ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN PHƯỚC MINH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINHERYTHROMYCIN TRONG TÔM, CÁ BẰNG KỸ

THUẬT SÓNG VUÔNG QUÉT NHANH TRÊN CỰCGIỌT CHẬM VÀ KHẢ NĂNG ĐÀO THẢI

Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ UốngMã số chuyên ngành: 62.54.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Tp. Hồ Chí Minh năm 2012

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa -ĐHQG-HCM

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Trần Bích LamNgười hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Trọng Giao

Phản biện độc lập 1:……………………………………………………Phản biện độc lập 2:……………………………………………………

Phản biện 1:…………………………………………………………….Phản biện 2:…………………………………………………………….Phản biện 3:…………………………………………………………….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại:…………………………………………………………….....................……………………………………………………………….................

vào lúc giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:- Thư viện Khoa học tổng hợp Tp. HCM- Thư viện Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG-HCM

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyen Phuoc Minh et al., “Simultaneous determination oferythromycin A in giant prawn and tilapia in Mekong region bystripping square wave voltammetry,” European Journal of FoodResearch and Review, vol. 1, no. 1, pp. 01-14, 2011.

2. Nguyen Phuoc Minh et al., “Accumulation and clearance of orallyadministered erythromycin in adult Nile tilapia (Oreochromisniloticus),” International Food Research Journal, vol. 18, no. 1,pp. 95-100, 2011.

3. Nguyen Phuoc Minh et al., “Tissue distribution and elimination oferythromycin in giant freshwater prawn (Macrobrachiumrosenbergii) depletion,” African Journal of Food Science, vol. 4,no. 9, pp. 578-584, 2010.

4. Nguyễn Phước Minh và cộng sự. “Quá trình tích tụ và đào thảikháng sinh erythromycin trên cá rô phi (Oreochromis niloticus),”Kỷ Yếu Hội Nghị Khoa Học: Phát Triển Nông Nghiệp Bền VữngThích Ứng Với Sự Biến Đổi Khí Hậu, Cần Thơ, 2010, trang 430-437.

5. Nguyễn Phước Minh và cộng sự. “Chuyển hóa sinh học và đàothải kháng sinh erythromycin trong tế bào tôm càng xanh trưởngthành (Macrobrachium rosenbergii),” Kỷ Yếu Hội Nghị Khoa Học:Phát Triển Nông Nghiệp Bền Vững Thích Ứng Với Sự Biến ĐổiKhí Hậu, Cần Thơ, 2010, trang 472-479.

1

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Một trong những vấn đề bức xúc về vệ sinh an toàn thực phẩm ởnước ta hiện nay là dư lượng kháng sinh trong vật nuôi, dư lượng khángsinh trong thực phẩm vượt quá mức cho phép ảnh hưởng tới sức khỏe củangười tiêu dùng và uy tín hàng xuất khẩu của chúng ta. Do tính chất khángkhuẩn mạnh của erythromycin từ lâu nó đã được dùng để phòng và trị bệnhtrên tôm cá. Do nông dân trong quá trình nuôi tôm càng xanh và cá rô phicó sử dụng erythromycin và không tuân thủ thời gian ngưng thuốc trướcthu hoạch nên để lại sản phẩm có dư lượng vượt mức cho phép.

Theo quy định của Codex, WHO/FAO, EU, Mỹ, Canada, Australia,v.v thì dư lượng erythromycin trong sản phẩm thủy sản nhìn chung phảinhỏ hơn 30 ppb. Theo thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 15/03/2009 củaBộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Việt Nam, erythromycin thuộcnhóm kháng sinh hạn chế sử dụng, với mức dư lượng tối đa cho phép là200 ppb. Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định dư lượng kháng sinhnày trong các sản phẩm thủy sản như ELISA, LC-MS/MS. Mục tiêu và nộidung thứ nhất đặt ra là phải tìm được phương pháp phân tích dư lượngkháng sinh trong sản phẩm thủy sản với chi phí thấp, nhanh, độ tin cậy vàtính chính xác cao, có khả năng tái khẳng định erythromycin.

Xét thấy chưa có bất kỳ nghiên cứu nào được công bố về quá trìnhđào thải, chuyển hóa, thời gian ngưng kháng sinh erythromycin trước thuhoạch trên đối tượng tôm càng xanh, cá rô phi. Vậy nên trong đề tài này emsẽ tiến hành nghiên cứu thời gian đào thải, chuyển hóa của erythromycintrong cơ thịt tôm càng xanh và cá rô phi nhằm rút ra quy luật và ước lượngđược thời gian ngưng thuốc trước thu hoạch an toàn.

Từ hai yêu cầu trên, em đã chọn đề tài “Nghiên cứu định lượngkháng sinh Erythromycin trong tôm, cá bằng kỹ thuật sóng vuông quétnhanh trên cực giọt chậm và khả năng đào thải”.

2

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨUMột là, trên thiết bị ANALYZER SQF 505 do Việt Nam sản xuất

xây dựng được phương pháp phân tích erythromycin bằng kỹ thuật sóngvuông quét nhanh trên cực giọt chậm đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩmquốc tế đồng thời đạt yêu cầu phân tích nhanh, đơn giản và giảm chi phíphân tích.

Hai là, nghiên cứu đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơthịt thủy sản (tôm càng xanh, cá rô phi), từ đó xác định được quy luật vềthời gian thu hoạch an toàn khi sử dụng erythromycin.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN Ý nghĩa khoa học:

1. Lần đầu tiên ở Việt nam và trên thế giới tiến hành nghiên cứu sử dụngkỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để phân tích địnhtính và định lượng kháng sinh eythromycin trong mẫu thủy sản.

2. Sự xuất hiện của sóng khử vùng thế khoảng -1,4 V là do sự khử củanhóm C = O thứ hai trong phân tử erythromycin liên kết với nhóm áiđiện tử chứa nguyên tử oxi bên cạnh. Quá trình khử là không hoàn toànthuận nghịch với sự trao đổi hai điện tử.

3. Phát hiện trong điều kiện thích hợp có sự hấp phụ của erythromycintrên bề mặt giọt thủy ngân. Có thể dùng hiệu ứng này để tiến hànhphân tích erythromycin ở các nồng độ rất thấp bằng kỹ thuật strippinghấp phụ trên cực giọt chậm hay cực ngồi, cực treo.

