PROCESAMIENTO CITOLÓGICO Y TISULAR

TEMA 5Aplicación de técnicas

histoquímicas y enzimohistoquímicas

1. Técnicas de tinción histoquímicas

• La histoquímica se define como: la aplicación de reacciones químicas sobre tejidos histológicos con el fin de localizar y determinar ciertas sustancias o su actividad y microorganismos.

• Se pueden distinguir distintas sustancias químicas que van a ser la base de reacciones que teñirán de distintos colores las sustancias a reconocer en el microscopio:– Hidratos de carbono o glúcidos. Los polisacáridos son

glúcidos formados por la unión de muchas moléculas de monosacáridos (>10).

– Lípidos o grasas.– Proteínas.– Iones y pigmentos.– Microorganismos.

Técnica Tiñe Uso

Azul alcián Mucina ácida: azul, núcleo: rojo, citoplasma: rosa

Identificar mucosustancias

Amarillo alcián Moco: amarillo, bacteria: azul H. Pylori

Azul de toluidina Mastocitos: violeta, fondo :azul Mastocitosis, cistitis

Bodian’sFibras nerviosas y neurofibrillas: negro, núcleo: negro, resto de tejido: azul

Tumores neurales

Diff-Quick (Giemsa modificado)

H. Pylori: azul oscuro, otras bacterias: azul, núcleo: azul oscuro, citoplasma: rosa

Gastritis crónica

Elásticas (Verhoeff-van Gieson)

Fibras elásticas: negro azulado, núcleo: azul a negro, colágeno: rojo

Identificar arterias y venas, elastofibroma

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS MÁS HABITUALES

Técnica Tiñe Uso

Fontana-MassonMelanina, gránulos argentafines y cromafines, lipofuchina: negro; núcleo: rojo

Melanomas y tumores neuroendocrinos

GiemsaBacterias (H. Pylori): azul, parásitos (leishmania, Plasmodium): púrpura, núcleo: azul

Núcleos, bacterias y parásitos

Gram Bacterias Gram+: azul y Gram-: rojo; núcleo: rojo

Bacterias, actinomices, hongos y amebas

Grimelius Gránulos argentafines y argirófilos: marrón oscuro-negro, núcleo:rojo

Tumores neuroendocrinos

Hematoxilina-eosina Núcleo: azul, citoplasma: rosa Tinción de rutina

Hierro coloidal Hierro: azul, citoplasma: rosadoBiopsias de médula ósea y carcinoma cromófobo renal

Mallory, hematoxilina fosfotúngstica

Glía: azul, núcleo: azul, neuronas: rojizo, colágeno: rojizo, fibrina: azul, músculo esquelético: azul

Lesiones neurales y de músculo esquelético

Técnica Tiñe Uso

Mucicarmín Mucina: rojizo, núcleo: negro Adenocarcinomas, criptococos

Oil red, Sudán Grasa: rojo, núcleo: azul Grasa o tejido adiposo

PASMucopolisacáridos, mucinas, membranas basales, coloide y hongos: rojo

Múltiples

PAS-diastasa El glucógeno (mucopolisacárido simple) desaparece

Detecta mucopolisacáridos neutros

Plata metenamina Hongos y neumocistis: negro, tejido: verdoso Infeccioso

Reticulina (Gomori, Gordon-Sweet)

Reticulina: negro, colágeno tipo I: marrón, tipos III y IV: negro

Médula ósea e hígado (fibrosis)

Tricrómico de Masson

Colágeno tipo I: azul oscuro, tipos III y IV: azul claro. Mucina: verde o azul, núcleo: negro, queratina y músculo liso: rojo

Hígado, riñón, …

Técnica Tiñe Uso

Von Kossa Calcio: negro, tejido: rojo Calcio, malacoplaquia

Warthin-Starry

Espiroquetas: negro, bacilos: negro, tejidos: amarillento a marrón claro

Infeccioso

Wrights

Gránulos eosinofílicos: rosa, neutrófilicos: púrpura, citoplasma y linfocitos: azul

Sangre

Ziehl-NeelsenBacilos ácido-alcohol resistentes (TBC):rojo, tejido: azul

Micobacterias

2. Tipos de tinciones histoquímicas• 2.1. Reacciones histoquímicas para hidratos de

carbono.Se basan en la demostración de grupos carbonilo (un átomo de C con doble enlace a uno de O) formados sobre los hidratos de carbono por oxidación previa.Las más importantes son: la técnica de PAS, la del azul alcián, la del azul de toluidina, la del azul alcián-PAS y otros.– 2.1.2. Técnica de PAS (ácido peryódico de Schiff).

