surditeshereditaires cochlea myosines these

5/5/2018 SurditesHereditaires Cochlea Myosines These - slidepdf.com

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THÈSE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE

Spécialité

GÉNOMIQUE FONCTIONNELLE

Présentée par

Raphaël ETOURNAY

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de L'UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE

Surdités héréditaires: rôles de la myosine VIIa dans le

développement de la cellule sensorielle auditive

soutenue le 12 décembre 2007

devant le jury composé de:

Professeur Daniel VERGÉ Président

Docteur Thomas LECUIT Rapporteur

Professeur Jonathan ASHMORE Rapporteur

Docteur Anne HOUDUSSE Examinateur

Professeur Christine PETIT Directrice de thèse



THÈSE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE

Spécialité

GÉNOMIQUE FONCTIONNELLE

Présentée par

Raphaël ETOURNAY

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR de L'UNIVERSITÉ PIERRE ET MARIE CURIE

Surdités héréditaires: rôles de la myosine VIIa dans le

développement de la cellule sensorielle auditive

soutenue le 12 décembre 2007

devant le jury composé de:

Professeur Daniel VERGÉ Président

Docteur Thomas LECUIT Rapporteur

Professeur Jonathan ASHMORE Rapporteur

Docteur Anne HOUDUSSE Examinateur

Professeur Christine PETIT Directrice de thèse

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Remerciements

Je remercie Christine Petit de m'avoir accueilli dans son laboratoire, mais surtout, de

m'avoir soutenu aux moments de réflexion et de remise en question. Je remercie Dominique

Weil pour sa gentillesse et pour m'avoir pris sous son aile durant mes débuts en biologie

moléculaire, alors qu'elle avait d'autres chats (souris?) à fouetter... Un grand merci à Jean-

Pierre Hardelin, pour ses précieux conseils lors de la rédaction des articles et de la thèse.

Enfin, je remercie tous les membres de l'équipe pour leur écoute, leurs conseils et leur

soutien, qui m'ont permis de mener mes projets dans les meilleures conditions.

Je remercie le professeur Daniel Vergé d'avoir accepté la présidence de mon jury de

thèse. Je remercie le professeur Jonathan Ashmore et le docteur Thomas Lecuit pour avoir

accepté d'être les rapporteurs de ma thèse. Enfin, je remercie le docteur Anne Houdusse pour

sa présence en tant qu'examinatrice.

Je remercie tous les passionnés d'informatique qui développent des logiciels libres

sous licence GPL. J'ai écrit ma thèse sous Linux (http://www.kubuntu-fr.org/), avec la suite

bureautique Open Office (http://fr.openoffice.org/). La bibliographie a été formatée avec lelogiciel Bibus (http://bibus-biblio.sourceforge.net/).

Je remercie la Fondation pour la Recherche Médicale de m'avoir attribué un

financement pour ma quatrième année de thèse.

Enfin, je remercie toute ma famille, et en particulier mes parents, de m'avoir laissé

libre de mes choix, et de m'avoir toujours fait confiance. Cela m'a donné l'élan pour endurer

cette thèse. J'ai une pensée toute particulière pour mon grand-père qui a toujours été fasciné

par les sciences expérimentales, et qui m'a transmis son optimisme et son enthousiasme.

J'espère moi aussi pourvoir lire « Sciences et Avenir » et m'émerveiller jusqu'à l'âge de 96 ans.

Merci à Nathalie, toujours à mes côtés, pour sa patience, sa compréhension, son réconfort

pendant cette course contre la montre.

3

http://www.kubuntu-fr.org/

http://fr.openoffice.org/

http://bibus-biblio.sourceforge.net/












Table des matières

Remerciements........................................................................................................................3

Préambule............................................................................................................................... 6INTRODUCTION....................................................................................................................... 7I- Fonctionnement de la cochlée des mammifères...................................................................8

1/ Les trois compartiments de l'oreille................................................................................82/ Anatomie fonctionnelle de la cochlée.............................................................................9

a) Analyse spectrale par la membrane basilaire...........................................................11b) L'organe de Corti.....................................................................................................13c) Amplification des vibrations cochléaires par les cellules ciliées externes................16

3/ Transduction mécano-électrique auditive..................................................................... 19a) L'endolymphe, un milieu liquidien de composition ionique atypique......................19b) Les cellules ciliées, siège de la transduction mécano-électrique..............................19

c) La régulation de la transduction mécano-électrique auditive: l'adaptation...............21d) La cellule ciliée interne (CCI): l'efficacité des synapses à ruban.............................22II- Les jonctions intercellulaires des cellules épithéliales......................................................23

1/ Le scellement des jonctions intercellulaires requiert un processus actif.......................23a) Une expérience avec des bulles de savon.................................................................23b) Le cytosquelette d'actine est nécessaire au scellement des jonctions ...................... 25

2/ Formation et maturation des jonctions intercellulaires................................................. 27a) Etapes initiales de l'assemblage des jonctions intercellulaires................................. 27b) Rôle de la myosine II dans la maturation des jonctions apicales des cellulesépithéliales ..................................................................................................................34

3/ Autres constituants des complexes d'adhérence intercellulaire.....................................38

a) Les desmosomes......................................................................................................39b) Le complexe nectine-afadine...................................................................................41c) Les jonctions serrées................................................................................................42

4/ Dynamique des jonctions apicales des cellules épithéliales..........................................43a) Anneau d'acto-myosine II........................................................................................43b) Le rôle des myosines non conventionnelles aux jonctions intercellulaires..............48

III- La lame réticulée.............................................................................................................521/ Architecture de la lame réticulée.................................................................................. 522/ Les jonctions intercellulaires de la lame réticulée chez les mammifères adultes..........54

a) Composition des jonctions homotypiques............................................................... 54b) Jonctions hétérotypiques: des jonctions hybrides, de composition atypique............54c) Rôle des myosines aux jonctions intercellulaires de la lame réticulée.....................57d) Aspects mécaniques: les contraintes physiques appliquées sur la lame réticulée.....57

IV- Conclusion de l'introduction...........................................................................................59RESULTATS............................................................................................................................ 62

I- PHR1, un partenaire de liaison de la myosine 1c, pourrait être un chaînon du complexe detransduction mécano-électrique.............................................................................................63

1/ Objectif........................................................................................................................ 632/ Résumé des résultats.................................................................................................... 64

a) PHR1 se lie à la queue de la myosine 1c................................................................. 64b) PHR1 se lie à la queue de la myosine VIIa .............................................................66

c) PHR1 peut se dimériser...........................................................................................67

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3/ Conclusion et perspectives immédiates........................................................................ 68Article 1..................................................................................................................69

II- Shroom2 se lie à la myosine VIIa et à l'actine et pourrait renforcer les jonctionsintercellulaires.......................................................................................................................79

1/ Objectif........................................................................................................................ 79

2/ Résumé des résultats.................................................................................................... 80a) Shroom2 se lie à la queue de la myosine VIIa......................................................... 80b) Shroom2 se lie à ZO1..............................................................................................82c) Shroom2 se lie à la F-actine.....................................................................................83

3/ Conclusion et perspectives........................................................................................... 83Article 2..................................................................................................................85

III- La myosine VIIa façonne la morphologie apicale des cellules sensorielles auditives... ..991/ Objectif........................................................................................................................ 992/ Résultats.......................................................................................................................99

IV- Discussion générale...................................................................................................... 104a) Caractérisation de cette transition jonctionnelle en termes moléculaires............... 105

b) La myosine VIIa peut remodeler les jonctions intercellulaires.............................. 107c) La myosine VIIa pourrait transporter des molécules ou exercer des tensions entre lecytosquelette et la membrane plasmique....................................................................110

GLOSSAIRE ALPHABÉTIQUE DES ABRÉVIATIONS......................................................113RÉFÉRENCES........................................................................................................................115

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Préambule

Parce que dans la cochlée, organe sensoriel de l’audition des mammifères, chaque type

cellulaire n’est représenté que par un tout petit nombre de cellules, les molécules dont le rôle

est essentiel dans son développement et/ou son fonctionnement échappent à toute

caractérisation par des approches de biologie moléculaire et/ou de biochimie. L’approche

génétique qui n’est en rien contrainte par le nombre de molécules ou de cellules impliquées

dans un phénomène donné pouvait à l’inverse être considéré comme prometteuse. C’est pour

cette raison que l’étude des surdités héréditaires a été initiée.

D'après l’analyse de mutants murins, deux protéines, la myosine 1c et la myosine VIIa

pouvaient être considérées comme des composants potentiels de la machinerie de

mécanotransduction. Dans un premier temps, afin d’isoler d’autres composants de cette

machinerie, j’ai recherché les ligands potentiels de la queue de la myosine 1c. Ceci m’a

conduit à étudier une protéine transmembranaire PHR1. Cependant, l’inactivation du gène

correspondant chez la souris ne se manifeste pas par une baisse de l’acuité auditive. En

conséquence, j’ai alors repris l’analyse du phénotype des souris défectueuses dans le gène qui

code la myosine VIIa. L’observation d’anomalies jonctionnelles chez ces souris m’a porté à

m’intéresser au rôle que joue ce moteur moléculaire à cet emplacement. Shroom2 avait été

identifié comme une protéine des jonctions serrées susceptible de se lier à la queue de la

myosine VIIa. En raison des observations que j’avais faites et qui mettaient en évidence pour

la première fois un rôle de la myosine VIIa aux jonctions cellulaires, j’ai décidé de compléter

le travail sur Shroom2 qui avait été initié par une de mes collègues.

J’achève cependant cette thèse avec deux sujets menés en parallèle, car très

récemment nous avons obtenu des indications suggérant un rôle important de PHR1 dans la

physiologie cochléaire.

Cette thèse comporte une introduction sur les jonctions cellulaires dont l’objectif est

de replacer mon second sujet d’étude dans le cadre des connaissances actuelles. Dans le but

de préparer la suite à donner à mes observations préliminaires sur les anomalies jonctionnelles

liées au déficit en myosine VIIa, la discussion se concentre elle aussi sur cet aspect de mon

travail. Les données obtenues sur PHR1 étaient trop récentes pour justifier un développement.

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INTRODUCTION

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I- Fonctionnement de la cochlée des mammifères

L'oreille interne des mammifères comprend la cochlée, organe de l'audition, et le

vestibule, organe de l'équilibration (Figure 1). La cochlée détecte les vibrations sonores etanalyse le spectre fréquentiel qui caractérise un son, tandis que le vestibule détecte les

accélérations dues aux mouvements de la tête de l'individu. Je limiterai mon propos à la

cochlée, sur laquelle a porté mon travail de recherche.

Le son est une onde de pression à laquelle est associée une énergie mécanique, et qui

se propage à des vitesses différentes selon les milieux. Dans l'air, sa vitesse de propagation est

de 340 m.s-1 alors qu'elle est d'environ 1500 m.s-1 dans l'eau. Pour entendre, notre oreille

canalise cette énergie, la transmet à la cochlée, qui la convertit en signaux électriques analysés

le long des voies auditives et au sein du cortex auditif. Ces trois étapes correspondent aux

tâches respectives de l'oreille externe, de l'oreille moyenne et de l'oreille interne.

1/ Les trois compartiments de l'oreille

L'oreille externe se compose du pavillon qui, à la manière d'une antenne parabolique,

qui collecte les radiations électromagnétiques, collecte le son. Elle le fait converger vers le

conduit auditif externe jusqu'au tympan qui marque la limite entre l'oreille externe et l'oreille

moyenne (Figure 1).

L'oreille moyenne est une poche emplie d'air qui communique avec le pharynx par la

trompe d'Eustache (Figure 1). Le son se propage dans l'oreille moyenne par trois osselets en

série et articulés: le marteau, l'enclume et l'étrier. La base du marteau est attachée à la

membrane tympanique. L'apex du marteau est relié à l'enclume par une connexion

ligamenteuse. Le même type de connexion relie l'enclume à l'étrier. La partie plate de l'étrier

s'insère dans la membrane obturant la fenêtre ovale, qui marque la limite entre l'oreille

moyenne et l'oreille interne. L'oreille moyenne a le rôle d'un adaptateur d'impédance en

transmettant le son aérien à la cochlée remplie de liquide, avec un minimum de pertes

énergétiques.

Le mot cochlée vient du grec cochlos, qui signifie escargot. L'intérieur de la cochlée

comprend trois cavités emplies de liquide. En coupe transversale (Figure 2), le compartiment

le plus apical porte le nom de rampe vestibulaire et se situe directement dans le prolongement

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de la fenêtre ovale. Le compartiment le plus basal s'appelle la rampe tympanique et se termine

au niveau de la fenêtre ronde, autre membrane qui sépare la cochlée de l'oreille moyenne. Un

compartiment intermédiaire, le canal cochléaire, sépare les deux autres compartiments sur

toute la longueur de la cochlée; il abrite le neuroépithélium auditif. Les rampes vestibulaire et

tympanique communiquent à l'extrême apex de la cochlée, l'hélicotrème, où le canal

cochléaire s'interrompt. Le canal cochléaire est délimitée par deux membranes élastiques. La

membrane de Reissner sépare la rampe vestibulaire du canal cochléaire. La membrane

basilaire, quant à elle, sépare le canal cochléaire de la rampe tympanique. La membrane

basilaire est une structure complexe qui permet l'analyse spectrale du son.

2/ Anatomie fonctionnelle de la cochléea) Analyse spectrale par la membrane basilaire

Une caractéristique essentielle de la membrane basilaire, dans la cochlée des

mammifères, est de ne pas être uniforme. En effet, les propriétés mécaniques de la membrane

basilaire varient graduellement tout le long de la cochlée (Figure 3A). A l'extrême apex de la

cochlée, la membrane basilaire chez l'homme est environ cinq fois plus large qu'à la base.

Alors que la taille de l'enveloppe cochléaire augmente de l'apex vers la base, celle de la

membrane basilaire au contraire diminue. De plus, la membrane basilaire est fine et lâche à

l'apex, où elle capte les sons graves, mais épaisse et rigide à la base, où elle capte les sons

aigus (Steele & Taber, 1981). Chez l'homme, l'apex de la cochlée détecte les sons graves,

jusqu'à 20 Hz, tandis que la base de la cochlée répond à des sons aigus d'une fréquence

pouvant atteindre 20 000 Hz. Cette analyse des fréquences sonores par la membrane basilaire

est rendu possible par le fait que son déplacement maximal a lieu en un point donné de son

axe longitudinal, déterminé par la fréquence du stimulus. Cette carte fréquentielle est ditetonotopique. C'est en raison des variations continues de ses propriétés mécaniques que la

membrane basilaire peut décomposer un son en ses différentes fréquences constitutives

(fréquence fondamentale et ses harmoniques) selon le principe d'analyse spectrale, inventé par

le mathématicien Joseph Fourier au début du 19ème siècle. Georg von Békésy a pu montrer

expérimentalement, à l'aide d'un stroboscope, que l'onde mécanique résultant d'un son se

propage le long de la membrane basilaire avant d'atteindre son maximum d'amplitude à la

position correspondant à la fréquence de stimulation, et que l'amplitude décroît rapidement au

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delà de ce point (Figure 3B) (Békésy G, 1960, Experiments in hearing, New York : Mc Graw

Hill). Cependant, la relation position/fréquence de la membrane basilaire n'est pas linéaire,

mais logarithmique, si bien que l'intervalle de fréquences [20 Hz-200 Hz] couvre le tiers basal

de la cochlée, celui de [200 Hz-2000 Hz] le tiers central, et celui de [2000 Hz-20 000 Hz] le

tiers apical. L'amplitude de l'onde propagée le long de la membrane basilaire est, quant à elle,

proportionnelle à l'intensité de la stimulation sonore. En conclusion, la membrane basilaire

fonctionne comme un analyseur spectral du son en le décomposant en ses fréquences

élémentaires qui font osciller la membrane basilaire localement, avec un déplacement qui est

proportionnel à leur intensité.

b) L'organe de Corti

L'organe de Corti est le neuroépithélium auditif. Il repose au dessus de la membrane

basilaire (Figure 4). Il contient les cellules sensorielles auditives, dites cellules ciliées en

raison de l'imposante touffe de microvillosités qui se dresse à leur apex, ainsi que les cellules

de soutien. Les cellules ciliées sont elles aussi organisées selon l'axe tonotopique, de telle

sorte qu'elles participent à la sélectivité fréquentielle tonotopique. Leurs propriétés

morphologiques et mécaniques, i.e la longueur du corps cellulaire ainsi que la hauteur et la

rigidité de la touffe ciliaire, varient également selon cet axe.

Les cellules ciliées sont réparties en trois rangées externes de cellules électromotiles,

dites cellules ciliées externes (CCE), qui ont une fonction d'amplification du signal sonore, et

une rangée interne de cellules, dites cellules ciliées internes (CCI), authentiques cellules

sensorielles, qui reçoivent la plus grande part de l'innervation afférente de l'organe de Corti

(Figures 4 et 5A). Les cellules ciliées comportent à leur apex 30 à 300 microvillosités qui

forment la touffe ciliaire (Figures 5B et C). Ces microvillosités très rigides, appelées

stéréocils, sont emplies de filaments d'actine dont le nombre peut excéder un millier. Au sein

de la touffe ciliaire, les stéréocils sont organisés en au moins 3 rangées de taille croissante

(Figure 5B et C). Ils sont solidarisés par des liens fibreux latéraux et un lien apical (tip link ),

ce dernier s’étendant du sommet d’un stéréocil à la face latérale du plus grand stéréocil

adjacent (Figure 5D). Ainsi, c’est l’ensemble de la touffe ciliaire qui est défléchi en réponse à

une stimulation sonore.

Comment une vibration de la membrane basilaire, en une position donnée, conduit-elle

à la déflexion des touffes ciliaires des cellules ciliées? Les cellules ciliées sont « prises en

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sandwich » entre la membrane basilaire, sur laquelle repose l’organe de Corti, et la membrane

tectoriale, gel acellulaire qui le recouvre. Il en résulte que les deux membranes vibrent en

réponse à l'onde sonore (Figure 6). Comme les membranes basilaire et tectoriale ne s'ancrent

pas aux mêmes endroits, les déplacements dûs à leur oscillation se traduisent par un

mouvement de cisaillement de la touffe ciliaire entre la membrane tectoriale et la surface

apicale de l'organe de Corti. Les touffes ciliaires subissent un mouvement de va-et-vient, dont

la direction est perpendiculaire à l'axe tonotopique, rythmé par la fréquence sonore. Cette

déflexion mécanique des touffes ciliaires correspond au stimulus effectif qui s'applique aux

cellules ciliées, qui sont alors dépolarisées lorsque la membrane basilaire monte, et

hyperpolarisées lorsqu'elle descend au cours d'un cycle d'oscillation. Les touffes ciliaires sont

le siège de la transduction mécano-électrique, i.e la transformation de ce message mécanique

en signaux électriques.

c) Amplification des vibrations cochléaires par les cellules ciliéesexternes

Dans ce paragraphe, je limiterai mon propos à l'électromotilité des cellules ciliées

externes (CCE) responsable, en grande partie, de l'amplification des vibrations cochléaires. La

déflexion des stéréocils entraîne une dépolarisation membranaire des cellules ciliées externes et provoque la contraction de leur paroi latérale (Ashmore, 1987; Brownell et al., 1985). Il est

communément admis que la protéine responsable de cette activité contractile est la prestine

(Zheng et al., 2000) (Figure 7). La contractilité des CCE permet l'amplification locale de l'onde

mécano-électrique qui se propage le long de la cochlée, en réponse à une stimulation sonore.

Les CCE prennent appui d'une part, par leur partie basale qui repose sur une cellule de soutien,

et d'autre part, par leur partie apicale et notamment sur les jonctions qu'elles établissent avec les

cellules de soutien au niveau de la lame réticulée (Figure 7). La membrane latérale des CCE,

quant à elle, n'est en contact direct avec aucune autre cellule, ce qui facilite probablement le

mouvement contractile. Il est admis que la contraction des CCE conduit in fine à l'amplification

du mouvement de cisaillement que subissent les touffes ciliaires des cellules ciliées internes

(CCI), augmentant ainsi considérablement (environ 40 dB) la sensibilité et la sélectivité en

fréquence de ces cellules en réponse à une stimulation sonore.

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3/ Transduction mécano-électrique auditive

a) L'endolymphe, un milieu liquidien de composition ionique atypique

La cochlée contient plusieurs compartiments liquidiens de compositions ioniques

différentes. Le canal cochléaire renferme l’endolymphe, riche en potassium (160 mM). Les

rampes vestibulaire et tympanique, quant à elles, renferment la périlymphe, dont les

concentrations ioniques sont assez proches des autres milieux extra-cellulaires (4 mM K +,

1 mM Ca2+, 150 mM Na+). De plus, il existe une différence de potentiel d'environ 80 mV entre

l’endolymphe et la périlymphe, appelée potentiel endocochléaire, qui joue un rôle crucial pour

la transduction mécano-électrique dans les cellules sensorielles auditives. La strie vasculaire

est un épithélium dont le rôle est de maintenir la composition ionique de l'endolymphe et de

générer le potentiel endocochléaire. Au niveau de l’organe de Corti, la barrière entre

l’endolymphe et la périlymphe est assurée par les jonctions intercellulaires serrées de la lame

réticulée, qui est constituée par la surface apicale des cellules sensorielles et de leurs cellules

de soutien (Figure 4 et 5A). Ainsi la touffe ciliaire des cellules sensorielles auditives baigne

dans l'endolymphe, tandis que la partie baso-latérale de ces cellules baigne dans la

périlymphe.

b) Les cellules ciliées, siège de la transduction mécano-électrique

La touffe ciliaire abrite la machinerie moléculaire de transduction mécano-électrique.

Le lien apical et le canal de transduction définissent le site de la machinerie de transduction

mécano-électrique, à l'apex des stéréocils. Selon le modèle du ressort d'ouverture, ( gating-

spring ) (Hudspeth, 1989), la déflexion de la touffe ciliaire en réponse à un stimulus sonore

induirait une tension au niveau des liens apicaux (tip-link) (Figure 8). En raison d'une

interaction de ce lien avec le canal cationique de transduction, ce dernier s’ouvrirait, livrant

passage aux ions K + et, dans une moindre mesure, Ca2+ de l'endolymphe, ce qui dépolarise la

cellule ciliée (Figure 8). Dans les CCE, cette dépolarisation membranaire conduit à la

contraction de la membrane latérale par électromotilité et à l'amplification locale du signal

sonore. Dans les CCI, la dépolarisation membranaire conduit à l’ouverture de canaux

calciques dépendant du potentiel de membrane, situés dans la région baso-latérale de la

cellule. Les ions Ca2+ pénètrent alors dans la cellule, et induisent la fusion des vésicules

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synaptiques avec la membrane plasmique, libérant le neurotransmetteur, le glutamate

(Hudspeth, 1997). Bien que les CCE possèdent quelques afférences, dont le rôle a été très peu

étudié, on pense que seules les CCI transmettent le message sonore vers le cerveau.

c) La régulation de la transduction mécano-électrique auditive:l'adaptation

Comme tous les autres systèmes sensoriels, ce système est doué d'adaptation, c’est-à-

dire que lors d'une stimulation continue, le système sensoriel restaure sa sensibilité à de toutes

petites variations d'intensité du stimulus: les cellules sensorielles se repolarisent pendant une

stimulation prolongée. Dans le cas des cellules ciliées de la cochlée, l'adaptation est liée à la

refermeture des canaux de transduction, situés au sommet des stéréocils, alors même que la

touffe ciliaire est défléchie (Corey & Hudspeth, 1983). On distingue deux modes

d’adaptation: l’un, rapide, est contrôlé par le Ca2+ et l’AMPc (Hudspeth, 1997), l’autre, lent,

également dépendant du Ca2+, ferait intervenir des myosines non-conventionnelles. Howard et

Hudspeth ont été les premiers à stipuler qu'un moteur moléculaire se déplaçant sur les

filaments d'actine (une myosine), pourrait contrôler l'ouverture des canaux de transduction

(Howard & Hudspeth, 1987). La dialyse des cellules sensorielles par plusieurs classes

d'inhibiteurs d'ATPase a renforcé cette idée (Gillespie & Hudspeth, 1993). Gillespie a ensuitemontré, par immuno-histochimie et western blot , que la « myosine 1», c'est-à-dire la

myosine 1c selon la nomenclature actuelle, est non seulement présente dans la touffe ciliaire

des cellules sensorielles du vestibule de la grenouille, mais qu'elle est aussi située à l'apex des

stéréocils, site attendu pour la machinerie de transduction (Gillespie et al., 1993). La co-

localisation de la myosine 1c avec le site de transduction à l'apex des stéréocils a été

confirmée en microscopie électronique à transmission par Garcia et ses collaborateurs (García

et al., 1998). Enfin, le rôle direct du complexe acto-myosine 1c dans l'adaptation a été mis enévidence dans le vestibule de souris exprimant une version de la myosine 1c modifiée pour le

site de fixation à l'ATP. Ainsi la myosine 1c modifiée est la seule myosine de la touffe ciliaire

à pouvoir fixer un analogue de l'ADP, le NMB-ADP (N6 2-méthyl butyl ADP), non

hydrolysable, bloquant ainsi spécifiquement le complexe acto-myosine 1c (Holt et al., 2002).

La myosine VIIa, qui est elle aussi présente dans la touffe ciliaire, a aussi été impliquée dans

l'adaptation (Kros et al., 2002). En absence de myosine VIIa fonctionnelle, la probabilité

d'ouverture des canaux de transduction est diminuée suggérant que la myosine VIIa devrait

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normalement exercer une tension orientée vers l'apex des stéréocils pour maintenir le

complexe de transduction à l'apex.

d) La cellule ciliée interne (CCI): l'efficacité des synapses à ruban

Les CCI possèdent des synapses à ruban. Elles transmettent le message sensoriel aux

terminaisons dendritiques de neurones ganglionnaires afférents, dont la fonction est de

transmettre l'information perçue au niveau de l'oreille vers le noyau cochléaire. Chez les

vertébrés, les synapses à ruban n'ont été observées que dans les systèmes sensoriels. Les

synapses conventionnelles libèrent le neurotransmetteur en réponse à des potentiels d'action,

dont la fréquence traduit la variation de l'intensité de la stimulation. Les synapses à ruban,

quant à elles, répondent à des variations graduelles du potentiel de membrane. De plus, les

synapses à ruban ont aussi une vitesse d'exocytose qui les classe parmi les synapses les plus

rapides.

22



II- Les jonctions intercellulaires des cellulesépithéliales

La jonction d' adhérence est un type particulier de contact intercellulaire basé sur

l'interaction de la membrane avec le cytosquelette (microfilaments d'actine ou filaments

intermédiaires). Elle est requise pour l'adhérence intercellulaire, l'organisation des tissus, et la

communication intercellulaire. La jonction d'adhérence a été caractérisée dans de nombreux

types cellulaires, dans lesquels elle a des fonctions distinctes (Figure 9). Dans les cellules de

Schwann, les jonctions d'adhérence ancrent les membranes sur la boucle paranodale,

contribuant ainsi à l'enroulement successif de myéline autour d'un axone (Fannon et al., 1995;

Uchida et al., 1996). Dans les synapses neuronales, ces jonctions semblent contribuer à laspécificité de la connexion entre neurones (Fannon & Colman, 1996). Dans les cellules du

coeur, ces jonctions relient les myocytes cardiaques de telle sorte que ces cellules se

contractent de manière synchrone (Volk & Geiger, 1986a; Volk & Geiger, 1986b). Enfin, dans

les cellules épithéliales, auxquelles je me limiterai par la suite, les jonctions d'adhérence,

forment en grande partie, une zonula adherens, i.e une ceinture qui épouse le pourtour de la

cellule, et qui sépare la surface apicale de la surface basolatérale. Deux autres complexes

d'adhérence constituent la zonula occludens, i.e les jonctions serrées, à l'apex, et les

desmosomes le long de la surface basolatérale. Ces deux autres complexes ont des

compositions et des fonctions distinctes, qui seront discutées à la fin de ce chapitre. Je

développerai plus particulièrement mon propos sur le système d'adhérence intercellulaire le

plus universel: l'adhérence intercellulaire dépendante du calcium faisant intervenir les

molécules d'adhérence du type cadhérine, et qui conduit à la formation d'une zonula adherens

dans les cellules épithéliales.

1/ Le scellement des jonctions intercellulaires requiert unprocessus actif

a) Une expérience avec des bulles de savon

La formation des contacts intercellulaires s'accompagne nécessairement d'un

changement morphologique des cellules, qui passent d'une forme ronde à une forme

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polyédrique. La notion selon laquelle les cellules s'organisent en des structures qui minimisent

l'aire de leur surface est récurrente. Les similarités de forme entre des agrégats de cellules en

contact et des bulles de savon ont été remarquées depuis longtemps (Thompson DW, On

Growgh and Form, Cambridge Univ Press, 1917). En 1873, Plateau a développé une série de

règles décrivant la géométrie des bulles de savon en interaction les unes avec les autres

(Plateau JAF, Statique expérimentale et théorique des liquides soumis aux seules forces

moléculaires, Gauthier-Villars, Paris, 1873). Il a découvert que, dans des systèmes stables

constitués de bulles de savon, il n'était jamais possible d'observer un point de jonction formé

par plus de trois bulles. En d'autres termes, trois bulles au maximum peuvent avoir un point

d'intersection en commun (sur un support à deux dimensions). La justification physique de ce

phénomène repose sur la minimisation de l'énergie libre de surface d'un groupe donné de

bulles de savon (Taylor, 1976). De plus, Plateau avait remarqué que le point de rencontre de

trois bulles de même taille était le centre d'un cercle dans lequel s'inscrivent les trois bulles

(Figure 10A). Ainsi les trois bulles se rencontrent en un seul point d'intersection, en formant

des angles identiques de 120° en rapport avec la minimisation de l'énergie libre de la surface

globale de ce trio. Il s'agit là d'un système très simple comparé à un système cellulaire. Le

processus physique sous-jacent est très différent de celui d'un système cellulaire. De plus, les

membranes des cellules vivantes ne fusionnent pas en une seule lors de l'établissement des

contacts intercellulaires. Cependant, dans de nombreux tissus, les contacts intercellulaires

semblent adopter une symétrie équivalente à celle obtenue par des bulles de savons en contact

les unes avec les autres (Figure 10A). Cette corrélation suggère que les cellules s'agencent

selon des configurations qui minimisent également leur surface totale. On s'attend alors à ce

que les cellules des épithéliums suivent cette symétrie. En revanche, des formes plus

complexes apparaissent dans des épithéliums où les cellules subissent diverses contraintes

physiques. Bien que les cônes de la rétine de drosophile répondent aux règles de Plateau par

la mise en place d'une régulation génétique fine des molécules d'adhérence du type cadhérine

(Hayashi & Carthew, 2004), le cas des cellules qui constituent l'épithélium sensoriel auditif

n'a pas encore été exploré (Figure 10B).

b) Le cytosquelette d'actine est nécessaire au scellement des jonctions

Adam, Vasioukhin et leur collaborateurs (Adams et al., 1998; Vasioukhin et al., 2000)

ont réalisé, de façon indépendante, une expérience sur deux lignées de cellules épithéliales en

25



26



culture, des cellules MDCK (Madin-Darby canine kidney) et des kératinocytes. Au plan

expérimental, la méthode de choix pour étudier l'assemblage des jonctions consiste à abaisser

la concentration de Ca2+ extracellulaire en dessous de 5 M pour détruire les jonctions

dépendant du Ca

2+

, puis à rétablir la concentration physiologique de calcium extracellulaire pour suivre le réassemblage des jonctions: c'est la méthode dite de « calcium switch ».

