TERAPIA GÉNICA: Un nuevo enfoque de la terapeútica

Terapia génica

El objetivo principal de la siguiente presentación es principalmente conocer y comprender una nueva forma de medicina terapéutica basada en la manipulación de material genético que promete ser el remedio a todas los padecimientos que aquejan al ser humano.

TERAPIA GÉNICA

DEFINICIÓN: Es el proceso por el cual se inserta material genético en una célula por medio de vectores, con el fin de hacer que esta produzca una proteína normal.

UTILIDAD: curar enfermedades unigénicas modificar totalmente el sistema inmune

La Terapia génica se realiza con las siguientes acepciones: somática (tratamiento de las células enfermas), germinal (para evitar la transmisión hereditaria de enfermedades) perfectiva (manipula los genes para mejorar ciertas características) eugénica (que busca mejorar cualidades complejas del individuo, tales

como la inteligencia).

Por lo tanto el propósito principal de la terapia génica es:

Cambiar genotipo para mejorar fenotipo

TERAPIA GÉNICA

VECTOR: Es aquel medio transportador que nos permitirá insertar el material genético de interés en las células del paciente en cuestión.

Viral: adeno, herpes, retroTIPOS DE VECTORES: No viral: liposoma transferencia de genes mediante

receptores inyecciones de DNA desnudo bombardeo con partículas de oro

A continuación se describe de forma breve el funcionamiento de cada vector, comenzaremos por los no virales y después por los virales.

Terapia génica

LIPOSOMA: funcionamiento en base a propiedades de carga eléctrica.

-ADN a insertar (-) X fostatos de la doble hélice -lípidos catiónicos o liposoma (vector) (+) -celula (-) X ácido siálico presente en su superficie

lípidos (+) + ADN (-)

Liposoma con ADN (+) + membrana celular(-)

Penetra ADN dentro del liposoma, el vector se unea los fosfolípidos de membrana y se libera el ADNPor lo tanto el DNA evita la degradación por lisosomas celulares

cel

Terapia génica

Liposoma se emplea en: Tx. Fibrosis quística defecto gen CFTR que codifica

proteína que mantiene libre de moco tubos aéreos de pulmones.

ADN a insertar: uno que codifique gen CFTRliposoma catiónico a utilizar: DC-chol/DOPE Cél. diana: cél. tracto respiratorio.R: se impide signos de inflamación o necrosis en el tejido

característicos de la enfermedad.

Esquema donde se muestra diversostipos de lipidos catiónicos utilizados como vectores en la Terapia Génica.

Terapia génica

TRANSFERENCIA DE GENES MEDIANTE RECEPTORES: En este caso al ADN a insertar se le adiciona un ligante (moléculas reconocidas por receptores específicos/tipo celular elegido) y un fusiógeno para evitar su degradación por el lisosoma celular.

ADN + ligantes

ADN penetra X endocitosis

unión endosoma + lisosoma evitada por fusiógenos

ADN entra al núcleo durante la división celular

L célulaR

RL

L

TRANSFERENCIA DE GENES MEDIANTE RECEPTORES se emplea en: El tratamiento de la hipercolesterolemia

problema de hipercolesterolemia: gen codificador de receptores LDL

ADN a insertar: Codificador de receptores para LDLligando: ASOR-PL Receptor ASGPr (hígado)R: colesterol en suero sanguíneo

Nota: Este método a diferencia del liposoma va dirigido contra una célula específica por medio del reconocimiento ligando/receptor.

Terapia génica

INYECCIONES DE DNA DESNUDO: Por este método el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente es directamente inyectado dentro del tejido deseado.

BOMBARDEO DE PARTÍCULAS DE ORO: 1º plásmido de ADN revestido gotas de oro o tungsteno. 2º Estas partículas son aceleradas por una descarga eléctrica y son "

disparadas" hacia el tejido.

Utilizado en: inyección directa en el músculo, del gen que codifica la proteína de matriz del virus influenza A para el Tx. de dicha enfermedad en el ratón.

VECTORES VIRALES

METODOLOGÍA:

Trasfieren

Gen a célula vectores

Eucarionte modificados

En ella “INFECTAN” : vector inicia mecanismos de trascripción y traducción de proteínas normales, pues sus proteínas patógenas fueron reemplazadas por estas anteriormente.

genoma vírico modificado secuencias víricas esenciales

VECTOR VÌRICO DNA de interés

componentes estructura del virión

El DNA o RNA del vectores cortado por enzimas de restricción con el fin

de eliminar zonas patógenas e insertar en el lugar de estas el gen de interés médico

RETROVIRUS

- ARN de cadena sencilla como genoma viral (huesped x TI ADN) - tres genes que codifican:- gag, el grupo específico de antígenos, proteína de la cápsida y de

la matriz - pol , la transcriptasa inversa, proteasa, integrasa. - env , proteínas de la envoltura del virus- LTRs promotor viral- El genoma también incluye secuencias:empaquetamiento del ARN víricocorte y empalme entre donador y aceptor ARNs mensajeros envueltos de forma separada.