Es la más utilizada. Consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido peryódico (HIO4) para incrementar el número de grupos carbonilo (aldehído o cetona) presentes en ellos, de forma que puedan ser mostrados posteriormente. El material PAS positivo se ve rojo oscuro o magenta. Detecta polisacáridos simples (glucosa, celulosa) y complejos (neutros, mucoproteínas). Son negativos los mucopolisacáridos ácidos que no pueden ser oxidados por el ácido peryódico.Se usa para ver moco o sustancias mucinosas, membranas basales y muchos hongos y parásitos. La variante PAS-digestión con diastasa sirve para distinguir si el material PAS positivo es glucógeno, en cuyo caso desaparece con la diastasa.La técnica de PAS se utiliza, por ejemplo, en el diagnóstico de tumores con glucógeno, como el sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma (tumor maligno de músculo estriado) o tumores renales, enfermedades de glomérulos de riñón, adenocarcinomas poco diferenciados o infecciones por hongos.

Corte histológico mostrando gastro-esófago de Barrett con células caliciformes. PAS 40x

Corte histológico mostrando gastro-esófago de Barrett con células caliciformes. H-E 40x

Candidiasis mostrada con la tinción de PAS

– 2.1.2. Azul alcián.Técnica para determinar mucopolisacáridos ácidos. El pH debe estar en torno a 2,4-2,6 y los mucopolisacáridos ácidos (carboxilos y sulfatos) se tiñen de azul. Si se usa un pH inferior a 1 ó 0,5 sólo se tiñen de azul los mucopolisacáridos ácidos sulfatados.Las soluciones empleadas en esta técnica son estables durante dos semanas, aproximadamente y hay que filtrarlas antes de usarlas.

Corte histológico de esófago teñido con azul alcián. Células caliciformes en azul y células columnares en color claro.

Metaplasia pilórica en la mucosa. Azul alcián 100x.

– 2.1.3. Azul de toluidina.Es la técnica de metacromasia más habitual. Indica un cambio de color cuando un colorante puro tiñe una estructura tisular de color diferente al de la solución diluida. Las estructuras responsables de este cambio se llaman cromotropas y pueden ser mucopolisacáridos ácidos, ácidos nucleicos, lípidos de carácter ácido y partículas de sílice. Las sustancias con carácter metacromático se verán de color rojo y el resto se verá en azul. La reacción metacromática presenta grandes variaciones ante pequeñas modificaciones del medio donde se produce.Los baños en alcohol etílico inhiben la metacromasia, por lo que deben realizarse preparaciones testigo.Protocolo:

•Desparafinar e hidratar.•Teñir con azul de toluidina, 2-5 min.•Lavar en solución tamponada.•Tratar los cortes en la solución de molibdato, 10 min.•Lavar con agua.•Deshidratar, aclarar y montar.

Corte histológico de carcinoma cromofóbico de células renales. Tinción de azul de toluidina.

– 2.1.4. Técnica del azul alcián-PAS.Sirve para diferenciar mucopolisacáridos ácidos, neutros y glicoproteínas. Se verán los mucopolisacáridos ácidos de color azul, los mucopolisacáridos neutros y glicoproteínas de color rojo o rosa y el resto de color morado (si se usa hematoxilina).

Técnica del azul alcián-PAS. Mucocitos

epiteliales de color azul, Mucopolisacáridos

neutros y glicoproteínas en rosa. Oreja de mar

haliotis.

– 2.1.5. Otros (hierro coloidal, mucicarmín, etc.).

Técnica de mucicarmín. Biopsia de sinovial. Cápsula

del microorganismo cryptococcus en rojo, 400x.

