de fluorescência, seguida de

derivatização pós-coluna. A técnica de cromatografia gasosa de alta resolução

acoplada à espectrometria de massas também pode ser empregada, porém, faz-se

necessária uma prévia derivatização para tornar os compostos voláteis e aumenar

sua polaridade (SOUZA et al, 2006, HSE; WHANG, 2009).

Quanto à derivatização, o glifosato é considerado um caso especial, visto que

devido à sua natureza polar e alta solubilidade em água limita a possibilidade de uso

de técnicas padrão de derivatização, empregadas nas análises via cromatografia

gasosa (SOUZA et al, 2006).

Geralmente, o processo envolve o uso de anidrido trifluoroacético (TFAA) e

trifluoroetanol (TFE) em excesso, devido ao fato de que as etapas de formação dos

compostos derivados são de equilíbrio e, com este excesso, a reação deslocar-se-à

no sentido de formar compostos derivados, conforme mostra a Figura 5 (SOUZA et

al, 2006).

Introdução

30

Figura 5 – Esquema simplificado de conversão do glifosato e AMPA em seus respectivos derivados

(adaptado de SOUZA et al, 2006)

1.4. Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas

A espectrometria de massas é muito utilizada como detector cromatográfico,

pois permite a obtenção de informações tanto qualitativas como quantitativas. O

espectrômetro pode ser altamente seletivo ao analito de interesse (HARRIS, 2005).

A espectrometria de massas necessita de alto vácuo para evitar colisões

moleculares durante a separação dos íons; já a cromatografia é intrinsecamente

uma técnica de alta pressão. O problema ao acoplar as duas técnicas é a remoção

da grande quantidade de matéria presente entre o cromatógrafo e o espectrômetro

(HARRIS, 2005). A Figura 6 mostra um esquema típico de um cromatógrafo gasoso

acoplado à espectrometria de massas.

Introdução

31

Figura 6 – Esquema de um cromatógrafo típico a gás capilar, acoplado a um espectrômetro de

massas (adaptado de SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2006)

A análise/separação consiste no bombardeamento de cada pico eluído da

coluna cromatográfica por uma fonte energizante (geralmente impacto de elétrons),

em que o composto é fragmentado em uma grande diversidade de íons. Os íons são

separados em um analisador (quadrupólo submetido a um campo elétrico). A

interação dos fragmentos iônicos com o campo elétrico faz com que apenas íons de

determinada relação massa/carga (m/z) passem intactos, sem colidirem com o

quadrupolo (LANÇAS, 1993).

A fonte de íons por impacto de elétrons funciona da seguinte maneira: a

temperatura da amostra é elevada a valor suficiente para promover sua evaporação,

sendo, em seguida, bombardeada por feixes de elétrons energéticos (SKOOG;

HOLLER; NIEMAN, 2006). A Figura 7 apresenta um esquema de uma fonte de íons

por impacto de elétrons.

Introdução

32

Figura 7 – Esquema ilustrativo de uma fonte de íons por impacto de elétrons (adaptado de SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2006)

As fontes por impacto de elétrons geram correntes iônicas grandes, o que dá

uma boa sensibilidade. A grande fragmentação também é vantajosa, pois facilita a

identificação de picos não-ambíguos. Porém, às vezes o fragmento do íon molecular

pode desaparecer, o que impossibilita a determinação da massa molecular dos

analitos (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2006).

Neste trabalho, utilizou-se a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria

de massas (CG-EM) para a determinação de glifosato e seu metabólito em amostras

ambientais.

Através da técnica, as moléculas derivatizadas de glifosato e AMPA foram

submetidas ao impacto de elétrons, originando os fragmentos mostrados na Figura 8

(m/z 238, 260 e 411 para o glifosato e m/z 246 e 302 para o AMPA).

Introdução

33

1.5. Resinas de Troca Iônica

As resinas de troca iônica são produtos sintéticos que, em contato com água,

podem liberar íons sódio ou hidrogênio (resinas catiônicas) ou hidroxila (resinas

aniônicas) e captar desta mesma água, respectivamente, cátions e ânions

responsáveis pela dureza e teor de sólidos dissolvidos, eliminando assim, algumas

impurezas da amostra (RIANI, 2008).

As resinas de troca iônica sintéticas são constituídas, na sua maioria, de

copolímeros de estireno, com divinilbenzeno (DVB), na forma de partículas esféricas

de diâmetro 300 a 1.180 µm. São muito utilizadas no tratamento de águas, resíduos

nucleares e nas indústrias alimentícias e farmacêuticas (HUNG, 1994).

Após a copolimerização, grupamentos ácidos (geralmente ácido sulfônico) ou

básicos (quaternários de amônio) poderão ser inseridos nos núcleos de benzeno

dos monômeros utilizados, dando uma funcionalidade às resinas (RIANI, 2008).

m/z 411 m/z 260 m/z 238

m/z 302 m/z 246

Figura 8 – Fragmentação proposta para análise de glifosato e AMPA por CG – EM

Introdução

34

+ 2 R – Na 2 Na+ + R2

+ 2 R – H 2 H+ + + 2 R – H 2 H+ + R2

As resinas com grupamentos ácidos ou básicos, ao contrário das soluções

aquosas de ácidos e bases, não se dissociam em duas espécies iônicas. Somente

uma espécie é dissociada nas resinas catiônicas (Na+ ou H+) e aniônicas (OH-). As

demais ficam ligadas às cadeias de estireno e divinilbenzeno (RIANI, 2008).

As resinas catiônicas podem estar na forma de sal de sódio, quando são

utilizadas para abrandamento da água ou na forma de hidrogênio, quando são

utilizadas para descarbonatação ou desmineralização da água, conforme

exemplificadas na Figura 9.

Reação de abrandamento

Ca2+ Ca2+

Mg2+ Mg2+ Reação de descarbonatação/desmineralização Ca2+ Ca Mg2+ Mg

2Na+ 2Na Figura 9 – Esquema das reações de abrandamento e desmineralização por resina de troca catiônica

Já as resinas aniônicas removem ânions fortes e fracos, tais como cloretos,

sulfatos, nitratos, bicarbonatos e silicatos. A Figura 10 apresenta um esquema da

reação ocorrida nesta resina.

H2SO4 SO42-

2 HCl 2Cl- 2 HNO3 2NO3

-

Figura 10 – Esquema da reação ocorrida na resina de troca aniônica

2 R – OH 2 R + 2 H2O

Objetivos

35

2. OBJETIVOS

- determinar os parâmetros físico-químicos das amostras de água e sedimento;

- validar metodologia para determinação de glifosato e AMPA em amostras de água,

e sedimento via CG-EM;

- verificar a presença de glifosato e AMPA em amostras de água e sedimento em

matrizes ambientais.

Fundamentos Teóricos

36

3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS

3.1. Validação

Validar, em Análise Química, é estar voltado para a confiabilidade analítica do

laboratório e do método escolhido ou desenvolvido para se obter o resultado (LEITE,

2008).

O INMETRO recomenda que no planejamento/execução da validação seja

seguida a seguinte sequência de trabalho (INMETRO, 2010):

• definir a aplicação, objetivo e escopo do método;

• definir os parâmetros de validação e critérios de aceitação;

• verificar se as características de desempenho do equipamento estão

compatíveis com o exigido pelo método em estudo;

• qualificar os materiais, por exemplo, padrões e reagentes;

• planejar os experimentos de validação, incluindo o tratamento estatístico, e

• fazer os experimentos de validação.

Os parâmetros que necessitam ser calculados durante o processo de

validação podem variar de acordo com o tipo de ensaio, como mostra a Tabela 1.


37

Tabela 1 – Parâmetros de validação conforme o tipo de ensaio (INMETRO, 2010)

Parâmetros

Tipo de ensaio

Qualitativo Determinação do

componente (ou

analito) em maior

teor

Análise de

elementos

menores e

Traços

Propriedades

Físicas

Precisão X X X

Seletividade X X X X

Recuperação X X X

Robustez X X X X

Sensibilidade X X X

Linearidade X X X

Limite de

detecção

X X

Limite de

quantificação

X

No presente trabalho, o objetivo principal é determinar glifosato e AMPA em

amostras ambientais. Sendo assim, a classificação mais adequada seria a análise

de elementos menores e traços.

3.2. Seletividade

A seletividade, em Química, tem como objetivo garantir a identidade do ativo

que se deseja determinar (LEITE, 2008).

Segundo a IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada), a

seletividade se refere à parte do método que pode ser aplicada para determinar uma

espécie em particular, na mistura, ou matrizes, sem sofrer interferências de outras

espécies de comportamento similar (LEITE, 2008).


38

De acordo com a ANVISA, em cromatografia, devem-se tomar as precauções

necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos. A utilização de testes

de pureza de pico (com auxílio de detector de arranjo de fotodiodos ou

espectrometria de massas, por exemplo) são interessantes para demonstrar que o

pico cromatográfico é atribuído a um só componente (BRASIL, 2003).

Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a recuperação e a

precisão estarão seriamente comprometidas (INMETRO, 2010).

A Tabela 2 mostra como deve ser feita a avaliação da seletividade, de acordo

com INMETRO.

Tabela 2 - Avaliação da seletividade (INMETRO, 2010)

Procedimento Demonstrar Comentários

a) Fazer a análise com a

amostra e materiais de

referência pelo método

em

estudo e outros métodos

validados

Habilidade do método em

estudo de identificar

e dosar o analito na

presença de interferentes

Evidências necessárias

para dar

suporte e gerar

confiabilidade

suficiente

b) Analisar amostras

contendo vários

interferentes

suspeitos na presença do

analito de interesse

Efeito de interferentes - a

presença de interferente

acentua ou inibe a

detecção ou

quantificação do analito

de interesse

Se alteram resultados,

aperfeiçoar o método ou

selecionar outro mais

adequado

3.3. Sensiblidade

Sensibilidade é um parâmetro que demonstra a variação da resposta em

função da concentração do analito. Pode ser expressa pela inclinação da curva de


39

regressão linear de calibração, conforme a Equação 1 e é determinada

simultaneamente aos testes de linearidade. A sensibilidade depende da natureza do

analito e da técnica de detecção utilizada (INMETRO, 2010).