Lorsque les cellules poussent en présence d'un milieu sans Ca 2+, les molécules d'adhérence

dépendant du calcium ne sont plus recrutées à la membrane. Les cellules sont alors

individualisées et ne forment plus de contacts intercellulaires: elles ont une forme arrondie

(Figure 10C). Après rétablissement d'une concentration physiologique du Ca2+ dans le milieu

extracellulaire, les molécules d'adhérence dépendant du Ca2+ sont de nouveau adressées à la

membrane plasmique, l'adhérence intercellulaire est alors réactivée. Les cellules adoptent la

forme polyédrique caractéristique, correspondant au rétablissement des contacts

intercellulaires. Cependant, si, en plus du Ca2+, on ajoute de la cytochalasine D, une substance

qui conduit à la dépolymérisation des filaments d'actine, alors les cellules n'adoptent pas la

forme polyédrique caractéristique, bien que les molécules d'adhérence dépendant du Ca2+

soient présentes à la membrane plasmique dans les zones de contact intercellulaire (Figure

10C). En l'absence de filaments d'actine, les contacts ne s'étendent pas le long des membranes

de cellules adjacentes. Cela indique, que contrairement aux bulles de savon, l'extension des

contacts intercellulaires nécessite un processus actif. Ainsi, le cytosquelette d'actine permet de

faciliter le rapprochement des membranes plasmiques de cellules adjacentes. Cette expérience

indique que la formation des jonctions d'adhérence peut être divisée en deux processus: un

processus passif par lequel la présence de molécules d'adhérence à la membrane plasmique

suffit à engager un contact local entre des cellules adjacentes, et un processus actif, qui

requiert un cytosquelette d'actine intègre, pour produire la force nécessaire au rapprochement

des membranes plasmiques de cellules adjacentes (Vasioukhin & Fuchs, 2001).

2/ Formation et maturation des jonctions intercellulaires

a) Etapes initiales de l'assemblage des jonctions intercellulaires

La forme majeure d'adhérence intercellulaire dans le règne animal résulte de

l'association dynamique des molécules de cadhérine, de caténine et des microfilaments

d'actine. Les cadhérines sont des protéines transmembranaires dont les domaines

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extracellulaires, constitués classiquement de 5 ectodomaines, sont engagés dans des

interactions homophiliques dépendant du calcium, en trans avec les cadhérines situées à la

surface de la cellule voisine. Comment les cadhérines sont-elles liées au cytosquelette

d'actine, et comment parviennent-elles à entrer en contact?

En 1988, Nagafuchi et Takeichi ont démontré que la partie cytoplasmique de la

cadhérine est indispensable pour une rapide agrégation cellulaire (Nagafuchi & Takeichi,

1988). Un an plus tard, Ozawa et ses collaborateurs ont identifié les caténines comme ligands

de la partie cytoplasmique de la cadhérine (Ozawa et al., 1989). Ainsi, le modèle

communément accepté proposait que le complexe cadhérine/-caténine s'associe à

l'-caténine qui à son tour recrute les filaments d'actine. En 2005, Drees, Yamada et leurs

collaborateurs montrent que l'-caténine ne peut pas se lier simultanément au complexe

cadhérine/-caténine et au cytosquelette d'actine (Drees et al., 2005; Yamada et al., 2005);

pour revue (Gates & Peifer, 2005). Alors, comment le cytosquelette d'actine, les cadhérines

ainsi que les protéines sous-membranaires associées aux cadhérines s'agencent-elles pour

former les contacts intercellulaires? Cette question n'est pas encore résolue. Néanmoins, il est

clair que les cadhérines sont ancrées au cytosquelette d'actine (Lambert et al., 2002).

L'interaction cadhérine-actine est médiée par un réseau d'interactions protéiques complexe, et

incomplètement connue (Figure 11A).Lors des étapes initiales de l'établissement de contacts intercellulaires, les cadhérines

diffusent librement dans la membrane plasmique (Lambert et al., 2002; Sako et al., 1998)

jusqu'à ce qu'elles se rencontrent sur la même surface, où elles s'assemblent en cis-dimères

par leur domaine extra-cytoplasmique (Brieher et al., 1996; Nagar et al., 1996; Shapiro et al.,

1995). Ces cis-dimères de cadhérines diffusant à la surface de deux cellules adjacentes se

rencontrent pour former des trans-tétramères de cadhérines de même type (Shapiro et al.,

1995). L'interaction homophilique des cadhérines en trans, couplée à l'oligomérisation descadhérines en cis, réduit de plus d'un facteur 10 la diffusion de ces cadhérines, qui se

regroupent en agrégats (clusters) (Adams et al., 1998; Lambert et al., 2002; Thoumine et al.,

2006; Yap et al., 1997). Alors, en combien de temps les contacts intercellulaires se forment-il?

Des mesures de forces réalisées au cours de la formation des contacts intercellulaires,

sur des cellules en suspension exprimant la E-cadhérine, ont permis d'identifier, dans ce

système, trois phases de la cinétique d'adhérence (Chu et al., 2004). La première phase, qui

dure moins de 30 secondes, correspond à l'établissement des contacts initiaux entre deux

28



29



cellules. Il est important de noter que l'ablation de la partie cytoplasmique de la E-cadhérine

n'affecte pas cette phase. De même, la destruction du cytosquelette d'actine n'a aucun effet sur

les contacts initiaux. Les forces mesurées durant cette première phase ne dépendent que des

interactions homophiliques entre E-cadhérines de cellules adjacentes. Il s'agit du processus

passif d'adhérence sus-mentionné. La seconde phase, qui dure environ 30 min, se caractérise

par une rapide augmentation de la force nécessaire à la séparation des cellules. On passe en

effet de 20 nN à 200 nN en 30 min de contact. Au delà de 30 min, c'est-à-dire durant la

troisième phase, la force nécessaire à la séparation de deux cellules augmente peu. Au cours

de ces deux dernières phases, le contrôle de la dynamique du cytosquelette d'actine est

essentiel pour le développement et la stabilisation de l'adhérence intercellulaire. Comment le

cytosquelette est-il agencé aux contacts intercellulaires? Comment la dynamique du

cytosquelette rend-elle compte de l'assemblage des jonctions?

Dans les cellules épithéliales, Zhang et ses collaborateurs ont décrit deux populations

sous-membranaires de microfilaments (Zhang et al., 2005) : (1) des filaments d'actine

jonctionnels, très dynamiques, impliqués dans l'établissement des tout premiers contacts

intercellulaires, et (2) des filaments d'actine périphériques, moins dynamiques, agencés

parallèlement à la membrane plasmique, et dont on ne connaît pas le rôle précis dans

l'établissement des tout premiers contacts intercellulaires (Figure 11B). L'intense

polymérisation des filaments d'actine est cruciale pour l'intégrité des jonctions en formation.

On notera qu'un traitement à la latrunculine B empêche la formation des jonctions, mais n'a

pas d'effet (à cours terme) sur les jonctions matures. De plus, un traitement à la jasplakinolide,

qui stabilise la F-actine, accroît la vitesse de formation des jonctions (Ivanov et al., 2005).

L'incorporation de G-actine dans les filaments d'actine jonctionnels (t1/2 = 3 min) est

légèrement plus longue que dans les lamellipodes (Adams et al., 1996; Adams et al., 1998;

McNeill et al., 1993). La cinétique lente d'incorporation de G-actine dans l'actine périphérique

(t1/2 = 12 min) est similaire à celle observée dans les fibres de stress (Amato & Taylor, 1986).

La forte dynamique de l'actine jonctionnelle permet très probablement aux cellules d'explorer

leur environnement afin d'établir des contacts avec une cellule voisine. Le cytosquelette est-il

le seul à être impliqué dans la formation des premiers contacts?

En plus des microfilaments, les microtubules jouent un rôle important dans

l'assemblage des jonctions d'adhérence (Ligon & Holzbaur, 2007). Les microtubules émanent

des centrosomes, par leur bout (-), et se projettent vers la périphérie de la cellule par leur bout

30



(+) (Figure 11C) (Akhmanova et al., 2001; Gundersen et al., 2004). La dynéine, qui est

recrutée aux contacts intercellulaires d'une manière dépendante de l'actine et indépendante des

microtubules, se lie à la -caténine, et permettrait l'ancrage des microtubules aux jonctions

d'adhérence (Ligon et al., 2001). Cette disposition radiale permet un trafic moléculaire bidirectionnel par l'intermédiaire des moteurs moléculaires de types kinésine et dynéine

(Ligon & Holzbaur, 2007). Les étapes initiales de l'assemblage des jonctions d'adhérence

sont-elles le fruit d'une coordination des cytosquelettes d'actine et de microtubules?

Probablement. En effet, la protéine p120ctn, est associée à la chaîne lourde d'une kinésine, et

transite le long des microtubules vers la périphérie de la cellule (Chen et al., 2003) pour

s'associer in fine avec la partie cytoplasmique des cadhérines (Yap et al., 1998).

Immédiatement après la formation des premiers contacts, la petite GTPase Rac,

recrutée par la p120ctn, active le complexe Arp2/3 nucléateur des filaments d'actine

jonctionnels, et recrute la cortactine à la zone de contact intercellulaire (El Sayegh et al.,

2004; Helwani et al., 2004). L'interaction de la cortactine avec le complexe Arp2/3 accroît la

nucléation de l'actine jonctionnelle et conduit à la formation d'actine branchée. De plus, le

recrutement du complexe VASP/Mena aux jonctions d'adhérence en développement accroît la

polymérisation de l'actine jonctionnelle (Laurent et al., 1999), ce qui a pour conséquence

d'étendre les contacts le long des membranes plasmiques de deux cellules adjacentes. En effet,

la synthèse d'actine branchée, qui conduit à la formations de lamellipodes, produit en grande

partie la force nécessaire pour pousser la membrane plasmique de ces cellules l'une contre

l'autre.

La présence de filopodes est aussi souvent observée aux jonctions d'adhérence en

formation. En effet, la synthèse d'actine jonctionnelle non branchée semble aussi jouer un rôle

important dans l'extension des contacts intercellulaires. La formine-1 (Dia1) est localisée aux

jonctions d'adhérence (Kobielak et al., 2004). Elle se lie à l'-caténine, et elle catalyse la

formation de câbles d'actine jonctionnelle non branchée (Kobielak et al., 2004; Kovar, 2006)

dans une direction radiale, parallèle aux cadhérines. Les microfilaments organisés en câbles

sont maintenus parallèles les uns par rapport aux autres par des protéines de pontage

(crosslinkers) des macrofilaments. La forme dimérique de l'-caténine pourrait entrer en

compétition avec le complexe Arp2/3 en pontant les microfilaments (Drees et al., 2005). De

plus, la vinculine semble aussi pouvoir coopérer avec l'-caténine afin de ponter les filaments

d'actine pour former des câbles (Bakolitsa et al., 2004; Janssen et al., 2006). Les protrusions

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ainsi générées permettraient d'augmenter les zones de contact entre cellules adjacentes,

facilitant l'extension des contacts le long de la membrane plasmique (Figure 11D).

A la dynamique du cytosquelette d'actine jonctionnelle, s'ajoute l'action des moteurs

moléculaires du type myosine, enzymes (activité ATPase) motrices qui se déplacent sur les

filaments d'actine. En effet, immédiatement à la suite de l'interaction en trans de cadhérines,

la myosine II non musculaire est recrutée et activée à la périphérie de la cellule, au niveau de

la seconde population de filaments d'actine périphérique décrite par l'équipe de Zhang (Zhang

et al., 2005), plus stables, et agencés parallèlement à la membrane plasmique. Dans les

cellules fibroblastiques (non polarisées) la myosine II pourrait contribuer à la mise en place de

la tension membranaire (Miyake et al., 2006), favorisant ainsi l'agrégation des molécules de

cadhérines (Delanoë-Ayari et al., 2004; Lambert et al., 2007; Shewan et al., 2005). Dans les

cellules épithéliales, la myosine II ne semble pas jouer de rôle majeur pendant l'établissement

des premiers contacts intercellulaires, bien qu'elle soit essentielle à la maturation de la zonula

adherens, juste après l'établissement de ces premiers contacts (Figure 12 A et B) (Zhang et al.,

2005). Une étude récente indique que la myosine II, et plus particulièrement la myosine IIA, a

tout de même un rôle dans l'établissement des tout premiers contacts intercellulaires (Ivanov

et al., 2007). Cette apparente contradiction peut provenir du fait que Zhang et ses

collaborateurs ont utilisé un inhibiteur de la myosine II (Zhang et al., 2005), qui était donc

présente sous une forme inactive, alors que Ivanov et ses collaborateurs ont supprimé la

myosine IIA par une approche « ARN interférence » (Ivanov et al., 2007). La disparition de la

myosine IIA entraînerait la désorganisation, voire la disparition de la population d'actine

periphérique, modifiant ainsi l'environnement global de l'actine jonctionnelle.

En conclusion, on retiendra deux aspects majeurs de la formation des contacts

intercellulaires: d'une part, l'oligomérisation des cadhérines en cis stabilise les interactions

cadhérine-cadhérine en trans et conduit à la formation d'agrégats de cadhérines, et d'autre

part, le contrôle de la dynamique du cytosquelette d'actine jonctionnelle par les complexes

d'adhérence conduit à accroître et renforcer les contacts intercellulaires. L'actine branchée

(lamellipodes), associée avec Arp2/3, permettrait l'extension des contacts initiaux, tandis que

les câbles d'actine (filopodes) favoriseraient la formation de macro-agrégats de cadhérines au

niveau des filopodes. Le rôle direct de la myosine II dans l'établissement des tout premiers

contacts reste à explorer. Enfin, le dialogue entre les cytosquelettes d'actine et de microtubules

dans l'assemblage des jonctions d'adhérence est une voie de recherche émergente. A l'heure

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33



actuelle, le rôle des microtubules dans l'assemblage des jonctions intercellulaires est très mal

connu.

b) Rôle de la myosine II dans la maturation des jonctions apicales descellules épithéliales

La myosine II non musculaire est une myosine conventionnelle, dont la structure

secondaire comprend trois parties fonctionnelles (Figure 13). La tête motrice (N-terminale) se

lie à la F-actine et hydrolyse l'ATP. Le cou, composé de motifs isoleucine-glutamine (IQ),

constitue le bras de levier, qui amplifie le changement de conformation dû à l'hydrolyse de

l'ATP. La myosine avance en faisant des pas sur la F-actine, en hydrolysant une molécule

d'ATP par pas. Enfin, la queue (C-terminale) peut s'oligomériser avec d'autres queues de

myosine II, créant ainsi des filaments de myosines II. Les motifs IQ de la chaîne lourde (tête

motrice et bras de levier) de la myosine II se lient à deux chaînes légères différentes. Le motif

IQ le plus distal de la tête motrice de la myosine II se lie à la chaîne légère régulatrice (RLC

i.e regulatory light chain, encore appelée sqh i.e spaghetti squash chez la drosophile), tandis

que le motif IQ le plus proximal se lie à la chaîne légère essentielle (ELC, essential light

chain, encore appelée mlc-c chez la drosophile). La RLC promeut l'activité de la myosine II

en levant l'autoinhibition (Craig et al., 1983; Naqvi et al., 2000; Uyeda & Spudich, 1993). La phosphorylation de la RLC augmente l'activité ATPasique de la myosine, ce qui lui permet de

marcher sur les filaments d'actine. D'autre part, la ELC est requise pour la transmission des

changements de conformation durant la production du travail (force x distance) par la

myosine. L'accrochage de l'ELC sur la chaîne lourde de la myosine II stabilise sa structure

tridimensionnelle, et augmente la raideur nécessaire à l'amplification du mouvement produit

par la myosine lors de l'hydrolyse d'une molécule d'ATP (Dominguez et al., 1998; Tyska &

Warshaw, 2002). Quel est le rôle de la myosine II non musculaire dans la formation des

jonctions entre les cellules épithéliales ?

Les cellules épithéliales sont caractérisées par une forte polarité des complexes

d'adhérence, tandis que les fibroblastes et les cellules neuronales sont caractérisés par des

interactions plus labiles, plastiques. Cette différence est probablement le reflet de la

composition des complexes associés aux cadhérines, mais aussi de l'architecture du

cytosquelette. Bien que les étapes initiales de la formation des contacts intercellulaires

semblent communes à tous ces types cellulaires, la maturation des jonctions est assez

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spécifique d'un type cellulaire. En effet, dans le cas des cellules épithéliales, qui acquièrent

une polarité apico-basale, les deux populations d'actine sus-mentionnées se confondent

progressivement en une seule population visible (marquage par la phalloïdine couplée à un

fluorochrome) durant la maturation des jonctions. L'acto-myosine contractile est étroitement

associé aux complexes d'adhérence à l'apex de la cellule (voir figure 11) (Zhang et al., 2005).

Ainsi les complexes d'adhérence matures des cellules épithéliales sont ancrés sur un large

anneau d'actine tangentiel à la membrane plasmique, alors que les complexes d'adhérence

matures de fibroblastes (non polarisés) sont ancrés sur des câbles d'actine radiale,

perpendiculaire à la membrane plasmique (Yonemura et al., 1995) (Figure 14A). Comment

cet anneau est-il positionné à l'apex des cellules épithéliales, en contact étroit avec les

complexes d'adhérence?

Le positionnement de l'anneau d'actine à l'apex est concomitant à la mise en place de

la polarité apico-basale de la cellule épithéliale; pour revue (Hsu et al., 1999; Zahraoui, 2004).

Le processus implique le recrutement du complexe Sec6/8, d'une manière dépendante du Ca2+,

aux sites d'adhérence intercellulaire. Sec6/8 induit un recrutement efficace et spécifique de

vésicules de transport dans la région basolatérale de la membrane. Au fur et à mesure que les

vésicules fusionnent avec la membrane plasmique, la surface membranaire augmente, élevant

ainsi le complexe jonctionnel à l'apex de la cellule (Figure 14B).

Le positionnement de l'anneau d'acto-myosine est également dépendant d'une forte

polymérisation du cytosquelette d'actine couplée à l'activité des myosines II. En effet, la

polymérisation de l'actine est intense durant la formation des jonctions intercellulaires, mais

pas pendant leur maintien (Ivanov et al., 2005). L'inhibition de la polymérisation de l'actine

ou de la myosine II, après le rétablissement d'une concentration physiologique du Ca2+,

conduit nécessairement à l'absence de jonctions intercellulaires matures. En revanche,

l'accélération de la polymérisation de l'actine suite à un traitement par la jasplakinolide

augmente la vitesse de formation des jonctions intercellulaires (Ivanov et al., 2005). Selon le

modèle proposé par Cohen et repris par Ivanov et leurs collaborateurs (Cohen et al., 2004b;

Ivanov et al., 2005), la polarisation des cellules MDCK suite à un calcium switch (voir ci-

dessus, §1b) se déroule en trois principales étapes. La première étape consiste en l'initiation

des contacts intercellulaires. La deuxième étape consiste en la formation d'une polarité

intermédiaire, de type hépatique (en référence à la polarisation des hépatocytes), qui se

caractérise par l'assemblage d'une « pré-membrane plasmique apicale » limitant une lumière

36



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latérale, transitoire (Figure 14C). Dans la troisième étape, cette membrane latérale est alors

transférée à l'apex de la cellule pour former la membrane plasmique apicale. Ivanov et ses

collaborateurs ont montré que si la myosine II est inactivée par la blebbistatine, la troisième

étape ne se produit pas (Ivanov et al., 2005). Cette étude montre clairement le rôle de la

myosine II dans le contrôle de la position de cet anneau d'actine. Par ailleurs, l'augmentation

trop importante de la contractilité suite à la surexpression des petites GTPases RhoA et RhoC,

conduit à la désorganisation des jonctions intercellulaires (Sahai & Marshall, 2002). Cela

indique qu'au sein des épithéliums matures, le maintien des jonctions d'adhérence exige un

juste équilibre entre les forces qui leur sont appliquées.

Des études récentes indiquent que la myosine II ne suffit pas à positionner l'anneau

d'actine. En effet, la protéine cytosolique Par-1 détermine l'emplacement de la lumière

épithéliale en réorganisant le cytosquelette de microtubules (Cohen et al., 2004a). Dans les

cellules non polarisées, les microtubules émanent de la région périnucléaire, où ils sont ancrés

sur les centrosomes par leur bout (-). L'adhérence intercellulaire initiée par les cadhérines

provoquerait le relargage des microtubules dont les bouts (-) seraient d'abord capturés à la

périphérie de la cellule, avant d'être séquestrés à l'apex par des protéines comme la ninéine ou

la -tubuline non centrosomale, toutes deux localisées à l'apex de la cellule épithéliale (Moss

et al., 2007). Le centrosome et l'appareil de Golgi acquièrent une position sous-apicale dans

les cellules polarisées. Dans le cas des cellules épithéliales polarisées en colonne (columnar

epithelial cells), un réseau additionnel de microtubules, composé de courts filaments orientés

aléatoirement, tapisse les surfaces basale et apicale. De plus, un cil primaire, rempli de

microtubules, se dresse à l'apex de ces cellules. Dans le cas des hépatocytes polarisés, les

microtubules sont horizontaux et les bouts (-) sont ancrés au niveau de la lumière latérale

(Figure 14C); ce modèle est présenté dans la revue de Müsch (Müsch, 2004). Par-1 semble

aussi réguler la myosine II, et constituerait ainsi une protéine clé pour la coordination des

cytosquelettes d'actine et de microtubules (Cohen et al., 2007).

3/ Autres constituants des complexes d'adhérenceintercellulaire

L'adhérence intercellulaire médiée par les cadhérines n'est pas seulement critique pour

la formation des jonctions d'adhérence, elle constitue aussi un pré-requis indispensable à

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l'établissement et la maintenance d'autres types de jonctions latérales comme les desmosomes,

les jonctions communicantes (gap junctions), et les jonctions serrées. Les desmosomes ont

une importance majeure dans la résistance aux contraintes physiques que subissent les tissus.

Les jonctions serrées maintiennent la barrière paracellulaire malgré les contraintes

mécaniques imposées aux tissus. Je limiterai mon propos aux desmosomes, aux jonctions

serrées, et aux nectines.

a) Les desmosomes

Un desmosome est une région où les surfaces latérales des cellules adjacentes

apparaissent connectées par une jonction ponctuelle (macula adherens), agissant comme une

sorte de pince à linge qui permettrait de maintenir des cellules ensemble. Du côté

cytoplamisque, les desmosomes sont ancrés sur les filaments intermédiaires du type

cytokératine. Plusieurs protéines ont été identifiées comme composants des desmosomes: les

desmocolines et les desmogléines (cadhérines non classiques) (Figure 15A) (Yin & Green,

2004). A la différence du complexe jonctionnel apical, qui est restreint à l'apex de la cellule,

les desmosomes se répartissent tout le long de la membrane latérale (Figure 15A).

Les jonctions d'adhérence sont les premières à se former. Les cellules exprimant des

composants des desmosomes, mais qui n'expriment pas de cadhérine classique, sont

incapables d'assembler des desmosomes; pour revue (Getsios et al., 2004; Huber, 2003; Yin &

Green, 2004). Malgré tout, les desmosomes peuvent être nécessaires à la maturation des

jonctions (Getsios et al., 2004; Vasioukhin et al., 2000). Les desmosomes sont des complexes

jonctionnels dépendant du Ca2+, qui se coordonnent avec les autres jonctions d'adhérence pour

maintenir l'intégrité mécanique des épithéliums (Yin & Green, 2004). Une étude récente,

réalisée à l'échelle de la molécule unique, indique que la force nécessaire à la séparation (en

tirant à une vitesse de 300 nm.s-1

sur une distance de 300 nm avec un microscope à force

atomique) de desmogléines, interagissant en trans, est voisine de 40 pN comme pour les

cadhérines classiques (Waschke et al., 2007). Les principales différences résident dans

l'affinité pour le calcium (K d=0.8 mM Ca2+ pour les desmogléines, K d=0.72 mM Ca2+ pour les

N-cadhérines, K d=1.1 mM Ca2+ pour les VE-cadhérines) (Baumgartner et al., 2000;

Baumgartner et al., 2003) et dans les propriétés biomécaniques (Panorchan et al., 2006a;

Panorchan et al., 2006b) de ces protéines. Ainsi, le mode général d'interaction en trans des

cadhérines (classiques et desmosomales) varie de manière significative. Les mesures de

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forces, à l'échelle de la molécule unique, permettent de décrire les mécanismes par lesquels

les molécules d'adhérence interagissent en trans. Cependant, tant qu'aucune étude

systématique des cadhérines n'aura été entreprise, il sera très difficile de prédire quelles

cadhérines sont les mieux adaptées pour résister aux contraintes mécaniques (Waschke et al.,

2007). Enfin, les études réalisées à l'échelle de la molécule unique ne rendent pas compte de

la distribution des molécules d'adhérence intercellulaire à la surface de deux cellules en

contact.

b) Le complexe nectine-afadine

Les nectines sont des protéines d'adhérence intercellulaire indépendante du Ca2+, qui

ressemblent à des immunoglobulines. La description des nectines peut se résumer en quatre

points: (i) elles forment des interactions homophiliques et hététophiliques en trans, (ii) elles

sont indirectement connectées au cytosquelette d'actine par leur liaison à l'afadine, une

protéine qui se lie à la F-actine, (iii) elles activent les petites GTPases Cdc42 et Rac, qui

réorganisent les filaments d'actine jonctionnelle, et (iv) elles se lient à Par-3, une protéine

sous-membranaire des jonctions serrées impliquée dans l'établissement de la polarité apico-

basale. En effet, les nectines jouent un rôle dans la formation des jonctions d'adhérence et des

jonctions serrées (Nakanishi & Takai, 2004). Les nectines régulent l'organisation du

cytosquelette d'actine périphérique, d'une part par leur interaction indirecte avec l'-caténine,

l'-actinine et la vinculine, et d'autre part par l'activation de Rac et Cdc42, facilitant ainsi la

formation et probablement le renforcement des jonctions d'adhérence.

Des mesures de forces réalisées à l’échelle de la molécule unique, couplées à des

études biochimiques, indiquent que les nectines interagissent en trans de manière plus rapide

que les cadhérines (Honda et al., 2003; Tsukasaki et al., 2007; Vedula et al., 2007). Ainsi

l’interaction en trans des nectines précèderait celle des cadhérines dans l’initiation des tout

premiers contacts intercellulaires (Figure 15B), et faciliterait l’interaction des cadhérines en

trans. De plus, des mesures de forces réalisées sur des cellules exprimant soit la E-cadhérine,

soit la nectine, suggèrent que les interactions homophiliques impliquant la E-cadhérine sont

les plus résistantes (Martinez-Rico et al., 2005). D’autres études biophysiques sont

nécessaires pour élucider le rôle des nectines dans le renforcement des jonctions

intercellulaires.

41



c) Les jonctions serrées

Les jonctions serrées, aussi appelées zonula occludens (voir figure 15A), sont

principalement présentes dans les cellules épithéliales et les cellules endothéliales. La

morphologie des jonctions serrées, révélée par la technique du freeze-fracture, varie selon les

épithéliums (Hull & Staehelin, 1976; Staehelin, 1973; Staehelin, 1974). Les jonctions serrées

sont composées d’au moins trois types de protéines transmembranaires : l’occludine (Furuse

et al., 1993), les membres de la famille des claudines (Tsukita & Furuse, 2000), et les

protéines d’adhérence de la superfamille des immunoglobines, telles que les molécules

d’adhérence jonctionnelles (JAM) (Martìn-Padura et al., 1998); pour revue (Bazzoni, 2003;

Mandell & Parkos, 2005).

Les jonctions serrées constituent une barrière paracellulaire, dont les propriétés

physiologiques diffèrent selon les épithéliums (résistance électrique, sélectivité de taille et de

charge des solutés). De nombreuses données suggèrent que les claudines sont les composants

prépondérants des jonctions serrées, dont elles modulent la perméabilité; pour revue

(Hartsock & Nelson, 2007). Les profils d'expression des 24 claudines identifiées chez

l'homme et la souris, varient considérablement (Morita et al., 1999). Ces protéines

interagissent en trans par des interactions homophiliques et hétérophiliques (Furuse et al.,

1999; Tsukita & Furuse, 2000).

La plaque cytoplasmique des jonctions serrées est formée par de nombreuses protéines

adaptatrices; pour revue (Hartsock & Nelson, 2007; Matter & Balda, 2003). Parmi elles, les

protéines ZO ( zonula occludens) sous-membranaires (González-Mariscal et al., 2000)

assurent un lien avec le cytosquelette d'actine (Fanning et al., 1998; Fanning et al., 2002;

Wittchen et al., 1999). Comme l'occludine, les protéines ZO sont recrutées à la membrane

avant que la cellule n'ait acquis sa polarité apico-basale, et se confondent alors avec les

constituants de la future zonula adherens. Lorsque la polarité apico-basale est acquise,l'occludine et les protéines ZO ont une distribution restreinte à la zonula occludens. L'absence

cumulée des trois protéines ZO (ZO1 à 3) induit un retard important, à la fois dans la

formation de la zonula adherens, et dans le recouvrement des deux populations d'actine

jonctionnelle et périphérique (Ikenouchi et al., 2007), pré-requis pour la formation des

jonctions serrées.

La plaque cytoplasmique des jonctions serrées se compose aussi de protéines

impliquées dans le trafic vésiculaire (Zahraoui, 2004), et de nombreuses protéines de

42



régulation et de signalisation (Matter & Balda, 2003). Ces protéines sont impliquées d'une

part dans les voies de signalisation contrôlant l'assemblage et la fonction des jonctions

serrées, mais aussi dans celles aboutissant à la polarisation de l'épithélium, la différenciation

cellulaire ou l'expression génique; pour revue (Shin et al., 2006).