Retrovirus

Obtención del Vector: retrovirus naturales se les reemplaza genes estructurales (gag, pol, env), por uno o varios genes terapéuticos deseados.

Expresión de genes terapeúticos estará dirigida por el promotor retroviral (LTR)

estos vectores retrovirales (sin genes estructurales pero con LTR) pueden ser producidos únicamente en unas líneas celulares de empaquetamiento, que son capaces de aportar por transcomplementación las proteínas retrovirales estructurales que son necesarias para la estructura del virión.

-desventaja: solo se integran en células que se replican- ventaja: genes que se integran X retrovirus poseen expresión a largo plazo.

ADENOVIRUS

- Virus no desarrollados que contienen ADN lineal de cadena doble

- El ciclo de infección productiva comprende dos fases, la primera, la más importante para la síntesis del ADN, la segunda, durante la cual las proteínas estructurales y el ADN vírico son ensamblados en viriones.

-cuatro unidades transcripcionales, cada una con su promotor, codifican ARN mensajero empalmados .

- La transcripción es secuencial en la que los genes E1 se expresan pronto, y en parte activan la transcripción de otros genes tempranos .

adenovirus

-E1 rescata células de la quiescencia, dejándolas capaces de sintetizar ADN vírico y proteínas, usando predominantemente las funciones del código del hospedador.

- E2 : replicación del ADN.

- E3 : detener los mecanismos de defensa de la célula hospedadora:anular los efectos de (TNF) en células infectadas bloquear el transporte de MHC I, reduce la presentación de

péptidos víricos.

- E4 regula fase primaria y secundaria del ciclo de vida vírico.

Terapia génica

- Obtención del Vector: se le elimina E1 y E3, crecen en cél. 293 que aportaran por transcomplementación los genes estructurales necesarios para integrar el virión.

- Son capaces de infectar células quiescentes y persisten como DNAs no integrado

- por su baja eficiencia es necesario utilizar virus a títulos muy altos que podrían desencadenar respuesta inflamatoria inespecífica.

- la expresión de la proteína es limitada a solo semanas o meses por la falta de integración del DNA, por esto se requiere readministración que puede desencadenar respuesta inmune y limitar su eficiencia.

ADENOASOCIADOS

- Es un virus muy pequeño, muy simple, no autónomo, que contiene ADN lineal de cadena sencilla. El virus requiere la coinfección con adenovirus u otros para replicarse

- rep, codifica proteínas para replicación e integración. - cap, codifica tres proteínas estructurales víricas.- Los extremos del genoma comprenden repeticiones terminales (TR)

de cerca de 145 nucleótidos- Vector: Contienen sólo las secuencias víricas TR que bordean el

ADN de interés.

HERPESVIRUS

- ADN bicatenario lineal - Dos trozos de ADN bicatenario lineal unidos dando una estructura

única llamadas molécula L y molécula S. Poseen en sus extremos secuencias repetidas terminales ( TRL y TRS ) que son los sitios mediante los cuales permite unirse a las dos moléculas.

- Vector: Contienen sólo las secuencias víricas TRL TRS y DNA de interés.

- Lleva grandes secuencias de ADN - Establece infecciones latentes de larga duración en las cuales el

genoma del virus existe como un episoma con efectos no aparentes en la célula hospedadora

- El herpes virus puede ser una herramienta muy valiosa en células del sistema nervioso central.

- Cél. en reposo.

Terapia génica

APLICACIONES DE LA TERAPIA GÉNICA

Terapia génica

Terapia génica

Distrofia muscular de Duchenne:

                                                

Terapia génica

Terapia génica

Gen codificador de BMP-7 transducido por adenovirus en el Tx. De la osteoporosis.

-OTROS:

-dolor: La expresión en forma continua de preproencefalina en neuronas sensitivas Tx. Dolor cáncer, angina, artritis y neuropatías periféricas.

-Ateroesclerosis: administración de genes que expresan el factor de crecimiento endotelial vascular (revascularizar la pierna).

