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Técnicas moleculares aplicadas en Bioquímica Clínica-2013
Dra. María Gabriela Lacoste
Alelle-specific oligonucleotide (ASO)-PCR
PCR con Sondas Alelo Específicas
El análisis de mutaciones puntuales utilizandola hibridación de sondas ASO se basa en elprincipio de que la presencia de UN SOLOERROR DE APAREAMIENTO entre unnucleótido de la sonda y el ADN blanco essuficiente para desestabilizar el híbrido.
Una de las primeras técnicas utilizadas parael análisis de mutaciones puntualesCONOCIDAS sobre fragmentos amplificadosde ADN.
SONDAS
Oligonucleótidos cortos (15-17 nucleótidos).
30-50% contenido G/C.
El nucleótido discriminante en el medio de la sonda.
Los errores de apareamiento A:A, T:T, C:T y C:A tienen unefecto más desestabilizante.
Evitar secuencias que contengan polimorfismos cercanos a lamutación ya que pueden desestabilizar el híbrido.
Marcación radioactiva o no radioactiva
interna o externa
Marcación Interna
Desplazamiento de mella (nick translation)
Random primers
Marcación Externa
Polinucleótido quinasa (marcación en extremo 5’, utiliza γ[32P]-ATP)
Transferasa terminal (marcación en extremo 3’,
utiliza α [32P]-ATP)
Marcaciones Radioactiva y No Radioactivas
PCR-ASO
1. Amplificación por PCR del fragmento de interés.
PCR-ASO
2. Dot Blot: transferencia de los productos amplificados a unamembrana.
El producto de PCRse desnaturaliza(NaOH 2N y 95 °C).Se añade a lospocillos donde elvacío impulsa elpasaje de la solucióna través de lamembrana (nylon onitrocelulosa).
La membrana seseca entre filtrosdurante una hora a80° C en estufa (opor cross – linker).
PCR-ASO
3. Hibridación de las sondas ASO marcadas, específicas ycomplementarias para la secuencia de interés.
Pre-hibridación: solución de SDS y ADNde esperma de salmón desnaturalizado.Bloquea la membrana para evitarreacciones inespecíficas (2h a 37°C).
Hibridación: sonda normal y mutada (8ha 37°C).
PCR-ASO
4. Revelado: dependiente de la marcación utilizada.
Interpretación e informe:
Individuo 1: +/- : Heterocigota para la mutación.Individuo 2:-/- : No presenta la mutación.Individuo 3:+/+: Homocigota para la mutación.Individuo 4:+/- : Heterocigota para la mutación.Individuo 5:-/- : No presenta la mutación.Individuo 6:+/+: Homocigota para la mutación.Individuo 7:-/- : No presenta la mutación.Individuo 8:+/+: Homocigota para la mutación.
5. Interpretación e informe.
PCR-ASO
Anemia Falciforme
PCR-ASO
Β-Talasemia
1 2 3 4 5 6 7 8
7: control negativo de la PCR
8: control negativo de hibridación (gen de tiroglobulina)
1: portador de la mutación 1 –1
2: portador de la mutación 1 –1
3: portador de la mutación 1 - 110
4: portador de la mutación 39
5: portador de la mutación 39
6: normal
PCR-ASO es muy útil cuando un gran número de muestras esexaminado para un pequeño número de alelos mutantes.
PCR-ASO necesita de sondas marcadas diferentes para cada alelo ycondiciones de hibridación diferentes para cada sonda.
¿¿Y si necesito analizar múltiples mutaciones???
PCR-ASO-REVERSA
PCR-ASO-REVERSA
1. Inmoviliza la sonda ASO en la membrana (linkers en el extremo 5´).
2. Se hibrida el producto amplificado y marcado por PCR.
Screening de genes con numerosos alelos mutantes : α-talasemia,β-talasemia y fibrosis cística.
VENTAJAS
La PCR-ASO, en especial el su formato reverso, es una técnicasimple para el genotipaje simultáneo de un gran número demutaciones y polimorfismos.