Equação 1

Onde:

S = sensibilidade;

dx = variação da resposta;

dc = variação da concentração.

3.4. Recuperação

O ideal de um método analítico é analisar o analito de interesse diretamente

sobre a amostra. Porém, essa operação é dificultada por fatores como o estado

físico da amostra, a forma molecular do analito e os demais componentes da

amostra, que podem influir não só na seletividade, mas também na resposta à

quantificação (LEITE, 2008).

Toda amostra que recebe tratamento de análise indireta (diluição, extração,

concentração, derivação etc) assim como direta (baixa solubilidade, possibilidade de

cristalização etc), deve ter calculado o erro ou perda da espécie em análise, de

acordo com a Equação 2. Ao número obtido, dá-se o nome de Fator de

Recuperação (LEITE, 2008).

Equação 2


40

3.5. Limites de detecção e quantificação

Toda técnica responde com um sinal analítico para uma determinada

quantidade de amostra (LEITE, 2008).

O limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma

amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado (BRASIL,

2003).

Para métodos instrumentais, pode ser determinado com base na relação de

três (3) vezes o ruído da linha de base. Pode ser determinado pela Equação 3

Equação 3

em que: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y e IC é a inclinação da

curva analítica.

Por sua vez, o limite de quantificação é a menor quantidade do analito em

uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis

(BRASIL, 2003).

O limite pode ser determinado por meio do ruído. Neste caso, determina-se o

ruído da linha de base e considera-se como limite de quantificação aquela

concentração que produza relação sinal-ruído superior a 10:1 (BRASIL, 2003).

Também pode ser determinado pela Equação 4:

Equação 4


41

em que: DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y e IC é a inclinação da

curva de calibração.

3.6. Linearidade

A linearidade está relacionada diretamente com o sistema de emissão

analítica, ou seja, determina a região da curva de resposta onde há relação direta

sinal/concentração (LEITE, 2008).

Segundo a Anvisa, recomenda-se que a linearidade seja determinada pela

análise de, no mínimo, cinco (5) concentrações distintas (BRASIL, 2003; INMETRO,

2010).

A verificação da linearidade fica mais fácil quando se introduz o coeficiente de

correlação (R), que expressa a relação de x e y na curva. Quanto mais próximo da

unidade (1), maior a probabilidade de existir uma relação linear (LEITE, 2008;

BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2002). O valor mínimo aceitável para este

coeficiente, segundo a ANVISA, é de 0,99. Para matrizes complexas, o coeficiente

pode chegar a 0,98 (BRASIL, 2003).

Outro coeficiente a ser analisado é o de determinação (R2), que nada mais é

do que uma medida da proporção da variabilidade em uma variável que é explicada

pela variabilidade de outra (no caso, as variáveis x e y). O valor máximo de R2 é a

unidade (1), e só ocorrerá se toda a variação em torno da média for explicada por

regressão. Quanto mais perto da unidade estiver o valor de R2, melhor terá sido o

ajuste do método às respostas observadas (BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS,

2002).


42

3.7. Precisão

O primeiro passo para verificação da confiabilidade de uma análise é

investigar se a mesma se repete quando operada seqüencialmente. A essa

operação de repetição denomina-se precisão (LEITE, 2008).

Quando se trata da instrumentação atual, a precisão deve ser questionada,

visto que os equipamentos atuais dispõem de sensores que acompanham as

mudanças de umidade e temperatura. A chegada dos injetores automáticos, fez com

que a verificação do processo de repetição de injeção do analista se tornar

desnecessária. Todavia, enquanto houver equipamentos mais antigos ainda em uso,

a verificação da precisão ainda será necessária (LEITE, 2008). Mas vale ressaltar

que ainda assim é necessário avaliar a precisão da metodologia como um todo,

desde a etapa de preparo de amostras até o momento da injeção.

Denomina-se precisão a concordância entre os vários valores experimentais

obtidos. Quanto mais próximos entre si estiverem, menor será o grau de

espalhamento das medidas (LEITE, 2008).

Para avaliar a precisão, é necessário entender dois conceitos importantes, a

Repetibilidade e a Reprodutibilidade (LEITE, 2008).

A Repetibilidade é a máxima diferença aceitável entre duas repetições.

Ocorre quando se tem em conjunto alguns fatores semelhantes como a mesma

amostra, analista, equipamento, momento, ajuste e calibração (LEITE, 2008). Há

dois tipos de precisão a serem analisadas; a precisão intra-corrida e a inter-corridas.

a) Precisão intra-corrida: concordância entre os resultados dentro de um curto

período de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação (BRASIL,

2003).


43

b) Precisão inter-corridas: concordância entre os resultados do mesmo

laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou

equipamentos diferentes (BRASIL, 2003).

A Reprodutibilidade, por sua vez, é a máxima diferença aceitável entre dos

resultados, cada um obtido em um laboratório distinto. Ocorre também quando uma

amostra é analisada por equipamentos diferentes, obtendo-se desvio aceitável e

compatível. Pode ser obtida através do conjunto de alguns fatores tais como

diferentes analistas, equipamentos, momentos, técnicas, calibrações, ajustes e a

amostra analisada ser diferente, porém de um mesmo ponto amostral (LEITE, 2008).

A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou

coeficiente de variação (CV%), segundo a Equação 5:

Equação 5

em que, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.

O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia

empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do

método, não se admitindo valores superiores a 5% (BRASIL, 2003).

3.8. Exatidão

A exatidão traduz a concordância dos valores experimentais com o valor

verdadeiro (LEITE, 2008).


44

A exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da quantidade

conhecida do analito adicionado à amostra, ou como a diferença porcentual entre as

médias e o valor verdadeiro aceito, acrescida dos intervalos de confiança, de acordo

com a Equação 6 (BRASIL, 2003).

Equação 6

Para avaliar a exatidão também pode-se usar testes estatísticos. Calcula-se

as médias dos diferentes níveis de fortificação e aplica-se o teste T de Student. O

teste é conhecido como Teste de Hipótese (BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS,

2002).

A filosofia do teste de hipótese é fácil de entender. O termo que aparece no

denominador da Equação 7 é um exemplo de erro padrão. A estimativa t é o

afastamento do valor amostral em relação ao valor populacional correspondente à

hipótese nula, medido em unidades de erro padrão. Quanto maior for esse

afastamento, menor a chance da hipótese nula ser verdadeira (BARROS NETO;

SCARMINIO; BRUNS, 2002).

Os testes de hipóteses são sempre constituídos por duas hipóteses, a

hipótese nula H0 e a hipótese alternativa H1.

Hipótese nula (H0): é uma hipótese (valor suposto) para um parâmetro (no

caso, 100% de recuperação). Se o resultado não for diferente de H0, a hipótese não

poderá ser rejeitada.

Hipótese alternativa (H1): é a hipótese que contraria a hipótese nula

(recuperação ≠ 100%). Só será aceita se os resultados forem diferentes de H0.


45

Equação 7

texp(95%) – constante T (teste T de Student) a 95% de confiança

α – desvio padrão das médias das recuperações

µ - hipótese esperada (100% de recuperação)

x – média das recuperações

n – tamanho da amostra

Se texp ≤ ttab, isso indica que a hipótese nula deve ser aceita, ou seja, não há

diferenças significativas entre o valor esperado e o encontrado, mostrando assim

que o método proposto é exato.

3.9. Robustez

A robustez pode ser conceituada como a variação da condição analítica. Deve

ser considerada como um alerta da susceptibilidade do método às variações e não

como parâmetro de aprovação/rejeição da condição analítica (LEITE, 2008).

Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliação

da robustez (BRASIL, 2003).

A Tabela 3 relaciona os principais parâmetros que podem resultar em

variação na resposta do método (BRASIL, 2003).


46

Tabela 3 – Fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método analítico (BRASIL, 2003)

Método de Análise Condição a ser variada

Preparo das Amostras - Estabilidade das soluções analíticas

- Tempo de extração

Espectrofotometria - Variação do pH da solução

- Temperatura

- Diferentes fabricantes de solventes

Cromatografia Líquida - Variação do pH da fase móvel

- Variação na composição da fase móvel

- Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

- Temperatura

- Fluxo da fase móvel

Cromatografia Gasosa - Diferentes lotes ou fabricantes de colunas

- Temperatura

- Velocidade do gás de arraste

Para determinar a robustez de um método de ensaio, pode-se recorrer ao

teste de Youden. Trata-se de um teste que permite não só avaliar a robustez do

método, como também ordenar a influência de cada uma das variações nos

resultados finais, indicando qual o tipo de influência de cada uma dessas variações

(INMETRO, 2003).

Nesse método são realizados oito (8) ensaios, separados para determinar os

efeitos da variação de sete (7) diferentes parâmetros, no procedimento analítico.

Caso um número menor que sete parâmetros forem analisados, basta excluir uma

linha da tabela. As oito medições podem ser realizadas numa ordem aleatória. A

Tabela 4 mostra a matriz de fatores a serem avaliados (INMETRO, 2003). Os fatores

nominais (sem variação) são representados por letras maiúsculas enquanto que os

fatores variáveis são representados por letras minúsculas.


47

Tabela 4 – Matriz dos fatores para a determinação da robustez (INMETRO, 2003)

Valor do

fator

Combinação Ensaiada

1 2 3 4 5 6 7 8

A ou a A A A A a a a a

B ou b B B b b B B b b

C ou c C c C c C c C c

D ou d D D d d d d D D

E ou e E e E e e E e E

F ou f F f f F F f f F

G ou g G g g G g G G g

Resultado s t u v w x y z

Se a combinação 1 for ensaiada, o resultado será s. Se a combinação 2 for

ensaiada será t e assim sucessivamente até que todas as 8 combinações tenham

sido ensaiadas. Para determinar a variação de um fator, encontrar os 4 valores

correspondentes às letras maiúsculas e as 4 minúsculas e comparar as médias dos

dois grupos. Por exemplo, ao calcular as alterações de C para c, usar os resultados:

Equação 8

Após crítica dos resultados obtidos, fazer um controle mais rigoroso dos

fatores de maior influência. Se não houver diferença significativa, calcular a média e

o desvio padrão dos oito (8) resultados, de s até z. O desvio padrão é uma

estimativa realista da precisão do método (INMETRO, 2003).