4. Đã nghiên cứu và chọn được dung dịch nền thích hợp, các thông sốchạy máy tối ưu, quy trình chuẩn bị mẫu đo hợp lý để phân tícherythromycin trong các mẫu tôm càng xanh, cá rô phi có kết quả tincậy. Các số liệu đã được so sánh với kỹ thuật phân tích truyền thốngLC-MS là có sự tương đồng.

3

5. Chứng minh rằng các dẫn xuất erythromycin không chỉ được chuyểnhoá bởi Sacchropolyspora erythrea bằng con đường lên men mà cònchứng minh được erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá còn có sựchuyển hoá sinh học sang các dẫn xuất erythromycin C, E, F.

Ý nghĩa thực tiễn:1. Đã nghiên cứu xây dựng thành công quy trình phân tích định tính và

định lượng erythromycin trong tôm càng xanh và cá rô phi bằng kỹthuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm với máy ANALYZERSQF-505 do Việt Nam sản xuất với chi phí phân tích rẻ hơn, thao tácdễ dàng hơn các kỹ thuật khác của nước ngoài. Các số liệu đã đượckiểm chứng với các kết quả phân tích bằng các phương pháp hiện đạikhác.

2. Kết quả này có thể giúp các nhà sản xuất kinh doanh ở các địa phươngcó phương tiện để kiểm soát kháng sinh từ gốc (thức ăn, môi trường,hóa chất, tôm cá trong quá trình thu mua, chế biến,…) nhằm tạo ra cácsản phẩm có uy tín quốc tế.

3. Sự thành công bước đầu này có thể mở ra một hướng nghiên cứu mớisử dụng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh đơn giản, không quá tốn kémđể phân tích nhiều kháng sinh khác trong các đối tượng thủy sản khácnhau nhằm giúp các địa phương tự giám sát tốt vấn đề này.

4. Rút ra được quy luật đào thải, chuyển hóa của erythromycin trong cơthịt tôm càng xanh và cá rô phi sau khi ăn thức ăn có trộnerythromycin, từ đó ước lượng thời gian ngưng thuốc an toàn, gópphần có được một nền công nghiệp chế biến thực phẩm chủ động, antoàn và bền vững.

4

CHƯƠNG I TỔNG QUANErythromycin là nhóm kháng sinh macrolide gồm erythromycin A, B,

C, D, E, F. Tất cả được tạo ra từ Sacchropolyspora erythrea bằng conđường lên men. Sản phẩm chính của quá trình lên men này là erythromycinA, còn lại là các erythromycin khác (≤ 5%). Erythromycin gồm 2 phân tửđường gồm desosamin và cladinose gắn vào Erythronolide. Nó dễ dàng hútẩm và tan ít trong nước (0,2%). Erythromycin hoạt hóa ở pH kiềm hơn làpH trung tính và không bền ở pH acid.

Erythromycin có tác dụng diệt khuẩn tốt ở các loài vi khuẩn Gram [+]và hiệu quả trong việc chữa trị nhiễm khuẩn Staphylococcus mà đã khánglại Penicillin. Mycoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria,Haemophylus, Corynebacterium, Listeria, Pasteurella multocida, Brucella,Rickettsia, Treponema rất nhạy cảm với erythromycin. Erythromycin đượcsử dụng rộng rãi để chữa nhiễm khuẩn ở người và động vật.

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của erythromycin

Nguyên lý của cực phổ sóng vuông quét nhanh trên cực giọtchậm và stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm: Nhúngvào dung dịch nền có chứa chất cần phân tích 3 điện cực: Cực làm việc: làcực giọt thủy ngân có tốc độ chảy ổn định khoảng 7 giây một giọt. Nếu ápdụng kỹ thuật stripping nhanh ta dùng cực giọt thủy ngân có tốc độ chảytrên 10 giây một giọt. Cực so sánh: Ag/AgCl/KCl bão hòa có thế khôngđổi. Cực hỗ trợ: dùng cực Platin. Đặt lên cực làm việc 2 thành phần: Thếmột chiều tăng dần theo thời gian dạng hình bậc thang với các bước thế 2,

5

4, 6, 8, 10 mV. Thế xoay chiều là các xung vuông góc có giá trị biên độxung: 10, 20, 30, 40 mV và tần số vài trăm Hz. Để triệt tiêu dòng tụ điệngây nhiễu cho tín hiệu cần đo, ta tiến hành ghi cường độ dòng Faraday xoaychiều ở đầu xung và cuối xung. Phần mềm SQF-505 cho phép hiển thị sựbiến đổi của cường độ dòng Faraday xoay chiều theo thế một chiều. Đườngthu được gọi là phổ sóng vuông quét nhanh. Phổ thường chứa nhiều đỉnh.Mỗi đỉnh ứng với một chất hay một giai đoạn phản ứng điện hóa của mộtchất. Thế bán sóng (E1/2) với một dung dịch nền nào đó là một giá trị đặctrưng cho mỗi chất và thường dùng cho mục đích phân tích định tính.Chiều cao của đỉnh (cường độ dòng Faraday xoay chiều) hay diện tích đỉnh(công suất tạo sóng) tỷ lệ với nồng độ chất tham gia phản ứng điện hóa trêncực làm việc nên được dùng cho mục đích định lượng.

Stripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm: Dùng mộtcực giọt thủy ngân chạy rất chậm, khoảng 10 giây một giọt, làm cực làmviệc. Phần mềm PSA-F cho phép đặt một giá trị thế một chiều tùy ý để tíchgóp chất cần phân tích lên bề mặt của một giọt thủy ngân đang lớn dần lên.Sau quá trình này, máy sẽ tự động tiến hành quét phổ theo chế độ sóngvuông quét nhanh.

Các nghiên cứu định lượng erythromycin: Nghiên cứu ở trongnước, chưa thấy có nghiên cứu nào về quá trình định lượng erythromycin,ngay cả các nghiên cứu ở nước ngoài cũng có rất ít nghiên cứu về phươngpháp Von-ampe để định lượng erythromycin mà chủ yếu là các phươngpháp sắc ký lỏng ghép khối phổ. Đặc biệt chưa thấy một công trình nghiêncứu nào dùng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm dùng đểđịnh lượng erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh và cá rô phi.