No requiere instrumentos especializados para su realización.
Puede ser aplicado a casi cualquier variación de secuenciaCONOCIDA.
LIMITACIONES
El diseño de sondas que funcionen bajo las mismas condiciones deastringencia e hibridación puede ser engorroso.
La metodología se basa en la posibilidad de introducir mutacionespuntuales durante la reacción de PCR.
Los cambios de secuencia se eligen de modo que generen sitios dereconocimiento para enzimas de restricción sólo en un aleloespecífico.
La técnica fue introducida por Haliassos et al (1989) en Franciapara la rápida detección de mutaciones en el oncogen ras y fueaplicada al diagnóstico de fibrosis cística por Friedman et al (1991).
Uno de los problemas que presenta es la posibilidad de falsosnegativos cuando la enzima, por diferentes razones, no corta(controles).
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Mutación ΔF508 en el gen del CFTR
Utiliza un cebador 5’ con un cambio puntual en una base que limitacon la mutación ∆F508.
Este cambio introduce un sitio para la enzima Mbol (5’GATC3’) en elalelo sano, pero no aparece en el alelo con la deleción ∆F508 por nocompletarse la secuencia de corte.
Para el extremo 3’ se buscó un cebador que permitiera abarcar en elproducto de amplificación un sitio de corte constitutivo para quesirviera como control interno de la actividad de la enzima derestricción.
MboI
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Sin MboI Con MboI
Normal: 262 pb
Mutado: 259 pb
Normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb
Mutado: 215 pb y 44 pb
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Sin corte con la enzima de restricción
Normal: 262 pb Mutado: 259 pb
El tamaño del gel y las condiciones de corrida no son suficientes para detectar estapequeña diferencia.
Heterodúplex: formados por la hibridación de una hebra sana y una mutada durante la PCR.
La falta de una adecuada complementariedad de bases debido a la deleción hace que losheterodúplex migren con dificultad en los geles.
MUTAGENESIS DIRIGIDA POR PCR
Con corte con la enzima de restricción
Los heterodúplex no presentan sitio de corte para Mbol en la hebra con la delección, por lotanto no son cortados y migran por encima del homodúplex
Normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb Mutado: 215 pb y 44 pb
Multiplex Allele Specific-PCR
PCR Multiplex Alelo Específica
Es la amplificación, en un único tubo, de múltiples fragmentos deuna determinada secuencia.
Elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar afragmentos de diferente tamaño, que deberán ser fácilmenteresueltos en una única línea de corrida de un gel.
Los primers usados son alelo-específicos.
Distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, β-talasemia yfibrosis cística
MAS-PCR
Detección de ΔF508 y G542X
MAS-PCR
2 REACCIONESMaster Mix NORMAL
Primers:Forward: CF-W1468-NReverse: CF-508 RP
Forward:5´IVS-11Reverse:G542X-N
Master Mix MUTADA
Primers:Forward: Δ508Reverse: CF-508 RP
Forward:5´IVS-11Reverse:G542X-M
20 µl Master Mix
5 µl ADN
MAS-PCR
WT (139 pb), ΔF508 (136 pb) y G542X (174 pb)
MAS-PCR
Análisis del gen de la distrofina por PCR multiplex, detección dedeleciones. Los números superiores corresponden a cada pacientes. Losnúmeros de la derecha corresponden a los exones amplificados. N: Controlnormal con todos los exones. Paciente 2 presenta deleciones en los exones50 y 52. Paciente 1 presenta deleciones en los exones 50, 47 y 52.Paciente 10 presenta deleción en el promotor Pm. Paciente 7 presentadeleción en el exón 52. Paciente 4 presenta deleción en los exones 3 y 6.Paciente 5 presenta deleción en los exones 43, 13 y 47.
Amplification Refractory Mutation System-PCR
Sistema de Mutación Refractario a la Amplificación por PCR
Detección de mutaciones puntuales.