Experimental

48

4. EXPERIMENTAL

4.1. Amostragem

De acordo com a CETESB, diversos compartimentos ambientais podem ser

amostrados, tais como solos, sedimentos, aterros, águas subterrâneas e águas

superficiais, efluentes, dentre outros (CETESB, 2001).

Para o monitoramento da concentração de glifosato e AMPA, foi realizada

amostragem na Bacia Hidrográfica Tietê-Jacaré, na sub-Bacia do rio Jacaré-Guaçu,

na cidade de São Carlos.

A Bacia Hidrográfica do Tietê-Jacaré é situada na região central do estado de

São Paulo. É composta por 34 municípios e abriga cerca de 3% da população do

estado e de acordo com o IBGE/2008 possui 1.489.153 habitantes. Divide-se em

seis (6) Sub-Bacias, sendo que a cidade de São Carlos encontra-se na Sub Bacia do

Rio Jacaré-Guaçu. (TUNDISI et al, 2008, SigRH, 2010). As Figuras 11 e 12 mostram

a localização da Bacia do Tietê Jacaré no estado de São Paulo, bem como as

cidades pertencentes à Bacia.

O rio Jacaré-Guaçu possui 155 km de extensão, cujas nascentes estão nos

municípios de Itirapina e São Carlos. Um de seus principais afluentes é o rio

Monjolinho (ESPÍNDOLA et al, 2000).

O município de São Carlos está localizado na região central do estado de São

Paulo, distante a 231 km da capital. Sua população estimada é de 221.936

habitantes (IBGE, 2010), distribuídos em uma área total de 1.141 km².

Experimental

49

Figura 11 – Bacia do Tietê-Jacaré em destaque no estado de São Paulo (adaptado de CTPI, 2008)

Figura 12 – Cidades pertencentes à bacia do Tietê-Jacaré (adaptado de CPTI, 2008)

A amostragem foi realizada no início do mês de setembro de 2010, em cinco

(5) pontos amostrais próximos à Estação de Tratamento de Esgoto Monjolinho, no

município de São Carlos. As condições ambientais do dia foram: temperatura

variando entre 15 e 29ºC, 0 mm de precipitação, ventos de 19 km/h e umidade

relativa do ar em 41%. A Tabela 5 apresenta os pontos amostrados, sua localização

e o material amostrado em cada ponto. Já as Figuras 13 – 17 apresentam a foto

digital e de satélite de cada ponto amostrado. A Figura 18 mostra a bacia do rio

Monjolinho com a localização dos pontos amostrados.

Experimental

50

Tabela 5 – Pontos de coleta e localização do material amostrado

Pontos de Coleta Localização Amostragem

Ribeirão Água Quente –

Ponto 1

Estrada Municipal do

Matadouro, logo após a

ETE Monjolinho

(22º1’53.52’’S,

47º55’48.68’’O)

Água e sedimento

Ribeirão Água Fria –

Ponto 2

Final da parte

pavimentada da Estrada

Municipal do Matadouro

(22º2’4.56’’S,

47º56’23.07’’O)

Água e sedimento

Ribeirão Água Fria –

Ponto 3

Final da parte

pavimentada da Estrada

Municipal do Matadouro

(22º2’3.13’’S,

47º56’23.35’’O)

Água e sedimento

Rio Monjolinho – Ponto 4 1ª bifurcação da Estrada

Municipal do Matadouro,

próximo a ponte

(22º2’7.12’’S,

47º57’27.03’’O)

Água e sedimento

Sem denominação

específica: afluente

Monjolinho – Ponto 5

Fazenda Santa Maria

(22º2’22.30’’S,

47º58’2.45’’O)

Água e sedimento

Experimental

51

Figura 13 – Foto real e imagem de satélite – Rio Monjolinho (Ponto 1)

Figura 14 – Foto real e imagem de satélite – Ribeirão Água Quente (Ponto 2)

Figura 15 – Foto real e imagem de satélite – Ribeirão Água Fria (Ponto 3)

Experimental

52



Experimental

53

Figura 18 – Bacia do Rio Monjolinho com seus afluentes e localização dos pontos amostrados

(adaptado de DORNELLES, 2006).

Os frascos usados (tipo âmbar) para a coleta das amostras foram imersos em

solução de detergente Extran por 24 horas. Em seguida, lavados seis vezes em

água corrente, três em água destilada, uma em água isenta de orgânicos e uma vez

com acetona. A vidraria foi seca em estufa (exceto material volumétrico).

As amostras de solo foram coletadas com auxílio de cavadeira. Após o

procedimento de coleta, as amostras de água foram conservadas a 4ºC em

geladeira. As amostras de sedimento foram armazenadas em freezer a -10ºC,

conforme condições de preservação apresentadas nas Tabelas 6 e 7.

Experimental

54

Tabela 6 – Preservação de amostras de água de acordo com a CETESB (CETESB, 2001)

Parâmetro Tipo de frasco Preservação Tempo de espera

Cor Vidro Não há Não há

Turbidez Vidro Não há Não há

pH Vidro Não há 24 horas

Condutividade Vidro Não há Não há

Temperatura Vidro Não há Análise imediata

DQO Vidro, Polietileno Não há Análise imediata

DBO Vidro, Polietileno Não há Não há

COT Não há Não há Não há

Análise CG-EM Vidro Não há 48 horas

Tabela 7 – Preservação de amostras de solo de acordo com a CETESB (CETESB, 2001)

Parâmetro Tipo de frasco Preservação Tempo de espera

Acidez Polietileno, vidro Resfriamento a

4ºC

14 dias

Carbono orgânico Polietileno, vidro Resfriamento a

4ºC

28 dias

Fósforo total

Polietileno, vidro Resfriamento a

4ºC

28 dias

Pesticidas Vidro, tampa de

Teflon

Resfriamento a

4ºC

30 dias após a

extração

Experimental

55

Vale ressaltar que a amostragem realizada não representa a situação da

Bacia do Rio Monjolinho como um todo, pois a amostragem não foi realizada em

toda a extensão do rio, e sim em pontos muito específicos, com o objetivo de validar

a metodologia proposta.

4.2. Materiais

4.2.1. Lista de reagentes

Tabela 8 – Lista de padrões e reagentes utilizados

Padrões Solventes

Ácido aminometilfosfônico – AMPA

(Sigma-Aldrich) (lote MRBC 7625;

validade: 14/09/2015)

Glifosato (Sigma-Aldrich) (lote

13023ME; validade: 30/05/2015)

2,2,2-trifluoroetanol (Sigma-Aldrich)

Anidrido trifluoroacético (Tedia)

Acetato de Etila (Tedia)

Água Deionizada (Milli-Q – Sistema

Millipore

4.2.2. Lista de Equipamentos

Balança Analítica – BG 1000 Gehaka

Centrífuga Novatecnica NT 810

Chapa Aquecedora

Espectrofotômetro UV-Vis Jasco V-630

Estufa – Quimis

Mesa Agitadora – Tecnal

Mufla – Edgcon – 1P

Experimental

56

pHmetro – pHMeter Tec 2 – Tecnal

Rotaevaporador Fisatom 802 D

Sistema GC/MS Shimadzu

TOC – VCPH modelo 5000A Shimadzu

4.2.3. Outros Materiais

Ácido acético 1,0 mol L-1

Ácido clorídrico PA (HCl)

Ácido sulfúrico PA (H2SO4)

Biftalato de potássio (C8H5KO4)

Cloreto de cálcio (CaCl2) 0,01 mol L-1

Cloreto de potássio (KCl) 1,0 mol L-1

Dihidrogeno fosfato de potássio (KH2PO4)

Fenolfateína (solução 0,1% m/v)

Hidroxido de sódio (NaOH)

Metanol (MeOH)

Papel de filtro comum

Peróxido de hidrogênio PA (H2O2)

Resina de troca aniônica (Amberlite IRA 420)

Resina de troca catiônica (Amberlite IR 120)

4.3. Caracterização físico-química das amostras

As características físico-químicas determinadas nas amostras de água foram

acidez, cor, turbidez, carbono orgânico total, condutividade, sólidos totais, sólidos

Experimental

57

totais dissolvidos e demanda química de oxigênio (DQO) e demanda bioquímica de

oxigênio (DBO). Nas amostras de sedimento foram determinadas acidez, teor de

umidade, matéria orgânica, CTC, acidez trocável e carbono orgânico total. Também

foi realizada a caracterização granulométrica das mesmas.

Todos os resíduos gerados foram encaminhados ao Laboratório de Resíduos

Químicos do Campus São Carlos, para descarte adequado (ALBERGUINI et al.,

2003 e ALBERGUINI et al., 2005).

4.3.1. Determinação da acidez

4.3.1.1. Água

Para determinação da acidez em amostras aquosas, usa-se um pHmetro

(após verificação com o uso de padrões – tampões 4,0 e 7,0 respectivamente).

Transfere-se cerca de 20 mL da amostra em um béquer (50 mL), inseri-se o eletrodo

de pH devidamente calibrado e aguarda-se a estabilização da leitura.

4.3.1.2. Sedimento

Para determinação da acidez em amostras de sedimento, pesou-se 5,00g de

amostra (previamente seca em estufa a 40º por 24 horas) num béquer, que foi

transferida para um erlenmeyer de 125 mL. Logo após, adicionou-se 50 mL de CaCl2

0,01 mol L-1 seguido de agitação eventual. Após 30 minutos, determinou-se o pH da

suspensão, com o auxílio de um eletrodo de pH (após verificação com o uso de

padrões) (BRASIL, 2007).

Experimental

58

4.3.2. Condutividade elétrica

4.3.2.1. Água

A condutividade elétrica é medida pelo mesmo aparelho onde é medida

acidez; troca-se somente a função (pH para mV). Coloca-se cerca de 20 mL da

amostra em um béquer (50 mL) e em seguida, inserir o eletrodo e aguardar

estabilização da leitura.

4.3.2.2. Sedimento

Não foi realizada determinação de condutividade elétrica em sedimento.

4.3.3. Determinação da taxa de umidade e matéria orgânica (MO)

4.3.3.1. Água

Ver item 4.3.6.1.1.

4.3.3.2. Sedimento

Para determinar a taxa de umidade e o teor de matéria orgânica em amostras

de sedimento, foram pesados cerca de 5,00 g de amostra em cadinho de porcelana.