Il est maintenant bien établi qu'il existe un couplage étroit entre les microfilaments et

la perméabilité des jonctions serrées. En effet, des traitements par des substances inhibant la

formation des filaments d'actine perturbent la perméabilité des ces jonctions (Madara, 1988;

Madara et al., 1986; Stevenson & Begg, 1994). Plusieurs travaux indiquent que la contraction

de l'anneau périjonctionnel d'acto-myosine agit sur la perméabilité paracellulaire de ces

jonctions; pour revues (Madara, 1998; Turner, 2000; Turner, 2006). La contraction de l'anneau

d'acto-myosine contrôle l'ouverture des jonctions serrées, après l'action du cotransporteur Na+-

glucose (Turner et al., 1997). De plus, la myosine II interagit avec la cinguline, une protéine

sous-membranaire de la plaque cytoplasmique des jonctions serrées, qui interagit avec ZO1, 2

et 3 (Cordenonsi et al., 1999). Ainsi, sous l'effet de la contraction de l'anneau d'acto-myosine,

les jonctions serrées permettent un passage plus important des ions et solutés (Shen et al.,

2006).

4/ Dynamique des jonctions apicales des cellules épithéliales

a) Anneau d'acto-myosine II

La myosine II, en conjonction avec les microtubules, contribue à organiser la zonula

adherens, ainsi que la future zonula occludens, et participe à l'établissement de la forme

polarisée des cellules épithéliales (Ivanov et al., 2005; Stehbens et al., 2006; Zhang et al.,

2005). Si la dynamique des complexes jonctionnels est cruciale à la formation des jonctions et

à l'acquisition de la polarité apico-basale des cellules épithéliales, qu'en est-il de la dynamiquedes complexes jonctionnels apicaux matures? Afin de souligner l'aspect dynamique des

complexes jonctionnels apicaux, je décrirai le rôle de la myosine II dans le désassemblage des

jonctions apicales en conjonction avec les microtubules. Au cours du développement, le

désassemblage des jonctions est nécessaire à la morphogénèse embryonnaire et au

remodelage des tissus. De plus, ce mécanisme permet d'envisager la manière dont le

renouvellement des complexes jonctionnels apicaux s'effectue. Enfin, j’aborderai le rôle des

myosines non conventionnelles dans les mécanismes de l’adhérence intercellulaire.

43



Au plan expérimental, la méthode pour étudier le désassemblage des jonctions consiste

à faire pousser les cellules en présence de 1,8 mM Ca2+ pendant plusieurs jours afin d'obtenir

des jonctions matures, puis à abaisser la concentration de Ca2+ extracellulaire en dessous de

5 M pour détruire les jonctions dépendant du Ca

2+

. C'est une variante de la méthode ducalcium switch décrite en II-1/-b). L'absence de Ca2+ extracellulaire conduit, d'une part à la

contraction de l'anneau d'actine qui encercle les microtubules (Ivanov et al., 2006), et d'autre

part à l'endocytose simultanée des complexes d'adhérence (Ivanov et al., 2004b). Il est

important de noter qu'au sein de cet anneau d'acto-myosine, la chaîne légère de la myosine II

est phosphorylée ce qui témoigne de l'activité de cette myosine au cours du désassemblage

des jonctions (Ivanov et al., 2004a). La contractilité de l'anneau d'acto-myosine est donc

requise non seulement pour la maturation des jonctions, l'acquisition de la polarité apico-

basale, la régulation de la perméabilité des jonctions serrées, mais aussi pour le

désassemblage des jonctions. Cela souligne l'importance d'une régulation fine de la

contractilité de l'anneau d'acto-myosine, afin d'ajuster les forces nécessaires à l'assemblage ou

au désassemblage des jonctions.

Des études pharmacologiques, ainsi qu'une étude génétique récente, décrivent les rôles

simultanés de l'anneau contractile d'acto-myosine et des microtubules dans le désassemblage

des jonctions (Ivanov et al., 2004a; Ivanov et al., 2006; Ivanov et al., 2007). Les résultats

correspondants sont résumés dans le tableau 1.

Tableau 1: l'anneau d'acto-myosine et les microtubules dans le désassemblage des jonctions.

Témoin (sans traitement)

pas d'internalisation des jonctions



pas d'internalisation des jonctions ND ND

BDM (inactive Arp2/3) pas d'internalisation des jonctions


peu d'internalisation des jonctions


Traitement avant changement de [Ca2+] Modification de la [Ca2+] extracellulaire Conséquence sur l'anneau d'actine (<3h)Conséquence sur le complexe jonctionnel apical (<3h)

Forte [Ca2+] > 8j, puis passage à faible [Ca2+]Forte contraction de l'anneau d'actine avec lesmicrotubules à l'intérieur de l'anneau

Internalisation des complexes jonctionnels, qui se localisent avecl'anneau d'actine

Blebbistatine (inhibe la marche des myosines II) Forte [Ca2+] > 8j, puis passage à faible [Ca2+]anneau d'actine en place aux jonctions (noncontractile)

siRNA spécifique de la myosine IIA Forte [Ca2+] 4j, puis passage à faible [Ca2+]Pas d'anneau, mais actine jonctionnelle présenteaux jonctions

CytoD, LatA (dépolymérisent la F-actine) Forte [Ca2+] > 8j, puis passage à faible [Ca2+] actine dépolymérisée

Jasplakinolide (stabilise les bouts pointus= baisse

[G-actine]) Forte [Ca2+

] > 8j, puis passage à faible [Ca2+

]

anneau d'actine en place aux jonctions (peu

contractile)Wiskosta tine (inhib iteur de N-WASP) Forte [Ca2+] > 8j, puis passage à faible [Ca2+]

Forte [Ca2+] > 8j, puis passage à faible [Ca2+]anneau d'actine en place aux jonctions (peucontractile)

Nocodazole (dépolymérise les microtubules) Forte [Ca2+] > 6j, puis passage à faible [Ca2+]anneau d'actine en place aux jonctions (pascontractile)

Docetaxel/Pacitaxel (stabilisent les microtubules) Forte [Ca2+] > 6j, puis passage à faible [Ca2+]anneau d'actine en place aux jonctions (peucontractile)

P-PNP/ATA (inhibiteurs des kinésines) Forte [Ca2+] > 6j, puis passage à faible [Ca2+]anneau d'actine en place aux jonctions (peucontractile)

44



On retiendra quatre principaux paramètres dans le désassemblage des jonctions: (i) la

présence de filaments d'actine dynamiques (polymérisation/dépolymérisation) est

indispensable à la contraction de l'anneau d'acto-myosine; (ii) l'activité de la myosine IIA,

mais pas celle des myosines IIB et IIC, est requise pour la contractilité de l'anneau d'acto-

myosine durant le désassemblage des jonctions; (iii) l'intégrité et la dynamique des

microtubules sont essentiels pour que l'anneau d'acto-myosine puisse se contracter, et (iv)

l'activité des kinésines, et plus particulièrement de la kinésine-1, qui est jonctionnelle, et

cruciale pour la contractilité de l'anneau d'acto-myosine. On notera que la kinésine-1 est un

moteur moléculaire qui se déplace vers les bouts (+) des microtubules. Elle pourrait donc se

déplacer, d'une part, en direction des contacts intercellulaires, dans les cellules épithéliales

non matures (voir figure 11C), pour convoyer la p120ctn et d'autres composants jonctionnels

nécessaires à l'établissement des jonctions intercellulaires, et, d'autre part, dans une direction

opposée aux jonctions intercellulaires, dans les cellules épithéliales matures (voir figure 14C),

afin de participer directement à l'endocytose des complexes jonctionnels apicaux. Enfin, ces

résultats montrent clairement l'importance du dialogue entre les cytosquelettes d'actine et de

microtubules, dans la dynamique d'assemblage et de désassemblage des jonctions

intercellulaires.

Il est maintenant bien établi que la dynamique des jonctions apicales est impliquée

dans la morphogénèse des cellules et des tissus; pour revue (Lecuit & Lenne, 2007). Les

tissus ont deux propriétés contradictoires: ils ont une architecture robuste pour conserver leur

intégrité malgré les contraintes mécaniques extérieures, tout en gardant une remarquable

plasticité nécessaire à leur remodelage. Ainsi, l'homéostasie des tissus repose-t-elle sur un jeu

subtil d'équilibre des forces, qui leur confère à la fois leur rigidité et leur plasticité. Par

exemple, l'augmentation de l'adhérence dépendant des cadhérines peut accroître la surface des

contacts intercellulaires, mais cet effet peut être contre-balancé par l'augmentation de la

tension corticale, suite à la contraction de l'anneau d'actine. La morphogénèse des tissus

durant le développement embryonnaire dépend principalement des forces intrinsèques qui

induisent des modifications locales de la forme cellulaire, bien que les forces extérieures

puissent aussi jouer un rôle (Lecuit & Lenne, 2007). Par exemple, chez les mammifères, la

constriction apicale des cellules épithéliales de l'ectoderme aboutit à la fermeture du tube

neural (Colas & Schoenwolf, 2001). Shroom3, une protéine sous-membranaire à domaine

PDZ qui se lie à l'actine, est capable d'induire cette constriction en augmentant la contractilité

45



de l'anneau d'acto-myosine par l'intermédiaire de ROCK (Hildebrand, 2005), une kinase qui

régule l'activité de la myosine II.

La myosine II joue également un rôle déterminant dans le remodelage des jonctions

intercellulaires durant le processus d'intercalation (Bertet et al., 2004), et pour revue (Lecuit,

2005; Lecuit & Lenne, 2007), pendant les mouvements d'extension-convergence (Figure

16A). L'intercalation cellulaire met en contact deux rangées de cellules qui étaient

initialement séparées par une tierce rangée. Ce « glissement » de cellules nécessite le

remodelage (désassemblage/réassemblage) des jonctions, pendant lequel les cellules changent

de forme. Le tissu reste malgré tout cohésif. Dans ce processus, la myosine II est distribuée de

manière asymétrique dans le plan perpendiculaire à l'axe apico-basal, et elle est

particulièrement abondante, sous sa forme active, aux endroits correspondant au remodelage

des jonctions (Bertet et al., 2004).

Les cadhérines jouent également un rôle majeur dans le contrôle de l'équilibre des

forces. Durant la morphogénèse des ommatidies chez la drosophile, les cellules de la rétine

qui entourent les cônes, et les cônes, s'organisent de telle sorte que les cônes sont maintenus

dans une configuration du type « bulles de savon » (voir §II-1/-a) et figure 10). La

N-cadhérine n'est présente qu'aux jonctions entre cônes, tandis que la E-cadhérine est présente

dans toutes les jonctions de la rétine (Hayashi & Carthew, 2004). Il en résulte que les

jonctions homotypiques cône-cône sont constituées de N- et de E-cadhérine, tandis que les

jonctions hétérotypiques cône-cellule pigmentaire primaire ne sont composées que de

E-cadhérine (Figure 16B). Ainsi, les jonctions hétérotypiques posséderaient davantage de

molécules d'adhérence augmentant leur surface, ce qui minimiserait la surface globale de la

tétrade de cônes (Figure 16B), et permettrait d'obtenir une configuration similaire à celle

observée pour les bulles de savon.

En conclusion, l'anneau d'acto-myosine, par son activité contractile, tend à réduire les

surfaces de contact entre deux cellules adjacentes, contrairement à l'action couplée de la

polymérisation de l'actine jonctionnelle et de l'interaction des cadhérines en trans, qui tend à

étendre les contacts intercellulaires. Ainsi la myosine II contraint les cellules à minimiser leur

surface d'interaction, tandis que les molécules d'adhérence et la polymérisation d'actine

jonctionnelle contraignent les cellules à maximiser leur surface d'interaction (Figure 16C).

Enfin, dans le cas des photorécepteurs de la drosophile, la distribution toute particulière des

N- et E-cadhérines permet d'établir un équilibre des forces avec les myosines II, de telle sorte

46



47



que la surface globale des cônes est minimisée, comme pour des bulles de savon. Du point de

vue de l'évolution, cela correspond-il à une sélection des photorécepteurs les plus compacts?

b) Le rôle des myosines non conventionnelles aux jonctionsintercellulaires

Si la myosine II non musculaire est ubiquitaire, et l'une des plus abondantes dans les

cellules, il existe une grande variété de myosines non conventionnelles, non ubiquitaires. Les

myosines non conventionnelles comportent, comme les myosines conventionnelles, une tête

motrice, un cou et une queue. Les séquences des queues des myosines non conventionnelles

sont particulièrement divergentes (voir figure 13). Contrairement aux myosines II, les

myosines non conventionnelles ne s'assemblent pas en filaments de myosines. Certaines

myosines non conventionnelles sont monomériques, et d'autres sont dimériques. Enfin, les

myosines non conventionnelles sont régulées par la calmoduline, la chaîne légère des

myosines non conventionnelles qui est la mieux étudiée.

La myosine VI joue un rôle, non seulement dans l'adhérence intercellulaire, mais aussi

dans la maintien de la rigidité des cellules épithéliales lors de l'embryogenèse chez la

drosophile (Millo et al., 2004). Une étude récente indique que cette myosine est recrutée aux

jonctions d'adhérence entre cellules épithéliales, lorsque les contacts intercellulairesdeviennent étendus et cohésifs (Maddugoda et al., 2007). La myosine VI serait aussi

nécessaire pour que la vinculine interagisse avec la E-cadhérine. Ce complexe tripartite aurait

pour rôle d'accroître la cohésion des contacts intercellulaires, et de renforcer l'adhérence à

l'apex des cellules épithéliales (Maddugoda et al., 2007).

La myosine VIIa (voir figure 13), quant à elle, ponte les cadhérines avec la vézatine et

pourrait accroître la tension entre la membrane plasmique et le cytosquelette (Küssel-

Andermann et al., 2000b). La vézatine est requise pour étendre les interactions E-cadhérines

dans le développement préimplantatoire de la souris (Hyenne et al., 2005; Hyenne et al.,

2007). De plus, la vézatine, en conjonction avec la myosine VIIa, pourrait activer une voie de

signalisation incluant Arf6 et ARHGAP10, conduisant au contrôle de l'adressage de

l'-caténine aux jonctions intercellulaires (Sousa et al., 2005). La queue de la myosine VIIa se

compose de deux répétions MyTH4-FERM (myosin tail homology 4; F pour 4.1 protein, E

pour ezrin, R pour radixin et M pour moesin)), séparées par un motif SH3 (Src homology 3)

(voir figure 13). Ces différents motifs médient les interactions de la myosine VIIa avec de

48



nombreux autres partenaires de liaison, qui sont listés dans le tableau 2. Il est intéressant de

noter que beaucoup d'entre eux interagissent, ou sont supposés interagir, avec la F-actine.

Parmi eux, shroom2, une protéine des jonctions serrées, pourrait réguler la myosine VIIa,

d'une façon analogue à la régulation de la myosine II par shroom3 (Etournay et al., 2007;

Hildebrand, 2005). De plus, chez le xénope, shroom2 a la propriété d'organiser le

cytosquelette de microtubules en positionnant la -tubuline à l'apex des cellules épithéliales

(Lee et al., 2007). En effet, en l'absence de l'un des membres de la famille shroom, les

microtubules sont désorganisés et leur bouts (-) ne sont plus positionnés à l'apex des cellules

épithéliales. Ainsi, shroom2, en conjonction avec la myosine VIIa, pourrait être à l'interface

des deux cytosquelettes d'actine et de microtubules, qui semblent se coordonner dans la

dynamique (assemblage/désassemblage) des jonctions intercellulaires des cellules

épithéliales. Cette idée est renforcée par le fait que la myosine X possède, elle aussi, un motif

MyTH4-FERM, qui peut interagir directement avec la tubuline (Weber et al., 2004).

Tableau 2: partenaires de liaison de la myosine VIIa.

Experimental evidence

2-hybride Fractionation CoIP Pulldown Direct binding

Actin/rac1? No Yes No No [CC-MyTH4]

?/? Cytoplasm Yes No No No

Vezatin (cytosolic) Actin?/arf6? Yes No Yes Yes No

PHR1 (PH) ?/? ? Yes No Yes No [MyTH4FERM]

?/? No Yes Yes No [SH3]

MyRIP (Nterm) Actin/rab27 Yes No Yes Yes No

Harmonin (PDZ1) Yes No No No

Yes Yes Yes No No [SH3]

Tubulin/ERK2 No No Yes No Yes (bacteria) [SH3]

R1alpha (PKA) Cytoplasm Yes No Yes No Yes (bacteria) [FERM2]

Actin/rab27 Tight juntion Yes No Yes No

Yes No Yes Yes In progress [SH3MyTH4FERM]

Myosine VIIaligands (interaction

region)

cytoskeletoninteraction/

signalingpathway ?

Subcellularlocalization

M7a sub-domaininvolved

M7a-ligandinteractionreferences

Talin (notdissected)

Focaladhesion

Yes (inter.directe)

Tuxworth RI et al.JBC, 2005

Sans (inter ANK3-SAM)

Yes(reticulocytes

)

[CC-MyTH4FERM1]

et [MyTH4FERM2]

Adato A et al. HumMol Gen, 2005

Adherens junction

[FERM2] Küssel-Anderman P

et al EMBO J, 2000

Yes(reticulocytes

)

Etournay R et al.JCS, 2005

Protocadherin 15(cytosolic)

Hair CellBundle

No for theauthors/Yes

for us

Senften M et al. JNeurosc, 2006

Synapticregion andmicrovilli of

RPE

[MyTH4FERM2] El-Amraoui A et al.

EMBO R, 2002

Actin/DOCK4-Rac

Hair CellBundle + actin

rich region

Yes(reticulocytes

)

[MyTH4FERM2] Boëda B et al.

EMBO J, 2002

Keap1/Kelch (kelch

repeats)

Actin/ERK,JNK

,p38

Adherens

junction

Velichkova M et al.Cell Motil Cytoskel,

2002

MAP-2B (notdissected)

microtubulerich region

Todorov P et al.Biochem J, 2001

?/ROCK(Rho),ERK

Küssel-AndermannP et al. JBC, 2000

Shroom2 (interPDZ-ASD1)

Yes(reticulocytes

)

[MyTH4FERM2] Etournay R et al.

JCS, 2007

Sorbs3(alpha/gamma isoincluding Sorbine)

Actin?/ERK,JNK,PKA,rho?

Focaladhesion/adherens junction

Etournay R,unpublished

49



La chaîne lourde de la myosine VIIa comporte 5 motifs IQ qui auraient la capacité de

se lier à la calmoduline, une chaîne légère sensible au calcium (Todorov et al., 2001). Un

excès de calcium provoque une changement de conformation de la calmoduline (Trybus et al.,

2007), qui se décrocherait alors de la chaîne lourde, inhibant ainsi la marche de la

myosine VIIa. Une étude récente, réalisée chez la drosophile, montre que l'ELC peut

s'associer aux motifs IQ d'autres protéines que la myosine II, dont la myosine VI ( jaguar ), la

myosine VIIa (crinkled ) et l'ASP ( Abnormal SPindle), une protéine associée aux microtubules

(Franke et al., 2006). Si l'on suppose que l'interaction de l'ELC avec les myosines VI et VIIa

est également possible chez les mammifères, l'ELC pourrait être le chef d'orchestre de la

dynamique des jonctions intercellulaires dans des cellules exprimant ces myosines, par

exemple les cellules ciliées de l'oreille interne.

En ce qui concerne le rôle de la myosine VIIa dans la morphogénèse apicale des

cellules ciliées de la cochlée, il est alors raisonnable de penser qu'il existe un dialogue entre la

myosine II et la myosine VIIa. On ne dispose actuellement que de très peu d'informations à ce

sujet. Plusieurs études, réalisées chez la drosophile, indiquent que la perte de fonction du gène

de la myosine VIIa conduit à l'apparition de soies multiples, au lieu d'une seule, à la surface

de chaque cellule de l'aile (Gubb et al., 1984; Turner & Adler, 1998). Ce phénotype est à

comparer avec la désorganisation et la fragmentation de la touffe ciliaire des cellules ciliées

de l'oreille interne chez les souris déficientes en myosine VIIa (Gibson et al., 1995; Weil et

al., 1995). Winter et ses collaborateurs ont montré, chez la drosophile, que les myosines II

(zip) et VIIa (crinkled) interagissent génétiquement avec des composants de la voie de

polarité planaire, Frizzled(Fz)/Dishevelled(Dsh), et que cette interaction conduit à des effets

opposés (Winter et al., 2001). En effet, la double mutation Dsh-crinkled conduit à la

suppression du phénotype « soies multiples » observé chez le mutant simple Dsh, tandis que

la double mutation Dsh-zip conduit à l'aggravation de ce phénotype. L'apparente relation

antagoniste entre les myosines II (zip) et VIIa (crinkled) suggère un mécanisme dans lequel

l'équilibre des activités ou la stœchiométrie de ces myosines est critique pour le contrôle du

nombre de soies (une soie par cellule). Winter et ses collaborateurs proposent que les

myosines II et VIIa pourraient partager un régulateur commun, en quantité limitante, requis

pour leur activité (Winter et al., 2001). Ainsi, le fait de supprimer l'une ou l'autre myosine

dérégulerait l'autre, créant un déséquilibre qui conduirait (i) à l'apparition de soies multiples

sur un fond génétique sauvage, ou (ii) à la suppression du phénotype mutant si la

50



myosine VIIa est inactivée sur un fond mutant pour Dsh, ou encore (iii) à l'aggravation du

phénotype mutant si la myosine II est inactivée sur un fond mutant pour Dsh. Il est tentant de

penser que ce régulateur commun est l'ELC. D'autres études sont nécessaires pour établir un

éventuel lien entre les myosines II et VIIa au niveau des jonctions apicales. Cela fait d'ailleurs

partie de mon troisième projet de thèse.

51



III- La lame réticulée

1/ Architecture de la lame réticulée

Le terme « lame réticulée » décrit la mosaïque cellulaire composée des domaines

apicaux des cellules sensorielles et des cellules de soutien, dans l’organe de Corti (Figure

17A). Les cellules sensorielles ne sont pas en contact direct avec les cellules ciliées

adjacentes. Chaque cellule sensorielle établit des jonctions hétérotypiques avec les cellules de

soutien qui l’environnent. Ainsi, chaque cellule ciliée est entourée de quatre cellules de

soutien (Figure 17A et B). Les cellules de soutien forment également des jonctions

homotypiques entre elles. Les jonctions homotypiques et hétérotypiques contiennent des

jonctions serrées, qui constituent une barrière entre l’endolymphe et la périlymphe participant

de fait au maintien du potentiel endocochléaire. On notera également que le périmètre apical

cellulaire engagé dans des jonctions hétérotypiques est plus imporant que celui engagé dans

des jonctions homotypiques, avec un rapport d'environ 6:1 (Figure 17B) (Nunes et al., 2006).

Les vibrations de l'organe de Corti produites par l’onde sonore induisent des forces de

cisaillement qui s’appliquent sur la lame réticulée. Au niveau des CCE, ces forces de

cisaillement, couplées aux forces produites par l’électromotilité de leur paroi latérale,

soumettent la lame réticulée à un stress mécanique. Les jonctions qui unissent les cellules

sensorielles aux cellules de soutien adjacentes, doivent donc être de nature à résister à ces

contraintes mécaniques, tout en conservant la flexibilité nécessaire au système et

l'imperméabilité de l'épithélium. Il faut noter que la distribution de l’actine aux jonctions

hétérotypiques est asymétrique: l’actine est abondante et particulièrement étendue sur la face

jonctionnelle de la cellule de soutien (Raphael et al., 1994). De plus, les cellules de soutien

présentent spécifiquement au niveau de la lame réticulée, un enrichissement manifeste de

faisceaux de microtubules (Pack & Slepecky, 1995) et de cytokératines (filaments

intermédiaires) (Mogensen et al., 1998), qui pourrait renforcer la résistance mécanique de la

lame réticulée aux vibrations.

52



53



2/ Les jonctions intercellulaires de la lame réticulée chez lesmammifères adultes

Bien que plusieurs groupes se soient intéressés à la nature des jonctions qui relient les

cellules de l'épithélium sensoriel auditif, aucun ne disposait des outils nécessaires à une

description fine des ces jonctions (Gulley & Reese, 1976; Raphael & Altschuler, 1991). Ces

études indiquent néanmoins la présence de jonctions serrées et de jonctions d'adhérence. De

plus, les cellules sensorielles dans l'organe de Corti mature ne possèdent ni jonction

communicante, ni desmosome, contrairement aux cellules de soutien; pour revue (Raphael &

Altschuler, 2003). Une étude récente fait une très bonne description des jonctions

homotypiques et hétérotypiques apicales des CCE (Nunes et al., 2006). Par la suite, je

m'appuierai donc essentiellement sur cette étude.

a) Composition des jonctions homotypiques

Les jonctions homotypiques entre deux cellules de soutien ont une structure classique

que l'on retrouve dans beaucoup d'épithéliums. Le complexe jonctionnel apical comprend,

d'une part les jonctions serrées, situées à l'extrême apex des cellules, et qui forment une

zonula occludens, et d'autre part les jonctions d'adhérence, situées au-dessous des jonctionsserrées, et qui forment une zonula adherens (voir figure 15 et figure 17C et D). Des

immunomarquages, réalisés sur explants de cochlée, suggèrent que les marqueurs des

jonctions serrées tels que ZO1, l'occludine, et les claudines 6 et 9, sont présents aux jonctions

homo- et hétérotypiques, mais sont plus abondants aux jonctions homotypiques. Par allieurs,

les marqueurs des jonctions d'adhérence, tels que la E-cadhérine, la -caténine et la p120ctn

sont présents aux jonctions homotypiques. En résumé, les jonctions entre cellules de soutien

sont d'une composition moléculaire tout à fait classique.

b) Jonctions hétérotypiques: des jonctions hybrides, de compositionatypique

Les jonctions qui relient une cellule ciliée à ses quatre cellules de soutien ne sont pas

simplement constituées d'une zonula occludens et d'une zonula adherens, bien que l'on y

retrouve des constituants des jonctions serrées et des jonctions d'adhérence. Globalement, la

54



structure des jonctions hétérotypiques ressemble d'avantage à celle d'une zonula occludens

qu'à celle d'une zonula adherens (Figure 18). En plus des claudines 6 et 9, les cellules

sensorielles possèdent la claudine 14, dont l'expression, au sein de l'organe de Corti, est

restreinte à ces cellules. La distribution de la claudine 14 est limitée à l'extrême apex de la

cellule ciliée, où elle est engagée dans une interaction hétérophilique avec un composant, non

encore identifié, de la cellule de soutien voisine. En revanche, les claudines 6 et 9 semblent

être situées en-dessous de la claudine 14, avec une distribution beaucoup plus étendue.

En ce qui concerne les complexes d'adhérence, on notera l'absence des cadhérines

classiques (E-cadhérine, N-cadhérine, P-cadhérine) dans les cellules ciliées de mammifères

adultes. Cependant, sont présentes la p120ctn, les - et -caténines. La vézatine, qui est

localisée au niveau des jonctions d’adhérence de nombreux épithéliums, où elle s’associe

avec le complexe cadhérine/caténine, est retrouvée au niveau des jonctions hétérotypiques

(Küssel-Andermann et al., 2000b). Ainsi, la vézatine pourrait-elle se substituer, au moins en

partie, à ces cadhérines classiques, dont les domaines extracellulaires sont probablement trop

longs pour entrer dans la composition des jonctions hétérotypiques? La présence du complexe

nectine-afadine n'a pas été explorée dans les cellules ciliées. Alors que la claudine 14 est

restreinte à l'extrême apex de la cellule ciliée, la distribution des claudines 6 et 9 recouvre

celle de la p120ctn et des - et -caténines. Cela suggère que les claudines 6 et 9 pourraient

également se substituer aux cadhérines classiques dans les cellules ciliées. Cette hypothèse est

plausible puisqu'il a été montré que l'expression ectopique des claudines 6 et 9, mais pas de la

claudine 14, peut recruter la -caténine endogène dans des cellules COS-7, qui n'expriment

pas de molécules des jonctions serrées de manière endogène (Nunes et al., 2006).

Les jonctions hétérotypiques sont des jonctions hybrides que l'on pourrait qualifier de

« jonctions d'adhérence serrées ». Comme on le voit schématisé sur la figure 18C, la

claudine 14 constitue des jonctions très serrées à l'extrême apex de la cellule ciliée, tandis que

les autres claudines sont les principaux composants des jonctions serrées homotypiques et

probablement des composants essentiels des jonctions d'adhérence serrées hétérotypiques.

Enfin, la présence des nectines reste à explorer.

55



56



c) Rôle des myosines aux jonctions intercellulaires de la lame réticulée

Selon une étude ancienne, la myosine II associée à la ceinture périphérique d’actine

n’est présente que dans la cellule de soutien (Drenckhahn et al., 1991). La myosine II a été

peu étudiée dans l'organe de Corti, alors qu'on sait maintenant que des mutations dans les

gènes codant les myosines IIA et IIC non musculaires (myh 9 et myh 14) sont responsables de

surdité (Donaudy et al., 2004; Lalwani et al., 2000; Seri et al., 2003). La myosine IIA est

exprimée dans la cochlée, et plus particulièrement dans les quatre rangées de cellules ciliées

de l'organe de Corti, où elle semble présente le long des stéréocils (Mhatre et al., 2006). Quant

à la myosine IIC, elle est également exprimée dans l'organe de Corti, en particulier dans les

cellules ciliées. La localisation intracellulaire de la myosine IIC n'a pas encore été décrite.

Enfin, on ne connaît pas le phénotype cellulaire associé aux mutations de ces myosines,

contrairement aux myosines non conventionnelles dont la fonction est nécessaire à l'audition.

Dans la cellule ciliée, la vézatine s’associe directement avec la myosine VIIa au sein

du complexe jonctionnel (Küssel-Andermann et al., 2000b). Il a été proposé que la

myosine VIIa pourrait, via son interaction avec la vézatine, appliquer une tension sur les

jonctions d’adhérence qui participerait à leur consolidation. L'étude du rôle de la vézatine

dans les jonctions hétérotypiques est en cours au laboratoire. La deuxième partie de mon

travail de thèse m’a conduit à caractériser un nouveau constituant des jonctions serrées de la

lame réticulée. Cette protéine, shroom2, protéine sous-membranaire à domaine PDZ, est un

composant ubiquitaire des jonctions serrées, où elle interagit avec la protéine adaptatrice ZO1.

