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Parte teorica I (14-14.15):Dal DNA alla terapia genica.
Terapia genicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Ridiculous idea
Cures all known diseases
Woudn’t give it to my dog
Good treatment
E.WFW. Alton, London ESGT Meeting 99
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Umori sulla terapia genica
Il DNA come l’aspirina
WhatI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Vantaggi teorici:
• Lunga durata
• Trattamento della causa
• Specificita’
• Assenza di effetti collaterali
WhyI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Why not
• Danno (inefficienza) da protocollo terapeutico
• Dato il rischio quando e’ giustificata la terapia?
• Trasduzione della linea germinale (eugenetica)
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Primo step:Scegliere, manipolare il DNA da usare comemedicina
HowI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
N
DD
Secondo Step:Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo)
N D
ND
ND
HowI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Terzo Step:Fare in modo che il processo funzioni in tutte le cellule eper la durata di vita dell’individuo (cervello=100x10e9neuroni).
HowI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Parte pratica I (14.15-15.30):Manipolazione del DNA
Terapia genicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Primo step:Scegliere, manipolare il DNA da usare comemedicina
HowI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
N
DD
Procedura sperimentale per l’estrazione diDNA umano
1. Congelamento/scongelamento per rompere lecellule (aliquote da 4x10e6 cellule in 500ul)li
2. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare idetriti cellulari
3. Recupero supernatante e trasferimento in unanuova eppendorf
4. Aggiunta di 50 ul di NaAcO 3M(formazione dicomplessi )
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
5. Vortex
6. Aggiunta di 1 ml di EtOH 100% (formazionedel precipitato di DNA)
7. Vortex
8. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare ilpellet di DNA
Procedura sperimentale per l’estrazione diDNA umano
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
9. Eliminazione del supernatante
10. Incubazione del campione 3’ a temperaturaambiente per far evaporare l’EtOH
11.Pellet in 1 ml di H2O sterile
Procedura sperimentale per l’estrazione diDNA umano
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
1. Preparazione aliquote da 15 ul di DNA estrattodalle cellule
2. Aggiunta di 3ul loading buffer
3. Caricamento su gel con controlli
4. Corsa a 100 volts per 15’
Procedura sperimentale per l’analisi diDNA umano
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Parte teorica II (9.15-9.45 e 11.30-
12):
Gli esperimenti di terapia genica sull’
uomo.
Terapia GenicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
La terapia genica oggi
• 636 protocolli clinici
• > 3496 pazienti
• > 20 paesi
• Ampio spettro di target terapeutici (AIDS,fibrosi cistica, emofilia, diabete, cancro…)
http://www.esgt.org
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Protocolli clinici approvatiI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Fasi dei protocolli clinici approvati
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
•Fase I: pochi pazienti per stabilire la safe dose•Fase II: piu’ pazienti seguiti per piu’ tempo•Fase III: grande numero di pazienti seguiti per mesi oanni•Fase IV: fase 'post-marketing'
Protocolli clinici in funzione del tempoI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Caratteristiche dei target terapeutici“ideali”
• Malattie mortali
• Gene noto
• Accessibilita’ del tessuto colpito
• Regolazione del gene non determinante
• Stato clinico del malato reversibile
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Malattie trattate con terapia genica
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Geni usati nei protocolli di terapia genicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Sistemi di trasferimento genico usati neiprotocolli clinici di terapia genica
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Protocolli clinici di terapia genica in (nord!)Italia
# author illness gene system phase comments
IT 001 C. BordignonSan Raffaele Milano
ADA ADA gene/ neogene
Retrovirus in PBL exvivo
I/II open
IT 002 C. BordignonSan Raffaele Milano
Precautional for Immunomodulation of DonorAnti-Tumor Immunity
TK/neo gene Retrovirus in PBL I/II open
IT 003 C. BordignonSan Raffaele Milano
Precautional for Immunomodulation of DonorAnti-Tumor Immunity
TK/neo gene Retrovirus in PBL I/II open
IT 004 Natale CascinelliIstituto Tumori, National Cancer Inst.Milano
melanoma IL-4 Retrovirus in melanomacell line
I/II 2/11 patientsclinical effect
IT 005 Natale CascinelliIstituto Tumori, National Cancer Inst.Milano
melanoma IL-2 Retrovirus in melanomacell line
I/II open
IT 006 V. M. FazioIstituto Medicina Sperimentale CNRRoma
Lymphoma leukemia Naked vectorintramuscolar
I open
IT 007 Giorgio ParmianiIstituto Tumori, National Cancer Inst.Oncologia SperimentaleMilano
Metastatic melanoma IL-4 Retrovirus I/II 2/11 patientsclinical effect
IT 008 A. AiutiSan Raffaele Telethon Institute for GeneTherapy (HSR-TIGET)Milan
ADA ADA gene Retrovirus in stem cells I open
IT 009 M MaioCentro di Riferimento OncologicoAviano
melanoma IL-2, IL-4 I open
IT0010
F. BelliNational Cancer InstituteMilanItaly
melanoma IL-2, IL-4 I Closed (results?)