O sistema em seguida é levado à estufa por 12 horas à temperatura de 100-110ºC.

O teor de umidade é calculado pela Equação 9:

Experimental

59

Após medição da massa, o cadinho que continha a amostra (agora sem a

umidade) é levado à mufla por 4 horas à 500ºC para combustão da matéria

orgânica. Logo após, o cadinho é novamente pesado e através das diferenças de

massas, calcula-se o teor de matéria orgânica, de acordo com a Equação 10

(COTTA, 2008).

4.3.4. Determinação da capacidade de troca catiônica (CTC)

4.3.4.1 Água

A determinação da capacidade de troca catiônica é um ensaio para

solo/sedimento.

4.3.4.2. Sedimento

A capacidade de troca catiônica é dada pela soma dos cátions metálicos

totais trocáveis e da acidez trocável.

Equação 9

Equação 10

Experimental

60

4.3.4.2.1. Cátions metálicos totais trocáveis

A determinação dos cátions metálicos trocáveis envolve a pesagem de

aproximadamente 2,50 g de amostra seca em um béquer e transferência para um

erlenmeyer de 125 mL. Em seguida adiciona-se 25 mL de ácido acético 1 mol L-1. A

mistura é levada à agitação orbital constante por 1 hora. Após agitação, mede-se a

acidez da solução em suspensão e realizam-se os cálculos abaixo (Equação 11)

para calcular os cátions metálicos trocáveis da amostra (BRASIL, 2007):

Onde;

pH1 = pH da suspensão

pH2 = pH da solução de ácido acético

22 = constante logarítmica

4.3.4.2.2. Acidez trocável

A determinação da acidez trocável envolve a pesagem de aproximadamente

5,00 g de amostra seca (50ºC por 24 h) em um béquer e transferência para um

erlenmeyer de 125 mL. Em seguida, adiciona-se 50 mL de KCl 1 mol L-1, agita-se

manualmente por alguns instantes e deixa-se em repouso por 30 min. Filtrar em

papel de filtro com duas (2) porções de KCl 1 mol L-1. Adicionar ao filtrado seis (6)

gotas de fenolftaleína 0,1% m/v e titular com NaOH 0,01 mol L-1 (BRASIL, 2007).

A acidez trocável é determinada pela Equação 12:

Equação 11

Experimental

61

Onde;

V = volume (mL) de NaOH gastos na titulação

C = concentração (mol L-1) do NaOH

m = massa (g) da amostra

4.3.5. Determinação de carbono orgânico total

Para a determinação de carbono orgânico total, as amostras são introduzidas

no tubo de combustão e oxidadas cataliticamente a uma temperatura de 900ºC,

sendo os componentes do carbono total convertidos a CO2 e determinados por

infravermelho. A calibração do aparelho é feita usando-se padrão de carbono na

forma de biftalato de potássio, construindo-se uma curva analítica. O equipamento

utilizado foi o modelo TOC-VCPH, da Shimadzu, com detector de infravermelho

(COTTA, 2008).

4.3.5.1 Água

As amostras de água foram filtradas (50 mL) em lã de vidro e acondiconadas

em béquer. Em seguida, foram analisadas pelo equipamento de análise de Carbono

Orgânico Total, modelo TOC-VCPH.

Equação 12

Experimental

62

4.3.5.2 Sedimento

Para a determinação de carbono total em sedimento, foram pesados no tubo

de combustão 100 mg de amostra seca em estufa (50ºC, por 24 horas) e em

seguida foram analisadas pelo equipamento para análise de carbono modelo TOC-

VCPH, acoplado ao módulo de amostras sólidas, modelo SSM-5000A Shimadzu.

4.3.6. Sólidos totais e sólidos totais dissolvidos

4.3.6.1. Água

4.3.6.1.1. Sólidos Totais

Em uma capsula de porcelana de massa conhecida, adiciona-se 90 mL de

amostra de água e coloca-se na estufa a 100 – 110ºC até a secura. Em seguida,

resfria-se em dessecador e pesar novamente o béquer. Calcula-se o teor de sólidos

totais de acordo com a Equação 13:

Equação 13

Após medição da massa, o cadinho que continha a amostra (agora sem a

umidade) é levado à mufla por 4 horas à 500ºC para combustão da matéria

orgânica. Logo após, o cadinho é novamente pesado e através das diferenças de

massas, calcula-se o teor de matéria orgânica, de acordo com a Equação 10, do

item 4.3.3.2. (COTTA, 2008).

Experimental

63

4.3.6.1.2. Sólidos Totais Dissolvidos

Em um béquer de massa conhecida, adiciona-se 90 mL de amostra de água e

colocar na estufa a 180ºC até a secura. Em seguida, resfriar em dessecador e pesar

novamente o béquer. Calcular o teor de sólidos totais de acordo com a Equação 14.

Equação 14

4.3.6.2. Sedimento

O ensaio de sólidos totais é semelhante ao ensaio de determinação de

umidade em sedimento. Já o ensaio de sólidos totais dissolvidos não é realizado

devido a sua inviabilidade.

4.3.7. Determinação de Nitrogênio Kjedahl e Fósforo Total

4.3.7.1. Água

A análise da água foi realizada via espectrômetro Hach pelo Método 399

(Nitrogênio total Kjeldahl (NKT)) e pelo Método 480 (Fósforo).

Experimental

64

4.3.7.2. Sedimento

Em 1,0 g de amostra seca (a 60-65ºC) e macerada, adicionaram-se 20 mL de

H2SO4, a mistura foi levada ao bloco digestor, onde a temperatura foi, então, elevada

a 350°C por 4 horas. Após esse período, observar se a mistura se torna uma pasta

negra; se não, deixar mais 1 hora.

Em seguida foram adicionados lentamente 2 mL de H2O2 ou mais, até que se

obtivesse uma solução cinza claro.

Esperou-se a solução esfriar à temperatura ambiente e diluiu-se a mesma

para um volume de 100 mL. A determinação do nitrogênio e do fósforo foi realizada

via espectrômetro Hach pelo Método 399 (Nitrogênio total Kjeldahl (NKT)) e pelo

Método 480 (Fósforo) (COTTA, 2008).

Para determinação da quantidade de N presente na amostra utilizou-se a

Equação 15:

Equação 15

Onde:

A = mg L-1 (leitura do aparelho).

B = massa da amostra para digestão (g).

C = Volume da amostra digerida (mL).

Experimental

65

Na determinação do fósforo total foi utilizada a Equação 16:

Equação 16

Onde:

Abs = valor de absorbância (leitura do aparelho)

Vam = volume de amostra usado (25mL)

Vdil = Volume final de diluição (1mL)

Vdil inicial = Volume inicial de dluição (pós abertura – 100mL)

mam = massa amostra aberta (1g)

31 = massa atômica do fósforo (P)

95 = massa atômica molar do íon fosfato (PO43-)

4.3.8. Análise granulométrica do sedimento

A análise granulométrica do sedimento foi realizada para se caracterizar sua

composição. Foi realizada de acordo com a norma técnica da ABNT NBR 7181/1984

(ABNT, 1984).

Para análise do sedimento utilizou-se um jogo de peneiras de números: 3/8,

4, 10, 16, 30, 50, 100, 140 e 200, a qual foi agitada em mesa agitadora por 15

minutos.

Experimental

66

O ensaio foi realizado no Laboratório de Geotecnia da EESC-USP.

4.4. Validação da metodologia

4.4.1. Preparação das amostras padrão (real e fortificada)

Foram determinados os seguintes parâmetros para validação da metodologia

de análise para determinação de glifosato e AMPA: seletividade, linearidade, limites

de detecção/quantificação, robustez e exatidão.

Para tal, preparou-se solução estoque dos analitos (um mix dos analitos na

mesma solução) à concentração de 100 mg L-1 em água. Para os ensaios preparou-

se soluções de 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250 e 500 µg L-1.

A determinação de glifosato e AMPA foi realizada via CG-EM. Cerca de 1 mL

de amostra foi adicionado em ampolas de vidro, onde foram secas sob fluxo de

nitrogênio, e logo após, adicionou-se 800 µL de TFAA e 400 µL de TFE. Após

lacrarem-se as ampolas (em bico de Bunsen), estas foram à estufa por 1 hora, a

100ºC.

Após atingirem a temperatura ambiente, secou-se novamente as amostras

sob fluxo de nitrogênio e retomam-se as amostras com 1 mL de acetato de etila. A

Figura 19 mostra o fluxograma de preparação das amostras.

Experimental

67

Figura 19 – Fluxograma de derivatização de amostras

As determinações foram realizadas em um cromatógrafo a gás com detector

de massas modelo QP 2010 Plus, da Shimadzu com injetor automático, no modo

SIM. Os fragmentos monitorados para o AMPA foram m/z 246 e 302 e para o

glifosato foram m/z 246, 260 e 411. O equipamento tem coluna capilar HP 5 da

Hewlett-Packard, de 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm

de espessura de filme.

4.5. Preparo das amostras para análise em CG-EM

4.5.1. Água

Coluna de vidro de 1,5 cm de diâmetro e 10 cm de comprimento foi

empacotada com 6,0 mL de resina catiônica (Amberlite IR-120). 50,0 mL da amostra

foi acidificada a pH 2 e eluida nessa coluna, que foi previamente condicionada com

Experimental

68

20,0 mL de água deionizada, 40,0 mL de HCl (0,2 mol L-1) e 1,0 mL de HCl (6,0 mol

L-1). Todo o eluato foi descartado. Após esse procedimento, eluiu-se o retido na

resina com 1 x 2,8 mL e 2 x 3,7 mL de HCl (6,0 mol L-1) sob fluxo de 2 mL min-1. O

eluato foi coletado em frasco de vidro e adicionou-se 4,0 mL de HCl 10 mol L-1.

Em seguida, outra coluna com as mesmas características da anterior, foi

empacotada com 5,0 mL de resina aniônica (Amberlite IRA-420) previamente

condicionada com 3 x 2,5 mL de HCl (6,0 mol L-1) e 1,0 mL de HCl concentrado,

descartando-se todo o eluato. As substâncias retidas nessa coluna foram eluídas

com 1 x 1,0 mL e 2 x 2,0 mL de HCl 6,0 mol L-1.