Một số công trình nghiên cứu về khả năng đào thải, chuyển hóaerythromycin trên một số loài thủy sản như: Esposito cùng cộng sự(2006) nghiên cứu quá trình đào thải erythromycin trên cá hồi vân dòngOncorhynchus mykiss. Moffitt cùng cộng sự (1988) đã nghiên cứu sự tích

6

lũy và đào thải của erythromycin thiocyanate trên cá hồi Oncorhynchustshawytscha. Moffitt cùng cộng sự (1999) tiến hành nghiên cứu độc tính,khả năng gây đột biến và hiệu quả của việc tiêm 10, 20, hoặc 40 mgerythromycin/kg thể trọng cá hồi Oncorhynchus tshawytscha, cách 20 ngàytiêm 1 lần và tiêm 6 lần, trước khi cá hồi phát dục. Moffitt và cộng sự(2001) kiểm tra tính độc cấp tính và độc mãn tính của erythromycin trên cáhồi Oncorhynchus tshawytscha ở 2 nhiệt độ nước khác nhau. Haukenes vàcộng sự (2002) tiêm erythromycin phosphate vào cá hồi cái Oncorhynchustshawytscha trước khi đẻ trứng. Fairgrieve và cộng sự (2005) cho cá hồiOncorhynchus tshawytscha ăn thức ăn có chứa azithromycin (30 mg/kg cátrong 14 ngày) hoặc erythromycin (100 mg/kg cá trong 28 ngày).

Tóm lại, những nghiên cứu trước về biến đổi của erythromycin trêncơ thể thủy sản chủ yếu mới tập trung trên đối tượng cá hồi, là cá nước lạnhvà cũng chỉ mới dừng lại ở việc theo dõi sự đào thải erythromycin ở cá.Chưa có báo cáo về erythromycin trên thủy sản nhiệt đới và cũng chưa cóbáo cáo nào cho biết trong cơ thể thủy sản erythromycin sẽ chuyển hóa thếnào, vì vậy đây sẽ là những nội dung mà đề tài này nghiên cứu.

Vì sao chọn đối tượng thủy sản trong nghiên cứu này là tômcàng xanh và cá rô phi: Đây là hai loại thủy sản được nuôi rất phổ biến ởViệt Nam và có sử dụng erythromycin. Rất nhiều vi sinh vật gây bệnh trêntôm càng xanh bao gồm protozoans như Epistylis, Zoothamnium, vàVorticella; các vi khuẩn gây bệnh như Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas,Edwardsiella. Trong khi đó các bệnh chủ yếu trên cá rô phi khi nuôithường là Streptococcus iniae, Aeromonas hydrophila, Trichodina,Flexibacter Columnaris, Edwardsiella. Phổ biến nhất là doStreptococcosis, vi khuẩn gram dương, đã gây thiệt nặng nề mà không cóvacccine nào phòng được, thậm chí trên cá trưởng thành và khỏe mạnh. Vìvậy, erythromycin cũng là kháng sinh từ lâu được dùng để phòng và trịbệnh trên cá rô phi do Streptococcus.

7

CHƯƠNG II. NGUYÊN VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ DỤNG CỤ, HÓA CHẤT2.1.1 Nguyên vật liệu- Tôm càng xanh ( 50 g/con), cá rô phi (500550 g/con).- Erythromycin base 96,5% từ cty Cổ Phần Dược Hậu Giang.2.1.2 Thiết bị, dụng cụ- Thiết bị Analyzer SQF-505 của Trung Tâm Nhiệt Đới Việt Nga.- Bộ chiết pha rắn SPE của Phenomenex, cột HLB của Waters.- Các dụng cụ phân tích thông thường khác.2.1.3 Hóa chất- Erythromycin A, chloramphenicol, florfenicol, furazolidone,ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin chuẩn có độ tinh khiết > 98% củahãng Sigma Aldrich, Fluka Chemical.- Các dung môi, hóa chất phân tích khác.2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1 Thuyết minh nghiên cứu

Nội dung thứ I: Nghiên cứu các điều kiện cơ bản của kỹ thuậtstripping sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm để định lượngerythromycin. Sau đó tiến hành đánh giá thẩm định hiệu năng phươngpháp. Cuối cùng là lấy mẫu tôm càng xanh, cá rô phi thực tế tại 10 tỉnhĐBSCL để đánh giá bức tranh thực trạng nhiễm erythromycin.

Nội dung thứ II: Theo dõi quá trình đào thải và chuyển hoáerythromycin theo thời gian khi kháng sinh này đi vào cơ thể tôm càngxanh và cá rô phi bằng con đường thức ăn. Từ đó rút ra quy luật thời gianngưng thuốc an toàn trước thu hoạch.2.2.2 Phương pháp thực nghiệm2.2.2.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho việc định lượng erythromycintrên thiết bị Analyzer SQF - 505

8

Khảo sát và lựa chọn các loại dung dịch nền: Amoni axetat, Natriaxetat, Borax, Tris, Citrat - phosphat Khảo sát nồng độ dung dịch nền: 0,05 0,25 M. Khảo sát dung môi hòa tan erythromycin: Methanol, Ethyl axetat,Acetonitril. Nghiên cứu kỹ thuật đo Stripping SWV: chiều quét, Vstart, Vstep, Vpulse,Tdrop, Velectrolise, Telectrolise

Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố gây nhiễu: các ion vô cơ. Xây dựng đường chuẩn trong khoảng 50 900 ppb. Lựa chọn quy trình trích ly mẫu: sử dụng cột chiết pha rắn để tách loạitạp và làm giàu erythromycin. Độ chính xác, độ đúng, hiệu suất thu hồi Khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinh khác: Khảosát sự hiện diện của lần lượt các kháng sinh chloramphenicol, florfenicol,furazolidone, ciprofloxacin, enrofloxacin, danofloxacin xem có tách biệt vànhận danh rõ so với erythromycin A. So sánh đối chứng kết quả Stripping SWV với LC-MS/MS: Tôm càngxanh (cá rô phi) được nuôi đến trọng lượng thương phẩm, được lấy 3 mẫuvà phân tích tại trung tâm kiểm định Intertek Việt Nam để dùng làm mẫutrắng “blank”. Sau đó tôm (cá) nuôi được gây nhiễm erythromycin bằngcon đường thức ăn; liều gây nhiễm 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày; thời gian gây nhiễm 7 ngày liên tiếp và tiến hành lấy mẫu sau ngàythứ 7, 8 và 9 kể từ thời điểm ngưng thuốc. Lúc này ta sẽ có 3 nhóm mẫunhiễm erythromycin (cao, trung bình, thấp). Ở mỗi nhóm nồng độ gâynhiễm (6 mẫu), chia làm 2 phần bằng nhau:- Phần I: Phân tích bằng Stripping SWV (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồngđộ trung bình, 3 mẫu nồng độ cao).