Fait intéressant, dans la cellule ciliée, shroom2 pourrait s'associer avec la myosine VIIa afin

de consolider ces jonctions (Etournay et al., 2007). Il faut noter que la myosine VIIa est

jusqu'à présent la seule myosine des cellules ciliées pour laquelle un rôle dans l'adhérence

intercellulaire a pu être mis en évidence.

d) Aspects mécaniques: les contraintes physiques appliquées sur lalame réticulée

L'organe de Corti subit la déformation de la membrane basilaire, qui est maximale

dans une zone restreinte (le long de l'axe longitudinal de la cochlée) correspondant à la

fréquence de stimulation (Figure 6). Le mouvement de l'organe de Corti a été étudié sur des

hémicochlées explantées; pour revue (Robles & Ruggero, 2001). Les résultats montrent que

57



l'organe de Corti subit la déformation imposée par la membrane basilaire. Le mouvement est,

en fait, beaucoup plus compliqué que celui décrit dans la figure 6, dont le but était de montrer

le couplage entre la membrane basilaire et la membrane tectoriale, qui conduit à la déflexion

de la touffe ciliaire des cellules ciliées. Ces déformations induisent des tensions aux jonctions

intercellulaires de la lame réticulée. Les jonctions serrées de la lame réticulée sont donc de

nature à subir ces déformations tout en assurant l'étanchéité de l'épithélium. Les cellules de

soutien sont particulièrement riches en actine, microtubules et filaments intermédiaires. Ces

cytosquelettes, et les molécules d'adhérence qui leur sont associées, confèrent probablement à

la lame réticulée ses propriétés, i.e à la fois flexible et imperméable aux charges.

Aux déformations de la lame réticulée, dues au mouvement de la membrane basilaire,

s'ajoutent celles dues au mouvement contractile des CCE électromotiles (voir figure 7). Les

jonctions hétérotypiques qui relient une CCE à quatre cellules de soutien, subissent donc, de

surcroît, des forces de cisaillement, perpendiculaires au plan formé par la lame réticulée. Ces

jonctions impliquent sans doute une composition moléculaire différente de celle des jonctions

des CCI. De plus, ces jonctions sont localisées dans une zone très restreinte à l'apex des CCE,

et ne gênent pas l'électromotilité. Les jonctions hétérotypiques ne comportent pas de

desmosomes, qui jouent pourtant un rôle crucial dans la résistance aux contraintes

mécaniques. Aux jonctions d'adhérence serrées, l'espace inter-membranaire entre une CCE et

une cellule de soutien est très réduit comparé à celui d'une jonction d'adhérence classique. Cet

agencement des claudines n'a-t-il pas pour effet de minimiser l'amplitude du mouvement de

cisaillement imposé par les cycles de contraction/décontraction des CCE? Les claudines

rigidifient probablement la lame réticulée, sans pour autant induire des répercussions sur le

couplage entre la membrane basilaire et la lame réticulée. En effet, la lame réticulée doit être

peu déformable latéralement afin que la force que la membrane tectoriale applique aux

stéréocils ne soit pas amortie par la lame réticulée. Néanmoins, la lame réticulée est

suffisamment flexible pour que le système puisse osciller en réponse à la stimulation sonore

(Nowotny & Gummer, 2006). On se demande alors quel serait le mouvement (et la rigidité)

de la lame réticulée de souris déficientes pour l'une des claudines 6, 9 ou 14 ?

58



IV- Conclusion de l'introduction

La formation, la maturation, et le renouvellement des jonctions intercellulaires, ainsi

que la morphogénèse des tissus, s'accompagne d'importantes tranformations descytosquelettes d'actine et de microtubules. Parmi les gènes responsables de surdité, il n'est pas

surprenant qu'un assez grand nombre soient reliés à la dynamique du cytosquelette d'actine.

Le tableau 3 dresse une liste non exhaustive des gènes de surdité dont la fonction est rattachée

au cytosquelette d'actine, aux jonctions intercellulaires, ou aux deux. En ce qui concerne

l'épithélium sensoriel auditif, beaucoup reste à faire pour comprendre comment les

cytosquelettes d'actine et de microtubules, ainsi que les molécules qui leur sont associées,

s'organisent pour mettre en place les jonctions et la structure mécanoréceptrice des cellules

sensorielles auditives. La myosine VIIa est impliquée dans divers processus cellulaires

permettant la croissance, la cohésion et l’orientation de la touffe ciliaire (communication de

Gaëlle Levèvre)(Self et al., 1998), mais aussi dans la dynamique des jonctions intercellulaires

(Etournay et al., 2007; Küssel-Andermann et al., 2000b). Dans la touffe ciliaire, la

myosine VIIa se lie à l’harmonine b, qui ancre la protocadhérine 15 et la cadhérine 23 au

cytoquelette d’actine. En l’absence de myosine VIIa, l’harmonine b n’est pas adressée à l'apex

des stéréocils, au contraire, elle s’accumule sous la touffe ciliaire (Boëda et al., 2002). De

même, les protéines VLGR1 (very large G protein coupled receptor 1), usherine, whirline et

vezatine ne sont pas adressées à la base des stéréocils, où les liens basaux relient les stéréocils

entre eux. Au contraire, elles s’accumulent autour du corps basal (Michalski et al., 2007). La

myosine VIIa convoie donc vraisemblablement ces molécules dans la touffe ciliaire en

développement, même si son rôle direct de transporteur reste à montrer. Par ailleurs, la

myosine VIIa pourrait exercer des tensions entre le cytosquelette d’actine et la membrane

plasmique afin de maintenir la rigidité et la cohésion de la touffe ciliaire. En effet, on notera

que le relargarge de l’ADP est l’étape limitante du cycle ATPasique de la myosine VIIa de rat

(Inoue & Ikebe, 2003), étape où l’affinité de la myosine pour l’actine est la plus forte. En

accord avec cette observation, la myosine VIIa de drosophile a un duty ratio de 0,8, signifiant

que cette myosine passe 80% du cycle ATPasique attachée aux filaments d’actine (Watanabe

et al., 2006). Kros et ses collaborateurs ont observé, chez des souris déficientes en

myosine VIIa, une hyper-adaptation des courants de transduction, lors d’une déflexion

continue et prolongée de la touffe ciliaire, qui se traduirait par un relâchement de la tension

59



membranaire le long des stéréocils (Kros et al., 2002). Ceci est en accord avec un rôle de

tenseur pour la myosine VIIa. On ne peut cependant pas exclure que cette hyper-adaptation

soit due à l’absence de molécules normalement transportées par la myosine VIIa dans la

touffe ciliaire. Enfin, la myosine VIIa se lie à de nombreux autres partenaires de liaison dont

les protéines jonctionnelles vézatine et shroom2. Aux jonctions intercellulaires, l’absence de

myosine VIIa ne perturbe ni la distribution de vézatine ni celle de shroom2 aux contacts

intercellulaires, elle ne joue donc pas de rôle dans l’adressage de ces protéines aux contacts

intercellulaires. Ce dernier aspect sera discuté dans la discussion générale. La myosine VIIa,

par son rôle dans l'adressage des molécules qui constituent les liens latéraux unissant les

stéréocils, mais aussi par son rôle probable dans la dynamique des jonctions cellulaires,

pourrait être un des chefs d'orchestre possibles de cette symphonie moléculaire.

60



Tableau 3: gènes de surdité dont la fonction est rattachée au cytosquelette d'actine et/ou aux

jonctions intercellulaires apicales.

Gène

Oui

Oui

DIAPH1 (formine1) Oui

?

?

Shroom2 ? Oui Shrm2

Claudine14 ? Oui Claudine14

Claudine11 ? Oui Claudine11

? Oui

?

?

?

Oui

Oui

?

Oui

Oui

Forme de surdité

humaine

Fonction associée a u

cytosquelette

Rôle dans

l'adhérence

intercellulaire ?

Modèles

murins

ACTG1 (actine 1)

(Rendtorff et al.,

2006) et (Zhu et al.,

2003)

Actine branchée ?

Actine (Procaccio et al.,

2006) Actine en câble ?

(Lynch et al., 1997)Nucléateur conduisant à

l'actine non branchée

ESPN (espine) (Naz et al., 2004)Crée des faisceaux

d'actineJerker ( Je)

Harmonine (Verpy et al., 2000) Stabilise la F actine HMN et Dfcr

Stabilise la F actine

(Ben-Yosef et al.,

2003) et (Wilcox et

al., 2001)

(Gow et al., 2004) et

(Kitajiri et al., 2004)

Tricelluline(Riazuddin et al.,

2006)

MYO1A (myosine Ia)

(D'Adamo et al.,

2003) et (Donaudy et

al., 2003)

Moteur moléculaire

associé à la F actine

MYO1C (myosine Ic) (Holt et al., 2002)Moteur moléculaire


myosine Ic

modifiée

MYO3A (myosine IIIa) (Walsh et al., 2002)Moteur moléculaire


MYO6 (myosine VI)(Avraham et al.,

1995)

Moteur moléculaire


Snell’s waltzer

(Sv)

MYO7A (myosine VIIa)(Gibson et al., 1995)

et (Weil et al., 1995)

Moteur moléculaire

associé à la F actineShaker 1 ( Sh1)

MYO15a (myosine XVa)(Probst et al., 1998)

et (Wang et al., 1998)

Moteur moléculaire

associé à la F actineShaker 2 ( Sh2)

MYH9 (myosine IIA non

musculaire)

(Lalwani et al., 2000)

et (Seri et al., 2003)

Moteur moléculaire


MYH14 (myosine IIC non

musculaire)

(Donaudy et al.,

2004)

Moteur moléculaire


61



RESULTATS

62



I- PHR1, un partenaire de liaison de lamyosine 1c, pourrait être un chaînon du complexede transduction mécano-électrique

1/ Objectif

Les études génétiques ont mis en lumière le rôle essentiel de certaines myosines non

conventionnelles dans l’oreille interne. En effet, des mutations dans les gènes codant les

myosines 1a, IIIa, VI, VIIa et XVa causent une surdité chez l’homme; pour revue (Petit,

2006). Aucune étude n’a cependant permis d’associer une mutation du gène de la myosine 1c

à une surdité chez l’homme. Mon intérêt s’est porté sur deux myosines, la myosine 1c et lamyosine VIIa, dont certains travaux indiquent qu'elles pourraient être des composants de la

machinerie de transduction mécano-électrique (Gillespie et al., 1993; Gillespie & Hudspeth,

1993; Holt et al., 2002; Kros et al., 2002). En effet, lorsque j'ai débuté mon travail de thèse, le

rôle de la myosine 1c dans l'adaptation lente (voir introduction) de la transduction mécano-

électrique vestibulaire venait juste d’être mis en évidence par l’inactivation chimique du

complexe acto-myosine 1c dans des cellules sensorielles de la souris (Holt et al., 2002). En ce

qui concerne la myosine VIIa, son déficit chez l’homme provoque le syndrome de Usher detype IB (Gibson et al., 1995; Weil et al., 1995). Ce syndrome se caractérise par une surdité

congénitale associée à une dégénérescence rétinienne progressive. Le rôle de cette myosine

dans l'adaptation lente de la transduction mécano-électrique auditive venait aussi d’être

rapporté (Kros et al., 2002). Je disposais cependant de beaucoup plus de données

expérimentales issues de la littérature appuyant le rôle de la myosine 1c dans l'adaptation,

c'est pourquoi je me suis initialement focalisé sur cette myosine. D'un point de vue

mécanistique, comment la myosine 1c pourrait-elle exercer une tension sur le complexe de

transduction? Est-ce directement sur le canal de transduction, ou sur la membrane plasmique

au voisinage du canal de transduction? La recherche des partenaires de liaison de la queue de

la myosine 1c, permettrait d'identifier le canal de transduction, dont on ne connaît toujours

pas l'identité génétique, ou d'identifier une protéine qui pourrait relier le complexe acto-

myosine 1c à la membrane plasmique. Par ailleurs, un partenaire de liaison de la myosine 1c

serait un excellent gène candidat impliqué dans une surdité héréditaire. Cette approche ouvre

ainsi la voie à l'identification de nouveaux gènes de surdité. Par conséquent, la recherche de

63



partenaires de liaison de la myosine 1c m'a semblé très prometteuse pour progresser dans la

compréhension du fonctionnement de la cellule sensorielle auditive.

2/ Résumé des résultatsa) PHR1 se lie à la queue de la myosine 1c

La myosine 1c se compose d'un domaine moteur qui inclut les sites de fixation de

l'ATP et de liaison à la F-actine, d'un cou contenant trois motifs IQ qui se lient à la

calmoduline avec une haute affinité, et d'une queue riche en résidus basiques chargés

positivement (voir figure 13). Un quatrième motif IQ situé immédiatement en C-terminal des

trois précédents, peut aussi se lier à la calmoduline avec une affinité faible (Gillespie & Cyr,

2002). Comme la queue des myosines non conventionnelles est très divergente d'une myosine

à l'autre (Oliver et al., 1999), j'ai utilisé un fragment C-terminal de la myosine 1c, couvrant le

quatrième IQ et la queue, comme point d'entrée dans cette quête de partenaires de liaison. J'ai

alors utilisé la méthode du double-hybride dans la levure, pour cribler une banque d'ADNc de

vestibules de souris âgées de 2 à 6 jours (Boëda et al., 2002), avec le fragment de la

myosine 1c, incluant le quatrième motif IQ et la queue basique, pour appât (Figure 19A). On

notera que P. Gillespie et ses collaborateurs ont recherché des partenaires de liaison de la

myosine 1c par la même technique de double-hybride, avec un appât ne comprenant que la

queue basique de la myosine 1c. Ils n'avaient trouvé aucun partenaire de liaison de la

myosine 1c.

L'analyse du crible m'a conduit à l'identification de plusieurs partenaires de liaison

potentiels de la myosine 1c, dont une kinase, une phosphatase et PHR1. Or PHR1, une

protéine transmembranaire comportant un domaine Pleckstrin Homology (PH) (Figure 19B),

a retenu mon attention car elle serait alors susceptible de faire le lien entre la membrane plasmique et le cytosquelette d'actine par l'intermédiaire de la myosine 1c, pour transmettre

les tensions que les myosines sont supposées exercer sur la membrane plasmique à l'apex des

stéréocils et/ou sur le canal de transduction mécano-électrique lui-même. Dans le cerveau,

quatre transcrits distincts de PHR1 (PHR1a, b, c et d) ont été identifiés (Figure 19B) (Xu et

al., 1999). Ils possèdent tous en commun le domaine PH et une région juxtamembranaire

(JMD) suivie du domaine transmembranaire (TM). Ce crible double-hybride m'a permis de

mettre en évidence quatre clones de PHR1 qui codent des protéines interagissant avec la

64



65



myosine 1c. Ces clones sont constitués de la moitié du domaine PH suivie par la région JMD

et le domaine transmembranaire (Figure 19B). PHR1 est ainsi le premier ligand protéique

identifié de la queue de la myosine 1c. De plus, PHR1 est exprimé dans divers épithéliums

sensoriels et en particulier dans les cellules ciliées de la cochlée. Ainsi, la protéine

transmembranaire PHR1 est un candidat de choix pour relier le canal de transduction mécano-

électrique au cytosquelette d'actine via la myosine 1c. Si tel est le cas, PHR1 constitue un

point d'entrée possible pour la recherche du canal de transduction mécano-électrique.

Je me suis donc engagé dans la validation de cette interaction (Figure 19C). J'ai tout

d'abord co-exprimé PHR1a et la myosine 1c dans des cellules HEK (human embryonic

kidney) et j'ai observé que ces protéines sont colocalisées dans le cytoplasme. Puis j'ai co-

immunoprécipité le complexe PHR1a-myosine 1c à partir de cellules HEK co-exprimant

PHR1a et la myosine 1c. Enfin, j'ai exprimé le fragment myosine 1c-IQ4-queue,

correspondant à l'appât, et les fragments PHR1aC, PHR1bC, PHR1aPH et PHR1b.mid de

PHR1 (Figure 19C) dans un système bactérien. J'ai observé que tous les fragments protéiques

purifiés de PHR1 interagissent directement avec avec le fragment myosine 1c-IQ4-queue. Par

une approche similaire, j'ai observé que cette interaction est indépendante du calcium, qui est

un élément régulateur de l'activité de la myosine 1c et qui pénètre dans le canal de

transduction mécano-électrique.

b) PHR1 se lie à la queue de la myosine VIIa

Dans le but d'identifier d'autres constituants de la machinerie de transduction mécano-

électrique, j'ai recherché d'autres partenaires de liaison de PHR1 par crible double-hybride en

utilisant, comme appât, PHR1b qui possède le domaine PH, le domaine JMD et le domaine

transmembranaire, plus une extension de 19 acides aminés en N-terminal (Figure 19B). J'ai

alors mis en évidence de nombreux partenaires de liaison potentiels de PHR1b, dont la

myosine VIIa, dont l'expression, dans la cochlée, est restreinte aux cellules ciliées. La

myosine VIIa se compose d'un domaine moteur qui inclut les sites de fixation de l'ATP et de

liaison à la F-actine, d'un cou contenant cinq motifs IQ, et d'une queue comprenant un

domaine coiled-coil plus deux répétitions MyTH4-FERM (myosin tail homology 4; F pour

4.1 protein, E pour ezrin, R pour radixin and M pour moesin) séparées par un motif SH3 (Src

homology 3) (voir figures 13 et 19D). L'unique clone de la myosine VIIa trouvé dans le

66



crible, interagissant avec PHR1, comprend une partie située entre le domaine coiled-coil et la

première répétition MyTH4-FERM, plus une cinquantaine d'acides aminés chevauchant la

première répétition MyTH4 (Figure 19D). En co-exprimant PHR1b et divers fragments de la

queue de la myosine VIIa incluant la région codée par le clone issu du crible, j'ai observé que

ces fragments étaient toujours colocalisés avec PHR1. J'ai immunoprécipité le complexe

« queue de la myosine VIIa-PHR1a » à partir de cellules co-transfectées par les plasmides

codant PHR1a entier et la queue de la myosine VIIa. De plus, la seconde répétition MyTH4-

FERM de la queue de la myosine VIIa est également colocalisée avec PHR1b dans la

cytoplasme de cellules HeLa. Ceci suggère la présence d'un site additionnel de liaison à

PHR1. Cette observation a été confirmée par des tests de liaison directe, en exprimant, d'une

part la proie et la seconde répétition MyTH4-FERM dans des réticulocytes, et d'autre part,

PHR1b dans un système bactérien. Enfin, par une approche similaire, j'ai observé que

l'interaction myosine VIIa-PHR1b est indépendante du calcium. En résumé, ces résultats

indiquent que la queue de la myosine VIIa peut se lier à PHR1 par au moins deux sites de

liaison et que cette interaction est indépendante du calcium (Figure 19D).

c) PHR1 peut se dimériser

J'ai ensuite recherché d'autres partenaires de liaison de PHR1 par crible double-hybride en

utilisant, comme appât, PHR1a qui correspond à la forme la plus longue de PHR1: elle

possède la structure secondaire de PHR1b plus un fragment additionnel correspondant à

l'exon 7, situé entre le domaine PH et le domaine JMD (Figure 19E). Par l'analyse de ce

crible, j'ai mis en évidence quatre clones PHR1, les proies correspondant aussi bien à PHR1b

qu'à PHR1d (Figure 19E). La dissection des interactions m'a amené à conclure que la région

JMD ou la région couvrant la moitié du domaine PH et l'exon7 (E7) est suffisante pour la

dimérisation de PHR1 (Figure 19F). Pour appuyer ces résultats, j'ai exprimé et purifié PHR1a

à partir d'un système bactérien. Afin de vérifier l'intégrité de la protéine, j'ai procédé à un

séquençage amino-terminal et à une analyse de la masse par spectrométrie de masse. La

protéine purifiée contient l'extension de 19 acides aminés en N-terminal, le domaine PH

entier, plus une dizaine d'acides aminés en C-terminal. Cette protéine a ensuite été étudiée par

chromatographie d'exclusion stérique ( gel filtration). Les résultats obtenus indiquent que la

masse apparente de PHR1 est le double de la masse mesurée par spectrométrie de masse.

67



Comme contrôle de la forme monomérique, j'ai choisi le domaine PH de la spectrine-V, dont

la masse apparente est très voisine de la masse déterminée par spectrométrie de masse. Ces

résultats indiquent que PHR1 peut se dimeriser in vitro.

3/ Conclusion et perspectives immédiates

Ces résultats suggèrent que PHR1 forme des dimères et qu'il pourrait ancrer les

myosines 1c et VIIa à la membrane. Par ailleurs, ces protéines pourraient jouer un rôle dans le

trafic vésiculaire. En effet, une étude indique un rôle de PHR1 dans le trafic de protéines dès

leur sortie de l'appareil de Golgi (Krappa et al., 1999). Dans les cellules ciliées, les

myosine 1c et VIIa sont particulièrement abondantes autour de la plaque cuticulaire, à l'apex

des cellules ciliées, une région où le trafic vésiculaire est particulièrement dense (Kachar et

al., 1997). Ces protéines pourraient alors être impliquées dans l'adressage de protéines sortant

de l'appareil de Golgi et en route vers la touffe ciliaire. Notons que l'un et l'autre rôles putatifs

de PHR1 ne sont pas mutuellement exclusifs.

La caractérisation fonctionnelle de PHR1 passe cependant par une localisation précise

de cette protéine dans la cellule sensorielle auditive. Or, malgré la production d'un grand

nombre d'anticorps contre PHR1 (plus de quinze peptides ou protéines injectées dans des

lapins), aucun n'a permis de révéler sa localisation dans les cellules sensorielles de l'oreille.

Pour contourner cette difficulté, j'envisage d'introduire, par électroporation, la construction

PHR1 fusionnée à la GFP dans les cellules de l'épithélium sensoriel auditif en développement,

seule période durant laquelle le transfert de gènes dans ces cellules est maîtrisé. Une attention

particulière sera portée sur sa possible localisation au niveau de l'ancrage apical des liens

apicaux (tip link ), site vraisemblable de la machinerie de la transduction mécano-électrique,

où PHR1, la myosine 1c, et la myosine VIIa pourraient exercer de concert un contrôle

mécanique sur le canal de transduction mécano-électrique. Enfin, l'identification d'une

mutation dans le gène PHR1 causant une surdité héréditaire chez l'homme serait une preuve

du rôle de PHR1 dans la fonction auditive. De plus, la reproduction par recombinaison

homologue chez la souris d'une mutation trouvée chez l'homme pourrait alors m'éclairer sur la

fonction de cette protéine. De ces études, je pourrai conclure que PHR1 appartient ou non à la

machinerie de transduction mécano-électrique ou la régule.

68



ARTICLE 1

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Introduction

Genetic studies have highlighted the crucial roles of unconventional myosins in the inner ear. Indeed, mutations inthe genes encoding myosin 1a, myosin IIIa, myosin VI, myosinVIIa, and myosin XVa cause hearing loss in humans and/ormice (reviewed by Petit et al., 2001; Frolenkov et al., 2004)(see also the websites for Hereditary Hearing Loss,http://www.uia.ac.be/dnalab/hhh/ and the Institute of HearingResearch, http://www.ihr.mrc.ac.uk/hereditary/). In deaf mouse mutants lacking myosin VI (Snell’s waltzer) (Avrahamet al., 1995), myosin VIIa (shaker-1) (Mburu et al., 1997) ormyosin XVa (shaker-2) (Probst et al., 1998), the hair bundles

of cochlear and vestibular sensory cells (hair cells) areabnormal, thus indicating that these myosins are involved inthe development of this mechanoreceptor organelle composedof 20 to 300 actin-filled stiff microvilli, called the stereocilia,arranged in three to four rows of increasing height.

The tails of unconventional myosins are highly divergent anddetermine the molecules and the structures to which the forceof the motor head is applied. The identification of themolecules that bind to myosin tails is thus likely to provideclues about the roles of the various myosins that are present ina given cell type, such as the hair cell. Myosin 1c and myosinVIIa have been detected throughout the cell soma of rodentvestibular and cochlear hair cells. Both myosins are

particularly abundant at the cell apical region around thecuticular plate (Hasson et al., 1997; Dumont et al., 2002), aregion filled with vesicles that are likely to be involved in exo-and endocytosis exchanges between the cytoplasm and theapical plasma membrane (Kachar et al., 1997). In addition,these two myosins are present in the developing and maturehair bundles (El-Amraoui et al., 1996; Hasson et al., 1997;Dumont et al., 2002). The identification of two myosin VIIatail ligands that are present in the stereocilia, vezatin andharmonin b, already led us to propose two functions for thismotor molecule in the differentiating hair bundle. Myosin VIIamay exert a tension force on a subset of interstereociliar basal

links, by directly interacting with the transmembrane proteinvezatin (Kussel-Andermann et al., 2000). In addition, myosinVIIa may convey harmonin b, a protein containing a PDZdomain, as the protein is mislocated in myosin VIIa defectivemutants (Boëda et al., 2002). No protein ligand of the myosin1c tail has been identified so far, thus precluding a moleculardeciphering of the cell mechanisms in which this myosin isinvolved. These include the mechanotransduction slowadaptation process that takes place in the stereocilia of maturehair cells (Holt et al., 2002). Here, we show that PHR1, anintegral membrane protein expressed in the hair cells (Xu etal., 1999; Xu et al., 2004), directly interacts with the myosin1c and myosin VIIa tails, and is able to dimerise. We discuss

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By using the yeast two-hybrid technique, we identified acandidate protein ligand of the myosin 1c tail, PHR1, andfound that this protein can also bind to the myosin VIIatail. PHR1 is an integral membrane protein that containsa pleckstrin homology (PH) domain. Myosin 1c andmyosin VIIa are two unconventional myosins present inthe inner ear sensory cells. We showed that PHR1immunoprecipitates with either myosin tail by usingprotein extracts from cotransfected HEK293 cells. In vitrobinding assays confirmed that PHR1 directly interacts withthese two myosins. In both cases the binding involves thePH domain. In vitro interactions between PHR1 and the

myosin tails were not affected by the presence or absenceof Ca2+ and calmodulin. Finally, we found that PHR1 isable to dimerise. As PHR1 is expressed in the vestibularand cochlear sensory cells, its direct interactions with themyosin 1c and VIIa tails are likely to play a role inanchoring the actin cytoskeleton to the plasma membraneof these cells. Moreover, as both myosins have beenimplicated in the mechanotransduction slow adaptationprocess that takes place in the hair bundles, we proposethat PHR1 is also involved in this process.

Key words: Myosin 1c, Myosin VIIa, PHR1, Inner ear, Hair cell

Summary

PHR1, an integral membrane protein of the inner earsensory cells, directly interacts with myosin 1c andmyosin VIIa

Raphaël Etournay1,*, Aziz El-Amraoui1,*, Amel Bahloul1, Stéphane Blanchard1, Isabelle Roux1,Guillaume Pézeron1, Nicolas Michalski1, Laurent Daviet2, Jean-Pierre Hardelin1, Pierre Legrain3 andChristine Petit1,‡

1Unité de Génétique des Déficits Sensoriels, INSERM U587, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75015 Paris, France2Hybrigenics, 3-5 impasse Reille, 75014 Paris, France3Département de Biologie Joliot-Curie, CEA, 91191 Gif-sur-Yvette, France*These authors contributed equally to this work‡Author for correspondence (e-mail: [email protected])

Accepted 6 April 2005 Journal of Cell Science 118, 2891-2899 Published by The Company of Biologists 2005 doi:10.1242/jcs.02424

Research Article

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2892

the functional implications of these findings in the inner earsensory cells.

Materials and Methods

Yeast two-hybrid screenings

To generate the inner ear two-hybrid cDNA library, the vestibular

sensory epithelia from postnatal day 2 to 6 (P2-P6) mice were usedas described (Boëda et al., 2002). Random-primed cDNAs wereconstructed in pP6 derived from the original pGADGH (Bartel et al.,1993) using the two-hybrid system to detect protein-proteininteractions (Hartley, 1993). Yeast two-hybrid screenings werecarried out as described (Rain et al., 2001; Colland et al., 2004), usingthree different baits, namely the tail of myosin 1c (myosin 1c IQ 4

tail; amino acids 762-1028), full-length PHR1a (aa 1-243) andPHR1b (aa 1-208) (Fig. 1A,B). Baits were PCR-amplified, thencloned into pB6, a vector derived from pAS2 (Fromont-Racine et al.,1997). The selectivity of the HIS3 reporter gene was eventuallymodulated with 3-aminotriazole for each screening to obtain amaximum of 384 histidine-positive clones. The interacting ‘prey’fragments of the positive clones were PCR-amplified and sequencedat their 5′ and 3′ junctions on a PE3700 Sequencer (Applied

Biosystems). The resulting sequences were used to identify the

corresponding gene in the GenBank database (NCBI) using a fullyautomated procedure.

Expression constructs

Using RACE-PCR, we isolated full-length cDNAs encoding myosin1c (NM_008659), myosin VIIa (NM_000260) and the four PHR1transcripts PHR1a (AF000272), PHR1b (AF101053), PHR1c

(AF100613) and PHR1d (AF071000) from the mouse inner ear at P2(see Fig. 1B). PCR-amplified fragments were cloned into pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Their sequences were checked prior to transferinto the appropriate expression vector. Inserts were subcloned intopCMV-tag3B (myc tag, Stratagene) and pcDNA3 (No tag, Invitrogen)for in vitro translation and transfection experiments, and into pGEX-4T-1 (GST tag, Amersham) and pEGFP (Clontech) for proteinproduction. The following PHR1 domains were subcloned: PHR1a∆C(aa 1-145), PHR1b∆C (aa 1-145), PHR1a.PH (aa 1-126), PHR1a.mid(aa 70-134), PHR1b.mid (aa 70-178, lacks the E7 domain),PHR1a.AP (aa 131-220) and PHR1.JMD (aa 166-221). The pGEX-PHR1a (aa 1-243) and pGEX-PHR1b (aa 1-208) fusion proteins wereproduced. The following myosin 1c domains were subcloned:pcDNA3-myo1c (aa 1-1028), pEGFP-myo1c IQ4 tail (aa 762-1028),pGEX-myo1c IQ4 tail (aa 762-1028) pCMV-myo1c IQ4 tail (aa 762-

1028); pGEX-myo1c T701 (aa 701-1028). A cDNA encoding the

Journal of Cell Science 118 (13)

Fig. 1. Myosin 1c binds to PHR1. (A) Predicted structure of myosin 1c. The position of the yeast two-hybrid bait is indicated. (B) Predictedstructure of the four PHR1 isoforms. PHR1a, the longest isoform, contains an N-terminal 19 amino acid peptide, a pleckstrin homology (PH)domain, the E7 domain encoded by the alternatively spliced exon 7, a juxtamembrane domain (JMD) that displays no significant similarity toany known protein, a transmembrane (TM) domain, and six putative extracellular residues (CT6). Numbers indicate amino acid positions (1-243) according to the PHR1a sequence. The overlapping cDNAs encoding the PHR1 fragments found to interact with the myosin 1c tail in theyeast two-hybrid system are shown. They all lack the E7 domain. (C) Co-immunoprecipitation of PHR1 and the myosin 1c tail. Extracts fromcotransfected HEK293 cells producing both the GFP-tagged PHR1a (lane S1) and the myc-tagged myosin 1c IQ4 tail (lane S2) were used. Theproteins were co-immunoprecipitated by the antibody to myc (lane IP2). Extract from transfected cells producing GFP-PHR1 and the c-myc tagalone (lane S1) was used as a negative control (lane IP1). (D-F) In vitro binding assays. Mapping of the binding site of PHR1. Different fusionproteins shown in D were incubated with immobilised GST-tagged myosin 1c tail fragments (myo1c IQ4 tail, aa 762-1028; and myo1c T701, aa701-1028) or with GST. (E) The GST-myosin 1c IQ4 tail binds to PHR1b and PHR1b.mid, but not to PHR1.JMD and PHR1a.AP. (F)Coomassie stained gel. GST-myosin 1c T701 binds to PHR1a∆C, PHR1b∆C, and PHR1a.PH. By contrast, it does not bind to the PH domain of βV spectrin (βV.PH). Positions of molecular mass markers are indicated in kDa on the right-hand side of blots.