Após isso a amostra foi armazenada em balão de fundo redondo e seca em

rotaevaporador Fisatom 802 D a 60ºC. Em seguida, adicionou-se 5,0 mL de água

deionizada e evaporou-se à secura novamente. Retomou-se o volume de cada

amostra com 1,0 mL de uma solução água:metanol:ácido clorídrico (160:40:2,7)

(v/v/v), onde foi transferido para ampola de vidro e procedeu-se a derivatização

conforme descrito no item 4.4.1. A Figura 20 apresenta um fluxograma explicativo do

preparo de amostras aquosas.

Experimental

69

Figura 20 – Fluxograma para preparo de amostras aquosas

4.5.2. Sedimento

As amostras de solo e sedimento que foram usadas para os testes de

determinação e recuperação de glifosato e AMPA foram levadas à estufa por 24

horas à 40ºC.

A determinação de glifosato e AMPA foram realizadas nas amostras de

solo/sedimento pesando-se 10 g da amostra. Em seguida foram adicionados 25 mL

de NaOH 1,0 mol L-1 e levadas em banho de ultrassom durante 30 minutos, com

controle de temperatura.

Experimental

70

Logo após, as amostras foram levadas à centrífuga Novatecnica NT 810 a

3000 rpm por 10 minutos.

O sobrenadante de cada amostra foi filtrado em papel de filtro, e ao filtrado,

adicionou-se 4,2 mL de HCl concentrado, ajustando-se o pH para 2 e em seguida,

avolumou-se para 200 mL. Aproximadamente 50 mL da amostra foi separado para a

etapa de purificação.

A etapa de purificação é praticamente a mesma realizada no item 4.5.1. com

apenas algumas mudanças.

Os 50 mL da amostra foram eluídos em coluna empacotada com resina de

troca catiônica (Amberlite IR-120 – a coluna possui as mesmas características que a

usada no item 4.5.1) previamente condicionada com 20,0 mL de água deionizada,

40,0 mL de HCl (0,2 mol L-1) e 1,0 mL de HCl (6,0 mol L-1). Todo o eluato foi

descartado. Após esse procedimento, eluiu-se o retido na resina com 1 x 2,8 mL e 2

x 3,7 mL de HCl (6,0 mol L-1) sob fluxo de 2 mL min-1. O eluato foi coletado em

frasco de vidro e adicionou-se 6,0 mL de NaOH 10 mol L-1 e o pH ajustado na faixa

de 6-8.

Em seguida, o eluato tratado na resina de troca catiônica foi eluído na resina

de troca aniônica (Amberlite IRA-420 – a coluna possui as mesmas características

que a usada no item 4.5.1) previamente condicionada com 3 x 2,5 mL de HCl (6,0

mol L-1) e 1,0 mL de HCl concentrado, descartando-se todo o eluato. As substâncias

retidas nessa coluna foram eluídas com 1 x 1,0 mL e 2 x 2,0 mL de HCl 6,0 mol L-1.

Após isso a amostra foi armazenada em balão de fundo redondo e seca em

rotaevaporador Fisatom 802 D a 60ºC. Em seguida, adicionou-se 5,0 mL de água

deionizada e evaporou-se à secura novamente. Retomou-se o volume de cada

amostra com 1 mL de uma solução água:metanol:ácido clorídrico (160:40:2,7)

Experimental

71

(v/v/v), onde transferiu-se para ampola de vidro e procedeu-se à derivatização

conforme descrito no item 4.4.1. A Figura 21 apresenta um fluxograma do processo

de extração de amostras sólidas.

Figura 21 – Fluxograma do processo de extração de amostras sólidas

4.5.3. Recuperação

Para a recuperação em amostras de água, dopou-se água isenta de

contaminante com três concentrações: baixa (30 µg L-1), média (90 µg L-1) e alta

(200 µg L-1). Procedeu-se a extração conforme o item 4.5.1.

Experimental

72

Para a recuperação em solo, foram usados dois tipos do mesmo: latossolo

vermelho e solo arenoso. Fortificou-se amostras de solo com três concentrações:

baixa (6 mg kg-1), média (12 mg kg-1) e alta (60 mg kg-1). Procedeu-se a extração

conforme o item 4.5.2.

Para ambos os casos, foi construída uma tabela de Concentração teórica e

Concentração esperada, onde foi determinada a recuperação, desvio padrão e

coeficiente de variação das recuperações.

4.5.4. Robustez

O ensaio de robustez foi realizado fazendo pequenas variações (conforme

mostrado da Tabela 28 no item 5.3.8) em cinco parâmetros distintos, a saber:

temperatura do forno, temperatura do injetor, temperatura da interface, temperatura

da fonte de íons e velocidade linear do gás de arraste.

Resultados e Discussões

73

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1. Caracterização das amostras de sedimento

Todas as determinações foram realizadas em triplicata, sendo o erro para um

intervalo de confiança de 95 % calculado pela Equação 17:

Equação 17

onde:

e = erro;

t = coeficiente de Student tabelado;

σ = desvio-padrão;

n = tamanho da amostra (3).

Nas Tabelas 9 e 10 são apresentados os resultados das determinações de

pH, matéria orgânica, umidade, CTC efetiva, carbono orgânico total, fósforo total,

nitrogênio Kjedahl, nitrogênio amoniacal e razão C/N.


74

Tabela 9 – Determinação de pH, teor de matéria orgânica, umidade e CTC em sedimento

Ponto de

amostragem

pH Matéria

orgânica (%)

Umidade (%) CTC Efetiva

(cmolc kg-1)

1 6,26 (0,08) 1,24 (0,04) 24,79 (0,66) 4,77 (0,35)

2 6,66 (0,07) 0,48 (0,02) 7,57 (0,74) 3,30 (0,22)

3 5,25 (0,09) 2,68 (0,09) 16,67 (0,34) 0,87 (0,05)

4 6,06 (0,05) 1,78 (0,08) 25,75 (0,95) 5,34 (0,31)

5 5,78 (0,09) 5,86 (0,13) 21,71 (0,49) 6,65 (0,26)

( ) erro a 95% de confiança.

Tabela 10 – Determinação de carbono orgânico, fósforo total, nitrogênio Kjedahl, nitrogênio amoniacal e razão C/N em sedimento

Ponto de

amostragem

Carbono total

(mg kg-1)

Fósforo

Total

(mg kg-1)

Nitrogênio

Kjedahl

(mg kg-1)

Nitrogênio

Amoniacal

(mg kg-1)

C/N

1 4750 (131) 75,1 (7,5) 450,7 (1,9) 70,7 (1,9) 12,30

(2,2)

2 1007 (35) 616,9 (35,8) 74,3 (1,0) 101,3 (3,9) 15,81

(1,5)

3 1972 (43) 604,7 (35,8) 73,3 (2,6) 106,0 (3,4) 31,39

(1,8)

4 10030 (77) 1427,7 (30,0) 1276,0 (4,5) 82,0 (3,4) 9,17

(1,1)

5 15650 (388) 1253,8 (35,8) 900,7 (3,5) 52,0 (3,4) 20,27

(1,6)


Uma representação gráfica global dos resultados é apresentada na Figura 22.


75

Figura 22 - Gráfico de dados de caracterização versus pontos de coleta (sedimento)

A Figura 23 apresenta as curvas analíticas usadas para as determinações de

carbono total em água e sedimento. Foram construídas usando um padrão de

biftalato de potássio seco em estufa por 24 horas.

Figura 23 – Curvas analíticas usadas para a determinação de carbono total em água (esquerda) e

sedimento (direita)

pH

Mat

éria o

rgân

ica

(%)

Um

idad

e (%

)

CTC

Efe

tiva

(cm

olc kg

-1)

Car

bono

org

ânico

tota

l (g

kg-1

)

Fósfo

ro (g

kg-

1)

N K

jeda

hl (g

kg-

1)

N A

mon

iaca

l (g

kg-1

)

Raz

ão C

/N)

0

5

10

15

20

25

30

Valo

r o

bti

do

Parâmetros avaliados

Ponto 1

Ponto 2

Ponto 3

Ponto 4

Ponto 5


76

O teor de matéria orgânica das amostras de sedimento foi baixo. O maior

valor foi no Ponto 5 (5,83%) e o menor no Ponto 2 (0,48%). Como é possível notar

na Tabela 11 e Figuras 20 a 24, o sedimento nos cinco pontos amostrados é muito

arenoso (mais de 80% de areia em todos os pontos). Para todas as amostras, os

valores de pH foram abaixo de 7, o que já era de se esperar, visto que o solo

brasileiro tem como uma de suas características o pH menor que 7.

Pelas Tabelas 9 e 10 nota-se que os sedimentos analisados possuem

quantidades diferentes de NKT e fósforo e o sedimento que possui maior quantidade

destes compostos é o Ponto 4.

O sedimento do Ponto 5 apresenta maior CTC, quando comparado com os

demais sedimentos, provavelmente isso se deva aos colóides da argila presente nos

sedimentos, uma vez que tal sedimento possui uma quantidade pequena de MO.

A Tabela 11 e as Figuras 24 a 28 mostram a caracterização granulométrica

por peneiramento realizada nas amostras dos cinco pontos.

Tabela 11 – Caracterização granulométrica das amostras de sedimento

Ponto de

amostragem

Pedregulho (%) Areia (%) Finos (Silte +

Argila) (%)

1 3,1 92,7 4,2

2 1,1 95,7 3,2

3 0,8 96,2 3,0

4 0,4 93,8 5,8

5 5,9 83,7 10,4


77

Figura 24 – Curva de Distribuição Granulométrica (Ponto 1)


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

PO

RC

EN

TAG

EM

QU

E P

ASSA

(%

)

DIÂMETRO DOS GRÃOS (mm)

CURVA DE DISTRIBUIÇÃO GRANULOMÉTRICA

NBR

ARGILA SILTEFINA MÉDIA GROSSA

PEDREGULHOAREIA

IDENTIFICAÇÃO : AREIA MÉDIA A FINA COM PRESENÇA DE PEDREGULHO FINO E MÉDIO

FINO GROSSOMÉDIO

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

PO

RC

EN

TAG

EM

QU

E P

ASSA

(%

)



NBR


PEDREGULHOAREIA

IDENTIFICAÇÃO : AREIA MÉDIA A FINA COM PRESENÇA DE PEDREGULHO FINO

FINO GROSSOMÉDIO


78



0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

PO

RC

EN

TAG

EM

QU

E P

ASSA

(%

)



NBR


PEDREGULHOAREIA


FINO GROSSOMÉDIO

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

PO

RC

EN

TAG

EM

QU

E P

ASSA

(%

)



NBR


PEDREGULHOAREIA


FINO GROSSOMÉDIO


79


Como é possível notar, as amostras de sedimento apresentaram uma grande

quantidade de areia; a fração prevaleceu nos cinco pontos com mais de 90%, com

exceção do Ponto 5. A porcentagem de argila e silte, denominada como finos, ficou

abaixo de 5%, com exceção dos Pontos 4 e 5.