9

- Phần II: Gửi phân tích đối chứng bằng LC-MS/MS tại trung tâm kiểmđịnh Intertek Việt Nam (3 mẫu nồng độ thấp, 3 mẫu nồng độ trung bình, 3mẫu nồng độ cao). Ứng dụng phân tích erythromycin trên các mẫu thực tế tôm, cá tại cácđịa phương: Lấy các mẫu tôm càng xanh, mẫu cá rô phi đại diện ở 10 tỉnh(mỗi tỉnh lấy mẫu ở 3 huyện) ở đồng bằng sông Cửu Long về phân tích vàxử lý thống kê để đánh giá thực trạng nhiễm erythromycin. Mỗi mẫu đượcphân tích 5 lần (n=5) trên máy Analyzer SQF - 505. Kết quả thể hiện: trungbình ± SD, % RSD.2.2.2.2 Xác định quy luật chuyển hóa sinh học, đào thải củaerythromycin trong cơ thể thủy sản khi nuôi

Kiểm soát từ giai đoạn thả giống đến khi đạt kích cỡ thương phẩmnhư: mật độ thả giống, kích cỡ thả giống nhiệt độ, pH, độ kiềm, hàm lượngoxy, khí độc, lượng thức ăn cho ăn, kích cỡ tôm khi xử lý kháng sinh,kháng sinh nguyên liệu, sàng lọc các dạng erythromycin B, C, D, E, F cótrong nguyên liệu erythromycin base này. Thời gian xử lý kháng sinh, conđường đưa kháng sinh vào cơ thể, liều kháng sinh xử lý, số lần cho ăn thứcăn trong ngày cũng được giám sát hết sức chặt chẽ. Mẫu được phân tíchkhẳng định dư lượng erythromycin A, phân tích sàng lọc các dạng chuyểnhóa của erythromycin như erythromycin B, C, D, E, F theo phương phápLC-MS/MS thông qua Cty kiểm nghiệm TUV Rheinland Aimex Vietnam.2.2.3 Xử lý số liệu

Tất cả số liệu phân tích đều được xử lý thống kê bằng phần mềmStatgraphics và WT14.

10

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN3.1 NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO VIỆC ĐỊNHLƯỢNG ERYTHROMYCIN3.1.1 Nghiên cứu thăm dò định hướng, chọn vùng quét thế và chiềuquét thế

Erythromycin khá dễ tan trong nước nên các dung dịch nền dùngcho người cứu chủ yếu là dung dịch nước với các chất điện ly khác nhau.Trong công thức cấu tạo của erythromycin có nhóm C=O liên kết với mộtnguyên tử oxy khác, ngoài ra có một số dị vòng chứa oxy được liên kết mộtnguyên tử oxy nữa nên có thể dự đoán sẽ xuất hiện những sóng khử trongkhoảng thế từ -1,0 V đến -1,7 V. Vì thế em sẽ tập trung nghiên cứu ở vùngthế này.

Qua thăm dò sơ bộ em thấy có một vài sóng trong khoảng thế này,nhưng sóng ở thế vùng khoảng -1,4 V là tốt nhất đối với mục đích phân tíchđịnh lượng, nên các khảo sát tiếp theo em tập trung để tìm điều kiện tối ưucho sóng này.3.1.2 Nghiên cứu tìm dung dịch nền và pH phù hợp

Cường độ dòng của erythromycin bị ảnh hưởng bởi loại dung dịchnền. Trong số các dung dịch nền khảo sát như Natri axetat, Amoni axetat,Citrat-Phosphat, Borax, đệm Tris thì dung dịch nền amoni axetat cho giá trịcường độ dòng erythromycin cao nhất và hình dạng đỉnh peak đẹp nhất.

Khoảng pH của dung dịch amoni axetat được khảo sát trongkhoảng 7,0 đến 10,0. Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở pH 8,0(E1/2 = -1.430 mV, I = 351,7 ± 5,7 nA). Vì thế dung dịch nền amoni axetat(pH 8,0) được chọn để khảo sát tiếp theo.3.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền

Nồng độ dung dịch nền amoni axetat pH 8,0 được khảo sát trongkhoảng 0,05 0,25 M. Erythromycin có cường độ dòng cao nhất ở amoniaxetat 0,1 M (E1/2 = -1.430 mV, I = 254,8 ± 10,2 nA).

11

Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nền amoni axetat đến cường độ dòng

của erythromycin A

3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi hòa tan erythromycinTiến hành ghi phổ của erythromycin trong dung dịch nền amoni

axetate 0,1 M pH 8,0 với sự có mặt của ba dung môi methanol, acetonitril,ethyl axetate để hòa tan chuẩn erythromycin. Kết quả thu được thấy khi cómặt của các dung môi trên vẫn không ảnh hưởng nhiều tới tính chất củaphổ eythromycin, chúng ta vẫn ghi được các phổ rõ ràng ở vùng thế như cũ.Qua đó, ta thấy trong quá trình chuẩn bị mẫu đo có thể dùng các dung môitrên.3.1.5 Nghiên cứu các điều kiện chạy máy thích hợp3.1.5.1 Nghiên cứu chiều quét

Chiều quét xuôi (0 đến -1.800 mV) và chiều quét ngược (-1.800mV đến 0) lên tín hiệu của cường độ dòng đã được khảo sát. Chiều quétxuôi (0 đến -1.800 mV) cho đỉnh peak cao và đẹp. Trong khi đó, chiều quétngược (-1.800 mV đến 0) không thể hiện đỉnh peak. Chiều quét xuôi (0 đến-1.800 mV) được chọn để khảo sát các thông số tiếp theo. Điều này nói lênrằng tính chất không thuận nghịch của erythromycin khi quét.3.1.5.2 Nghiên cứu chọn thế bắt đầu ghi phổ Vstart

Tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong dung dịchnền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 với các giá trị thế bắt đầu ghi phổ Vstart

khác nhau và thu được các kết quả sau:

150,0

170,0

190,0

210,0

230,0

250,0

270,0

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30

Nồng độ dung dịch nền ammonium acetate (M)

Cư

ờng

độ d

òng

eryt

hrom

ycin

A(n

A)

12

Hình 3.13: Ảnh hưởng của Vstart đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.3 Nghiên cứu chọn bước thế 1 chiều Vstep

Tiến hành ghi phổ dung dịch erythromycin nồng độ 100 ppb trongdung dịch nền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0 một số tốc độ quét thế một chiềutương ứng với thế bước Vstep = 6 , 8 , 10 mV/ bước thế và thu được:

Hình 3.15: Ảnh hưởng của Vstep đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.4 Nghiên cứu chọn biên độ xung vuông Vpulse

Tiến hành ghi phổ erythromycin nồng độ 100 ppb trong nền amoniaxetat 0,1 M; pH 8,0 với các biên độ khác nhau 10, 20, 30, 40 mV

Hình 3.17: Ảnh hưởng của Vpulse đến cường độ dòng của erythromycin A

y = 0,1332x + 162,8

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

-1200-1100-1000-900-800-700-600-500-400-300-200Vstart (mV)

Cư

ờng

độ

dòng

ery

thro

myc

in A

(nA

)

y = -12,395x + 284,64

150

160

170

180

190

200

210

220

4 6 8 10 12Vstep (mV)

Cư

ờng

độ d

òng

eryt

hrom

ycin

A (n

A)

y = 15,258x + 78,47

100

200

300

400

500

600

700

800

0 10 20 30 40 50Vpulse (mV)

Cư

ờng

độ d

òng

eryt

hrom

ycin

A (n

A)

13

3.1.5.5 Nghiên cứu chọn thời điểm quét thế trong đời sống 1 giọt thủyngân Tdrop

Giá trị Tdrop này thể hiện thời điểm bắt đầu ghi sóng kể từ thời điểmhình thành một giọt thủy ngân mới. Để ghi toàn phổ ta nên chọn giá trị1.000 ÷ 5.000 ms để trong quá trình ghi giọt không bị rơi. Giá trị Tdrop cànglớn sóng càng lớn vì được ghi ở vùng giọt lớn, cường độ dòng qua cực làmviệc càng cao, độ nhạy càng cao.

Hình 3.19: Ảnh hưởng của Tdrop đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.6 Nghiên cứu chọn thời gian điện phân tích góp Telectrolise

Tiến hành ghi phổ erythromycin sau các khoảng thời gian tích góp3 - 4 - 5 giây và thu được:

Hình 3.21: Ảnh hưởng của Telectrolise đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.5.7 Nghiên cứu chọn thế điện phân tích góp Velectrolise

Tiến hành thí nghiệm với các thế tích góp: -400, -900, -1100 mVvà thu được:

y = 0,0631x + 70,59

100

150

200

250

300

350

400

450

0 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000Tdrop (ms)

Cư

ờng

độ d

òng

eryt

hrom

ycin

A (n

A)

y = 181,7x + 815,2

130013501400145015001550

16001650170017501800

2 3 4 5 6Telectrolise (s)

Cư

ờng

độ d

òng

eryt

hrom

ycin

A (n

A)

14

Hình 3.23: Ảnh hưởng của Velectrolise đến cường độ dòng của erythromycin A

3.1.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các ion vô cơ Na+, K+, Ca++, Mg++, Fe3+,Cl- , SO4

-2 , HPO42- tới phổ erythromycin

Ở nồng độ 05 ppm thì các ion K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe3+,Cu2+, Cl-, I-, SO4

2-, HPO42- ảnh hưởng không đáng kể (<5%) đến cường

độ dòng của erythromycin.3.1.7 Nghiên cứu xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 50 400 µg/kg với hệ sốtương quan điều chỉnh radjusted = 1,0; LoD = 0,52 µg/kg.

Hình 3.24: Đường chuẩn erythromycin A trên dung dịch nền amoni axetat 0,1 M; pH 8,0

3.1.8 Nghiên cứu lựa chọn quy trình trích ly mẫuKết quả khảo sát này cho thấy trên nền mẫu tôm càng xanh và cá rô

phi thì quy trình trích ly III cho hiệu suất thu hồi erythromycin cao nhất(90,59%, 83,57%) nên quy trình trích ly III được chọn để khảo sát cácthông số tiếp theo.

y = -0,2187x + 1620,8

1650

1700

1750

1800

1850

1900

-1200 -1100 -1000 -900 -800 -700 -600 -500 -400 -300Velectrolise (mV)

Cư

ờng

độ d

òng

eryt

hrom

ycin

A (n

A)

15

Hình 3.25: Hiệu suất trích ly erythromycin trên tôm càng xanh

Hình 3.26: Hiệu suất trích ly erythromycin trên cá rô phi

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP3.2.1 Khoảng tuyến tính

Đường chuẩn erythromycin tuyến tính trong khoảng nồng độ 50 400 µg/kg với hệ số tương quan điều chỉnh R2

adjust = 1,0 và độ lệch chuẩntương đối %R.S.D trong khoảng 0,4 3,7 %. Phương trình đường chuẩnY=1,08*X + 87.3.2.2 Giới hạn phát hiện LOD- Giới hạn phát hiện trên nền dung dịch đệm 0,52 µg/kg- Giới hạn phát hiện trên nền mẫu tôm càng xanh 0,57 µg/kg- Giới hạn phát hiện trên nền mẫu cá rô phi 0,80 µg/kg3.2.3 Độ chính xác, độ đúng và hiệu suất thu hồi

87.90 88.6290.59

77.27

81.63

70.0072.0074.0076.0078.0080.0082.0084.0086.0088.0090.0092.00

Hiệu suất tríchly (%)

I II III IV V

Quy trình trích ly

70.69 75.2583.57

69.33 72.34

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

Hiệu suấttrích ly (%)

I II III IV V

Quy trình trích ly

16

Bảng 1.16 (phụ lục): Độ chính xác (RSD %), độ đúng (RE %) và hiệu suất thu hồi

erythromycin A trên mẫu tôm càng xanhNgày Nồng độ thêm

(µg*kg-1)Nồng độ phân tích được

(TB ± SD, µg*kg-1)RSD(%)