– 2.1.6. Uso de las diferentes tinciones para mucopolisacáridos:

• MPS neutros: se pueden encontrar en las glándulas del tracto gastrointestinal y en la próstata. Son PAS positivos, pero no se tiñen con azul alcián, hierro coloidal, mucicarmín o colorantes metacromáticos.

• MPS ácido simple (no sulfatado) epitelial: son las mucinas típicas de las células epiteliales que contienen ácido siálico. Se tiñen con PAS, azul alcián a pH 2,5, hierro coloidal y colorantes metacromáticos. Resisten la digestión hialuronidasa.

• MPS ácido simple, mesenquimal: contienen ácido hialurónico y se encuentran en el estroma. Son positivos con azul alcián a pH 2,5, hierro coloidal y colorantes metacromáticos y PAS negativos. Se digieren con ácido hialurónico. Se pueden encontrar en sarcomas.

• MPS ácido complejo (sulfatado) epitelial: típicos de los adenocarcinomas. PAS positivos, azul alcián positivo a pH 1, hierro coloidal, mucicarmín y colorantes metacromáticos también positivos. Resisten la digestión con hialuronidasa.

• MPS ácido complejo, mesenquimal: se encuentra en estroma, cartílago y hueso. Son PAS negativos y positivos con azul alcián a pH 0,5.

• 2.2. Histoquímica de grasas, proteínas y ácidos nucleicos.A pesar de la pérdida de vigencia de los métodos histoquímicos desde la aparición de los inmunohistoquímicos, que permiten caracterizar genéticamente la mayor parte de las proteínas, siguen empleándose algunos:– Rojo Congo: permite detectar la presencia de la

proteína amiloide.

Depósitos amiloides perivasculares teñidos con rojo Congo (x400)

– Fontana-Masson: para detectar la presencia de melanina, gránulos argentafines y cromafines o pigmentos como lipofucsina. Técnica usada para diagnosticar melanomas y tumores neuroendocrinos.

Hiperpigmentación cutánea: aumento del pigmento melánico e

incontinencia pigmenti. H&E (izquierda) y Fontana-

Masson (derecha).

– Grimelius: técnica empleada antiguamente para diagnosticar tumores neuroendocrinos, porque detectaba las proteínas de los gránulos argentafines y argirófilos.

– Reticulina: lás técnicas de reticulina (Gomori, Gordon-Sweet) sirven para distinguir diferentes tipos de colágeno, bien el maduro o tipo I, bien los inmaduros y los tipos III y IV. Se tiñen de marrón los primeros y de negro los últimos (III y IV). También distinguen en negro las membranas basales que tienen colágeno de tipo IV.

Criptococosis renal. Se distinguen los distintos

tipos de colágeno gracias a la impregnación

argéntica de Gomori.

– Tricrómico de Masson: técnica muy utilizada que combina distintos colorantes que tiñen de manera diversa las distintas sutancias: colágeno tipo I de azul oscuro, tipos III y IV de azul claro; mucina de color verde o azul; núcleos de negro o violeta; citoplasma de rosa; queratina, músculo liso y nervios de rojo. Los usos más habituales son en biopsias de hígado, riñón o corazón.

Corte histológico de lengua teñido con la técnica

tricrómica de Masson.

– Reacción de Feulgen: en condiciones normales los ácidos nucleicos se conjugan con proteínas básicas para formar nucleoproteínas, por ello la realización de una hidrólisis ácida permite separar el componente proteico y así poder demostrar la presencia de ácidos nucleicos. Un ejemplo de las técnicas que permiten separar el ADN de otras estructuras es la reacción de Feulgen.

– Sudán y Oil Red O: la identificación de grasa, lípidos o tejido adiposo es importante porque se disuelven con la mayoría de los fijadores durante el procesado. Es mejor usar material en congelación y criostato. Lás técnicas más habituales son Sudán rojo (III y IV) y negro, y Oil Red O.Oil Red O stain showing

abundant intracellular lipid in a renal cell carcinoma .

• 2.3. Métodos para la identificación de pigmentos e iones metálicos.