Como há um alto teor de areia e baixo teor de argila, silte, umidade e matéria

orgânica, é de se esperar que os compostos de interesse (glifosato e AMPA)

estejam dissolvidos na água e adsorvidos no material em suspensão e não no

sedimento, uma vez que ele é pobre em sítios de ligação.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0,001 0,01 0,1 1 10 100

PO

RC

EN

TAG

EM

QU

E P

ASSA

(%

)



NBR


PEDREGULHOAREIA

IDENTIFICAÇÃO : AREIA FINA A MÉDIA COM PRESENÇA DE PEDREGULHO FINO

FINO GROSSOMÉDIO


80

5.2. Caracterização das amostras de água

Nas Tabelas 12 a 14 e Figura 29 são apresentados os resultados das

determinações de pH, temperatura, condutividade, carbono total, cor, turbidez, DQO,

DBO, sólidos totais, sólidos totais dissolvidos, fósforo total, nitrogênio Kjedahl e

nitrogênio amoniacal.

Os ensaios foram realizados em triplicata e o erro foi calculado de acordo

com o descrito no item 5.1.

Tabela 12 – Determinação de pH, temperatura, condutividade e carbono orgânico em água

Ponto de

amostragem

pH Temperatura

(ºC)

Condutividade

(uS mol-1)

Carbono total

(mg L-1)

1 7,15 (0,16) 17 24,7 (5,2) 58,30 (1,61)

2 6,46 (0,10) 16 13,7 (3,5) 11,43 (0,46)

3 6,46 (0,12) 14 11,3 (2,5) 10,70 (0,16)

4 7,43 (0,77) 15 54,7 (8,5) 35,80 (0,65)

5 7,41 (0,47) 13 19,7 (4,2) 3,88 (0,26)



81

Tabela 13 – Determinação de matéria orgânica, cor, turbidez, DQO, DBO, sólidos totais em água

Ponto de

amostragem

Matéria

Orgânica

(%)

Cora

(UH)

Turbidezb

(NTU)

DQOc

(mg O2

L-1)

DBOd

(mg O2

L-1)

Sólidos

Totais

(mg L-1)

1 70,52

(2,43)

164 35,5 128 36 254,19

(6,23)

2 16,87

(1,46)

51 5,34 32 12 23,74

(2,37)

3 15,25

(3,04)

56 6,70 12 2 57,52

(2,98)

4 59,54

(4,11)

102 18,2 23 7 199,0 (3,0)

5 4,72

(0,88)

36 3,40 6 1 87,46

(11,05)

a, b,c e d – análises realizadas junto ao Laboratório de Saneamento, EESC-USP

( ) erro a 95% de confiança

Tabela 14 – Determinação de Sólidos Totais Dissolvidos, nitrogênio Kjedahl, nitrogênio amoniacal e fósforo total em água

Ponto de

amostragem

Sólidos Totais

Dissolvidos

(mg L-1)

Nitrogênio

Kjedahl

(mg L-1)

Nitrogênio

Amoniacal

(mg L-1 )

Fósforo

(mg L-1)

1 123,81 (6,84) 13,0 (0,4) 7,30 (0,09) 0,05 (0,01)

2 23,57 (2,02) 1,00 (0,09) 1,50 (0,09) 0,08 (0,01)

3 21,67 (1,86) 3,00 (0,09) 1,46 (0,02) 0,06 (0,01)

4 135,11 (4,26) 7,00 (0,17) 5,60 (0,19) 0,15 (0,01)

5 21,75 (1,91) 2,00 (0,19) 0,27 (0,02) 0,18 (0,01)

( ) erro a 95% de confiança


82

Figura 29 – Gráfico de dados de caracterização versus parâmetros avaliados (água).

Os Pontos 2, 3 e 5 foram os que apresentaram menor teor de matéria

orgânica e condutividade. Sendo assim, a presença de pouca quantidade matéria

orgânica facilita a solubilidade dos compostos de interesse, visto que a solubilidade

em água de ambos é alta.

Portanto, é de grande importância a realização da caracterização dos

parâmetros físico-químicos das amostras, pois auxilia na elucidação da causa da

contaminação em maior grau de um rio em detrimento dos demais, uma vez que os

rios são geograficamente próximos uns dos outros.

pH

tem

pera

tura

Con

dutiv

idad

e (u

S m

ol-1

)

Car

bono

Tot

al (m

g L-

1)

Cor

(uH)

Turbide

z (N

TU)

DQO (m

g O2

L-1)

DBO (m

g O2

L-1)

Sólidos

Tot

ais (m

g L-

1)

Sólidos

Tot

ais Disso

lvidos

(mg

L-1)

N K

jeda

hl (m

g L-

1)

N A

mon

iaca

l (m

g L-

1)

Fósfo

ro (m

g L-

1)

0

50

100

150

200

250

Va

lor

ob

tid

o

Parâmetros avaliados

Ponto 1

Ponto 2

Ponto 3

Ponto 4

Ponto 5


83

A Figura 30 mostra os parâmetros analisados para cada ponto amostrado de

acordo com os valores máximos permitidos pela CONAMA 357. A Figura mostra

para cada parâmetro, a comparação com a Classe II e III do referido documento.


84

Ponto 1 Ponto 2 Ponto 3 Ponto 4 Ponto 5

6

7

8

9

10

Faixa Classe 2 e 3 (6-9)

Valo

r

Pontos amostrados

pH


0

2

4

6

8

10

12

14

Limite Classe 2 e 3 (2,18 mg L-1

)

Co

ncen

tração

(m

g L

-1)

Pontos amostrados

Nitrogênio Kjedahl


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Limite Classe 3 (13,3 mg L-1

)


)Co

ncen

tração

(m

g L

-1)

Pontos amostrados

Nitrogênio Amoniacal


0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Pontos amostrados


)


)

Co

ncen

tração

(m

g L

-1)

Fósforo


0

5

10

15

20

25

30

35

Pontos amostragem

Limite Classe 3 (10 mg O2 L

-1)

Limite Classe 2 (5 mg O2 L

-1)

Co

ncen

tração

(m

g O

2 L

-1)

DBO


0

20

40

60

80

100

120

140

160

Pontos amostrados

Limite Classe 2 e 3 (75 uH)

uH

Cor

Figura 30 - Comparação com valores da CONAMA 357


0

20

40

60

80

100

120

140

Limite Classe 2 e 3 (100 mg L-1

)

NT

U

Pontos amostrados

Turbidez


0

100

200

300

400

500

600

Limite Classe 2 e 3 (500 mg L-1

)

Co

ncen

tração

(m

g L

-1)

Pontos amostrados

Sólidos Totais Dissolvidos


85

Como é possível observar através dos gráficos, as amostras coletadas nos

cinco pontos amostrais da cidade de São Carlos apresentam uma alta concentração

de fósforo, maior que o limite estabelecido pela CONAMA 357 para águas de Classe

III, o que indica a presença de fertilizantes do tipo NPK ou esgoto doméstico.

O Ponto 1, que é o mais próximo à ETE Monjolinho apresenta alto teor de

nitrogênio Kjedahl e cor. Este ponto recebe toda a carga de esgoto doméstico sem

tratamento da mancha urbana de São Carlos, conforme pode ser visto na Figura 15

no item 4.1. (o tratamento de esgoto no município é recente). Outro fator que indica

a presença de esgoto doméstico é o alto valor de DBO neste ponto, o que mostra a

necessidade de uma alta quantidade de oxigênio para os microrganismos

consumirem a matéria orgânica presente neste ponto. Por sua vez, o Ponto 5, que

fica dentro da Fazenda Santa Maria, que é conhecida pelo turismo ecológico,

apresenta todos os parâmetros analisados dentro da Classe II.

5.3. Validação da Análise Química do Glifosato e AMPA

A Tabela 15 apresenta as condições cromatográficas otimizadas para a

análise do Glifosato e do AMPA via CG-EM.


86

Tabela 15 – Condições cromatográficas para determinação do Glifosato e do AMPA.

Parâmetros de injeção

Lavagem solvente 3 vezes

Descarte amostra 3 vezes

Volume de injeção 1 µL

Parâmetros do injetor

Modo Splitless

Temperatura 280ºC

Parâmetros da coluna

Coluna Capilar HP 5 – 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm

Fluxo total 15,1 mL min-1

Fluxo coluna 2,02 mL min-1

Velocidade linear 57,3 cm s-1

Pressão total 157,7 kPa

Gás de corrida Hélio

Parâmetros do Forno

Temperatura inicial 80ºC

Rampas

Taxa (ºC min-1

) Temperatura final (ºC) Tempo final (min)

80 2,00

28,80 270

Tempo total 8,60 minutos

Parâmetros do detector

Modo SIM

Tempo de corte do solvente 3,00 minutos

Temperatura fonte de íons 200ºC

Temperatura da interface 260ºC


87

Como mencionado no item 4.4.1, foram preparadas nove soluções mix de

glifosato e AMPA em água nas concentrações de 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250 e 500

µg L-1.

Os cromatogramas das diferentes soluções padrão encontram-se nas Figuras

31 a 33. O tempo de retenção para o AMPA foi de 4,3 minutos e para o glifosato foi

de 5,3 minutos.