RE(%)

1 100 91,45 ± 1,44a 1,58 91,452 100 90,40 ± 1,25a 1,38 90,403 100 90,92 ± 1,43a 1,57 90,921 200 187,23 ± 2,79b 1,49 93,612 200 184,76 ± 1,97b 1,07 92,383 200 185,18 ± 2,43b 1,31 92,591 300 286,03 ± 4,01c 1,40 95,342 300 288,27 ± 2,71cd 0,94 96,093 300 289,50 ± 2,65d 0,91 96,50

* Mỗi giá trị là trung bình của 6 mẫu đo

Bảng 1.17 (phụ lục): Độ chính xác (RSD %), độ đúng (RE %) và hiệu suấtthu hồi erythromycin A trên mẫu cá rô phi

Ngày Nồng độ thêm(µg*kg-1)

Nồng độ phân tích được(TB ± SD, µg*kg-1)

RSD(%)

RE(%)

1 100 85,07 ± 1.26a 1,48 85,072 100 85,34 ± 1.79a 2,10 85,343 100 85,31 ± 1.24a 1,45 85,311 200 173,25 ± 2.34b 1,35 86,632 200 173,03 ± 2.09b 1,21 86,513 200 172,82 ± 1.39b 0,80 86,411 300 261,62 ± 4.53c 1,73 87,212 300 262,57 ± 3.42cd 1,30 87,523 300 265,68 ± 5.38d 2,02 88,56

* Mỗi giá trị là trung bình của 6 mẫu đo

3.2.4 Đánh giá khả năng nhận danh erythromycin A với các kháng sinhkhác

17

Bảng 3.3: Thế bán sóng đặc trưng của một số kháng sinh được định danhbằng phương pháp sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm

Stt Kháng sinh Thế bán sóng E1/2

1 Erythromycin -1.430 mV2 Chloramphenicol -168 mV3 Florfenicol -78 mV4 Furazolidone -1.152 mV5 Ciprofloxacin -1.336 mV6 Enrofoxacin -214 mV7 Danofoxacin -1.120 mV

Sự tách biệt thế bán sóng này chứng tỏ được phương pháp strippingsóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm ngoài khả năng sàng lọc mà còncó khả năng nhận danh và tính khẳng định. Giải thích cơ chế xuất hiện sóng của erythromycin:

Trong công thức cấu tạo của eythromycin (hình 3.1) có hai nhómC=O, đó là cơ sở để hy vọng có thể bắt được tín hiệu khử đặc trưng củaeythromycin. Các nhóm C=O, như trong các aldehyde và xeton, thường chosóng khử trực tiếp theo cơ chế sau: Trong giai đoạn thứ nhất xảy ra phản ứng khử thuận nghịch với sự

tham gia một điện tử để tạo ra gốc anion:RR’C=O + e- (+ H+) RR’C`– O- (hay là RR’C` – OH)

Các gốc anion tiếp tục khử với sự tham gia thêm một điện tử nữavà tạo một sóng khử có sự tham gia hai điện tử.Tuy nhiên tùy nguyên tử cacbon của nhóm C=O liên kết với các

nhóm ái nhân hay ái điện tử mà việc khử nhóm C=O dễ hay khó. Nếu nóliên kết với các nhóm ái điện tử càng mạnh thì việc khử nhóm C=O càngdễ, sóng càng chuyển dịch về phía dương.

Ta hãy xét thế bán sóng của một số chất hữu cơ có nhóm C=O sau: Formaldehyde H–CH=O Đệm pH 8 E1/2 = -1,50 V

Đệm pH 10 E1/2 = -1,63 VĐệm pH 12 E1/2 = -1,74 V

18

Axetaldehyde CH3–CH=O Đệm pH 7 E1/2 = -1,93 VĐệm pH 9 E1/2 = -2,08 V

Propionaldehyde CH3–CH2–CH=O LiOH 0,1M E1/2 = -1,96 VQua các ví dụ trên ta thấy khi nguyên tử cacbon của nhóm C=O

liên kết với các mạch cacbon càng dài, mật độ điện tử trong nhóm C=Ocàng cao, quá trình khử càng khó, thế bán sóng càng tăng về phía âm.Ngược lại khi các nhóm ái điện tử càng gần nguyên tử cacbon của nhómC=O, thì nhóm C=O càng dễ khử như các ví dụ sau: Methylglyoxal CH3–CO–CH=O Đệm pH 7 E1/2 = -1,36 V Glycoaldehyde HO–CH2–CH=O Đệm pH 7 E1/2 = -1,54 V

Nhóm C=O thứ nhất của erythromycin liên kết với một loạt nhómCH và CH3 là các nhóm ái nhân nên mật độ điện tử khá cao nên rất khókhử. Thế bán sóng của nhóm này phải nằm lân cận vùng -2,0 volt.

Nhóm C=O thứ hai liên kết trực tiếp với một nguyên tử oxy là mộttác nhân ái điện tử, cho nên có thể kết luận sóng của erythromycin có thếđỉnh vùng -1,4 volt là sóng khử của nhóm C=O thứ hai. Khái quát hoá khả năng phân tích một số họ kháng sinh:a) Họ Phenicol:

Trong công thức cấu tạo của họ kháng sinh phenicol có 3 nhómchức điện hoá:- Nhóm -Cl2: CH2=CCl2 có E1/2 > -0,2 V; CH2=CH-CH2Cl có E1/2: -1,95 V- Nhóm C=O cũng có thể tham gia phản ứng khử.- Nhóm nitro có trị số E1/2 dao động trong khoảng -0,2 V đến -1,0 V phụthuộc vào giá trị pH, các nhóm liên kết với nhóm NO2 và dung môi sửdụng. Tuỳ thuộc pH dung dịch nền, nhóm này cho 1 sóng hay 2 sóng khử.b) Họ Nitrofuran:

Trong họ kháng sinh nitrofuran có 3 nhóm chức điện hoá:- Nhóm NO2 có E1/2 trong khoảng - 0,2 V đến - 1,0 V.- Nhóm C=N có E1/2 trong khoảng -1,0 V đến - 1,8 V.