• 2.3.1. Azul de Perls.Se utiliza para detectar hierro, tanto en forma iónica, formando sales ferrosas y férricas, como ligado a proteínas. Sirve para detectar hemosiderina (pigmento de color amarillo - dorado o pardo y aspecto granuloso o cristalino que deriva de la hemoglobina cuando hay más hierro del necesario en el cuerpo. Consiste en agregados micelares de ferritina, cuya función es servir de reservorio de hierro). Se observa el hierro en azul y los núcleos en rojo. Esta técnica se utiliza en preparaciones de tejidos, frotis de sangre o frotis de médula ósea. Habitualmente se encuentran cantidades minúsculas de ácido férrico en la médula ósea y el bazo. Las cantidades anómalas de hierro pueden indicar hemocromatosis y hemosiderosis. La identificación de falta de hierro puede indicar una anemia por deficiencia.

Protocolo:– Desparafinar e hidratar.– Tratar con la mezcla de ferrocianuro de

potasio al 10% y ácido clorhídrico (10’).– Lavar con agua destilada (el hierro se ve

azul).– Se puede contrastar con una solución rojo

nuclear al 1% durante 2-3’.– Deshidratar, aclarar y montar.

El tiempo de tinción depende de la cantidad de hierro existente en los tejidos.

• 2.3.2. Von Kossa.Se emplea para detectar sales de Ca, tanto el presente en condiciones normales en huesos y dientes, como el que aparece de manera esporádica en diferentes lesiones o áreas de calcificación en tejidos desprovistos de ellas. Se observan los iones calcio o calcificación en negro y los núcleos de las células en rojo.

Protocolo:Desparafinar e hidratar.Tratar con la solución de nitrato de plata al 1% a plena luz durante 30-60’.Lavar con agua destilada.Lavar en solución de tiosulfato al 2,5% durante 5’.Lavado en agua destilada.Contrastar con rojo neutro al 1% durante 2-3’.Deshidratar, aclarar y montar.

Calcificación de la arteria aorta en una iguana.

• 2.4. Técnicas para microorganismos.• 2.4.1. Giemsa.

Tinción muy habitual e importante que está formada por varios colorantes: azul de metileno (colorante metacromático) como tinte básico y eosina como tinte ácido, que dan una amplia gama de colores. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente, según diversos fijadores, en un rango entre 6,4 y 6,9. Se usa para ver con más detalle los núcleos y las características de la cromatina, identificar células cebadas o mastocitos y tinción de bacterias y parásitos. Es especialmente útil para detectar Helicobacter pylori, rickettsias y protozoos.Se observa el citoplasma de color rosa, los núcleos azules, los glóbulos rojos naranja, los gránulos de las células cebadas de color púrpura, las bacterias azules y los parásitos azules.

Tinción de Giemsa en biopsia de mucosa gástrica en la que se observan los bacilos de Helicobacter

pylori.

• 2.4.2. Ziehl Neelsen.Técnica usada para detectar micobacterias, sobre todo bacilos ácido-alcohol resistentes, como el bacilo de Koch, causante de la tuberculosis.

• 2.4.3. Gram.En el tema anterior ya se estudió esta técnica que distingue bacterias grampositivas y gramnegativas, las primeras las tiñe de azul y las segundas de rojo.

• 2.4.4. Plata metenamina y otras técnicas de plata.Técnica usada para detectar hongos y Pneumocystis, que se ven de color negro.

3. Fundamentos, controles y aplicaciones de las técnicas de

histoquímica enzimáticas.

La histoquímica enzimática se basa en la metabolización de un sustrato mediante enzimas. La visualización se realiza con un colorante insoluble combinado con la ventaja de localizar en el microscopio la actividad enzimática. Prácticamente cualquier enzima puede ser detectada. Debido al uso de la inmunohistoquímica y de técnicas de patología molecular, su uso actualmente se ha reducido mucho.