88

4 5 6 7 8 9

0

500000

1000000

1500000

2000000

Áre

a (

u2)

Tempo de retenção (min)

m/z

246

302

238

260

411

4 5 6 7 8 9

0

200000

400000

600000

800000

1000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

4 5 6 7 8 9

0

200000

400000

600000

800000

1000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

4 5 6 7 8 9

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

Figura 31 – Cromatograma das soluções padrão de diferentes concentrações (1 a 75 ug L-1

) de Glifsosato e AMPA para a construção da curva analítica

5,3

09

4,2

94

4 5 6 7 8 9

0

50000

100000

150000

200000

250000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

4 5 6 7 8 9

0

200000

400000

600000

800000

1000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

1 ug L-1

5 ug L-1

10 ug L-1

25 ug L-1

50 ug L-1

75 ug L-1

AM

PA

AM

PA

AM

PA

AM

PA

AM

PA

AM

PA

Glif

osato

Glif

osato

G

lifosato

Glif

osato

Glif

osato

Glif

osato


89

4 5 6 7 8 9

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000Á

rea

(u

2)


m/z

246

302

238

260

411

4 5 6 7 8 9

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

Figura 32 – Cromatograma das soluções padrão de diferentes concentrações (100 a 500 ug L-1

) de Glifosato e AMPA para a construção da curva analítica

4,2

91

4 5 6 7 8 9

-500000

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

4,2

91

100 ug L-1

250 ug L-1

500 ug L-1

AM

PA

AM

PA

AM

PA

Glif

osato

Glif

osato

Glif

osato


90

4 5

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000Á

rea

(u

2)


Concentrações

500 ug L-1

250 ug L-1

100 ug L-1

75 ug L-1

50 ug L-1

25 ug L-1

10 ug L-1

5 ug L-1

1 ug L-1

Figura 33 – Sopreposição dos cromatogramas das diferentes concentrações da solução padrão de Glifosato e AMPA

5.3.1. Linearidade

O método apresentou-se linear com coeficientes de correlação (R) e

determinação (R2) significativos dentro da faixa de concentração proposta. A Figura

31 mostra a curva analítica obtida a partir desses resultados.

Como discutido no item 3.5, o coeficiente de correlação (R) indica a

probabilidade de existir uma relação linear entre x e y, quanto mais próximo da

unidade. Já o coeficiente de determinação (R2) indica que, quanto mais próximo da

unidade ele estiver, melhor terá sido o ajuste do método às respostas observadas

(BARROS NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2002).

Glif

osato

AM

PA


91

0 100 200 300 400 500

-2000000

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

12000000

14000000

16000000

Áre

a (

u2)

Concentração (ug L-1)

Curva AMPA

Curva GLIFOSATO

Figura 34 – Curvas Analíticas obtidas para o AMPA e o Glifosato.

Para o AMPA, a equação da reta foi y = - 334480,19776 + 26262,44875 x. R e

R2 calculados para esta curva foram 0,99505 e 0,9901 respectivamente.

Já para o Glifosato, a equação da reta foi y = - 78128,86851 + 23743,33998 x.

R e R2 calculados para esta curva foram 0,99627 e 0,9925 respectivamente.

5.3.2. Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) relativos ao método foram

calculados de acordo com Ribani et al, (2004). Para o AMPA, os resultados obtidos

para tais parâmetros foram, respectivamente 0,15 µg L-1 e 0,45 µg L-1. Isso indica

que o método está adequado para detectar e quantificar o ácido aminometil

fosfônico.

Para o glifosato, os limites de detecção e quantificação obtidos foram de 0,67

µg L-1 e 2,02 µg L-1 respectivamente.


92

Souza et al (2006) trabalharam com uma curva de trabalho de 30 e 300 µg L-1

e conseguiram limites de detecção e quantificação de 10 e 30 ug L-1

respectivamente, tanto para AMPA como para glifosato. O R2 obtido foi de 0,9991

para o AMPA e 0,9974 para o glifosato. Já Börjesson e Torstensson (2000)

trabalharam com uma curva de trabalho entre 0,1 e 2,5 µg L-1 e obtiveram limites de

detecção e quantificação de 0,05 e 0,1 µg L-1 respectivamente, tanto para AMPA

como para glifosato. O R2 obtido foi de 0,9751 para o AMPA e 0,9483 para o

glifosato.

No presente trabalho, o intervalo da curva de trabalho foi de 1,0 a 500 µg L-1 e

conforme apresentado nos itens 5.3.1 e 5.3.2, é possível observar que apesar de um

baixo limite de detecção e quantificação obtido por Börjesson e Torstensson (2000),

o R2, que indica a possibilidade de um modelo matemático ser ajustado ao método

fica comprometido, o que não é viável quando se fala em validação. Portanto, vale

ressaltar que o presente trabalho usa uma ampla faixa de concentração, porém, sem

comprometer a qualidade do coeficiente de determinação R2.

5.3.3. Branco

Não foi identificado nenhum pico cromatográfico que pudesse coeluir com a

substância de interesse, conforme mostrado nas Figuras 35 e 36.


93

4 5 6 7 8 9

0

100000

200000

300000

400000

500000

Áre

a (

u2)

Tempo de retenção

m/z

246

302

238

260

411

Figura 35 – Cromatograma branco para água.

4 5 6 7 8 9

-1000000

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

Figura 36 – Cromatograma branco para solo arenoso


94

5.3.4. Seletividade

O método apresentou boa seletividade, conforme mostrado nas Figuras 37 e

38, onde são comparados cromatogramas de amostras sem contaminação e com

fortificação de AMPA e glifosato a 500 µg L-1.

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

Áre

a (

u2)

Tempo de retenção

Amostra dopada (500 ug L-1)

Amostra Branco

Figura 37 – Sobreposição dos cromatogramas de uma amostra de água isenta de contaminação e de

outra dopada com 500 µg L-1

de AMPA e glifosato.

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

Áre

a (

u2)


Amostra dopada (500 ug L-1)

Amostra Branco

Figura 38 – Sobreposição dos cromatogramas de uma amostra de solo isenta de contaminação e de

outra dopada com 500 µg L-1

de AMPA de glifosato.

AM

PA

Glif

osato

AM

PA

Glif

osato


95

Como é possível observar, não existem picos cromatográficos que eluem no

mesmo tempo de retenção do AMPA (4,3 minutos) e do glifosato (5,3 minutos).

5.3.5. Sensibilidade

De acordo com o descrito no item 3.3., a sensibilidade do método é definido

pelo coeficiente angular da curva analítica (ou tangente da reta). Sendo assim a

sensibilidade para o AMPA é de 26262 e para o glifosato é de 23743.

5.3.6. Recuperação

Nas Tabelas 16 a 21, a seguir, são apresentados os valores de recuperação

obtidos para glifosato e AMPA em água e solo (arenoso e latossolo vermelho).

Tabela 16 – Recuperação do AMPA em água

Concentração

teórica

(µg L-1)

Concentração

obtida

(µg L-1)

Recuperação

(%)

Média

(%)

sa CV%b

30

32 111

115

14,9

14,1 28 88,4

37 116

90

91 101

106

8,6

8,1 103 116

92 102

200

179 88,8

96,2

6,8

7,1 196 97,9

204 102

a desvio padrão das médias de recuperação;

b coeficiente de variação das médias das recuperações.


96

Tabela 17 – Recuperação do glifosato em água

Concentração

teórica

(µg L-1)

Concentração

obtida

(µg L-1)

Recuperação

(%)

Média

(%)

sa CV%b

30

25 81,3

102

18,9

18,5 32 107

35 118

90

97 108

105

6,8

6,4 99 110

88 97,7

200

179 89,6

102

7,9

7,7 220 110

189 94,4



Tabela 18 – Recuperação do AMPA em solo arenoso

Concentração

teórica

(mg kg-1)

Concentração

obtida

(mg kg-1)

Recuperação

(%)

Média

(%)

sa CV%b

6,0

7,2 121

114

23,3

20,2 5,6 88,4

8,4 133

12,0

10,7 87,1

92,4

17,4

18,9 13,2 112

9,7 78,0

60,0

57,9 96,3

106

20,6

19,5 76,5 129,4

55,2 91,5




97

Tabela 19 – Recuperação do glifosato em solo arenoso

Concentração

teórica

(mg kg-1)

Concentração

obtida

(mg kg-1)

Recuperação

(%)

Média

(%)

sa CV%b

6,0

6,5 103

89,8

17,5

19,5 5,8 96,3

4,4 70,0

12,0

14,0 117

113

16,0

14,1 11,5 95,4

15,1 126

60,0

69,3 115

115

9,2

8,0 74,1 124

63,3 106



Tabela 20 – Recuperação do AMPA em latossolo vermelho

Concentração

teórica

(mg kg-1)

Concentração

obtida

(mg kg-1)

Recuperação

(%)

Média

(%)

sa CV%b

6,0

5,0 71,0

82,8

15,6

18,9 6,7 100

5,2 76,8

12,0

10,9 89,6

98,7

5,2

5,9 11,3 93,5

13,9 113

60,0

45,3 73,8

82,1

10,6

13,0 47,1 77,0

56,4 95,6




98

Tabela 21 – Recuperação do Glifosato em latossolo vermelho

Concentração

teórica

(mg kg-1)

Concentração

obtida

(mg kg-1)

Recuperação

(%)

Média

(%)

sa CV%b

6,0

3,4 56,8

70,1

16,4

23,4 3,8 65,1

5,4 88,8

12,0

10,4 86,2

85,0

5,3

6,2 10,8 89,6

9,6 79,2

60,0

49,8 82,7

83,9

5,4

6,5 54,0 89,8

47,7 79,2



Os resultados obtidos para recuperação foram considerados aceitáveis, visto

que apresentaram valores de recuperação entre 82,8 e 115%. A ANVISA recomenda

valores de recuperação entre 70-120% (BRASIL, 2003).

Trabalhos de Börjesson e Torstensson (2000), Souza et al (2006) e Abreu,

Matta e Montagner (2008) obtiveram recuperações de 75-103 para AMPA/glifosato

em água e solo, 85-102% para AMPA/glifosato em solo e 80,5-92% para glifosato

em grãos de soja respectivamente. Portanto, os resultados obtidos para a

recuperação do método estão dentro dos já publicados até o momento.