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2893PHR1 interacts with myosin 1c and myosin VIIa

myosin VIIa prey (myo7a prey; aa 934-1071) was subcloned intopCMV-tag3B and pGEX-4T-1. pEGFP-myosin VIIa-tail and pEGFP-myosin VIIa/MyTH4 FERM (aa 1690-2215) were also used (Boëdaet al., 2002). The constructs encoding myosin XVa/MyTH4 FERM(aa 3071-3511), and βV spectrin.PH domain (aa 3533-3641) werekindly provided by B. Delprat (Pasteur Institute, Paris, France) andK. Legendre (Pasteur Institute, Paris, France), respectively. Constructs

encoding myosin VIIa/SH3 MyTH4 FERM (aa 1605-2215), myosinVIIa/SH3 MyTH4 (aa 1605-1907) were kindly provided by I.Zwaenepoel (Pasteur Institute, Paris, France).

Immunocytofluorescence analysis

HeLa cells were transfected using Effectene reagent (Qiagen),following the manufacturer’s instructions. Immunocytofluorescenceanalysis was carried out on fixed cells as described (Kussel-Andermann et al., 2000). We used an anti-myc mouse monoclonalantibody (clone 9E10, Santa Cruz) and secondary antibodies coupledwith Alexa 488 or Alexa 568 (Amersham, Molecular Probes). Cellswere analysed with a laser-scanning confocal microscope (LSM-540,Zeiss).

Co-immunoprecipitation experiments

Human embryonic kidney HEK293 cells were transfected usingLipofectamine Plus Reagent (Invitrogen), according to themanufacturer’s instructions. The cell pellets were solubilised bysonication in PBS, complemented with EDTA-free cocktail of protease inhibitors (Roche). Cell extracts were prepared using 0.1%Triton X-100, and 0.1% sodium deoxycholate in PBS, pH 7.4.Immunoprecipitations were done using either polyclonal anti-GFPantibodies (Invitrogen) or monoclonal anti-c-myc antibodiespreincubated with protein G-agarose (Pharmacia). Theimmunoprecipitates were electrotransferred to nitrocellulose sheetsand probed with anti-c-myc (1:500 dilution), anti-myosin VIIa(1:3000), or anti-GFP (1:5000) antibodies. Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit or anti-mouse antibodies (Amersham) andthe ECL chemiluminescence system (Pierce) were used for detection.

Production and purification of GST-tagged proteins

GST-tagged proteins were produced in BL21 bacteria. For all PHR1proteins and the PH domain of βV spectrin, the production wastriggered with 0.5 mM IPTG at an OD600nm of 0.8. After 2 hoursincubation at 30°C, cells were collected and centrifuged 20 minutesat 4°C. The pellet was washed once in PBS and frozen in liquidnitrogen. After cell lysis in PBS with 1% Triton X-100, 1 mM DTT,300 mM NaCl, and protease inhibitor cocktail, supernatants wereincubated with glutathione–Sepharose beads (Pharmacia) for 2 hoursat 4°C, then washed three times with a saline buffer (0.1% Triton X-100, 1 mM DTT, in PBS supplemented with 50 mM NaCl). Theproteins of interest were retrieved from GST-fusion proteins bythrombin cleavage (Sigma). Thrombin was then eliminated by usingbenzamidine-agarose beads (Sigma). For myosin 1c tail production,0.1 mM IPTG was added at an OD600 of 0.6, and cells were incubatedovernight at 18°C. Soluble proteins were treated as described above.

In vitro binding experiments

The in vitro binding assays were carried out using purified GST-tagged fusion proteins. Each binding experiment was done at least intriplicate. In one series of experiments, 35S-labelled proteins weretranslated in vitro with the T3/T7-coupled transcription–translationsystem (Promega) according to the manufacturer’s instructions. Totest the myosin 1c tail-PHR1b interaction, the same amount of GST-tagged myosin 1c IQ4 tail or GST alone (2 µg), was incubated withpre-equilibrated glutathione-Sepharose beads for 90 minutes at 4°C.

The beads were washed three times with binding buffer (5% glycerol,5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, in PBS, pH 7.4) supplemented withEDTA-free protease inhibitor cocktail, and then incubated with the invitro translated 35S-labelled PHR1b for 3 hours, at 4°C on a rotatingwheel. The beads were then washed four times with binding buffersupplemented with 150 mM NaCl and bound proteins wereresuspended in 30 µl of 2 SDS sample buffer. Samples were then

analysed on a 4-12% SDS-polyacrylamide gel. The gel was fixed,dried and exposed to a Biomax film (Kodak).In a second series of experiments GST-tagged fusion proteins were

purified on glutathione-Sepharose beads and then either eluted with20 mM reduced glutathione at pH 8 or cleaved by thrombin. To testthe interaction between the myosin 1c tail and different PH-containingdomains of PHR1b, the same amount (3 µg) of purified GST-taggedmyosin 1c tail (T701) or GST alone was incubated with pre-equilibrated glutathione-Sepharose beads for 90 minutes at 4°C.Purified and cleaved PHR1b domains (3 µg) were incubated overnightwith either GST-tagged myosin 1c T701 or GST alone, in a salinebuffer (PBS containing 5% glycerol, 0.1% Triton X-100, andcomplete protease inhibitor cocktail). The beads were then washedfive times with binding buffer supplemented with 150 mM NaCl, andbound proteins were resuspended in 30 µl of 2 SDS sample buffer.

Samples were then analysed on a 4-12% SDS-polyacrylamide gelstained with Coomassie Brilliant Blue R250.For the PHR1 dimerisation test, the full-length GST-tagged PHR1a

protein was produced as described above, then purified onglutathione-Sepharose beads and eluted in 20 mM reducedglutathione. The purified PHR1a extract was loaded on a gel filtrationcolumn Superdex™ 75 prep grade (Amersham). The followingmolecular mass standards were also applied to the column forcalibration: bovine serum albumin (66 kDa), ovalbumin (45 kDa),chymotrypsinogen A (25 kDa), ribonuclease A (13.7 kDa).Confidence intervals for the molecular mass values were calculatedfrom the regression curve. In order to check the integrity of thepurified PHR1a extract, we carried out mass spectroscopy and Edmansequencing. ESI-MS measurements were performed on ESI-triplequadrupole API365 (MDS-Sciex, Toronto, Canada). The N-terminalsequencing was performed on an ABI 494 (USA) machine.

Results and Discussion

PHR1, an integral membrane protein, directly interactswith the myosin 1c tail

Myosin I isoforms are widely expressed in invertebrates andvertebrates. They can be grouped into two phylogeneticallydistinct subclasses. Subclass 1 isoforms have long tails thatcontain basic (TH1), proline-rich (TH2) and Src homology-3(SH3) domains, whereas the subclass 2 isoforms contain onlya short TH1 tail domain. Myosin 1c belongs to subclass 2.Myosin 1c consists of a motor head domain with actin- andATP-binding sites, a neck region containing three IQ motifs,

and a short basic tail domain (Fig. 1A). The three IQ domainsbind to Ca2+-free calmodulin with high affinity. A fourth IQmotif that seems to bind to calmodulin with a very low affinityhas also been reported (Gillespie and Cyr, 2002). In order toidentify proteins that interact with myosin 1c in the inner ear,we used a fragment encompassing the fourth IQ motif and theentire C-terminal basic tail domain (i.e. amino acids 762-1028,Fig. 1A), hereafter referred to as myosin 1c IQ4 tail, to screena P2-P6 mouse inner ear library (see Materials and Methods),in the yeast two-hybrid system.

We identified 71 clones by histidine nutritional selection andβ-galactosidase (β-gal) activity. The inserts from the isolatedclones were sequenced, leading to the identification of four

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2894

overlapping clones that encode the C-terminal region of aprotein named PHR1 (Krappa et al., 1999; Xu et al., 1999)(Fig. 1B). PHR1 is abundantly expressed in maturephotoreceptor cells, cochlear and vestibular hair cells, andolfactory receptor neurons. In the cochlea PHR1 is alsoexpressed in a subset of interdental cells at the surface of thespiral limbus (Xu et al., 2004). Immunohistochemistry and

chemical extraction studies on the photoreceptor outer segmenthave shown that PHR1 is an integral membrane protein (Xu etal., 1999). PHR1 contains an N-terminal pleckstrin homologydomain (Krappa et al., 1999; Xu et al., 1999). Pleckstrinhomology (PH) domains are 100- to 120-amino acid modulesbest known for their ability to bind to phosphoinositides(Lemmon et al., 2002). Unlike other PH domains (Rebecchiand Scarlata, 1998), that of PHR1 lacks most of the eightconserved residues known to coordinate binding tophosphoinositides (Xu et al., 1999). The use of two promotersand alternative splicing of exon 7 lead to four different PHR1transcripts (Krappa et al., 1999; Xu et al., 1999), hereafterreferred to as PHR1a-d . PHR1a and PHR1b both result from

the use of the more upstream promoter. They contain a 19-amino acid N-terminal peptide (NT19), which is absent fromPHR1c and PHR1d. In addition, PHR1a and PHR1c contain a36-amino acid segment encoded by exon 7, hereafter referredto as E7 (aa 131-166), whereas PHR1b and PHR1d do not (Fig.1B). Thus, the PHR1 sequence can be subdivided in sixdifferent regions, namely NT19 (in PHR1a and PHR1b), PHdomain, E7 (in PHR1a and PHR1c), JMD, TM domain, and ashort six amino acid C-terminal peptide CT6 (Fig. 1B). Theoverlapping sequences of the yeast two-hybrid PHR1 preyscode for a peptide that extends between residues 70-208 of PHR1b (aa 51-189 of PHR1d), that is the C-terminal part of the PH domain and the entire JMD, TM and CT6 domains (Fig.1B).

To confirm the interaction of PHR1 with myosin 1c,HEK293 cells were cotransfected with plasmids encoding theGFP-tagged PHR1a and c-myc-tagged myosin 1c IQ4tail (seeMaterials and Methods). Cell extracts were incubated with ananti-c-myc antibody. PHR1a co-immunoprecipitated with themyosin 1c IQ4 tail. Co-immunoprecipitation was not observedwhen the c-myc-tagged myosin 1c IQ4 tail was substituted by

c-myc tag alone (Fig. 1C).To assess a possible direct interaction between the two

proteins, we carried out in vitro binding assays. Using in vitrotranslated 35S-labelled proteins, we found that full lengthPHR1a, PHR1b and PHR1d bound to the GST-tagged myosin1c IQ4 tail (Fig. 1E and data not shown). In the reciprocalbinding experiment, either full-length PHR1a or PHR1b fusedto GST did bind to 35S-labelled full-length myosin 1c (Fig. 2and data not shown). To define the myosin 1c-interactingregion of PHR1, three different PHR1 fragments, namely theC-terminal part of the PH domain (PHR1b.mid; aa 70-178) andthe downstream region containing (PHR1a.AP; aa 128-220) orlacking (PHR1.JMD; aa 166-221) the E7 fragment (Fig. 1D),

were incubated with the GST-myosin 1c IQ4 tail or with GSTalone. PHR1b and PHR1b.mid, but not PHR1a.AP orPHR1.JMD, bound to the GST-myosin 1c IQ4 tail (Fig. 1E).Based on these results, bacterially expressed untagged PHR1afragments (Fig. 1D) obtained by cleavage of the GST-fusionprotein with thrombin, were incubated either with the GST-tagged myosin 1c T701 (aa 701-1028) corresponding to theentire neck and tail part of myosin 1c or with GST alone.PHR1a∆C (aa 1-145), PHR1b∆C (aa 1-145) and PHR1a.PH(aa 1-126) fragments did interact with GST-tagged myosin 1cT701, but not with GST alone. Under the same experimentalconditions, the PH domain of βV spectrin (aa 3533-3641) didnot bind to GST-myosin 1c T701 (Fig. 1F). We conclude thatthe myosin 1c tail interacts with PHR1 via its PH domain.

All myosin I TH1 tail domains have net positivecharges and many, including that of myosin 1c, havebeen shown to interact with phospholipids in vitro(Titus, 2000; Tang et al., 2002). In addition, myosin1c directly interacts with PtdIns(4,5)P2 (PIP2) andother anionic phospholipids via its IQ domains(Hirono et al., 2004). Both interactions have onlybeen detected in the presence of high Ca2+

concentrations (Tang et al., 2002; Hirono et al.,2004), however, and they may not fully account forthe subcellular targeting of myosin 1c. Therefore,the proposed anchoring of myosin 1c to the plasmamembrane (Cyr et al., 2002) may also involveintegral membrane protein(s). Based on the present

results, we suggest that PHR1 is one of these. Inorder to test whether the free Ca2+ concentration canaffect the interaction between myosin 1c tail andPHR1, we carried out the in vitro bindingexperiments in the presence of either 100 µM EGTA(a calcium-chelating agent) or a 50 µM free Ca2+

concentration, two conditions designed to mimiclow- and high-Ca2+ environments that may beencountered by myosin 1c in the hair cell bundle(Gillespie and Cyr, 2002). The PHR1-myosin 1cinteraction was detected under both conditions (Fig.2A). It has been found that calmodulin completelyblocks the targeting of the myosin 1c neck-tail


Fig. 2. Effect of Ca2+ and calmodulin on the myosin 1c-PHR1 interaction.(A) Effect of the Ca2+ concentration. Myosin 1c IQ4 tail or GST alone wasincubated with [35S]PHR1b in the presence of 100 µM EGTA or 50 µM Ca2+.PHR1b interacts with the tail of myosin 1c in both cases (upper panel). In thereciprocal experiment, full-length myosin 1c binds to GST-PHR1b in thepresence of 100 µM EGTA or 50 µM Ca2+ (lower panel). (B) Effect calmodulin(CaM). GST-PHR1b binds to 35S-labelled full-length myosin 1c in the absence(–) or presence of calmodulin (1.5, 7.5 or 15 µM) (upper panel). In thereciprocal experiment, GST-myo1c T701 or GST was incubated with 35S-PHR1b in the absence or presence of calmodulin (1.5, 7.5 or 15 µM). Themyosin 1c IQ4 tail-PHR1b interaction is not affected by any of the calmodulinconcentrations tested (lower panel). Positions of molecular mass markers areindicated in kDa on the right-hand side of blots.

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fragment (myosin 1c T701) to a putative ‘membrane receptor’in the hair bundle (Cyr et al., 2002), possibly PtdIns(4,5)P2

(Hirono et al., 2004). In addition, increasing the Ca2+

concentration has been shown to weaken calmodulinassociation to the myosin 1c IQ motifs (Gillespie and Cyr,2002). This would result in conformational changes of themotor head-neck region that would in turn prevent the

coupling between energy released by ATP hydrolysis and thecreation of a tension force exerted on the membrane. We testedwhether the binding of PHR1 to myosin 1c is modulated bycalmodulin in the presence of low or high free-Ca2+

concentrations. Calmodulin (1.5-15.0 µM) failed to preventthe PHR1-myosin 1c interaction in the presence of 100 µMEGTA (Fig. 2B) or 50 µM Ca2+ (data not shown). Together,these results suggest that myosin 1c associates to the plasmamembrane both in Ca2+ /calmodulin-dependent (Cyr et al.,2002; Hirono et al., 2004) and Ca2+ /calmodulin-independent(this study) ways that could involve lipid and protein ligandsrespectively.

PHR1 interacts with the myosin VIIa tailIn order to find additional PHR1-interacting partners in thehair cell, we used full-length PHR1b as the bait in a yeast two-hybrid screening of the same mouse inner ear library.Sequence analysis of the clones positive for HIS3 and LacZ revealed a single myosin VIIa clone (myo7a prey; aa 934-1071). This clone encodes a short tail fragment that partially

overlaps with the first 54 amino acids of the first MyTH4domain (see Fig. 3A). Extracts from HEK293 cotransfectedcells producing the entire myosin VIIa tail and GFP-taggedPHR1a were immunoprecipitated by an antibody to GFP andthe myosin VIIa tail was detected in the immunoprecipitate(Fig. 3B).

In vitro binding assays demonstrated direct interactionbetween PHR1b and the myosin VIIa original prey (138 aa tailfragment), the entire myosin VIIa tail or the full-length myosinVIIa (Fig. 3C,D). Both the absence of Ca2+ and increasing theCa2+ concentration up to 500 µM did not affect the PHR1b-myosin VIIa tail interaction (Fig. 3C).

Fig. 3. Myosin VIIa binds to PHR1. (A) Predicted structure of myosin VIIa. The yeast two-hybrid myosin VIIa prey obtained using PHR1b asthe bait is indicated. (B) Binding of the myosin VIIa tail to GFP-tagged PHR1a in cotransfected HEK293 cells. Protein extract fromcotransfected HEK293 cells producing both the GFP-tagged PHR1a and the untagged-myosin VIIa tail (lane S2) was used forimmunoprecipitation. The myosin VIIa tail and PHR1a are co-immunoprecipitated by the anti-GFP antibody (lane IP2). Extract fromcotransfected cells expressing the myosin VIIa tail and GFP alone (lane S1) was used as a negative control (lane IP1). (C) GST-PHR1b binds tothe 35S-labelled myosin VIIa prey fragment, entire myosin VIIa tail, and full-length myosin VIIa. The PHR1-myosin VIIa tail interaction isaffected by neither the absence of Ca2+ (–), nor high free Ca2+ concentrations (10, 50 or 500 µM). (D) In the reciprocal experiment, GST-taggedmyosin VIIa prey fragment or GST alone was incubated with in vitro translated [35S]PHR1b, [35S]PHR1b.mid or [35S]PHR1.JMD (see Fig.1D). GST-myo7a prey binds to PHR1b and PHR1b.mid, but not to PHR1.JMD. (E,F) The myosin VIIa tail constructs (E) used for the in vitrobinding assays in F are given a number (circled). GST-PHR1b or GST was incubated with different 35S-labelled myosin VIIa protein fragments.GST-PHR1b binds to Myo7a/SH3 MyTH4 FERM and Myo7a/MyTH4 FERM, but not to Myo7a/SH3 MyTH4. Binding is not detected with theMyTH4 FERM C-terminal tail fragment of myosin XVa (Myo15a/MyTH4 FERM). MyTH4, myosin tail homology 4; FERM, 4.1, ezrin,radixin, moesin; SH3, src homology 3. Positions of molecular mass markers are indicated in kDa on the right-hand side.

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To define the myosin VIIa-interacting region of PHR1, wecarried out binding assays with different PHR1 fragments (seeFig. 1D). The GST-myosin VIIa prey bound to PHR1b.mid, butnot to PHR1.JMD (Fig. 3D), thus indicating that PHR1interacts with myosin VIIa via the PH domain.

Myosin VIIa consists of a motor head domain, five IQ motifsand a long tail (aa 847-2215). The tail contains an α-helix

dimerisation domain, followed by two MyTH4 FERM repeatsseparated by an SH3 domain (Fig. 3A). In cotransfected HeLacells producing c-myc-tagged PHR1b and a GFP-taggedmyosin VIIa tail fragment (myosin VIIa/MyTH4 FERM; aa1690-2215) lacking the myosin VIIa prey region, the twoproteins colocalised in the cytoplasm (data not shown),suggesting the presence of an additional binding site in the C-terminal region of myosin VIIa. To define the PHR1-interacting regions of myosin VIIa, we carried out bindingassays with different myosin VIIa tail fragments (Fig. 3E).GST-PHR1b bound to SH3 MyTH4 FERM (aa 1605-2215) andMyTH4 FERM (aa 1690-2215) C-terminal tail fragments of myosin VIIa. In contrast, GST-PHR1b did not bind to myosin

VIIa/SH3 MyTH4 (aa 1605-1907), or to the FERM domain (aa1896-2215) and MyTH4 domain (aa 1752-1890) alone.

Finally, GST-PHR1b did not bind to the MyTH4 FERM C-terminal tail fragment (aa 3071-3511) of myosin XVa (Fig. 3Fand data not shown). Together, these results indicate thepresence of at least two PHR1-interaction sites within themyosin VIIa tail, namely one in the interdomain separating thedimerisation domain from the first MyTH4 and another in theC-terminal MyTH4 FERM.

PHR1 can form homodimers

We used full-length PHR1a as the bait in a third yeast two-hybrid screening of the inner ear library. We identified fourclones that encode two overlapping regions of PHR1b/d, i.e.from amino acid number 70 to the C-terminal end (Fig. 4A).In in vitro binding assays, GST-tagged PHR1a interacted withthe four isoforms, PHR1a-d (Fig. 4B and data not shown).Moreover, by using different PHR1 fragments, we were ableto show that the JMD domain is sufficient for PHR1homomerisation (Fig. 4B, lower panel). To confirm the abilityof PHR1 to form homodimers we ran a gel filtration column

with full length PHR1a purified from a GST-PHR1a fusionprotein by thrombin cleavage (see Materials and Methods). In


Fig. 4. PHR1 can form dimers. (A) Yeast two-hybrid PHR1 preys obtained using PHR1a as bait. (B) PHR1 isoforms can form heteromers. Toppanel, PHR1 constructs used for the in vitro binding assay. Middle panel, GST-PHR1a or GST alone was incubated with full length[35S]PHR1a, [35S]PHR1b, or [35S]PHR1d. GST-PHR1a interacts with every PHR1 isoform. Lower panel, PHR1.JMD is sufficient for PHR1homomerisation. (C) Gel filtration analysis of the purified PH domains of PHR1a (PHR1a.PH) and βV spectrin (βV spectrin.PH). The figureshows the regression curve between the molecular mass and the partition coefficient (K av) defined by K av = (Ve – Vo)/(Vt – Vo), where Ve iselution volume of the protein, Vo, column void volume and Vt , total bed volume. The molecular masses of eluted fractions are estimatedaccording to the fractions corresponding to four molecular mass standards: bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, ribonuclease A andchymotrypsinogen A. PHR1a.PH is eluted as a dimer, whereas βV spectrin.PH is eluted as a monomer. (D) Schematic diagram illustrating howa PHR1 dimer can recruit two myosin 1c, two myosin VIIa, or one myosin 1c and one myosin VIIa molecule to the plasma membrane.

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parallel, we analysed the integrity of the PHR1a fragment byEdman sequencing and mass spectrometry in denaturingconditions and found that the C-terminus of the protein wasdegraded. The residual fragment has a predicted molecularmass of 15878±1 Da. It contains the N-terminal extension(NT19), the entire PH domain and ten amino acid residues of the E7 domain. The estimated molecular mass of 28±5 kDa

that we obtained by gel filtration corresponds to a PHR1adimer. In contrast, the elution fraction of the βV spectrin PHdomain (predicted molecular mass, 12 kDa), that we used as acontrol, corresponds to an estimated molecular mass of 13±5kDa, i.e. to monomers (Fig. 4C). These results indicate thatPHR1 can form dimers in vitro.

As myosin 1c and myosin VIIa bind to the same region of PHR1, namely the PH domain, a given PHR1 molecule maynot interact with both myosins at the same time. However,PHR1 dimers could interact simultaneously with two myosin1c, two myosin VIIa, or one myosin 1c and one myosin VIIamolecule (see Fig. 4D). Myosin VIIa and myosin 1c are actin-based motors moving to the plus end of the filaments (Zhu et

al., 1996; Inoue and Ikebe, 2003). Myosin VIIa is a two-headed motor protein that has been proposed to be processive(Inoue and Ikebe, 2003). Myosin VIIa has a much loweraffinity for ATP than for ADP, which makes this myosin agood candidate to maintain a tension force at a given site(Inoue and Ikebe, 2003). Myosin 1c is a single-headed, non-processive motor protein. It is thus predicted to create

only transient tension forces on its ligands, unless severalmyosin 1c molecules bind to the same ligand molecule (seeGillespie and Cyr, 2004). As a result of the PHR1dimerisation, the bridging of several myosin 1c moleculesis expected to increase the probability of creating a tensionat a given plasma membrane location (see Fig. 5B).Interestingly, a cooperative role of two unconventional

myosins has already been reported. Studies on Dictyosteliummutants have demonstrated that different myosins I play acooperative role in the production of the resting corticaltension that is required for fluid macropinocytosis and cellmotility (reviewed by Titus, 2000). Indeed, although

Dictyostelium mutants lacking either a subclass-2 (myoA –)or a subclass-1 (myoB –) myosin I have normal levels of cortical tension, double myosin I mutants (myoA – /B –) displaya 50% reduction in cortical tension (Dai et al., 1999; Titus,2000).

PHR1 and hair cell vesicular trafficking

In the retina, pulse-labelling experiments in isolated frogphotoreceptors, led Krappa and colleagues (Krappa et al.,1999) to suggest that PHR1 functions as a mediator of post-Golgi protein trafficking. By studying ciliogenesis in rattrachea epithelial cells, it has also been shown that PHR1transcripts are upregulated upon stimulation of ciliarydifferentiation (Andrews et al., 2000). As myosin VIIa and

Fig. 5. Schematic representation of an inner ear sensory cell and proposed molecular model of the slow adaptation process. (A) The hair bundleis composed of 20-300 actin-filled stiff microvilli, called the stereocilia, arranged in three to four rows of increasing height. Stereocilia are heldtogether by different types of lateral links. In addition, a single tip link joins the tip of each stereocilium to the lateral side of its taller neighbourin the adjacent row. (B) According to the gating spring hypothesis (Howard and Hudspeth, 1987), deflection of the hair bundle in the excitatorydirection exerts a tension force on the tip links. The force is transmitted to the mechanoelectrical transduction (MET) channels (believed to belocated close to the tip link insertion in the membrane), increasing their probability of being open. An influx of cations (mainly K+ ions, butalso Ca2+ ions) through the open MET channels depolarises the hair cell leading to neurotransmitter release and signalling to the centralnervous system via afferent nerve fibres. (C) A model of the slow adaptation process evoked by sustained deflection of the hair bundle. TheCa2+ influx through the open MET channels triggers the adaptation process (see Fettiplace and Ricci, 2003; Gillespie and Cyr, 2004). Theincrease of the stereociliar Ca2+ concentration weakens calmodulin (CaM) binding to the myosin 1c IQ motifs, which in turn interact withanionic phospholipids [such as PtdIns(4,5)P2 (PIP2)] in the membrane. This also leads to the dissociation of myosin molecules from actinfilaments. The resulting reduction in the tension exerted on the stereocilia membrane is thought to underlie the slow adaptation process, i.e. adecrease of the MET channel open probability while the mechanical stimulus is persisting. The PHR1-myosin complexes are expected tofunction as elastic molecular crosslinkers that contribute to and modulate the membrane tension. Unlike myosin 1c-phospholipids interactions,they may not be dependent on the local Ca2+ concentration.

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myosin 1c are abundant in the hair cell apical region aroundthe cuticular plate, a region characterised by a dense vesiculartraffic (Kachar et al., 1997), these myosins, together withPHR1, might be involved in the sorting of proteins en route tothe hair bundle.

Is PHR1 involved in the mechanotransduction slowadaptation process?

Owing to its location at the stereociliary tip, i.e. at themechano-electrical transduction (MET) channel putative area,in amphibian hair cells (Metcalf, 1998; Steyger et al., 1998),myosin 1c has long been regarded as a good candidate for theadaptation motor of the hair cell (Hudspeth and Gillespie,1994; Gillespie and Cyr, 2004). Indeed, a role of myosin 1c inthe slow adaptation process has been demonstrated in postnatalday 1 to 8 (P1-P8) mouse vestibular hair cells, by using achemical/genetic approach (Holt et al., 2002). Becausecochlear hair cells from P2 shaker-1 mice adapt more rapidlythan those from control mice, myosin VIIa may also play a role

in the slow adaptation process (Kros et al., 2002). It is presentlyunknown whether the two myosins actually cooperate in alltypes of hair cell or whether myosin VIIa in cochlear hair cellsplays a role equivalent to that of myosin 1c in vestibular haircells (Gillespie and Cyr, 2004). Inhibitors of PtdIns(4,5)P2

synthesis lead to defective hair cell mechanotransduction, andreduce the rates of fast as well as slow adaptation. Becausemyosin 1c directly binds to PtdIns(4,5)P2 through its IQdomains, it has been proposed that PtdIns(4,5)P2 is acomponent of the molecular complex underlying the slowadaptation process (Hirono et al., 2004). Upon deflection of thehair bundle by an excitatory stimulus, MET channels open andCa2+ ion influx increases the Ca2+ concentration in thestereocilia, leading to calmodulin-myosin dissociation. The

free IQ domains would then bind to anionic phospholipids suchas PtdIns(4,5)P2, thereby strengthening the interaction betweenmyosin 1c and the membrane, whereas myosin head domainsmay detach from the core of actin filaments (Fig. 5B). At rest,when myosin 1c IQ domains are occupied by calmodulins,myosin molecules would bind to the stereocilia membranethrough their tail domain (Hirono et al., 2004). Assuming thatPHR1 is present at the tip of the stereocilia, this integralmembrane protein presumably anchors myosin 1c and myosinVIIa to the membrane (Fig. 5B), in a way that may not bedependent on the local Ca2+ concentration (see Fig. 2 and Fig.3C).