-Disfx. Eréctil e infertilidad: adm. gen KL-2 que potencia formación y crecimiento de cél. Sertoli (ratas).

-Ceguera: adm. gen RPE95 x virus impide degeneración y reanudación de la actividad eléctrica de la retina (animales).

-Alzhaimer: adm. Gen del factor de crecimiento neurológico (NGF) (monos viejos)

-Parkinson: gen de la descarboxilasa glutámica ácida (GAD)/ cél. hperactivas del núcleo subtalámico.

-Diabetes tipo I: gen PDX-1 hígado produce insulina (rata)

.

Marcadores

Ingeniería Genética

Tecnología del ADN

Fármacos Anti-cáncer

DiagnósticosCultivo de Células Vegetales

Transferencia de genes en animales

Síntesis de Sondas de

ADN

Localización de desórdenes

genéticos

Clonación

Solución de crimenes

Producción de Proteínas humanas

TerapiaGénica

Bancos de ADN, ARN Proteínas

Mapas de Genomas completos

BiologíaMolecular

BiologíaMolecular

Cultivos

CelularesCultivos

Celulares

Anticuerpos Monoclonales

Anticuerpos Monoclonales

Síntesis de Nuevas Proteínas

NuevosAntibióticos

NuevasPlantas yAnimales

NuevosAlimentos

Recursos humanos químicos raros

En investigación criminal y medicina forense, antropología y manejo de vida silvestre. Esto también puede ser usado para detectar secuencias que pueden predisponer a un individuo a enfermedades genéticas tales como muchas formas de cáncer, una forma de HIV, Alzheimer, fibrosis cística, Corea de Huntington y otras condiciones.

HUELLA GENETICA (DNA fingerprinting)

A. Prueba Forense. Usada en 1980 en Gran Bretaña como refuerzo de la ley. En USA hasta 1987. En Virginia, Minnesota, Illinois y Florida, ha exonerado a individuos acusados de asaltos sexuales.

B. Establecimiento de la paternidad. Los patrones de ADN son heredados, la mitad de la madre y la mitad del padre. Para establecer la paternidad, la huella digital genética de la madre, niño y del padre alegado son comparadas.

C. Manufactura. La huella de ADN es usada para asegurar el control de calidad en los seres vivos.

HUELLA GENETICA (DNA fingerprinting)

1. CLONACION2. PRODUCCION DE EMBRIONES PARA TRANSPLANTES3. XENOTRANSPLANTES4. GENOMICA5. PROTEOMICA6. ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE

INVESTIGACIONES EN BIOTECNOLOGIA

Término genérico para la replicación en un laboratorio de genes, células u organismos de una entidad original, con copias genéticas exactas del gen, célula u organismo original. Esta técnica ha producido avances sensacionales en medicinas y vacunas.

También hay investigación en clonación de células humanas, órganos y otros tejidos. Esto puede producir el reemplazo de piel, cartilagos y hueso para victimas de quemaduras y accidentes, o de órganos.

CLONACIÓN

1- Células de una oveja adulta son extraídas y se llevan a un estado de latencia.

2- El núcleo es removido del huevo infertilizado de otra oveja y el núcleo de la oveja donadora es colocado en su lugar.

3- Una pequeña corriente eléctrica sobre el huevo manipulado inicia los mecanismos de fertilización.

4- Hay división celular y comienza el crecimiento y el huevo es implantado en la madre nodriza similar a una fertilización in vitro.

5- El clon es llevado a término y nace la oveja.

COMO CLONARON A DOLLY

En 1997, en la Universidad de Bath crearon embriones de rana sin cabeza, manipulando genes que suprimen el desarrollo de la cabeza, el tronco y la cola.

Esto se puede aplicar a embriones humanos porque los mismos genes realizan funciones similares en ambas especies, y “genéticamente se puede programar el embrión para suprimir el crecimiento en todas las partes del cuerpo, excepto aquellas que se desea, más un corazón y la circulación de la sangre”.

EMBRIONES PARA TRANSPLANTES

Consiste en tomar el núcleo de una célula del paciente adulto y transferirlo a un óvulo humano cuyo núcleo se ha eliminado previamente. El resultado sería un embrión humano clónico (un clon del paciente).

Sin embargo, el embrión no se implantaría en una mujer (lo que daría lugar a un hijo clónico del paciente). Sólo se le dejaría desarrollarse unos días. Luego se elimina para obtener de él las células madre.

CULTIVO DE CELULAS MADRES

XENOTRANSPLANTES

Esta práctica se conoce como xenotransplantación.