5.3.7. Exatidão

Para o cálculo da exatidão pode-se aplicar o teste de significância, usando o

Teste t de Student. Foi utilizado o teste hipótese, estabelecendo-se como hipótese


99

nula (H0): u = 100% e como hipótese alternativa (H1): u ≠ 100%. O valor de t

experimental foi calculado pela da Equação 18:

Equação 18

Onde:

X rec = média das recuperações do método;

µ = valor esperado (100%);

n = tamanho da amostra (3);

S rec = desvio padrão das médias de recuperação de cada nível de fortificação.

Tabela 22 – Teste hipótese para AMPA em água

Nível

Fortificação

(µg L-1)

Recuperação

(%)

X rec (%) S reca │t exp│b

30 111

104

7,53

1,012 90 106

200 96,2


b t de Student experimental.

Tabela 23 – Teste hipótese para Glifosato em água

Nível

Fortificação

(µg L-1)

Recuperação

(%)


30 102

102

3,51

0,822 90 105

200 98,0




100

Tabela 24 – Teste hipótese para AMPA em solo arenoso

Nível

Fortificação

(µg L-1)

Recuperação

(%)


30 114

104

10,9

0,655 90 92,4

200 106



Tabela 25 – Teste hipótese para Glifosato em solo arenoso

Nível

Fortificação

(µg L-1)

Recuperação

(%)


30 89,8

106

14,0

2,238 90 113

200 115



Tabela 26 – Teste hipótese para AMPA em latossolo vermelho

Nível

Fortificação

(µg L-1)

Recuperação

(%)


30 84,6

88,5

8,95

2,232 90 98,7

200 82,1




101

Tabela 27 – Teste hipótese para Glifosato em latossolo vermelho

Nível

Fortificação

(µg L-1)

Recuperação

(%)


30 70,1

79,6

8,30

4,241 90 85

200 83,9



O valor de t tab para t = 95% é de 4,303 (n-1 = 2). Os resultados obtidos de

acordo com o teste da hipótese nula variam de 0,655 a 4,241, o que mostra que t

exp ≤ t tab, ou seja aceita-se a hipótese nula, isto é, não se pode afirmar que há

diferenças entre o valor esperado e o encontrado, com 95% de confiança,

mostrando que o método proposto é exato. Resultados na literatura para o teste

hipótese podem ser encontrados no trabalho de Abreu, Matta e Montagner, 2008.

5.3.8. Robustez

A determinação da robustez foi realizada através do Teste de Youden. Neste

estudo preliminar foram avaliados cinco (5) fatores que afetam a robustez do método

em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas: temperatura do

forno, temperatura do injetor, temperatura da interface, temperatura da fonte de íons

e a velocidade linear do gás de arraste, conforme mostrado nas Tabelas 28 a 30 e

Figura 39.


102

Tabela 28 – Condições cromatográficas a serem variadas no teste de robustez

Fator Nominal Variável

Temperatura Forno 80 (A) 70 (a)

Temperatura Injetor 280 (B) 290 (b)

Temperatura Interface 260 (C) 270 (c)

Temperatura Fonte de

Íons

200 (D) 190 (d)

Velocidade Linear 57,3 (E) 60,0 (e)

Tabela 29 – Variação da área e do tempo de retenção de acordo com os ensaios realizados para a avaliação da robustez

Condição Área Tempo de retenção

AMPA Glifosato AMPA Glifosato

1 11532574 11171155 4,239 5,292

2 11179247 10956508 4,166 5,225

3 11133046 10922771 4,252 5,294

4 11013716 10690297 4,174 5,225

5 10858590 10628049 4,401 5,417

6 11011580 10659141 4,473 5,484

7 11028902 10560134 4,410 5,420

8 11062946 10816059 4,482 5,486


103

Tabela 30 – Concentração obtida para Glifosato e AMPA de acordo com as modificações realizadas no teste de robustez

Conjunto de

modificações

Concentração (ug L-1)

AMPA Glifosato

Sem modificações 479 488

Temp. Interface,

velocidade linear, 465 479

Temperatura injetor, fte de

ions 463 477

Temp injetor, interface, fte

de ions, velocidade linear 458 467

Forno, fonte de ions,

velocidade linear, 452 464

Forno, injetor, velocidade

linear 458 466

Forno, injetor, interface 459 461


104

Figura 39 – Influência de cada fator modificado no teste de robustez para análise de glifosato e AMPA.

De acordo com o observado nas Tabelas 28 a 30 e na Figura 39, nota-se que

a temperatura do forno é o parâmetro que mais influencia no resultado da análise,

visto que, em temperaturas menores (no caso 10ºC a menos), os analitos

derivatizados podem condensar na coluna e retardar seu tempo de retenção, pois

tem uma velocidade menor de eluição.

A velocidade linear do gás de arraste e a temperatura da fonte de íons

também apresentaram influência considerável no resultado das análises, pois o

primeiro fator está diretamente relacionado ao tempo em que o composto eluirá na

coluna e o segundo fator está intrinsecamente ligado ao fato que a fonte de íons cria

partículas carregadas para o bombardeamento das moléculas, a fim de se obter os

fragmentos moleculares a serem analisados pelo detector. Tendo uma temperatura

menor (no caso, 10ºC a menos), a quantidade de íons gerados pode comprometer o

resultado da análise.

T. Forno T. Injetor T. Interface T. Fte Íons V. Linear

0

2

4

6

8

10

12

Valo

r nu

méri

co

Fatores modificados

Glifosato

T. Forno T. Injetor T. Interface T. Fte Íons V. Linear

0

2

4

6

8

Va

lor

nu

mé

rico

Fatores modificados

AMPA


105

De acordo com a Tabela 30, o pior resultado obtido foi quando se variou

simultaneamente os três fatores acima mencionados (temperatura do forno, da fonte

de íons e a velocidade linear do gás).

A temperatura do injetor se mostrou o fator que menos influencia na análise,

mas vale ressaltar que neste parâmetro em si, a variação foi positiva, logo, o efeito

foi pouco pronunciado. Caso essa variação fosse negativa, um injetor resfriado

poderia comprometer o resultado da análise, devido a possível condensação dos

compostos de interesse.

5.3.9. Amostras reais

Conforme descrito nos itens 5.1 e 5.2 espera-se encontrar glifosato e AMPA

nas amostras de água, mais especificamente nos Pontos 2, 3 e 5. De acordo com as

análises realizadas, confirmou-se a presença de AMPA em dois pontos amostrados:

os Pontos 2 e 3.

O cálculo realizado para a quantificação do AMPA nessas amostras está

ilustrado na Equação 19.

Equação 19


106

onde:

x – concentração encontrada (µg L-1)

y – área encontrada no cromatograma

% Rec – porcentagem de recuperação do método

V diluição – 51mL (na etapa de clean up, foram eluídos 50mL de amostra e no final,

1mL foi analisado via CG-EM).

As Figuras 40 a 42 apresentam os cromatogramas obtidos nas análises de

água dos Pontos 2 e 3 e um cromatograma do sedimento do Ponto 3.

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

-500000

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

Figura 40 – Cromatograma Ponto 02 (água) com 4,19 µg L

-1 de AMPA.

AM

PA


107

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5

0

2000000

4000000

6000000

8000000

10000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

Figura 41 – Cromatograma Ponto 03 (água) com 6,22 µg L

-1 de AMPA.

4 5 6 7 8 9

0

500000

1000000

1500000

2000000

Áre

a (

u2)


m/z

246

302

238

260

411

Figura 42 – Cromatograma Ponto 03 (sedimento).

Como o AMPA e o glifosato apresentam alta solubilidade em água (105 mg L-1

a 20ºC e 10,1 g L-1 a 20ºC respectivamente), é de se esperar que a maior parte

destes compostos esteja presente na água. O glifosato apresenta um tempo de meia

vida muito menor que o do AMPA (chegando a até 3 dias, contra 199 dias, no

AM

PA


108

mínimo, do AMPA), sendo assim, a possibilidade de se encontrar AMPA em

amostras ambientais é muito maior que a de se encontrar glifosato.

Para sedimento, para se ter uma maior certeza sobre a contaminação por

glifosato e AMPA, é necessário realizar testes de adsorção, pois é possível que

parte dos analitos estejam adsorvidos na matéria orgânica, argila e silte das

amostras.

Nas amostras dos cinco pontos coletados, determinou-se AMPA nas

amostras de água dos pontos 2 e 3. Não se detectou AMPA e tampouco glifosato

nos demais pontos. Pelos resultados obtidos, pode-se afirmar que o método

proposto é adequado e atende à legislação, no caso do glifosato. No entanto, para o

AMPA não há valor máximo permitido estabelecido por nenhuma agência

reguladora.

Conclusões e Continuidade

109

6. CONCLUSÕES E CONTINUIDADE

O método proposto para a determinação de glifosato e o ácido

aminometilfosfônico (AMPA) apresenta boa linearidade, seletividade, exatidão e

robustez de acordo com os critérios de validação da ANVISA e do INMETRO.

O estudo no curso do rio Monjolinho mostrou que o mesmo apresenta resíduo

de AMPA (chegando a 4,19 µg L-1), mas como o mesmo não é contemplado por

nenhuma legislação brasileira, não existe a possibilidade de afirmar se o mesmo

apresenta algum potencial tóxico. Sendo assim, há necessidade de que o AMPA

seja contemplado em alguma legislação, visto que atualmente, tanto na CONAMA

357 como na MS 518, somente o glifosato é contemplado.

Outro ponto importante que foi constatado foi que, no Ribeirão Água Quente

(Ponto 1), há grande quantidade de esgoto doméstico despejado in natura. Com o

funcionamento da ETE Monjolinho, essa quantidade de esgoto tenderá a diminuir e

não só este rio, mas toda a bacia do Monjolinho terá a qualidade de suas águas

melhorada, devido à capacidade de autodepuração dos corpos d’água.

Para trabalhos futuros, há necessidade de realizar estudos de adsorção e

dessorção de glifosato e AMPA, melhorar o teste para robustez, a fim de acrescentar

outros fatores que podem contribuir para o rendimento da análise (coluna

cromatográfica, tempo de extração e tipo de solvente, no caso de amostras de

solo/sedimento), bem como realizar um estudo comparativo de outras metodologias

para determinação do herbicida e seu metabólito principal, a fim conhecer o custo

benefício dos métodos, bem como sua rapidez e sensibilidade.

110

REFERÊNCIAS

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