Despite the fact that the murine PHR1 is abundantlyexpressed in several types of sensory cells (i.e. olfactory,

retinal, vestibular and cochlear cells) and various other celltypes, an abnormal phenotype was not detected in PHR1 nullmouse mutants up to 1 year of age (Xu et al., 2004). Inparticular, these mice do not have an overt hearing impairmentor balance defect. The apparent normal phenotype of PHR1null mice may reflect functional redundancy between PHR1and other protein(s). PHR2, which has 57% amino acid identitywith PHR1 in the PH domain and is expressed in many tissues(Krappa et al., 1999; Xu et al., 2004), is an obvious candidate,although it remains to be shown whether it is expressed in thesame cell types as PHR1. However, refined analyses of thePHR1 mutant mice in different genetic backgrounds and/orenvironmental conditions (for instance, chronic exposure to

high sound levels), could help reveal subtle deficiencies of thebalance and auditory functions. In conclusion, the PHR1 nullmutant is a valuable model to determine whether PHR1 isrequired for the proper targeting of myosin 1c and myosin VIIain the hair bundle.

We thank S. Pêtres for technical assistance in gel filtration

experiments, J. D’Alayer for N-terminal sequencing, A. Namane andP. Lenormand for mass spectroscopy experiments. We thank J.Levilliers and D. Weil for their constant help. This work wassupported by grants from the EC (QLG2-CT-1999-00988), R & GStrittmatter Foundation, A & M Suchert Kontra Blindheit.

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II- Shroom2 se lie à la myosine VIIa et à l'actine etpourrait renforcer les jonctions intercellulaires

1/ Objectif

J'ai poursuivi l'étude du rôle de la myosine VIIa dans la fonction auditive en

examinant les souris sh14626SB (shaker1, allèle 4626SB), dont le gène qui code la myosine VIIa

est porteur d'une mutation non-sens située au codon 720. En l'absence de myosine VIIa

fonctionnelle, outre la désorganisation de la touffe ciliaire des cellules ciliées, le pourtour

apical des cellules ciliées externes est anormalement circulaire chez des souris adultes. Ce

phénotype jonctionnel couplé aux résultats précédemment obtenus au laboratoire, supporte unrôle de la myosine VIIa aux jonctions intercellulaires. En effet, la myosine VIIa interagit avec

la vézatine aux jonctions d'adhérence (Küssel-Andermann et al., 2000b) et permet l'entrée de

Listéria dans les cellules épithéliales (Sousa et al., 2005). Enfin, Ingrid Zwaenopoel, au

laboratoire, avait identifié shroom2, une protéine jonctionnelle à domaine PDZ, comme

nouveau partenaire de liaison potentiel de la myosine VIIa, par la technique de double-

hybride chez la levure, en utilisant la même banque d'ADNc que précédemment (voir ci-

dessus). Mon attention s'est alors portée sur shroom2, dont je suspectais un rôle dans la

morphogénèse apicale des cellules ciliées. En effet, l'absence de shroom3, un paralogue de

shroom2, empêche la fermeture du tube neural chez les vertébrés (Hildebrand & Soriano,

1999). De plus, shroom3 contrôle la distribution de la myosine II aux jonctions (Hildebrand,

2005). Ceci suggère que shroom3 est un élément clé dans la morphogénèse des cellules

épithéliales (Haigo et al., 2003). Par analogie, shroom2 serait donc un bon candidat pour

sculpter la forme apicale des cellules ciliées externes en conjonction avec la myosine VIIa. En

raison des observations que j’avais faites et qui mettaient en évidence pour la première fois un

rôle de la myosine VIIa aux jonctions cellulaires, j’ai décidé de compléter le travail sur

shroom2. Après avoir validé l’interaction myosine VIIa-shroom2, j’ai confirmé que shroom2

est une protéine des jonctions serrées qui se lie à ZO1 et à la F-actine. Je présenterai ce travail

d'équipe à la première personne pour en faciliter la lecture.

79



2/ Résumé des résultats

a) Shroom2 se lie à la queue de la myosine VIIa

J'ai recherché de nouveaux partenaires de liaison de myosine VIIa en utilisant comme

appât un fragment C-terminal SH3-MyTH4-FERM (SH3 pour Src homology 3; MyTH4 pour

myosin tail homology 4; FERM: F pour 4.1 protein, E pour ezrin, R pour radixin et M pour

moesin) de la queue de cette myosine. Parmi les partenaires de liaison potentiels de la

myosine VIIa, shroom2, protéine à domaine PDZ, a suscité mon intérêt. Les protéines à

domaine(s) PDZ organisent des complexes macromoléculaires associés à des domaines

spécifiques de la membrane plasmique. Elles permettent en particulier l'ancrage et le

regroupement de protéines transmembranaires, qu'elles amarrent, pour certains, aux filaments

d'actine. De plus, la séquence protéique de shroom2 ainsi que son organisation modulaire sont

très similaires à celle de shroom3, protéine des jonctions d'adhérence qui se lie à la F-actine

(Hildebrand & Soriano, 1999). Des co-marquages shroom2/β-caténine et shroom2/occludine

indiquent que la distribution de shroom2 est restreinte aux jonctions serrées. Shroom2 est

donc une protéine des jonctions serrées. Shroom2 est constituée d'un domaine PDZ en N-

terminal suivi d'une région riche en sérines et prolines (SPR pour serine-proline rich), et de

deux domaines apx-shroom ASD1 et ASD2 (ASD pour apx-shroom domain) en C-terminal de

la protéine (Figure 20A). Le clone issu de ce crible double-hybride couvre une région que j'ai

appelée MBR (myosin VIIa binding region), et qui est comprise entre la région SPR et le

domaine ASD1 (Figure 20A: shroom2-proie). Le domaine MBR est colocalisé avec la queue

de la myosine VIIa lorsque ces deux fragments sont co-exprimés dans des cellules Hela. De

plus, les immuno-marquages effectués sur les épithéliums dans lesquels shroom2 et

myosine VIIa sont co-exprimés, ont montré que les distributions de shroom2 et de la

myosine VIIa se recouvrent au niveau des jonctions serrées. J'ai obtenu la co-

immunoprécipitation du complexe shroom2-myosine VIIa à partir d'extraits cellules HEK co-

transfectées par des plasmides codant pour les protéines shroom2 et myosine VIIa. La

dissection de l’interaction entre ces deux protéines montre que le domaine MBR de shroom2

interagit directement avec la seconde répétition MyTH4-FERM de la myosine VIIa, indiquant

que l'interaction entre les deux protéines est sans doute directe (Figure 20B). Comme la

myosine VIIa est un moteur moléculaire, je me suis alors demandé si elle pourrait transporter

shroom2 aux jonctions apicales des cellules ciliées de la cochlée. Chez les souris déficientes

80



81



en myosine VIIa (sh14626SB/4626SB), shroom2 est normalement distribuée, c'est-à-dire aux

jonctions serrées des cellules sensorielles. En conclusion, la myosine VIIa se lie à shroom2

mais n'est pas impliquée dans son adressage aux jonctions serrées.

b) Shroom2 se lie à ZO1

Pour appréhender le rôle de shroom2 à la jonction serrée, j'ai recherché des partenaires

de liaison de shroom2 par un second crible double-hybride, en utilisant un fragment N-

terminal de shroom2 couvrant les domaines PDZ et SPR. L'analyse de ce crible m'a conduit à

l'identification de plusieurs partenaires de liaison potentiels de shroom2, dont ZO1, une

protéine à domaine PDZ présente elle aussi aux jonctions serrées (voir introduction). ZO1 est

constitué de trois domaines PDZ suivis d'un domaine SH3, d'un domaine guanylate kinase

(GuK, guanylate kinase) et d'une région riche en résidus acides (ArR, acid rich region)

(Figure 20C). Les deux clones issus du crible couvrent une partie du troisième domaine PDZ,

les domaines SH3 et GuK, et la région ArR.

Des immunomarquages réalisés sur différents épithéliums (nez, glande sous-

mandibulaire, intestin, plexus choroïde) montrent que shroom2 est présent aux jonctions

serrées, avec ZO1. Dans la cochlée, shroom2 est particulièrement abondant au niveau du

pourtour apical des CCE où le stress mécanique dû aux forces de cisaillement générées par

l'eléctromotilité des CCE est important. Le complexe ZO1-shroom2 peut être co-

immunoprécipité à partir d'extraits protéiques de cochlée et de cerveau. La dissection de

l'interaction ZO1-shroom2 montre que shroom2 interagit, par sa région SPR, directement avec

la région contenant les domaines SH3-GuK de ZO1. Shroom2 interagit donc avec ZO1 par

une région distincte de celle qui est impliquée dans l’interaction avec la queue de la

myosine VIIa (Figure 20D).

Afin de mieux comprendre le rôle de shroom2 sur la formation et le maintien des

jonctions serrées, j'ai produit une lignée stable de cellules MDCK synthétisant shroom2

fusionnée à la GFP, et j'ai étudié la cinétique de recrutement de GFP-shroom2 et de ZO1 à la

membrane durant la formation des contacts intercellulaires, par la méthode du calcium switch.

J'ai ainsi montré que la présence de ZO1 précède celle de GFP-shroom2 aux contacts

intercellulaires en voie de formation. Pour tester si ZO1 est suffisant au recrutement de

shroom2 à la membrane, des fibroblastes LE, cellules exprimant la E-cadhérine humaine de

manière stable mais ne formant pas de jonctions serrées, ont été transfectés avec le plasmide

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GFP-shroom2. Dans ces cellules, bien que ZO1 endogène soit présent à la membrane

plasmique, GFP-shroom2 reste diffus dans le cytoplasme. Ces résultats indiquent que le

recrutement de ZO1 aux contacts intercellulaires ne suffit pas pour permettre celui de

shroom2.

c) Shroom2 se lie à la F-actine

Lorsque shroom2 fusionné à la GFP est surexprimé dans les cellules MDCK, une

augmentation de l'intensité du marquage de la F-actine par la phalloïdine est toujours

observée. Dans les épithéliums sus-mentionnés, shroom2 est également colocalisé avec les

microfilaments d'actine. Je me suis alors demandé si shroom2, comme shroom3 (Hildebrand

& Soriano, 1999), pourrait se lier à la F-actine. Dans les cellules MDCK exprimant

GFP-shroom2 et mises en présence de cytochalasine D (qui dépolymérise la F-actine),

GFP-shroom2 reste colocalisée avec l'actine. Lorsque l'on transfecte la partie N-terminale de

shroom2, couvrant le domaine MBR, dans les cellules MDCK, de longs filaments d'actine

persistent même en présence de cytochalasine D. Enfin, des expériences de co-sédimentation

in vitro ont montré que la partie N-terminale de shroom2, lorsqu'elle est mise en présence de

F-actine, co-sédimente avec l'actine. Ces observations suggèrent que shroom2 se lie à la

F-actine, et la stabilise.

3/ Conclusion et perspectives

Dans l’embryon de souris, shroom3 est situé aux jonctions d’adhérence des cellules du

tube neural. Shroom3 régule la formation du réseau contractile d’acto-myosine associé aux

jonctions d'adhérence, en contrôlant la distribution de la myosine II. Je propose donc, qu’au

travers des interactions shroom2/myosin VIIa et shroom3/myosin II, des mécanismessemblables assurent une liaison dynamique entre la membrane plasmique et le cytosquelette

d’actine au niveau des jonctions serrées et des jonctions d’adhérence respectivement.

Au regard des résultats obtenus par la méthode du calcium switch, shroom2 ne semble

pas impliqué dans les étapes initiales de la formation des tout premiers contacts

intercellulaires. Mais shroom2 est-il requis pour la maturation des jonctions serrées? Pour

répondre à cette question, j'inhiberai l'expression endogène de shroom2, par une approche

« ARN interférence », dans les cellules MDCK. J'examinerai, dans les cellules où l'expression

83



de shroom2 est inhibée versus dans les cellules témoins, la cinétique de formation et de

maturation des jonctions intercellulaires par la méthode du calcium switch, avec comme

marqueur des jonctions d'adhérence la E-cadhérine ou la β-caténine, et comme marqueur des

jonctions serrées, ZO1 ou les claudines ou les occludines. Par ailleurs, je mesurerai, durantcette cinétique, la résistance trans-épithéliale par unité de surface, qui doit augmenter

progressivement pour atteindre une valeur maximale d'environ 350cm2 après 6h de

rétablissement d'une concentration physiologique de Ca2+ (pour la lignée de cellules

MDCK II), témoignant que les jonctions serrées sont matures.

La surexpression de shroom2 s'accompagne d'une augmentation de la concentration de

F-actine aux jonctions serrées, ce qui suggère que shroom2 a un effet sur la concentration

d'actine jonctionnelle. Shroom2 a-t-il la capacité de renforcer les jonctions serrées? Si tel estle cas, on s'attend à ce que la cinétique d'ouverture des jonctions serrées soit plus longue

quand shroom2 est surexprimé. Pour tester cette hypothèse, je mesurerai, en continu, la

résistance trans-épithéliale d'un tapis de cellules MDCK surexprimant ou non shroom2, suite

à l'ajout d'EGTA, une substance qui chélate le Ca2+, dans le milieu de culture. L'augmentation

de la concentration de F-actine aux jonctions serrées pourrait aussi s'accompagner d'une

baisse de la perméabilité des jonctions serrées. Si tel est la cas, on s'attend à ce la perméabilité

soit inversement proportionnelle à la concentration de shroom2 aux jonctions serrées. Je

testerai cette hypothèse sur des cellules MDCK inductibles pour l'expression de shroom2, par

la doxycycline (lignée MDCK Tet-On). Je mesurerai alors la résistance trans-épithéliale pour

divers taux d'expression de shroom2.

Enfin, pour tester l'importance de shroom2 dans la fonction auditive et analyser sa

fonction dans la cochlée, J'ai entrepris l'inactivation conditionnelle du gène correspondant

chez la souris. Ces souris mutantes permettront aussi d'apprécier si shroom2 est nécessaire au

recrutement de la myosine VIIa aux jonctions hétérotypiques, entre cellules sensorielles et

cellules de soutien dans la cochlée. Les rôles possibles du complexe shroom2-myosine VIIa

dans les cellules sensorielles seront abordés dans la discussion générale.

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ARTICLE 2

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2838 Research Article

IntroductionEpithelia have specialized intercellular structures involved incell-cell contacts. The apical junctional complex (AJC)comprises the tight junction (TJ) and the subjacent adherens junction (AJ). The AJ is involved in initiating and maintainingadhesion between adjacent cells, whereas the TJ controlsparacellular permeability and maintains cell polarity. The TJand AJ are associated with thick bundles of actinmicrofilaments, which form a characteristic perijunctionalactin ring at the apical pole of differentiated epithelial cells(Mooseker, 1985; Madara, 1998; Turner, 2000). Both the TJand AJ are multiprotein complexes that consist of integral

membrane proteins and the cytosolic junctional plaques(Perez-Moreno et al., 2003; Schneeberger and Lynch, 2004;Miyoshi and Takai, 2005). TJ integral membrane proteinsinclude occludin, claudins and junctional adhesion molecules(JAMs), which interact with their counterparts at the plasmamembrane of adjacent cells. Among the growing number of proteins identified in the TJ plaque is an array of PDZ-domain-containing proteins, such as members of the ZO family, whichact as submembranous scaffolding molecules that bridge TJcomplexes to the actin cytoskeleton. Some of these TJ proteinsalso participate in intracellular signaling pathways that regulategene expression (Matter and Balda, 2003; Ivanov et al., 2005b).

Both the actin cytoskeleton and myosin II have been

involved in the formation and functioning of the AJC. Activecytoskeletal rearrangements, through de novo actinpolymerization, have been shown to mediate the formation of both the AJ and TJ (Vasioukhin et al., 2000; Verma et al., 2004;Ivanov et al., 2005a). This tight association to actin filamentsis also responsible for the maintenance of the mature AJC(Fanning, 2001; Bershadsky, 2004). Myosin II is involved,through the Rho kinase pathway, in the localization andaccumulation of E-cadherin at cell-cell contacts, therebypromoting AJ integrity (Shewan et al., 2005). Myosin II alsoplays a crucial role in TJ formation (Ivanov et al., 2005a).Along the same line cingulin, a peripheral component of the

TJ that interacts with myosin II, has been proposed to transducethe force produced by the contraction of the actomyosincytoskeleton to TJ proteins (Cordenonsi et al., 1999).Moreover, there is increasing evidence that the perijunctionalactin ring directly regulates TJ permeability through thecortical tension generated by actomyosin contraction (Turner,2000).

The myosin superfamily comprises myosin II (conventionalmyosin) and 17 classes of unconventional myosins (Krendeland Mooseker, 2005). Myosin II forms bipolar filaments thatare crucial for contractile properties. By contrast,unconventional myosins do not assemble into filaments. Thebinding of their tails to specific proteins and/or lipids is thought

Defects in myosin VIIa lead to developmental anomalies of the auditory and visual sensory cells. We sought proteinsinteracting with the myosin VIIa tail by using the yeasttwo-hybrid system. Here, we report on shroom2, asubmembranous PDZ domain-containing protein that isassociated with the tight junctions in multiple embryonicand adult epithelia. Shroom2 directly interacts with the C-terminal MyTH4-FERM domain of myosin VIIa and withF-actin. In addition, a shroom2 fragment containing theregion of interaction with F-actin was able to protect actinfilaments from cytochalasin-D-induced disruption inMDCK cells. Transfection experiments in MDCK and LE(L fibroblasts that express E-cadherin) cells led us toconclude that shroom2 is targeted to the cell-cell junctionsin the presence of tight junctions only. In Ca2+-switchexperiments on MDCK cells, ZO-1 (also known as TJP1)

preceded GFP-tagged shroom2 at the differentiating tight junctions. ZO-1 directly interacts with the serine- andproline-rich region of shroom2 in vitro. Moreover, the twoproteins colocalize in vivo at mature tight junctions, andcould be coimmunoprecipitated from brain and cochlearextracts. We suggest that shroom2 and ZO-1 form a tight-

junction-associated scaffolding complex, possibly linked tomyosin VIIa, that bridges the junctional membrane to theunderlying cytoskeleton, thereby contributing to thestabilization of these junctions.

Supplementary material available online at

http://jcs.biologists.org/cgi/content/full/120/16/2838/DC1

Key words: Myosin VIIa, Shroom2, F-actin, ZO-1, Tight junctions

Summary

Shroom2, a myosin-VIIa- and actin-binding protein,

directly interacts with ZO-1 at tight junctions

Raphaël Etournay1,*, Ingrid Zwaenepoel1,*,‡, Isabelle Perfettini1, Pierre Legrain2, Christine Petit1 andAziz El-Amraoui1,§

1INSERM UMRS 587, Unité de Génétique des Déficits Sensoriels, Institut Pasteur, 25 rue du Dr Roux, 75015 Paris, France2Département de Biologie Joliot-Curie, CEA, 91191 Gif-sur-Yvette, France*These authors contributed equally to this work‡Present address: Department of Pathology and Immunology, Faculty of Medicine – CMU, 1 rue Michel Servet, CH-1211 Geneva 4, Switzerland§Author for correspondence (e-mail: [email protected])

Accepted 18 June 2007 Journal of Cell Science 120, 2838-2850 Published by The Company of Biologists 2007 doi:10.1242/jcs.002568

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2839Shroom2 at the tight junction

to position these motors at certain intracellular locations. Themotor activity of their head is then harnessed to exert a tensionon the molecules. Unconventional myosins either move alongactin filaments and convey tethered vesicles and/or proteins, oranchor vesicles or proteins to actin filaments and exert atension force on these components (Krendel and Mooseker,2005). These motors have been implicated in a variety of

cellular functions including membrane trafficking, cellmovements and signal transduction (Krendel and Mooseker,2005). Among the unconventional myosins, myosin VIIa hasbeen proposed to be involved in cell adhesion processes.Indeed, myosin VIIa is abundant at cell-cell junctions andbinds to vezatin, a putative transmembrane protein of the AJ,associated with the cadherin-catenin complex (Kussel-Andermann et al., 2000). Moreover, myosin VIIa is associatedwith Keap1 (a mammalian homologue of the Drosophila ringcanal protein Kelch), a submembranous protein present in theectoplasmic specialization, a dynamic adhesion structure thatforms between Sertoli cells in the testis (Velichkova et al.,2002).

Mutations in the gene encoding myosin VIIa are responsiblefor the most prevalent genetic form of Usher syndrome type I(USH1), a disease characterized by congenital deafness,vestibular dysfunction, and progressive retinitis pigmentosaleading to blindness (Weil et al., 1995; El-Amraoui and Petit,2005). With the objective of getting a deeper understanding of the role of myosin VIIa in the inner ear and retinal sensorycells, we sought proteins interacting with the tail of this myosinin the yeast two-hybrid system. We thereby identified shroom2,a protein located at the TJs of embryonic and adult epithelia.

ResultsShroom2, a submembranous PDZ-domain-containingprotein, binds to myosin VIIa

The C-terminal fragment of myosin VIIa containing SH3,MyTH4 and FERM domains (aa 1605-2215; Fig. 1A) was usedas the bait to screen a yeast two-hybrid mouse inner ear cDNAlibrary (Boeda et al., 2002). Among the potential ligandsisolated was a prey composed of 368 aa (aa 350-721) of themurine shroom2 (hereafter referred to as mShrm2; Fig. 1B), amember of the shroom family of proteins. The shroom familyconsists of four different proteins, shroom1 (Shrm1, alsoknown as Apx) (Staub et al., 1992; Zuckerman et al., 1999),shroom2 (Shrm2, also known as Apxl), shroom3 (Shrm3, alsoknown as KIAA1481), and shroom4 (Shrm4, also known asKiaa1202) (Staub et al., 1992; Zuckerman et al., 1999), definedby the arrangement of at least two out of three conservedsequence motifs (Hagens et al., 2006 and references therein).

By using race-PCR on a mouse vestibular cDNA library andsequence comparison with ESTs, we reconstituted a cDNAcontaining an entire open reading frame of 4461 bp, thatdisplays 74% nucleotide sequence identity with the humanshroom2 coding sequence. The deduced shroom2 amino acidsequence predicts a 1487 aa protein (163.5 kDa) with a PDZdomain (aa 27-107), a serine- and proline-rich domain (SPR;aa 123-326, 21% serine and 10% proline residues), the myosin-VIIa-binding region (MBR; aa 350-721), and the two Apx-Shroom domain (ASD) motifs ASD1 (aa 705-807) and ASD2(aa 1191-1487) (see Fig. 1B).

In transfected HeLa cells expressing the GFP-taggedshroom2 MBR (GFP-mShrm2MBR) only, we observed a

punctate staining throughout cell bodies and also peripherallong GFP-labeled structures associated to F-actin (openarrowheads, Fig. 1C). In co-transfected cells that express bothGFP-mShrm2MBR and the myosin VIIa tail, the two proteinscolocalized in the punctate structures (arrows, Fig. 1D). Tofurther map the myosin-VIIa-binding site in shroom2, wegenerated a construct encoding the N-terminal part of MBR (aa

350-563), mShrm2MBRC. In transfected HeLa cells, GFP-tagged mShrm2MBRC (GFP-mShrm2MBRC) exhibited adiffuse cytoplasmic staining (Fig. 1E), whereas addition of the myosin VIIa tail resulted in colocalization of GFP-mShrm2MBRC and myosin VIIa tail (arrows, Fig. 1F). Thisdifference in the labeling pattern suggested that this shroom2fragment is able to interact with the myosin VIIa tail. We thentested the direct interaction between mShrm2MBR and themyosin VIIa tail by in vitro binding assays (Fig. 1G). The 35S-labeled myosin VIIa tail (aa 847-2215), SH3/MyTH4/FERM(aa 1612-2215) and MyTH4/FERM (aa 1752-2215) fragmentsdid bind to GST-mShrm2MBR, whereas a peptide containingthe SH3 and MyTH4 domains only (aa 1605-1907) did not(Fig. 1G). None of the myosin VIIa fragments bound to GSTalone. These results suggested that the C-terminal FERMdomain of myosin VIIa mediates the interaction with shroom2.Similar experiments carried out with either the 35S-labeledMyTH4 domain (aa 1752-1890) or the FERM domain (aa1896-2215) alone, however, failed to detect any interactionwith mShrm2MBR in both cases (not shown). In the reciprocalexperiments, immobilized biotin-tagged myosin VIIaMyTH4/FERM or FERM fragments alone were incubated withsupernatants containing GST-mShrm2MBR. The GST-taggedmShrm2MBR did bind to myosin VIIa MyTH4/FERM, but notto myosin VIIa FERM (supplementary material Fig. S1A).These results indicate that the entire C-terminal repeat,composed of both the MyTH4 and FERM domains, is

necessary for the binding of myosin VIIa to shroom2. Toconfirm that shroom2 and myosin VIIa can form a complex ina cellular context, we carried out coimmunoprecipitationassays. Since our antibodies against myosin VIIa and shroom2did not immunoprecipitate the corresponding proteins(supplementary material Fig. S1B-D), we used HEK293 cellsexpressing both Myc-tagged full-length shroom2 (Myc-mShrm2) and either the myosin VIIa tail or full-length myosinVIIa (Fig. 1H). By using the anti-Myc antibody, both themyosin VIIa tail and full-length myosin VIIa were co-immunoprecipitated with Myc-tagged shroom2 (Myc-mShrm2), but not with the Myc-tag alone (Fig. 1H). Together,these results show that shroom2 directly interacts with myosinVIIa, through the MBRC region and C-terminal MyTH4/

FERM repeat.

Shroom2 is an F-actin-binding proteinTo analyze the distribution of shroom2, we producedpolyclonal antibodies against a mixture of two syntheticpeptides derived from the shroom2 protein sequence (seeMaterials and Methods, and supplementary material Fig. S1B).Because immunofluorescence analysis of several epithelial celllines (MDCK, LLC-PK, Caco-2 cells) showed faint shroom2immunoreactivity (Fig. 2A), we studied the subcellulardistribution of full-length shroom2 or various truncated formsin transfected cells (Fig. 2B; supplementary material Fig. S2).In MDCK cells expressing GFP-tagged full-length shroom2

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(GFP-mShrm2), the protein was targeted to the AJC (Fig. 2B),in accordance with the endogenous shroom2 labeling. Both


endogenous shroom2 and GFP-mShrm2 were moreconcentrated at tricellular contacts (arrowheads in Fig. 2A,B).

Fig. 1. Myosin VIIa binds to shroom2. (A,B) Domain structures of (A) myosin VIIa and (B) shroom2 (mShrm2). The domain composition andposition of the yeast two-hybrid bait (myosin-VIIa–SH3-MyTH4-FERM) and of the prey clone (mShrm2MBR) are indicated. (B) Shroom2consists of an N-terminal PDZ domain, an SPR, an MBR, and the ASD1 and ASD2 domains. (C) In transfected HeLa cells expressing GFP-tagged shroom2 MBR (GFP-mShrm2MBR; prey) alone, the protein exhibits a punctate cytoplasmic staining and is also particularly abundant incytoplasmic extensions (arrowheads). (D) In co-transfected HeLa cells expressing both the prey GFP-mShrm2MBR (left panel) and MyosinVIIa tail (right panel), the two proteins colocalize in punctate structures (arrows) in the cytoplasm, arrowhead indicates cytoplasmic extension.(E) In transfected HeLa cells expressing GFP-tagged mShrm2MBRC (GFP-mShrm2MBRC, aa 350-563) alone, the fusion protein is

diffusely distributed throughout the cytoplasm. (F) In co-transfected HeLa cells expressing both GFP-mShrm2MBRC (left panel) and MyosinVIIa tail (right panel), the two proteins colocalize in cytoplasmic punctate structures (arrows). Bars, 10 m. (G) 35S-labeled myosin VIIafragments (1-4 in upper panel) were incubated with either GST-mShrm2MBR or GST alone (see blots in bottom panels). The 35S-labeledmyosin VIIa tail binds to GST-mShrm2MBR but not to GST (two lanes on left side (1) of right blot). Fragments 2 and 4 (Myosin VIIaSH3/MyTH4/FERM and Myosin VIIa MyTH4/FERM, respectively) bind to GST-mShrm2MBR (lanes 2 and 4 in right blot), whereas the SH3-MyTH4 fragment does not (lane 3 in right blot). (H) Co-immunoprecipitation assay. HEK293 cells were co-transfected with plasmids encodingeither the full-length myosin VIIa and yc-tagged shroom2 (Myc-mShrm2) or the full-length myosin VIIa and Myc tag alone (Myosin VIIa)(middle panels). The same experiment was carried out using the untagged myosin VIIa tail (Myosin VIIa tail) instead of the entire protein (toppanels). Upon immunoprecipitation with the anti-Myc antibody, immunoblots were probed with antibodies against myosin VIIa or shroom2 asindicated. Both the Myosin VIIa and Myosin VIIa tail co-immunoprecipitate with Myc-mShrm2 (bottom panel).

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Truncated GFP-mShrm2 fragments (GFP-mShrm2PDZ,GFP-mShrm2PSP, GFP-mShrm2MBR-ASD1) were detectedat cell-cell contacts, whereas GFP-mShrm2MBRC and a C-terminal fragment containing ASD2 gave a diffuse labeling(supplementary material Fig. S2 and data not shown).Overexpression of either GFP-mShrm2 or GFP-mShrm2MBRresulted in a significant increase of the F-actin labeling intransfected cells, compared with the non-transfectedneighbouring cells (Fig. 2C,E, and supplementary material Fig.

S6B). In addition, cells expressing GFP-mShrm2MBR showedmany F-actin clumps (Fig. 2E). Transfected cells were treatedwith cytochalasin D, which binds to the barbed end of actinfilaments and alters actin polymerization (Fig. 2D,F). In cellsproducing GFP-mShrm2, both the cortical actin filaments andthe stress fibres were disrupted, and GFP-mShrm2 wasdetected in the same spots as F-actin (Fig. 2D). By contrast,the large filaments co-labeled for F-actin and mShrm2MBRresisted disassembly in the presence of cytochalasin D (Fig.

Fig. 2. Shroom2 binds to F actin. (A,B) Using (A) the anti-mShrm2R1 antibody, faint shroom2 labeling is observed in some MDCK cells,especially at cell-cell contacts. Shroom2 colocalizes with ZO-1 (yellow in right panel) especially at tricellular contacts. In (B) transfectedMDCK cells that express GFP-labeled full-length shroom2 (GFP-mShrm2) a similar distribution pattern is displayed. Both endogenousshroom2 (A) and GFP-mShm2 (B) labeling is more intense at tricellular contacts (arrowheads in A and B). The TJs are visualized by ZO-1labeling (red in A,B). (C,D) In MDCK cells expressing GFP-mShrm2 that were treated with cytochalasin D, the GFP-mShrm2 (green)colocalizes with F-actin (red), along the cell membrane. (E,F) By contrast, in cells expressing GFP-mShrm2MBR (green) that were treated withcytochalasin D, the large F-actin bundles induced by overexpression of GFP-mShrm2MBR (red) are protected against depolymerization(arrowheads). (G) In MDCK cells that express GFP alone, a diffuse GFP staining is observed in cytochalasin-D-treated cells. (H) F-actin co-sedimentation assay. Lanes 1 and 2 contain the soluble and pellet fractions of GST-mShrm2MBR, respectively, obtained upon high-speedcentrifugation. GST-mShrm2MBR is not recovered in the pellet fraction (lane 2). When the same amount of GST-mShrm2MBR is incubated

with F-actin at 37°C for 30 minutes (lanes 3 and 4), almost all GST-mShrm2MBR is recovered with F-actin in the pellet fraction afterultracentrifugation (lane 4). GST alone was used as a negative control (lanes 5 and 6). Bars, 20 m.