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Liposomi (8.6 %)
DNA
+
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+
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+
+
+
+
+
DNA_
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I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Trasferimento di un gene reporter nel topo conliposomi (intraven.)Andamento in funzione del tempo.
Liposomi: durataI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Tossicita’ dose dipendente di liposomi-DNA iniettatinella cavita’ nasale di topi di Laboratorio (sezionipolmonari 48h p.i.)
Liposomi: tossicita’I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Why Virus (70.6%)I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Ex-vivo Retrovirus-mediated gene therapy:ADA protocolli 1990NIH, USA (Science 1995, Blaese et al)
• Sicuro
• Inefficiente
• Risultati non definitivi: trattamento parallelo conproteina
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo
G
Successo o catastrofe? 2 pazienti / 11, 1 protocollo / 263
1998
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Virus ricombinante ex vivo: efficacia e tossicita’sull’uomo
Adverse event (1 caso/ 256 protocolli clinici)
Wilson and coworkers; Science 2000Winstar Institute U-Penn USA
• OCT deficienza, X-linked• Adenovirus E2tsE1-/OCT• Iniettato nella vena epatica 3.8x1013 particles• 4 giorni dopo l’iniezione il paziente muore• WHY?
Virus ricombinante in vivo: tossicita’ sull’uomo
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Virus ricombinante in vivo: la rispostaimmunitaria
Inflammation CTL Abs
48h 7 d 21 d
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Topi di Laboratorio con tumore trattati con virus(AdIL-2)
Risposta immunitaria: dal male il bene?
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Virus ricombinante ex vivo su cellule staminaliI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Valutazione del rischio
Virus:•RC virus (problema nel paziente e nell’ambiente)•Immunogenicita’•Creazione di nuovi virus•Mutagenesi inserzionale•Danno da prodotto genico•Irreversibilita’ Non-virus:•Immungenicita’, tossicita’•Danno da prodotto genico
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Come si controlla il rischio biologicoI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
In Laboratorio• Inattivazione del virus (delezioni, targeting, controllo trascrizionale,
cell marking)• Manipolazione sotto cappe Biohazard• P2, P3• Isolatori per gli animali• Analisi dei preparati da usare per I trattamenti (presenza di
materiale batterico, presenza di RCA)
Sul paziente• Selezione del target• Isolatori per i pazienti trattati con virus• Analisi della risposta immunitaria/infiammatoria• Analisi della presenza di virus circolante• Follow up clinico su lunghi tempi
Organismi di controllo giuridico dei protocolliclinici di terapia genica
•Italia: Ministero della salute
•Europa:The European Agency for the evaluation ofMedicinal products (EMEA) http://www.emea.eu.int/sitemap.htm
•USA: FDA
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Parte pratica II (9.45-11 e 12-13.15):Trasferimento genico nellacellula umana mediante virus
Terapia genicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Secondo Step:Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo)
N D
ND
ND
HowI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
1. Visualizzazione al microscopio di cellule umane. (12
piastrine 6well con 24 pozzetti contenenti ciascuno
5x10e6 cellule HeLa). (10’)
2. Cenni sulla quantita’ di virus da usare, sul vettore e sul
transgene in uso. (5’)
3. Aspirazione del mezzo di coltura dalle cellule da trasdurre.
(15’)
4. Aggiunta alle cellule del virus ricombinante (2000 opu per
pozzetto in 500ul, tot. 2.4x10e10 opu). ( 15’)
Procedura sperimentale per latrasduzione di DNA in cellule umane
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Parte pratica III (9.30-10-30 e12-13):Analisi della cellula umanageneticamente modificata
Terapia genicaI. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
1.Trasferimento su vetrino delle cellule trasdotte
2.Visualizzazione al microscopio del transgene
(GFP) espresso dalle cellule con microscopio a
fluorescenza
Procedura sperimentale per la visualizzazionedella cellula umana geneticamente modificata
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004
Si ringraziano
Gioia CherubiniStefania Piersanti
Per il prezioso contributo alla parte sperimentale diquesta sezione del corso Open Lab
Terapia genica