• 3.1. Fundamentos.Ejemplos de bases bioquímicas de las reacciones de histoquímica enzimática:– Vía deshidrogenasa: consiste en quitar dos

átomos de hidrógeno a los sustratos o los compuestos, oxidándose y usando el cloruro de tetrazolio como indicador de esta reacción, lo que produce un cambio de color. La lactatodeshidrogenasa o el succinato deshidrogenasa son fundamentales en el metabolismo de la célula, en el ciclo de Krebs.

– Vía fosfatasa y esterasa: la reacción enzimática quita grupos fosfato o naftilo y en este caso el indicador colorimétrico son sales de diazonio.En el capítulo de inmunohistoquímica se muestra de qué manera se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Las enzimas más frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina. Estas enzimas hacen cambiar de color los sustratos de diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Pueden usarse a la vez, en combinación. Esta reacción enzimática puede hacerse directamente sobre el anticuerpo primario o indirectamente, mediante anticuerpos secundarios o sustancias como biotina.

Todas las técnicas deben tener controles positivos y negativos. Habitualmente se incluye un pequeño cilindro de reactividad conocida en cada porta.

4. Técnicas de tinción para la determinación de enzimas

• En casi todas las técnicas histoquímicas que se han venido utilizando para ver las enzimas y localizarlas en los tejidos, el producto final de la reacción debe ser insoluble. El resultado de estas técnicas puede ser visible en función de tener alguna de las siguientes propiedades:– Opaco a la luz blanca, luz ultravioleta o haz de

electrones en microscopía electrónica.– Luminiscencia, tanto fluorescencia como

fosforescencia.– Incremento del índice refractivo.– Reflectividad (fracción de radiación incidente reflejada

por una superficie).

• 4.1. Manejo de los tejidos.Casi todas las técnicas se realizan con tejido congelado, porque la mayoría de las enzimas se inactivan por fijación con formol. Se recomienda congelar las muestras en hielo seco (CO2) a -80 ºC o en isopentano en un congelador (-25 ºC), en un pequeño tubo Eppendorf (biopsias) o bolsa de plástico (resecciones quirúrgicas).Es importante el espesor mínimo de sección en criostato. Es recomendable realizar cortes finos. En algunas técnicas resulta complicado el uso de controles o muestras de referencia con una actividad enzimática conocida o estandarizada, que suelen estar disponibles comercialmente.

• 4.2. Aplicaciones.– La acetilcolinesterasa es la más comúnmente usada. Es clave

para el diagnóstico de la enfermedad de Hirschprung (enfermedad congénita en la que faltan células del sistema nervioso de la pared del colon).

– La fosfatasa alcalina es una enzima importante en la barrera hematoencefálica, la mucosa dental y el túbulo proximal del riñón. Una disminución de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina indica deterioro funcional grave.

– Un aumento de actividad de la fosfatasa alcalina lisosomal es un marcador temprano de lesiones isquémicas (falta de oxígeno) de los tejidos.

– La clasificación de enfermedades musculares, miopatías y distrofias.

– Las reacciones de histoquímica enzimática más frecuentemente usadas son ATPasa a pH 4,5 y 9,4, deshidrogenasa succínica, NADH, fosforilasa y citocromo C oxidasa (COX).

5. Histoquímica de las lectinas y aplicaciones

• Las lectinas son proteínas que se unen a oligosacáridos o carbohidratos de manera específica y pueden utilizarse como los anticuerpos en inmunohistoquímica para obtener una reacción colorimétrica. Distintos usos en la identificación de carbohidratos característicos de distintos tipos de tejidos como glía, neuronas, epitelios, tejido conectivo, etc., son muy útiles en histología y patología para identificar distintos tipos de tumores.

• Se pueden clasificar según el ligando (sustancia que forma un complejo con una biomolécula) que reconocen:

– Glucosa-manosa: por ejemplo, GNA, LCH, ConA.– Galactosa: por ejemplo, PNA, RCA, VVL.– N-acetilglucosamina: por ejemplo, WGA.– N-acetilglucosamina ácida: por ejemplo, SNA, MAL, MAH.– Fucosa: por ejemplo, UEA (Ulex europeus), AAL.

Los usos podrían agruparse como:– Marcadores tumorales.– Quistes odontogénicos.– Microbiología.– Serología.– Inflamación.