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2F), thus indicating that mShrm2MBR is able to stabilize actinfilaments. Dietz et al. have shown that a region of shroom2composed partly of the MBR and the ASD1 domain (aa 513-880) binds to F-actin (Dietz et al., 2006). By in vitro co-sedimentation assays, we showed that, in the presence of F-actin, the bulk of the GST-tagged mShrm2MBR fusion proteinco-sediments with F-actin, whereas in the absence of F-actin,

GST-tagged mShrm2MBR is present in the supernatant (Fig.2H). Also, MDCK cells expressing GFP-mShrm2MBRC (aa350-563) exhibited a diffuse cytoplasmic labeling, with noparticular colocalization with F-actin (data not shown).Together, these results suggest that the region of shroom2 thatbinds to F-actin, which will be referred to as ABR (for actin-binding region; aa 563-721), resides in the C-terminal part of MBR (see supplementary material Fig. S7A).

Shroom2, a TJ protein of embryonic and adult epitheliaTo explore the relevance of shroom2 association with the actincytoskeleton, we analyzed subcellular distribution of shroom2in vivo. In agreement with the results obtained by Dietz et al.


(Dietz et al., 2006), shroom2 was detected at the AJC of mouseembryonic epithelial and endothelial cells (Figs 3, 4, 5). Wefurther explored shroom2 distribution in adult mouse epithelia.Shroom2 labeling was detected at the most apical border of cell-cell contacts in all tested epithelia, i.e. in the nasal cavity,brain, inner ear, retina, submandibular gland, lung, liver,pancreas, stomach, intestine, kidney and testis (Figs 3, 4, 5,

supplementary material Fig. S3, and data not shown).Expression of mShrm2 in neuronal processes may beassociated with the TJ-like structures that form between themyelin sheath lamellae (Dermietzel and Kroczek, 1980).Because some of the retinal and inner ear anomalies in myosin-VIIa-defective mice (Liu et al., 1998; Self et al., 1998; Liu etal., 1999) might result from a disruption of the interactionbetween myosin VIIa and shroom2, we focused on thedistribution of shroom2 in these sensory organs. In the retina,shroom2 was first detected at embryonic day 12 (E12) in thedifferentiating pigment epithelium, and the labeling thenincreased from E14 onwards (Fig. 4A-C). Analysis at 3 weeksand at 3 months of age showed that the bulk of shroom2

Fig. 3. Shroom2 in embryonic and adult mouse epithelia. (A,B) In embryonic mouse epithelia, at E15, the shroom2 staining (green)significantly overlaps with that of ZO-1 (red) in (A) the olfactory epithelium, and (B) the choroid plexus. (C-F) At adult stages (P20 and P90),in (C,D) the gastric glands and (E,F) small intestine, shroom2 colocalizes with ZO-1 at the TJs (yellow in C and E), but not with (D) -cateninor (F) E-cadherin. Bars, 10 m.

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immunoreactivity is in retinal pigment epithelium (RPE) cells(Fig. 4C,D, supplementary material Fig. S4), and also in someneuronal extensions in the inner plexiform layer of theneuroretina, where bipolar cells and interneurons of the inner

nuclear layer synapse with ganglion cells (Fig. 4C). In the innerear, the shroom2 labeling progresses differently during themorphogenesis period and maturation steps of the auditoryorgan (Fig. 5). Intense staining of shroom2 showed that it wasequally distributed at the apical part of all epithelial cells facingthe luminal space of the early developing cochlear andvestibular organs (Fig. 5A and data not shown). At lateembryonic and postnatal stages in the cochlea, strong shroom2labeling was detected at the tightly joined apical surfaces of sensory cells (hair cells) and supporting cells, that form thereticular lamina (Fig. 5B-D; supplementary material Fig. S5B),and in the apical region of the stria vascularis marginal cells(Fig. 5E, supplementary material Fig. S5A). Notably, the

labeling was even more intense at tricellular contacts(arrowheads in Fig. 5E). Labeling of Shroom2 and myosinVIIa overlapped in the apical region of cochlear (Fig. 5F;supplementary material Fig. S5B) and vestibular (not shown)

hair cells. Analysis of shroom2 in the hair cells of myosin VIIadefective shaker-1 B4626SB mice, did not show any significantalteration in the distribution of shroom2 (Fig. 5G), suggestingthat myosin VIIa is not required for targeting of shroom2 tothe TJ in hair cells.

Double immuno-labeling experiments with TJ and AJmarkers were carried out in various epithelia to define theprecise shroom2 distribution within the AJC. In all theanalyzed epithelia, i.e. olfactory epithelium (Fig. 3A), choroidplexus (Fig. 3B), gastric glands (Fig. 3C,D), intestinal cells(Fig. 3E,F), retinal pigment epithelial cells (Fig. 4D,supplementary material Fig. S4) and inner ear epithelial cells(Fig. 5A-D, supplementary material Fig. S5B), we found that

Fig. 4. Shroom2, myosin VIIa and ZO-1 in the mouse retina. (A-F) Sections of the mouse retina at (A,B) E14 and P90 (C-F). Shroom2 isdetected in the retinal pigment epithelium (RPE) cells, and some neuronal extensions in the inner region of the neuroretina. (C-F) Shroom2 isconcentrated at the TJs, where it is co-distributed with ZO-1 (red). The neuronal labeling of shroom2 persists in adults, in the inner plexiformlayer (IPL). (E,F) Adjacent tangential sections of the P90 mouse retina labeled for ZO-1 and either shroom2 or myosin VIIa. Note that shroom2is co-distributed essentially with ZO-1 at the TJ zone, whereas myosin VIIa is present throughout the cytoplasm, and in the apical microvilli.Colocalization with ZO-1 is illustrated in the confocal orthogonal (YZ ) reconstructions. ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer,GCL, ganglion cell layer. Bars, 10 m.

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shroom2 colocalized with occludin (not shown), and ZO-1(also known as TJP1) at the apical most border. By contrast,no significant colocalization was observed between shroom2and the AJ proteins -catenin and E-cadherin (Fig. 3D,F; andsupplementary material Fig. S3D). We conclude that shroom2is preferentially targeted to the TJs, in embryonic and adultepithelia.

Shroom2 targeting requires pre-existing TJsTo get insight of the role shroom2 plays in the formation and/orthe maintenance of TJs, we studied the distribution of GFP-mShrm2 during the establishment of cell-cell contacts in


MDCK cells. The cells were analyzed at various times duringthe formation of contacts between cells. In isolated and non-confluent cells, GFP-mShrm2 displayed a cytoplasmic stainingand colocalized with F-actin (Fig. 6A). In islands of differentiating MDCK cells, we observed shroom2 associatedwith the plasma membrane exclusively at the sites of initialcell-cell contacts (arrowheads Fig. 6B). However, shroom2 wasnot recruited to all cell-cell contacts, visualized by the ZO-1staining (arrows, Fig. 6B; and supplementary material Fig.S6A). As cells became confluent and cell-cell junctions moredifferentiated, both GFP-mShrm2 and ZO-1 were broadlydistributed along the junctional sites (Fig. 6C, and

Fig. 5. Spatiotemporal shroom2 distribution in the mouse auditory epithelia. (A-D) At E12, shroom2 colocalizes with ZO-1 at the apical surfaceof all the epithelial cells delineating the cochlear duct (cd) (A). As development proceeds, the shroom2 labeling becomes more intense in thesensory epithelium (organ of Corti) (B). At birth, a transient diffuse labeling is observed throughout the cytoplasm of the sensory inner (IHC),and outer (OHC) hair cells (* over cell bodies), and pillar (p) cells (C). This cell body labeling decreases at later stages, and is not detectedfrom P10 onwards (D). The bulk of shroom2 labeling is associated with the tightly joined apical domains of the hair cells and their adjacentsupporting cells, forming the reticular lamina (D), and also at the apical cell-cell junctions of the marginal cells in the stria vascularis(arrowheads in E). The stria vascularis is a bilayer epithelium of the cochlear duct lateral wall, which secretes K + in the endolymph (the fluidfiling the cochlear duct) and produces the endocochlear potential. (F) Whole-mount preparation of a mouse organ of Corti at P2, illustrating thecodistribution of shroom2 and myosin VIIa. (G) The absence of myosin VIIa in shaker-1 mutant mice does not alter the normal targeting of shroom2 in the hair cells. Stronger shroom2 labeling is observed in the reticular lamina, whereas weaker labeling is seen in other supportingcells (arrows). Bars, 10 m.

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supplementary material Fig. S6A). In such confluent cells,GFP-mShrm2 was colocalized with the TJ proteins ZO-1 andoccludin, whereas only limited colocalization was observedwith -catenin (Fig. 6C).

We then analyzed the kinetics of the junctional targeting of shroom2 in stably transfected MDCK cells producing eitherGFP-mShrm2 or GFP alone (Fig. 7, and supplementarymaterial Fig. S6C). MDCK cells were pre-treated with trypsin-EDTA to break all the junctions and individualize cells, asdescribed (Nigam et al., 1992; Riesen et al., 2002). Cells weresubmitted to long-term Ca2+ depletion (20 hours in low-Ca2+medium), which resulted in GFP-mShrm2 and ZO-1localizing in a diffuse pattern or in dot-like cytoplasmicstructures (t =0 hours in Fig. 7). After restoration of the normal

Ca2+

concentration, cell-cell contacts were progressivelyrestored. Within 1 hour after addition of Ca2+, MDCK cellsproducing GFP-mShrm2 or GFP alone displayed the samekinetics of ZO-1 recruitment to the cell-cell junctions (t =1 hourin Fig. 7, and supplementary material Fig. S6C). ZO-1fluorescence intensity displayed a heterogeneous distributionat cell-cell junctions, whereas GFP-mShrm2 was still diffusein the cytoplasm. Within 2 hours (t =2 hours in Fig. 7), GFP-mShrm2 reached the plasma membrane only in cells whereZO-1 was present at cell-cell contacts. Moreover, there was astrong correlation between the GFP-mShrm2 and ZO-1fluorescent signal intensities at cell-cell junctions (Fig. 7, t =2hours). Within 4, 7 and 24 hours in the presence of Ca2+, ZO-

1 and GFP-mShrm2 were homogeneously distributed along thecell-cell contacts, and were especially abundant at tricellular junctions (t =7 hours in Fig. 7, and data not shown).

Since the experiments in MDCK cells showed that ZO-1recruitment at the TJ precedes that of shroom2, we askedwhether ZO-1 is sufficient to target shroom2 to the TJ. GFP-mShrm2 was expressed in stably transfected L fibroblastsproducing human E-cadherin. These cells (LE cells) form E-cadherin-mediated AJ that contain ZO-1 but lack TJ (Itoh etal., 1993). In non-confluent LE cell cultures, GFP-mShrm2was found in the cytoplasm, associated with F-actin-richstructures (Fig. 8A), reminiscent of the labeling in non-confluent MDCK cells (Fig. 6A). At cell confluence, GFP-mShrm2 became more diffuse in the cytoplasm, and could not

be detected at the cell-cell junctions (Fig. 8B-D). This resultindicates that ZO-1 is not sufficient to target shroom2 to cell-cell contacts.

Shroom2 directly interacts with ZO-1Transfection experiments showed that the PDZ and SPRdomains (PSP) of shroom2 are sufficient to target the proteinto the cell-cell contacts (supplementary material Fig. S2). Toidentify putative shroom2-binding partners at the TJ, we thusused a shroom2 fragment that contained the PDZ and SPRdomains as the bait (mShrm2PSP; aa 1-356) to screen the innerear cDNA library in the yeast two-hybrid system (Fig. 9A). Weidentified two independent clones encoding a ZO-1 fragment

Fig. 6. Shroom2 targeting requires the presence of TJs. (A) In non-confluent MDCK cells, GFP-mShrm2 displays a punctate labeling, thatperfectly colocalizes with F-actin (red) in the cytoplasm or beneath the plasma membrane. (B) In nascent cell-cell contacts, as shown in theperipheral cells of MDCK islands, GFP-mShrm2 is recruited to the plasma membrane at the AJC. GFP-mShrm2 is present in some(arrowheads) but not all junctional regions visualized by ZO-1 labeling (arrows). (C) Upon cell confluency, GFP-mShrm2 spreads to all

junctional sites, as shown in Caco-2 cells. In these cells, GFP-tagged shroom2 colocalizes with occludin and ZO-1 but not with -catenin; seeconfocal orthogonal (YZ ) reconstructions at the bottom.

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(aa 444-1015) that contains part of the third PDZ domain, SH3and guanylate kinase (GuK) domains, and the acid rich region(Fig. 9A). The direct interaction between shroom2 and ZO-1was confirmed by in vitro binding assays. Either the GST-tagged ZO-1 prey or GST alone was incubated with 35S-labeledshroom2 fragments (Fig. 9B). The GST-tagged ZO-1 preybound to full-length shroom2 and to mShrm2PDZ (aa 214-1487), but not to mShrm2ASD2 (aa 931-1487; used as an


internal control) (Fig. 9B) or MyRIP/Slac2c (used as anunrelated control) (not shown). This result indicates that theshroom2-PDZ domain does not mediate the interaction withZO-1. Using 35S-labeled shroom2 fragments containing boththe PDZ domain and SPR region (mShrm2PSP; aa 1-356), thePDZ domain alone (mShrm2PDZ; aa 1-118) or the SPR regionalone (mShrm2SPR; aa 119-356) (Fig. 9B), we found that theSPR region is sufficient for the binding of shroom2 to ZO-1.

Fig. 7. Shroom2 recruitment at the forming TJs after calcium switch in MDCK cells. The lines were used to calculate the fluorescence intensityin line scan. In micrographs, dots with numbers indicate fluorescence intensity at cell edges. Blue asterisks indicate nontransfected cells that donot express GFP-mShrm2. In the fluorescence intensity profiles, vertical blue lines delineate the emplacement of these cells that were used asan internal control for fluorescence quantification. After 20 hours of incubation in low-Ca2+ medium (t =0), cells were fixed and analyzed 1 hour(t =1 hour), 2 hours (t =2 hours) and 7 hours (t =7 hours) after Ca2+ repletion. At t=0, the fluorescence intensity profiles of transfected cellsindicate that both ZO-1 (red) and GFP-mShrm2 (green) are distributed throughout the cytoplasm. At t =1 hour, ZO-1 is recruited at cell-cell

junctions in a discontinuous pattern, whereas GFP-mShrm2 is not yet present at the junctions. At t =2 hours, GFP-mShrm2 is mainly detected atcell-cell junctions and the intensity of the labeling at the junctions correlates with that of ZO-1. At t =7 hours, ZO-1 and GFP-mShrm2 displaycontinuous fluorescence patterns along the junctions, and both protein labelings are more intense at tricellular junctions. Bars, 20 m.

94




To determine the site at which ZO-1 binds to shroom2,different ZO-1 fragments fused to GST were produced andincubated with 35S-labeled full-length shroom2 or 35S-labeledSPR domain (mShrm2-SPR) only (Fig. 9C). Shroom2 boundto the SH3/GuK domains of ZO-1 (aa 513-812), whereas abinding was not observed with two ZO-1-truncated fragments

containing either the N-terminal PDZ3 and SH3 domains (aa444-649) or the GuK domain alone (aa 644-812) (Fig. 9C).Shroom2 also failed to bind to ZO-1 fragments encompassingthe GuK domain followed by the acid rich region (aa 644-891),or by the entire C-terminal part of the prey (aa 644-1015) (datanot shown). We conclude that shroom2, through its SPRdomain, binds to ZO-1 within the SH3/GuK domains. In pull-down experiments, overexpressed shroom2 bound to the GST-tagged ZO-1 prey but not to GST alone (supplementarymaterial Fig. S1E). Finally, we were able tocoimmunoprecipitate endogenous shroom2 and ZO-1, by usingthe anti-ZO-1 antibody on auditory organ and brain extracts(Fig. 9D). We conclude that shroom2 and ZO-1 can alsointeract in vivo.

DiscussionWe identified shroom2, a submembranous PDZ-domain-containing protein, as a new binding partner of myosin VIIa,and showed that shroom2 is a TJ protein that also directlyinteracts with F-actin and ZO-1. Consistent with the resultsobtained by Dietz et al. (Dietz et al., 2006), we found thatshroom2 is present at the AJC in embryonic epithelia. Inaddition, we show that, in adult mouse epithelia, shroom2 isstill present at the AJC and localizes preferentially at the TJs.In transfected epithelial cells expressing shroom2, the proteinwas not detected in nascent TJs that already contained ZO-1,which indicates that shroom2 is not involved in the early stages

of junction formation. Rather, the kinetics of shroom2recruitment at the forming TJs in the Ca2+-switch experimentsuggest that the protein plays a role in TJ stabilization. Indeed,shroom2 contains a PDZ domain and is thus expected to exerta scaffolding function by stabilizing submembranousmolecular complexes. Notably, numerous TJ proteins,

including the two submembranous proteins ZO-2 and ZO-3,the two groups of integral membrane proteins, JAMs andclaudins, possess a typical C-terminal PDZ-binding motif (Schneeberger and Lynch, 2004) and are therefore likelycandidates to interact with shroom2. Moreover, becauseshroom2 can bind to F-actin, it may provide a link between theplasma membrane and the cortical cytoskeleton at the TJ. Ourresults further suggest that the shroom2 MBR subdomainstabilizes actin filaments because it was able to protect F-actinfrom cytochalasin-D-induced disruption in transfected MDCKcells. Finally, the abundance of shroom2 at TJs in matureepithelia, which are very tight (e.g. marginal cell layer of thecochlear stria vascularis) (Jahnke, 1975) or are continuouslysubmitted to shearing forces (e.g. reticular lamina of the organ

of Corti) (Nowotny and Gummer, 2006), further supports theidea that shroom2 is involved in the strengthening of the TJs.There is increasing evidence that the TJ, on its cytoplasmic

side, acts as a platform where the trafficking of proteins to theapical versus basolateral zone is controlled (Kohler andZahraoui, 2005). In the AJC region, structural proteins (actin,microtubules, spectrin) and regulatory proteins (actin-bindingproteins, GTPases, kinases) are juxtaposed withtransmembrane proteins (Matter and Balda, 2003;Schneeberger and Lynch, 2004; Kohler and Zahraoui, 2005).The clustering of Rabs, their effectors and the Sec6-Sec8complex close to the TJ has been proposed to provide themachinery required for docking and fusion of transport vesicles

Fig. 8. Shroom2 in mouse L2071 fibroblasts stably transfected with human E-cadherin (LE cells). (A) In non-confluent LE cells thatoverexpress GFP-mShrm2, the protein is scattered within the cytoplasm or linked to the plasma membrane, associated with F-actin. (B-D) Inconfluent LE cells, GFP-mShrm2 is not recruited to the cadherin-mediated cell-cell contacts, visualized by (B) -catenin and (C,D) F-actin.Rather, the GFP-mShrm2 staining is more diffuse, and occasionally forms clusters in the (C, XZ plane) basal, or (B, XZ and YZ planes; C, YZ plane) lateral regions of LE cells. Such clusters were not observed in transfected MDCK or Caco-2 cells (see Fig. 6). XZ and YZ sections showcoronal (F) and orthogonal (r) confocal reconstructions, respectively. Bars, 10 m.

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(see Kohler and Zahraoui, 2005). Shroom2 displays a widertissue distribution compared with that of myosin VIIa, but bothproteins are present in a variety of epithelial cells, includinghair cells, retinal pigment epithelium cells, choroid plexuscells, enterocytes and kidney tubular cells (Sahly et al., 1997;Wolfrum et al., 1998). In these cells, myosin VIIa can bedetected throughout the cell body, and electron microscopy

analyses have shown that this myosin is especially abundant inciliary and microvillar structures (Sahly et al., 1997; Wolfrumet al., 1998). In hair cells, myosin VIIa – like shroom2 – isespecially abundant in the vesicle-rich region at the immediatevicinity of the AJC (Hasson et al., 1997). How then, doesmyosin VIIa act in conjunction with shroom2? It has beenshown in vitro that dimerized myosin VIIa can moveprocessively on actin filaments, and myosin VIIa requires highATP concentrations for its motile activity (Inoue and Ikebe,2003; Yang et al., 2006). By contrast, ADP increases the F-actin-binding affinity of myosin VIIa to actin filaments,suggesting that in subcellular compartments with a high ADPconcentration, myosin VIIa is exerting a tension force (Inoue


and Ikebe, 2003) rather than having a transport function.Collectively, its kinetic parameters would allow myosin VIIato exert and hold tension on actin filaments and, whendimerized, to function as a processive cargo transporter.Therefore, depending on the ATP context in situ, myosin VIIa,in conjunction with shroom2, could be involved in the targetingof a certain set of proteins and/or vesicles at the TJ.

Fairbank et al. have reported that a loss of shroom2 activityresults in defects in both the biogenesis and the apicallocalization of retinal melanosomes in Xenopus (Fairbank etal., 2006). It is worthy of note that also in myosin-VIIa-defective mice, melanosomes do not enter the apical processesin retinal pigment epithelium cells (Liu et al., 1998). MyosinVIIa and shroom2 codistribute at the level of the TJ zone,whereas myosin VIIa and its binding partner MyRIP areespecially abundant in the apical microvilli (El-Amraoui et al.,2002). Therefore, in the retinal pigment epithelium cells, theputative interaction between shroom2 and myosin VIIa couldbe essential to transfer melanosomes from microtubules to theapical actin cytoskeleton in the TJ zone. Once in the microvilli,

Fig. 9. Shroom2 binds to ZO-1 in vitro and in vivo. (A) Domain structure of the shroom2 yeast two-hybrid bait (mShrm2PSP) and of the twoZO-1 preys isolated. (B) Several 35S-labeled shroom2 fragments (labeled 1 to 6) were incubated with the GST-tagged ZO-1 prey (GST- ZO1prey) or GST alone. mShrm2, mShrm2PDZ, mShrm2PSP and mShrm2SPR bind to the GST- ZO1 prey, but not to GST. By contrast,

mShrm2ASD2 and mShrm2PDZ do not bind to the GST-ZO1 prey. (C) Characterization of the shroom2-interaction domain of ZO-1.35

S-labeled shroom2 and 35S-labeled shroom2-SPR only bind to the original GST-ZO1 prey and to the GST-ZO1 SH3/GuK fragment. (D) Proteinextracts from the mouse auditory organ (left panels) or brain (right panels) were used for the immunoprecipitation assays. The endogenousshroom2 protein is immunoprecipitated in the presence of the anti-ZO-1 antibody, but not with protein G alone. Under the conditions we used,ZO-1 immunoprecipitates do not contain myosin VIIa (bottom panels).

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a tripartite complex of myosin VIIa, MyRIP/Slac2c andRab27a would mediate the recruitment and movement of melanosomes along the peripheral actin filaments (El-Amraouiet al., 2002; Fukuda and Kuroda, 2002). This scenario is inagreement with the recent results showing that, in addition totheir link to F-actin, proteins of the shroom family regulate -tubulin distribution and may thus coordinate the assembly of

both microtubule and actin cytoskeletons (Fairbank et al.,2006; Lee et al., 2007).

Among the shroom family members, shroom2 displays thesame modular organization as shroom3a, namely a N-terminal PDZ domain and two C-terminal ASD domains (seesupplementary material Fig. S7A). In primary neural tubecells from mouse embryos, shroom3a is located at the AJs(Hildebrand and Soriano, 1999). Shroom3 regulates theformation of a contractile actomyosin network associatedwith the AJC, and it has been proposed that shroom3regulates the distribution of myosin II at the AJC(Hildebrand, 2005). Therefore, we propose that throughinteractions between shroom2 and myosin VIIa, andshroom3a and myosin II, similar interaction networksbetween the plasma membrane and subcortical actincytoskeleton takes place at the TJ and AJ, respectively (seesupplementary material Fig. S7B).

Materials and MethodsYeast two-hybrid screenings and expression constructsYeast two-hybrid screenings were performed as described previously (Rain et al.,2001) using different baits, namely the C-terminal SH3/MyTH4/FERM fragment of myosin VIIa (aa 1605-2215), and the N-terminal PDZ and SPR domains of shroom2(mShrm2PSP, aa 1-356).

The full-length mouse cDNA encoding shroom2 (GenBank accession numberEF071946) was reconstituted by using race-PCR on a mouse inner ear cDNA libraryand sequence comparison with ESTs. PCR-amplified fragments of myosin VIIa,shroom2 and ZO-1 cDNA were checked prior to transfer to the appropriateexpression vector. Inserts were subcloned into pEGFP (Clontech), pCDNA-DEST-47/53 (Invitrogen), pCMV-tag3B (Myc tag, Stratagene) and pcDNA3 (No tag or

V5/His, Invitrogen) for in vitro translation and transfection experiments, and intopGEX-4T1 (GST tag, Amersham) and pXa3 (biotin tag, Promega) for proteinproduction.

The following fragments were subcloned into the appropriate vectors. For myosinVIIa: myosin VIIa tail (aa 847-2215), SH3/MyTH4/FERM fragment (aa 1612-2215), MyTH4/FERM fragment (aa 1752-2215), SH3/MyTH4 fragment (aa 1605-1907), MyTH4 domain (aa 1752-1890) and FERM domain (aa 1896-2215). Forshroom2: PDZ domain (aa 1-118), SPR domain (aa 119-356), PSP fragment (aa 1-356), the myosin VIIa-binding region (MBR, aa 350-721), MBR-ASD1 fragment(aa 293-810) and ASD2-containing fragment (aa 931-1487). The truncatedmShrm2MBR fragment (mShrm2MBRC) was produced by introducing a stopcodon at aa position 563, using the quick-change mutagenesis system, according tothe supplier’s instructions (Stratagene). For ZO-1: SH3/GuK fragment (aa 513-812),part of the PDZ3 domain and SH3 domain (aa 444-649); GuK domain (aa 644-812);GuK/acid-rich region fragment (aa 644-891); GuK/acid-rich region/C-terminal partof the prey (aa 644-1015).

Binding experimentsThe in vitro binding assays were performed using glutathione-Sepharose(Amersham) and/or Tetra-link avidin resins (Promega) as described (Kussel-Andermann et al., 2000). Radiolabeled proteins were translated in vitro with theT7/T3-coupled transcription-translation system (Promega) according to themanufacturer’s instructions. To test the interaction between shroom2 and myosinVIIa, a bacterial lysate containing the GST-mShrm2MBR fusion peptide wasincubated with pre-equilibrated glutathione-Sepharose beads for 90 minutes at 4°C.The beads were washed three times with binding buffer (5% glycerol, 5 mM MgCl 2

and 0.1% Triton X-100 in PBS) supplemented with a protease inhibitor cocktail(Roche), and then incubated with the in vitro translated 35S-labeled myosin VIIafragments for 3 hours at 4°C on a rotating wheel. Beads were then washed fourtimes with binding buffer supplemented with 150 mM NaCl. Bound proteins wereresuspended in 30 l 2 concentrated SDS sample buffer, and analyzed on a 4-12% SDS-PAGE.

Co-immunoprecipitation of Myc-tagged shroom2 and either the myosin VIIa tailor full-length myosin VIIa was done using monoclonal anti-Myc antibodies (Santa

Cruz). HEK-293 cell extracts were prepared using 500 l of lysis buffer (0.1%Triton X-100, and 0.1% sodium deoxycholate, 0.5 mM DTT, protease inhibitorcocktail in PBS pH 7.4). The anti-Myc-preincubated resin was incubated with thesoluble fraction for 2 hours at 4°C, and washed four times in 0.1% Triton-X100with protease inhibitor cocktail in PBS. Samples were analyzed as mentionedabove.

Co-immunoprecipitation of ZO-1 and shroom2 in vivo. Cochleas from mice atpostnatal day 3 (P3) or P4, or brains from mice at P7 were homogenized in 500 llysis buffer (20 mM Tris pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.2% Triton X-100,

0.01% SDS, 1% glycerol, and protease inhibitor cocktail). The soluble fraction wasincubated for 2 hours with 40 l protein G-agarose preincubated either with 3 gof purified anti-ZO-1 polyclonal antibody (Zymed) or without antibody. After threewashes in PBS supplemented with 25 mM NaCl and 0.1% Triton X-100, boundcomplexes were resuspended in 20 l SDS sample buffer, and analyzed on a 3-8%Tris-glycine SDS-PAGE.

Actin binding assaysA solution of 50 M G-actin (Molecular Probes) was polymerized by incubationfor 30 minutes at 37°C in a high-salt buffer containing 50 mM KCl and 2 mMMgCl2. Co-sedimentation assays were done by incubating 2 g of either GST-mShrm2MBR or GST, with 20 l of a 16.5 M F-actin solution for 30 minutes,followed by ultracentrifugation (100,000 g, 1 hour). The same amount of supernatant and pellet fractions were subjected to SDS-PAGE and analyzed withCoomassie Blue staining.

Antibodies and immunofluorescence analysisA polyclonal antibody was produced against a mixture of two peptides derived fromthe murine shroom2 protein: mShrm2P1 (MEGAEPRARPERLAE, aa 1-15) andmShrm2P2 (GSFPSTYKEHLKEAQ, aa 695-709). Antibodies from two rabbits (R1and R2) were used. The specificity of the immunopurified antibodies was assayedby immunocytofluorescence and immunoblot analysis. Substitution of thepreimmune serum for the purified antibody against shroom2 and preadsorption of the antibodies with the corresponding antigens were used as negative controls.

The following monoclonal antibodies were used: anti-ZO-1 (Zymed), anti-occludin (Zymed), anti-E-cadherin (Transduction laboratories), anti--catenin(Transduction laboratories), anti-GST (Amersham). F-actin was visualized usingTRITC-phalloidin (Sigma).

Immunofluorescence analyses were carried out on fixed cells (grown on glasscoverslips or on transwell filters) and cryostat sections of tissues or whole-mountpreparations of the organ of Corti of RJ Swiss mice (Janvier, France) as describedpreviously (Kussel-Andermann et al., 2000). Cells, tissue sections and whole-mountpreparations were analyzed with a laser scanning confocal microscope (LSM-540,Zeiss).