19

- Ngoài ra còn có nhân dị vòng 2-oxo-1,3-oxolidin cũng có thể tham giaphản ứng khử.c) Họ Fluoroquinolon:

Nhóm fluoroquinolon trong công thức cấu tạo có khung quinolon,nhân quinon, nhóm này có phản ứng khử trên điện cực giọt thuỷ ngân.3.2.5 So sánh đối chứng kết quả SSWV với LC-MS/MS3.2.5.1 Trên mẫu tôm càng xanh

Hiệu suất thu hồi: > 90,92 %, MDL: 0,57 µg.kg-1; R_adjust:0,99999; RSD: 0,91 1,58 %. (Hình 3.29)

Hình 3.29: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu tôm càng xanh

3.2.5.2 Trên mẫu cá rô phiHiệu suất thu hồi: > 85,07%; MDL: 0,80 µg.kg-1; R_adjust: 1,0;

RSD: 0,80 2,10 % (Hình 3.30).

Hình 3.30: Đường chuẩn erythromycin trên nền mẫu cá rô phi

3.2.5.3 So sánh kết quả phân tích bởi SSWV và LC-MS/MSa) Tôm càng xanh

20

Bảng 3.4: So sánh kết quả phân tích mẫu tôm càng xanh bởi 2 phương pháp

Số nhận diệnSSWV (LOD=0,57 µg*kg-1) LC-MS/MS (LOD=10 µg*kg-1)

Dư lượng(µg*kg-1)

TB ± SD(µg*kg-1)

RSD(%)

Dư lượng(µg*kg-1)

TB ± SD(µg*kg-1)

RSD(%)

GP – Blank KPH KPHGP – Blank KPH KPHGP – Blank KPH KPHGP – I 51,37

50,75 ± 0,59a 1,1750,73

52,61 ± 3,72a 7,06GP – I 50,19 56,89GP – I 50,68 50,21GP – II 65,45

65,48 ± 0,53b 0,8072,82

70,49 ± 2,41b 3,42GP – II 64,97 68,00GP – II 66,02 70,65GP – III 80,61

80,00 ± 0,75c 0,9474,60

80,23 ± 5,30c 6,61GP – III 79,16 85,12GP – III 80,22 80,98

* LOD: Giới hạn phát hiện, ** KPH: Không phát hiện

b) Cá rô phiBảng 3.5: So sánh kết quả phân tích mẫu cá rô phi bởi 2 phương pháp

Số nhận diện SSWV (LOD=0,80 µg*kg-1) LC-MS/MS (LOD=10 µg*kg-1)Dư lượng(mg*kg-1)

TB ± SD(mg*kg-1)

RSD(%)

Dư lượng(mg*kg-1)

TB ± SD(mg*kg-1)

RSD(%)

TL – Blank KPH KPHTL – Blank KPH KPHTL – Blank KPH KPHTL – I 1,31

1,29 ± 0,02a 1,611,23

1,26 ± 0,03a 2,10TL – I 1,27 1,28TL – I 1,30 1,27TL – II 1,95

2,02 ± 0,07b 3,473,14

2,72 ± 0,43a 15,64TL – II 2,09 2,72TL – II 2,02 2,29TL – III 2,80

2,78 ± 0,03c 1,252,80

2,80 ± 0,01b 0,21TL – III 2,80 2,80TL – III 2,74 2,81

* LOD: Giới hạn phát hiện, ** KPH: Không phát hiện

Qua bảng 3.4 và 3.5, cũng như kết quả phân tích ANOVA ở bảng3.28-3.31 (phần phụ lục) ta thấy được có sự tương đồng khá chặt chẽ về kếtquả phân tích giữa 2 phương pháp SSWV và LC-MS/MS. Xét về độ lặp lạicủa phương pháp thì phương pháp sóng vuông quét nhanh có độ lặp lại tốt

21

hơn phương pháp LC-MS/MS dựa trên chỉ số % R.S.D trên cả 2 đối tượngmẫu là tôm càng xanh và cá rô phi.3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH ERYTHROMYCIN TRÊN CÁC MẪU THỰC

TẾ TÔM, CÁ TẠI CÁC ĐỊA PHƯƠNG

Hình 3.31: Tình hình nhiễm erythromycin ở tôm càng xanh tại các tỉnh ĐBSCL

Hình 3.32: Tình hình nhiễm erythromycin ở cá rô phi tại các tỉnh ĐBSCL

Tỷ lệ nhiễm trên tôm càng xanh (45/150 mẫu) cao hơn so với trêncá rô phi (30/150 mẫu). Người nông dân đã bắt đầu sử dụng loại kháng sinhnày, thậm chí ở nồng độ cao để điều trị bệnh cho thủy sản nuôi và khôngtuân thủ thời gian ngưng thuốc cần thiết (hình 3.31 & 3.32).3.4 XÁC ĐỊNH QUY LUẬT CHUYỂN HÓA SINH HỌC, ĐÀO THẢI

KHÁNG SINH ERYTHROMYCIN TRÊN CƠ THỂ THỦY SẢN KHI NUÔI

0

100

200

300

400

500

600

700

Dư lượngerythromycin A

(ppb)

Cao

Lan

hTa

m N

ong

Thap

Muo

iG

o Q

uao

Gio

ng R

ieng

Vin

h Th

uan

Thoa

i Son

Long

Xuy

enP

hu T

anTa

m B

inh

Bin

h M

inh

Long

Ho

Mo

Cay

Cha

u Th

anh

Gio

ng T

rom

Duy

en H

aiTr

a C

uC

ang

Long

Phu

ng H

iep

Long

My

Vi T

huy

My

TuM

y X

uyen

Ke

Sac

hV

inh

Than

hO

Mon

Co

Do

Phu

oc L

ong

Hon

g D

anG

ia R

ai

Dongthap

KienGiang

AnGiang

VinhLong

BenTre

TraVinh

HauGiang

SocTrang

CanTho

BacLieu

Địa phương

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Dư lượngerythromycin A

(ppb)