Organos de otras especies -cerdos y otros animales - se han convertido en una fuente promisoria para donar órganos para humanos.

PPL Therapeutics anunció que el 5 de marzo de 2000, nacieron cinco cerditas: Millie, Christa, Alexis, Carrel y Dotcom, como resultado de transferencia nuclear (clonación) que tienen inactivado el gen de la alfa 1-3 gal transferasa, cuya azúcar es responsable del rechazo hiperagudo en el órgano transplantado.

PRODUCCIÓN DE XENO ORGANOS

Proyecto Genoma Humano, iniciado en 1990, previsto para el 2007, fue terminado el 26 de Junio de 2000, con la secuenciación del borrador del genoma humano, que contiene unos 100,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Se espera que los científicos tengan las herramientas para encontrar los genes responsables de las enfermedades.

Con la secuenciación del genoma humano, los investigadores pueden mover su enfoque del hallazgo de genes, el cual puede ser manejado a través de la base de datos de la computadora, hacia el entendimiento de la función de dichos genes, a través de la Proteómica.

GENOMICA

La Proteomica: es la clave para entender y tratar a las enfermedades. ”Al entender a las proteínas, los científicos consideran que finalmente podrán resolver los mecanismos bioquímicos básicos fundamentales de las

enfermedades y la salud.” The Wall Street Journal

PROTEOMICA

Inició su desarrollo en la década de los 70s. Con esta tecnología, se pueden aislar los genes, manipularlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

Estas tecnologías son intensivas en conocimiento dependen principalmente del recurso humano calificado, para utilizar adecuadamente la información disponible y requieren infraestructura instalada e inversiones de capital que están al alcance de países como el nuestro.

BIOTECNOLOGIA DEL ADNRECOMBINANTE

Papa con la vacuna que previene la insulinadependencia de la diabetes mellitus 100 vecesmás poderosa que la actual vacuna. Papa con la sub-unidad B antigénica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del cólera). Frijolde soya con anticuerpos que protegen contra elvirus 2 de Herpes simplex (HSV). Tabaco con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.

Alimentos modificados genéticamenteCON VACUNAS INCORPORADAS

Técnica de laboratorio que permite distinguir los 23 pares de cromosomas humanos al mismo tiempo, con cada par de cromosomas pintados en un color fluorescente diferente..Muchas enfermedades están asociadas con anormalidades cromosómicas, ejemplo, células cancerosas exhiben translocaciones. La técnica permite identificar translocaciones u otras anormalidades, cuando un cromosoma está pintado de un color y tiene una pequeña pieza de otro cromosoma pintado de otro color (Access Excellence About Biotech).

CARIOTIPO ESPECTRAL

Las mutaciones, resultan en ciertas enfermedades, y es difícil identificar y caracterizarlas a causa de que los genes tienen muchas regiones en donde las mutaciones pueden ocurrir y causar enfermedad (www.nhgri.nih.gov). Ejemplo, mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, son factores de riesgo de 50-85% de cáncer de mama en la mujer. Hedenfalk et al, usando la tecnología de microarreglos, de 5361 genes identificaron 176 genes que se expresaban diferente en dos tipos de tumor. BRCA1 y BRCA2, expresan diferente tipo de genes, sugiriendo que una mutación heredable influencia el perfil de la expresión génica del cáncer.

TECNOLOGÍA BIOCHIP DE ADN

El microarreglo génico está basado en una base de datos de mas de 40,000 fragmentos de genes llamados Secuencias Expresadas Marcadoras (ESTs).

Cientos o miles de ESTs son arregladas en una lámina de microscopio. Los ARNm de una célula particular son marcados con marcas “tags” fluorescentes que se hibridizan, a los ESTs en la lámina cuando estas secuencias son complementarias a aquellas del ARNm.

Un escaner mide la fluorescencia de cada muestra sobre la lámina, para determinar la actividad de los genes representados por los ESTs que están en la célula

TECNOLOGÍA BIOCHIP DE ADN

HABITAR MAS ALLA DELA TIERRA.

La NASA busca combinar avances en biotecnología y nanotecnología para modificar los genes de las plantas de manera bioregenerativo para que sus células produzcan micro sensores, transmisores y receptores moleculares, que supervisen funciones internas de las plantas e informen sobre su salud, para garantizar una buena cosecha de manera controlable y que produzcan flores y frutos bajo comando. Una idea paralela es diseñar plantas que produzcan sustancias químicas que las protegan del aumento de radiación en el espacio y en planetas con atmósferas poco densas tales como Marte.