Fundamento: la amplificación del ADN será ineficiente o completamenterefractaria si hay un error de apareamiento (mismatch) entre el nucleótidodel extremo terminal 3´ del cebador y su correspondiente nucleótido enADN molde.
ARMS-PCR
Se requiere un apareamiento de bases complementario en el extremo 3´del cebador para que la Taq ADN polimerasa pueda amplificareficientemente el fragmento de ADN deseado, permitiendo mayorespecificidad y discriminación por parte de la enzima.
El alelo deseado es amplificado fácilmente mientras que el otro no esamplificado o lo es escasamente.
ARMS-PCR
Para incrementar la especificidad se introduce en ellos un cambio de unabase adicional en el segundo al cuarto (2º-4º) nucleótido del extremo 3’, deeste modo se asegura que cada cebador permita únicamente la amplificacióndel alelo para el que su nucleótido 3’ terminal es complementario.
2 REACCIONESMaster Mix 1
Cebador alelo específico NCebador común
Master Mix 2
ARMS-PCR
Cebador alelo específico MCebador común
Puede utilizarse también un par de primers control, que amplifican unsegmento de ADN diferente, no relacionado a la mutación buscada y que nointerfiera con la amplificación del segmento de interés.
control
ARMS-PCR
ARMS-PCR
Genotipificación de ApoE
Cebadores Alelo Específicos
Cebador común
Cebador control interno
Cebadores Alelo Específicos
Cebador común
Cebador control interno
2 REACCIONES
ARMS-PCR
Genotipificación de ApoE
E2: Cys112 y Cys158E3: Cys112 y Arg 158E4: Arg112 y Arg 158
VENTAJAS:
Relativamente sencillo, rápido y confiable.
No requiere equipo especial (sólo termociclador).
Distingue entre heterocigotos y homocigotos.
No requiere digestión ni secuenciación.
Análisis mediante electroforesis en geles de agarosa opoliacrilamida.
ARMS-PCR
Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)
Paso a Paso:
1. Seleccionar la secuencia de interés2. Seleccionar y diseñar los cebadores
-Fragmentos de diferente tamaño
-Cebadores con características similares (contenido GC, tamaño,T°annealing).
3. Desarrollar la PCR con cada fragmento por separado
-Concentraciones equimolares de los cebadores.
4. Adicionar los cebadores secuencialmente
Ajustar las concentraciones de los cebadores (0,04-0,6 µM).
-El amplicón más corto suele amplificarse preferencialmente.
-Si la intensidad del amplicón es débil, aumentar el primer y si es muyfuerte, disminuirlo.
-Concentraciones muy bajas disminuyen el rendimiento y muy altas,aumentan la inespecificidad.
Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)
Paso a Paso:
6. Ajustar los componentes de la reacción
-Mg2+ (1-2 mM) concentraciones bajas disminuyen el rendimiento yconcentraciones altas aumentan la especificidad y los errores deincorporación.
-dNTPs (200-400 µM) concentraciones más bajas aumentan la fidelidad yla especificidad, pero disminuye el rendimiento.
-Taq
-Cantidad de ADN molde: mucho ADN causa productos inespecíficos oinhibición de la PCR y poco ADN, bajo rendimiento.
6. Ajustar los componentes de la reacción
-Tiempos: extensión se puede aumentar para completar la síntesis detodos los fragmentos.
annealing se puede acortar para aumentar la especificidad.
-Temperatura annealing: temperaturas altas son más específicas peropueden disminuir el rendimiento
temperaturas bajas producen productosinespecíficos por apareamiento inespecífico de los cebadores.
-Ciclos: 28-30
-Aditivos: DMSO, Tritón X-100 (disminuye inespecíficos)
Condiciones para PCR Múltiples (MAS y ARMS)
CONDICIONES PARA MEJORAR LA ESPECIFICIDAD
Mg2+
[dNTPs]
Tiempo de los ciclos
Número de ciclos
[primer]
T° annealing
DISMINUIR AUMENTAR