Cao

Lan

hTa

m N

ong

Thap

Muo

iG

o Q

uao

Gio

ng R

ieng

Vin

h Th

uan

Thoa

i Son

Long

Xuy

enP

hu T

anTa

m B

inh

Bin

h M

inh

Long

Ho

Mo

Cay

Cha

u Th

anh

Gio

ng T

rom

Duy

en H

aiTr

a C

uC

ang

Long

Phu

ng H

iep

Long

My

Vi T

huy

My

TuM

y X

uyen

Ke

Sac

hV

inh

Than

hO

Mon

Co

Do

Phu

oc L

ong

Hon

g D

anG

ia R

ai

Dongthap

KienGiang

AnGiang

VinhLong

BenTre

TraVinh

HauGiang

SocTrang

CanTho

BacLieu

Địa phương

22

3.4.1 Đào thải erythromycin trong cơ thịt

Hình 3.33: Khả năng đào thải erythromycin A trong cơ thịt tôm càng xanh đã

được cho ăn 50 và 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày

Hình 3.34: Khả năng đào thải erythromycin A trong cơ thịt cá rô phi đã được cho

ăn 50 và 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày

Bằng phương pháp thống kê, rút ra được thời gian ngưng thuốc 976°C_ngày (tương đương 34,86 ngày; ở nhiệt độ 28 oC) đối với tôm càngxanh đã được cho ăn erythromycin 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong thờigian 7 ngày. Riêng với mức nồng độ 50 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong thờigian 7 ngày thì dư lượng để lại là không đáng kể và ở mức an toàn.

0.0

100.0

200.0

300.0

400.0

500.0

600.0

700.0

0 100 200 300 400 500 600 700

Thời gian (oC - ngày)

Ery

thro

myc

in A

(µg/

kg)

50 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày 100 mg erythromycin/kg thể trọng/ngày

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

30,000

35,000

40,000

45,000

50,000

0 100 200 300 400 500 600 700Thời g ian (oC - ngày)

Eyr

thro

myc

in A

(µ

g/kg

)

50 mg ery thromy cin/kg thể t rọng/ngày 100 mg ery thromy cin/kg thể t rọng/ngày

23

Cũng bằng phương pháp thống kê này, rút ra được thời gian ngưngthuốc 908 °C-ngày (tương đương 32,42 ngày, ở 28 oC) đối với cá rô phi đãđược cho ăn erythromycin 50 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong thời gian 7ngày. Trong khi đó thì cần đến 1.150 °C-ngày ngưng thuốc (tương đương41,07 ngày, ở 28 oC) nếu cá rô phi được được cho ăn 100 mg.kg-1 thểtrọng.ngày-1 trong thời gian 7 ngày.3.4.2 Chuyển hoá sinh học của kháng sinh gốc3.4.2.1 Tôm càng xanh

Khi cho ăn ở liều 100 mg.kg-1 thể trọng.ngày-1 trong 7 ngày bằngcon đường thức ăn, erythromycin A đã dần chuyển hóa sang erythromycinE (2,09 µg/kg) ở ngày thứ nhất sau ngưng thuốc. Ở ngày thứ 23 sau ngưngthuốc, erythromycin E (5,81 µg/kg) và erythromycin F (3,52 µg/kg) đượcphát hiện ở mức nồng độ không đáng kể.3.4.2.2 Cá rô phi

Khi cá rô phi được cho ăn erythromycin base ở liều thấp (nhóm A),ở ngày thứ nhất sau ngưng thuốc thì không phát hiện được bất kỳ dẫn xuấtchuyển hóa nào của erythromycin. Tuy nhiên đến ngày thứ 23 thì phát hiệncó các dẫn xuất erythromycin E (2,30 µg/kg) và erythromycin F (2,37µg/kg) trong cơ thịt cá. Trong trường hợp cá rô phi được cho ănerythromycin base ở liều cao (nhóm B) thì ngay ở ngày thứ nhất sau ngưngthuốc, phát hiện thấy dẫn xuất chuyển hóa erythromycin C (131,5 µg/kg) vàerythromycin E (258,3 µg/kg). Ở ngày thứ 23 sau ngưng thuốc,erythromycin E (6,94 µg/kg) và erythromycin F (5,90 µg/kg) được pháthiện ở mức nồng độ không đáng kể. Khi phân tích cơ chế chuyển hóa, thấyrằng: Có sự oxy hóa tại vị trí R2 và R3 trong phân tử erythromycin A làmbiến đổi erythromycin A thành erythromycin E ở cả tôm càng xanh và cá rôphi và có sự khử methyl của R4 làm biến đổi erythromycin A thànherythromycin C ở cá rô phi. Như vậy các enzyme oxy hóa khử có trong ganvà trong mô cơ của tôm và cá đã xúc tác phân giải erythromycin.

24

KẾT LUẬN1. Đề tài đã xây dựng được phương pháp sóng vuông quét nhanh trêncực giọt chậm trong việc phân tích kháng sinh erythromycin trong tôm, cáđạt được giới hạn phát hiện, đáp ứng yêu cầu giới hạn dư lượng cho phéptheo tiêu chuẩn quốc tế. Phương pháp cho thấy hiệu suất thu hồi cao (85,05 96,50 %), độ nhạy cao (giới hạn phát hiện 0,52 µg/kg), độ chính xác cao(độ lệch chuẩn tương đối, RSD từ 0,80 2,10 %), độ đúng (sai biệt tươngđối, RE từ 3,50 4,95 %) cũng như mức độ tuyến tính rất cao (r2 ≥0,99999). Có sự tương đồng giữa kết quả phân tích bởi phương pháp nàyvới phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ.2. Đưa ra được cơ chế giải thích xuất hiện sóng erythromycin. Từ đókhái quát hoá và đưa ra được giả thuyết khả năng phân tích từng họ khángsinh như phenicol, nitrofuran, fluoroquinolon (thường gặp trong nuôi trồngthuỷ sản) bằng kỹ thuật sóng vuông quét nhanh trên cực giọt chậm.3. Kết quả đề tài đã làm cho thấy rằng các dẫn xuất erythromycinkhông chỉ được chuyển hoá từ Sacchropolyspora erythrea bằng con đườnglên men, mà còn chứng minh rằng erythromycin A khi vào cơ thể tôm cá,dưới tác dụng của các enzyme oxy hóa khử và enzyme chuyển methyl hóa,biến thành erythromycin C, E, F, sau đó bị đào thải. Đề tài cũng đưa rađược giả thuyết giải thích cơ chế chuyển hoá erythromycin trong tôm càngxanh, cá rô phi khi nuôi.4. Đã đánh giá và rút ra được quy luật thời gian ngưng kháng sinherythromycin trước thu hoạch trên đối tượng tôm càng xanh và cá rô phi.