Cells, transfection and Ca

2+

-switch assaysHeLa, Caco-2, MDCK, LLCPK, CHO, L and LE cells were grown in DMEMsupplemented with 10% FCS, containing penicillin and streptomycin. Transienttransfections were performed using Effectene (Qiagen) for HeLa and CHO cells andLipofectamine Plus (Invitrogen) for the other cell lines, according to themanufacturer’s instructions. Stable MDCK cell lines expressing GFP-mShrm2 andGFP alone were obtained by Jet-PEI transfection agent (Polyplus-transfection).Cells were treated with 0.8 mg/ml G418 (PAA) for 10 days to select stabletransfectants. Cells were then sorted by FACS using MoFlo setup of the PasteurInstitute cytometry platform. We selected small subpopulations for a weak intensityof fluorescence to avoid very high levels of transgene expression. Stable cell lineswere maintained under selection in 0.2 mg/ml G418. For the Ca2+-switchexperiments, 1.3105 MDCK cells/cm2 were grown overnight (20 hours) in low-Ca2+ medium i.e. Ca2+-free D-MEM supplemented with 5% dialyzed FCS(Invitrogen), according to the protocol by Gumbiner (Gumbiner et al., 1988). Cellswere then incubated in D-MEM containing physiological concentrations of Ca2+ for0, 1, 2, 4, 7 and 24 hours, fixed in 4% PFA and analyzed by immunofluorescence.Fluorescence intensity profile analysis was performed using the linescan function

of MetaMorph (version 7.0, Universal Imaging Corp., Downingtown, PA) asdescribed (Sousa et al., 2005). The profile of fluorescence intensity was measuredalong the line in two channels.

We thank S. Blanchard, S. Nouaille, A. Louise, H. Kiefer, M. C.Wagner and V. Michel for technical assistance, and J.-P. Hardelin forcritical reading of the manuscript. This work was supported by grantsfrom Fondation Raymonde et Guy Strittmatter, the EuropeanCommission FP6 Integrated Project EuroHear LSHG-CT-2004-512063, ANR-05-MRAR-015-01, Ernst-Jung Stiftung für MedizinPreis, and A & M Suchert-Retina Kontra Blindheit. The confocalmicroscope was purchased with a donation from Marcel and LilianePollack. I.Z. and R.E. received a fellowship from Fondation pour laRecherche Médicale (France).

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98



III- La myosine VIIa façonne la morphologieapicale des cellules sensorielles auditives

1/ Objectif

J'ai ensuite repris l'observation des jonctions que les cellules ciliées externes (CCE)

forment avec quatre cellules de soutien. Ceci m'a amené à découvrir que les CCE des souris

de génotype sauvage subissent, au cours de la maturation cochléaire, une transformation de

leurs jonctions à partir du stade postnatal 3 jours. Le pourtour cellulaire passe d’une forme

circulaire à polygonale, qui ne s'opère pas chez les souris sh14626SB/4626SB déficientes en

myosine VIIa. Je me suis alors engagé dans la caractérisation de cette transition jonctionnelleet j'ai poursuivi l'étude du rôle de la myosine VIIa dans ce changement morphologique.

2/ Résultats

Des observations systématiques de l'épithélium cochléaire, en microscopie confocale

après marquage à la phalloïdine ou en microscopie électronique à balayage, m'ont permis de

situer cette transformation jonctionnelle des CCE entre les jours P3 à la base de la cochlée, et

P7 à l'apex de la cochlée, chez la souris. Le pourtour apical des CCE, initialement circulaire,

prend une forme trapézoïdale. La base du trapèze, du côté proximal opposé au vertex du V de

la touffe ciliaire, est creusée d'une échancrure dans laquelle s'encastre une cellule de soutien.

Par une analyse systématique de cochlées de souris entre P3 et P7 utilisant, d'une part, un

marquage par ZO1 pour suivre la transition à l'extrême apex des jonctions (jonctions serrées)

(Figure 21), et d'autre part, un marquage par la -caténine pour suivre la transition aux

jonctions d'adhérence (Figure 22), j'ai observé que cette transition s'effectue sur toute la

hauteur des jonctions des CCE. La transition se produit non seulement dans le plan de la lame

réticulée, mais aussi selon l'axe apico-basal du corps des CCE. Les jonctions des cellules

ciliées internes (CCI), quant à elles, conservent une forme elliptique, même chez les souris

adultes de génotype sauvage. Je limiterai mon propos à l'étude des CCE dont la transition de

forme est très marquée.

Chez les mutants sh14626SB/4626SB, la protéine ZO1 est bien détectée. Elle a une

distribution qui épouse le pourtour cellulaire, circulaire dans les CCE (Figure 23A, B).

99



100



101



102



Cependant, tandis que la E-cadhérine et la -caténine ont complètement disparu des jonctions

hétérotypiques des CCE chez les souris de génotype sauvage ou les hétérozygotes à P8, un

marquage résiduel E-cadhérine persiste aux jonctions des CCE chez les mutants sh14626SB/4626SB

(Figure 23C). Il reste à montrer s'il en est de même pour la -caténine. De plus, le marquageshroom2 est nettement plus intense aux jonctions des CCE chez les souris sh14626SB/4626SB à P8

que chez les souris de génotype sauvage. Les épitopes de shroom2 sont-ils plus accessibles

chez les souris mutantes, ou bien le taux d'expression de ces protéines jonctionnelles est-il

anormalement élevé en l'absence de myosine VIIa? En résumé, cette transition jonctionnelle

accompagnerait la mise en place de l'électromotilité des CCE, et se caractériserait par un

remodelage du cytosquelette sous-jacent (Figure 23D), d'une forme circulaire à une forme

trapézoïdale avec une encoche polarisée, et pourrait être associée à la baisse d'expression de laE-cadhérine, de la -caténine et de shroom2, sous réserve qu'elle soit déjà présente à P3 à la

base de la cochlée.

Afin d'examiner si les jonctions serrées de la lame réticulée sont fonctionnelles chez

les souris sh14626SB/4626SB, le potentiel endocochléaire a été mesuré. En effet, une brèche dans

les jonctions serrées doit conduire à une fuite des charges, qui peut se manifester par une

chute du potentiel endochléaire. Trente souris ont été testées (15 shaker-1 et 15 témoins).

Aucune différence significative n'a été observée dans les valeurs du potentiel endocochléaire.

Ces résultats indiquent que les jonctions serrées des CCE sont fonctionnelles, ou au moins

partiellement fonctionnelles, car la strie vasculaire, qui produit le potentiel endocochléaire,

peut compenser une fuite de charges qui serait modérée. Ce résultat exclut l'existence de

brèches importantes au niveau de ces jonctions en l'absence de myosine VIIa.

Ces résultats et les perspectives sont discutés dans la discussion générale.

103



IV- Discussion générale

Au regard de ces résultats, quels sont les mécanismes qui pourraient être à l'origine de

cette transition jonctionnelle des CCE, et quel pourrait-être le rôle de la myosine VIIa dans ce processus? La réponse à cette première question nécessite une caractérisation plus fine de la

transition jonctionnelle découverte. Comment évolue la structure et la composition

moléculaire des jonctions hétérotypiques des CCE durant cette transition? Le pourtour

cellulaire acquérant un axe de symétrie planaire confondu avec celui de la touffe ciliaire, cette

transition est-elle dictée par la voie de polarité planaire jonctionnelle (le sommet des « V »

formés par les touffes ciliaires des CCE pointe vers la paroi latérale du conduit cochléaire

définissant l'axe de polarité planaire de l'épithélium sensoriel) ou passe-t-elle par le relais du

positionnement du corps basal du kinocil (qui détermine lui aussi l'orientation de la touffe

ciliaire)? Cette transition implique-t-elle les protéines codées par d'autres gènes Usher1, dont

le rôle dans le positionnement et l'orientation de la touffe ciliaire a été récemment mis en

évidence (communication de Gaëlle Lefèvre)?

La myosine VIIa a-t-elle un rôle direct dans le remodelage des jonctions en agissant

sur l'activité contractile de l'anneau d'actine, dont on sait qu'il est impliqué non seulement

dans la maturation des jonctions, mais aussi dans leur désassemblage (voir introduction), ou

sur l'incorporation de G-actine, essentielle à la dynamique des jonctions apicales des cellules

épithéliales, ou encore sur la réorganisation des microtubules?

D'autres hypothèses peuvent être développées, fondées sur les connaissances que nous

avons acquises sur ce moteur moléculaire: (1) la myosine VIIa pourrait transporter, à la

jonction, des protéines de structure ou de régulation participant au renouvellement des

constituants jonctionnels nécessaires à cette transition; (2) la myosine VIIa pourrait être un

« senseur » de forces et/ou être impliquée dans la réponse à ces forces par la production de

tensions et/ou le déclenchement d'une voie de signalisation. Par exemple, elle pourrait jouer le

rôle d'un senseur de la pression imposée par les cellules de soutien sur les CCE, et exercer des

tensions sur les complexes membranaires d'adhérence pour assurer leur maintien, alors qu'ils

subissent les contraintes mécaniques imposées par la vibration de l'organe de Corti en réponse

à l'onde sonore, ainsi que par la motilité apico-basale de la paroi latérale des CCE en rapport

avec l'électromotilité. Cette myosine pourrait aussi déclencher une voie de signalisation

menant au remodelage du cytosquelette d'actine et/ou de microtubules, ou bien à la régulation

104



de l'expression de molécules d'adhérence au niveau des jonctions apicales des CCE. Dans le

cadre de ces hypothèses (transport, senseur et générateur de forces), la liaison de la

myosine VIIa à la PKA, à shroom2, et à la vézatine pourrait être impliquée.

a) Caractérisation de cette transition jonctionnelle en termes moléculaires

Comment évolue la structure et la composition moléculaire des jonctions hétérotypiques

durant cette transition?

La disparition de la E-cadhérine et de la -caténine aux jonctions hétérotypiques

indique aussi une redistribution des molécules d'adhérence. Selon l'hypothèse illustrée figure

16C, dans une cochlée de génotype sauvage, la disparition progressive de la E-cadhérine aux

jonctions hétérotypiques devrait s'accompagner d'une diminution progressive de la longueur

des contacts formés par ces jonctions (lorsque la lame réticulée est vue de dessus). A l'inverse,

l'intensification progressive du marquage E-cadhérine aux jonctions homotypiques traduirait

une augmentation de la longueur des contacts intercellulaires. Pour quantifier ce remodelage,

on caractérisera la variation relative de la longueur des contacts formés par les jonctions

hétérotypiques et les jonctions homotypiques entre P3 et P7. On mesurera en parallèle la

densité d'intensité de fluorescence d'un ensemble de molécules jonctionnelles: E-cadhérine,

-caténine, -caténine, vézatine, ZO1, shroom2, claudines 6, 9, 14. Si une baisse de la

longueur de certains de ces contacts est corrélée avec une baisse de la densité de fluorescence,

alors une redistribution des molécules d'adhérence intercellulaire pourrait être considérée

comme étant à l'origine de la transition jonctionnelle.

On s'engagera ensuite dans la même caractérisation chez les mutants sh14626SB/4626SB.

L'absence de myosine VIIa conduit-elle à une anomalie de distribution des molécules

d'adhérence durant la transition jonctionnelle? Et cette anomalie de distribution est-elle

restreinte aux jonctions hétérotypiques? On mesurera la longueur des contacts formés par les

jonctions hétérotypiques versus homotypiques entre les stades P3 et P7. Ceci permettra

d'apprécier si l'absence de myosine VIIa consiste ou non en un simple gel de la longueur des

contacts formés par les jonctions hétérotypiques des CCE. On examinera aussi si tout ou

partie des molécules marqueurs de la transition jonctionnelle présente une anomalie

d'intensité ou de distribution.

La disparition progressive de la E-cadhérine et de la -caténine, aux jonctions

105



hétérotypiques des CCE de souris de génotype sauvage, suggère que les jonctions d'adhérence

sont progressivement remplacées par les jonctions « d'adhérence serrées » décrites par

l'équipe de Nunes (Nunes et al., 2006). Pour tester cette hypothèse, on étudiera la structure de

ces jonctions durant la transition jonctionnelle qui implique la myosine VIIa (P3-P7), par les

techniques de microscopie électronique à transmission et de cryo-fracture. On examinera

notamment le réarrangement de ces jonctions selon l'axe apico-basal des CCE. On comparera

alors cette description à celle réalisée sur des cochlées de souris sh14626SB/4626SB.

Enfin, se pose la question de savoir si la séquence temporelle de modification de

l'expression des protéines jonctionnelles, comme la variation de leur taux d'expression par

rapport à la longueur des contacts intercellulaires, indique une causalité dans la transition

jonctionnelle. On testera cette hypothèse de la même façon que précédemment, par l'étude de

cette transition chez les souris déficientes pour shroom2 ou pour la vézatine, que nous avons

générées. L'étude du mutant déficient pour la claudine 14, quant à lui, a été réalisée par Ben-

Yosef et ses collaborateurs (Ben-Yosef et al., 2003). Des images acquises en microscopie

électronique à balayage, sur des cochlées de souris déficientes en claudine 14, à P7, indiquent

que la transition jonctionnelle des CCE semble s'être effectuée normalement (Ben-Yosef et al.,

2003). Nous nous attacherons particulièrement à l'étude des mutants déficients en vézatine, ou

en shroom2. La vézatine, qui se lie à la myosine VIIa, fait partie du complexe d'adhérence

-caténine/E-cadhérine (Küssel-Andermann et al., 2000b). Son absence pourrait créer une

désorganisation de ce complexe empêchant la transition jonctionnelle des CCE. Shroom2 est

une protéine des jonctions serrées, qui se lie à la myosine VIIa et à la F-actine. Son absence

pourrait provoquer une désorganisation de complexes moléculaires des jonctions serrées,

empêchant la transition jonctionnelle.

Cette transition jonctionnelle, polarisée dans le plan, est-elle régulée par l'activité

polarisante des protéines jonctionnelles ou par la polarité du kinocil? Implique-t-elle

d'autres gènes Usher1?

Cette transition jonctionnelle suit la polarité planaire des CCE. En effet, une fois la

transition opérée, le côté proximal des CCE dessine une encoche, qui présente un axe de

symétrie confondu avec l'axe de polarité planaire. Les trois autres côtés, qui complètent la

circonférence apicale, sont rectilignes. Une étude génétique récente a montré que le

positionnement du kinocil détermine l'orientation de la touffe ciliaire (Jones et al., 2007).

106



Enfin, l'étude comparative de l'orientation des touffes ciliaires des différents mutants Usher1,

dont le mutant sh14626SB/4626SB, à des stades embryonnaires, a mis en évidence le fait que tous

ces mutants présentent des anomalies de polarité planaire sans modification apparente des

protéines jonctionnelles de polarité planaire, mais avec des modifications de la position du

kinocil (communication de Gaëlle Lefèvre). On testera l'hypothèse de l'implication des

molécules jonctionnelles de polarité planaire par l'étude d'un mutant conditionnel de polarité

planaire déficient pour vangl2, et celle du positionnement du kinocil par l'étude d'un mutant

conditionnel du gène polaris, et enfin, celle de l'implication des molécules Usher1 par l'étude

des souris déficientes pour chacun des gènes Usher1. Dans l'hypothèse où, parmi les mutants

Usher1, seuls les mutants sh14626SB/4626SB n'opèrent pas la transition jonctionnelle, on étudiera

les divers mutants hypomorphes du gène de la myosine VIIa, afin de rechercher une

éventuelle corrélation entre la transition jonctionnelle et tout autre modification jonctionnelle

discutée ci-dessous.

b) La myosine VIIa peut remodeler les jonctions intercellulaires

La myosine VIIa modifie-t-elle l'activité contractile de l'anneau d'actine?

Une étude génétique réalisée chez la drosophile Winter et ses collaborateurs suggèrent

que les myosines II et VIIa ont des rôles antagonistes dans la détermination du nombre de

soies (structure riche en F-actine) de chaque cellule de l'aile (voir introduction) (Winter et al.,

2001). On notera qu'une mutation hypomorphe du gène codant la myosine II conduit à

augmenter la probabilité qu'une cellule de l'aile ait de multiples soies. L'abolition de l'activité

de la myosine VIIa conduit aussi à ce phénotype. L'apparition de soies multiples lorsque la

myosine VIIa est déficiente, rappelle la fragmentation des touffes ciliaires des cellules

sensorielles auditives des souris sh14626SB/4626SB. Chez la drosophile, le nombre de soies est

déterminé essentiellement par l'activation de la voie de polarité planaire Fz/Dsh, qui conduit

normalement à la présence d'une seule soie par cellule. Une mutation gain de fonction de Fz

ou une mutation perte de fonction de Dsh augmente la probabilité qu'une cellule ait de

multiples soies. Fait surprenant, chez ces deux mutants, la suppression d'un allèle du gène de

la myosine II augmente encore la probabilité qu'une cellule ait des soies multiples, tandis que

la suppression d'un allèle du gène de la myosine VIIa diminue cette probabilité. Ces études

génétiques suggèrent que ces deux myosines pourraient agir de manière antagoniste, pour

limiter à un le nombre de soies par cellule de l'aile.

107



Pour explorer si ces deux myosines agissent de la sorte aux jonctions des CCE, on

fera, au préalable, une étude systématique de la distribution des myosines II non musculaires

dans les cellules ciliées de souris sauvages pour s'assurer de la présence de l'une d'elles à la

jonction. La myosine IIA semble jouer un rôle essentiel dans la contraction de l'anneau

d'actine dans une lignée de cellules épithéliales de côlon (Ivanov et al., 2007). Des mutations

dominantes dans les gènes de la myosine IIA (myh9) (Lalwani et al., 2000) et de la

myosine IIC (myh14) (Donaudy et al., 2003) causent, dans les deux cas, une surdité modérée

à sévère chez l'homme. On examinera ensuite la distribution de la RLC phosphorylée (voir

introduction) qui indique où la myosine II est active. De plus, il a été récemment montré chez

la drosophile, que les myosine II et VIIa pourraient partager un même régulateur, l'ELC (voir

introduction) (Franke et al., 2006). On produira un anticorps reconnaissant l'ELC pour

examiner sa distribution dans les cellules ciliées. Si l'on trouve une indication de modification

de distribution ou d'intensité chez les mutants, on testera si la myosine VIIa de mammifère

peut se lier à l'ELC, par un test de liaison directe et par coimmunoprécipitation à partir

d'extraits cochléaires. La compréhension du dialogue entre les myosines II et VIIa passe par

un test de la fonction de la myosine II dans les CCE. Ce test pourra s'effectuer sur des

cochlées mises en culture en présence ou non de blebbistatine, un inhibiteur spécifique de la

myosine II. On examinera notamment si la transition s'effectue alors que la myosine IIA est

inactivée par adjonction répétée de blebbistatine sur des cochlées de souris de génotype

sauvage à P3. L'inactivation du gène de la myosine IIA chez la souris a été faite par Mhatre et

ses collaborateurs (Mhatre et al., 2007). Les souriceaux meurent au stade embryonnaire 7

jours, ce qui exclut toute étude de la cochlée.

La myosine VIIa contrôle-t-elle l'incorporation de G-actine?

Dans des cellules épithéliales en culture, lors d'un calcium switch, l'anneau d'actine ne

peut pas se contracter en présence de jasplakinolide (Ivanov et al., 2007) (voir tableau 1, en

introduction), ce qui suggère qu'un taux élevé d'incorporation de G-actine dans cet anneau est

nécessaire à son activité contractile. On examinera tout d'abord par la technique de FRAP

( fluorescence recovery after photobleaching ), sur des cochlées en culture provenant des souris

transgéniques exprimant l'actine fusionnée à la GFP, si la cinétique d'incorporation de G-

actine dans l'aneau d'actine varie entre les stades P3 et P7. Si tel était la cas, shroom2 serait un

bon candidat pour médier un tel processus. En effet, Shroom2 se lie à la F-actine (Dietz et al.,

108



2006; Etournay et al., 2007) et peut la protéger de l'effet de la cytochalasine D, qui se lie au

bout barbé (+) des filaments d'actine, et qui conduit à la dépolymérisation des filaments à leur

bout pointu (-). Shroom2 permet-il l'incorporation de G-actine en présence de cytochalasine D

ou empêche-t-elle la dépolymérisation des filaments au bout pointu? Nous avons montré que

la surexpression de la partie N-terminale de shroom2 induit la fasciculation des filaments

d'actine à la périphérie des cellules, qui se couvrent alors de prolongements cytoplasmiques

emplis de F-actine. Ainsi shroom2 semble avoir la capacité de modifier la dynamique des

filaments d'actine en augmentant la longueur et la fasciculation des câbles de F-actine. On

notera que le marquage shroom2 est plus intense aux jonctions intercellulaires de la lame

réticulée de souris sh14626SB/4626SB à P8 que chez les souris témoins. On examinera donc par

FRAP, sur des cochlées en culture provenant de souris sh14626SB/4626SB exprimant l'actine

fusionnée à la GFP, la cinétique d'incorporation de G-actine dans l'anneau d'actine entre les

stades P3 et P7.

La myosine VIIa pourrait-elle agir sur les microtubules pour permettre le remodelage

des complexes jonctionnels?

Un faisceau d’arguments nous conduit à penser que la myosine VIIa pourrait jouer un

rôle dans l’organisation des microtubules. En effet, Todorov et ses collaborateurs ont montré

que la myosine VIIa interagit avec MAP-2B (Todorov et al., 2001), une protéine associée aux

microtubules, et Werber et ses collaborateurs ont montré que la myosine X interagit avec les

microtubules via son domaine MyTH4-FERM (Weber et al., 2004), domaine également

présent en deux exemplaires dans la myosine VIIa. Par ailleurs, shroom2 (qui se lie à la

myosine VIIa) a la capacité, tout comme les autres membres de la famille shroom, de

réorganiser les filaments de microtubules en maintenant la distribution de la γ -tubuline,

élément nucléateur des microtubules, à l'apex des cellules épithéliales (Lee et al., 2007). Enfin

la kinésine1, qui est requise pour la dynamique des jonctions apicales (voir Introduction), se

lie à la myosine V pour former un complexe de moteurs qui pourrait faciliter le transport

d'organelles en permettant non seulement le transport sur les microtubules mais aussi sur les

filaments d'actine (Brown et al., 2004). Peut-être la myosine VIIa pourrait-elle se lier à une

kinésine pour renouveler les constituants jonctionnels. Pour tester ces hypothèses, on

effectuera tout d'abord des immunomarquages pour détecter une éventuelle anomalie de

l'organisation globale des microtubules dans les CCE des souris sh14626SB/4626SB, e t on

109



comparera en particulier la distribution de MAP-2B, de la -tubuline et de la kinésine1 dans

les cellules sensorielles auditives de souris de génotype sauvage et de souris sh14626SB/4626SB.

Enfin, dans le cas où seule une distribution anormale des microtubules pourrait rendre compte

du phénotype des souris sh1

4626SB/4626SB

, on testera si l'une au moins des deux répétitionsMyTH4-FERM de la myosine VIIa peut se lier aux microtubules.

c) La myosine VIIa pourrait transporter des molécules ou exercer destensions entre le cytosquelette et la membrane plasmique

La myosine VIIa semble pouvoir transporter les composants de liens latéraux

transitoires qui unissent les stéréocils et permettent la cohésion de la touffe ciliaire. En effet,

l'approche génétique a permis de montrer qu'en l'absence de la myosine VIIa, les protéines

constitutives de ces liens ne sont plus adressées à la touffe ciliaire. Ainsi, l'hypothèse selon

laquelle la myosine VIIa serait un convoyeur de protéines vers la touffe ciliaire est-elle très

probable, même si aucune étude dynamique n'a réellement montré que la myosine VIIa

transporte des protéines. En supposant que la myosine VIIa a un rôle de transport, transporte-

t-elle des molécules nécessaires à la transition de forme que subissent les jonctions apicales

des cellules ciliées? Les protéines de structure vézatine, shroom2, et -caténine sont toujours

adressées aux jonctions chez les mutants sh14626SB/4626SB. Mais qu'en est-il de la protéine kinase

A (PKA)? La myosine VIIa se lie en effet à la sous-unité régulatrice RI- de la PKA (Küssel-

Andermann et al., 2000a). Aucune étude n'a encore montré que la PKA peut directement

réguler la myosine VIIa par phosphorylation, ou que le complexe myosine VIIa/RI- est un

élément régulateur d'une voie de signalisation. Cependant, on notera que la PKA peut

contrôler l'intégrité des jonctions d'adhérence, mais aussi la différenciation morphologique et

fonctionnelle des cellules épithéliales de l'intestin (Boucher et al., 2005). On examinera donc

finement la distribution de la PKA aux jonctions apicales des cellules ciliées. Lamyosine VIIa pourrait transporter d'autres molécules de signalisation, non encore identifiées,

qui auraient, par exemple, une action sur le renouvellement des molécules jonctionnelles, par

ubiquitination ou sumoylation. Il faut noter que l'analyse du crible double-hybride réalisé avec

la partie C-terminale de la queue de la myosine VIIa comme appât, a mis en évidence une

protéine impliquée dans le processus de sumoylation comme possible partenaire de liaison de

cette myosine.

Le pourtour apical des CCE reste rond chez les mutants déficients en myosine VIIa, ce

110



qui suggère que les forces sont réparties de manière isotropique. De ce point de vue, deux

autres hypothèses pourraient rendre compte de la transition morphologique du pourtour des

CCE: (i) l'équilibre des tensions jonctionnelles serait modifié en présence de la myosine VIIa,

afin que le pourtour cellulaire des CCE passe d'une forme ronde à trapézoïdale; (ii) la

myosine VIIa serait un senseur de la pression imposée par les cellules de soutien sur les CCE,

et activerait une voie de signalisation qui conduit à cette transition. Sous la première

hypothèse, le rôle de la myosine VIIa serait, entre autres, d'introduire des contraintes

physiques au niveau jonctionnel, afin de créer cette invagination du côté proximal des CCE et

de rendre les trois autres bords rectilignes. Il est tentant de penser que la myosine VIIa

modifie l'équilibre des forces produites par l'anneau d'acto-myosine II. Sous la seconde

hypothèse, quelle voie de signalisation la myosine VIIa pourrait-elle déclencher? Comme

shroom2, la vézatine est recrutée aux jonctions des CCE d'une manière indépendante de la

myosine VIIa (Küssel-Andermann et al., 2000b), alors que sa localisation dans les stéréocils

dépend de l'activité de la myosine VIIa (Michalski et al., 2007). La vézatine est une protéine

transmembranaire, qui pourrait directement détecter la pression exercée par les cellules de

soutien sur les CCE, et par exemple changer de conformation au delà d'une certaine pression,

ce qui aurait des répercussions sur son interaction avec la myosine VIIa. De plus, le complexe

myosine VIIa/vézatine pourrait activer une voie de signalisation incluant Arf6 et ARHGAP10,

conduisant au contrôle de l'adressage de l'-caténine aux jonctions intercellulaires (Sousa et

al., 2005), et modifiant ainsi l'équilibre entre la forme monomérique, qui se lie à la -caténine

et la forme dimérique, qui ponte les filaments d'actine, de l'-caténine (voir figure 11A).

Sachant que le complexe vézatine-myosine VIIa est présent à la fois dans les CCE et les CCI,

comment expliquer que seul le pourtour des CCE acquière une forme trapézoïdale avec une

encoche à la base? On peut faire l'hypothèse que les voies de signalisation déclenchées par ce

complexe sont différentes dans les deux types cellulaires.

Quels que soient les mécanismes moléculaires sous-jacents, la myosine VIIa est

impliquée dans la mise en place d'une transition jonctionnelle (qui se traduit, dans les CCE,

par un changement de forme de leur pourtour apical) qui est concomitante à l'acquisition de

l'électromotilité dans ces cellules. On notera que la transition des CCE semble concomitante

du début de l'expression de la prestine, protéine de la paroi externe des CCE, impliquée dans

l'électromotilité de ces cellules sensorielles (voir Introduction). La prestine est détectée à

partir de P2 à l'extrême base de la cochlée murine (communication de Kirian Legendre). Tout

111



se passe comme si les jonctions que les CCE forment avec les cellules de soutien se

modifiaient pour résister aux forces que développe l'électromotilité dans l'axe apico-basal du

corps cellulaire. Est-ce pour résister aux forces que développe l'électromotilité dans l'axe

apico-basal du corps cellulaire que les jonctions hétérotypiques des CCE se modifient?

L'approche génétique concernant les molécules Usher1, associée à une analyse

morphologique hautement résolutive et systématique, nous a permis d'établir un scénario

probable pour le développement cohésif de la touffe ciliaire (communication de Gaëlle

Lefèvre) (El-Amraoui & Petit, 2005), et nous nous engageons dans une approche semblable

pour tenter d'établir un scénario moléculaire qui rende compte de la transition que subissent

les jonctions hétérotypiques des cellules sensorielles de la cochlée.

112



GLOSSAIRE ALPHABÉTIQUEDES ABRÉVIATIONS

113



AMPc: Adénosine Monophosphate cyclique

ArR: Acid rich RegionASD: Apx-Shroom Domain

CCE: Cellule Ciliée Externe

CCI: Cellule Ciliée Interne

COS-7: Lignée cellulaire de singe

dB: décibel

Dsh: Dishevelled EGTA: Ethylene Glycol Tetraacetic Acid

ELC: Essential Light ChainFERM: 4.1 band, Ezrin, Radixin, MoesinFRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching

Fz: Frizzled GFP: Green Fluorescent Protein

GuK: Gunylate Kinase domainHEK: Human Embryonic Kidney cellsHz: Hertz

IQ: Isoleucine-Glutamine

JMD: Juxta-Membrane DomainMBR: Myosin Binding Region

MDCK: Madine Darby Canine Kidney cellsMyTH4: Myosin Tail Homology 4

NMB-ADP: N 6 2-méthyl butyl ADP nN: nanoNewton

PDZ: post-synaptic density protein P SD-95, Drosophila Discs-Large septate junction

protein, epithelial tight-junction protein Z O-1.PH: Pleckstrin Homology

PKA: Protein Kinase ARLC: Regulatory Light Chain

Sh14626SB: lignée de souris shaker1, allèle 4626SB, amorphe

SH3: Src homology 3SPR: Serin-Prolin RichTM: TransMembrane domain

114



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RESUME

Les cellules sensorielles (cellules ciliées) de la cochlée, organe sensoriel de l'audition des

mammifères, transforme les signaux sonores en signaux électriques (transduction mécano-électrique).

Elles se caractérisent par une touffe apicale de microvillosités rigides (stéréocils), très riches en

filaments d'actine, qui constitue un organelle mécano-récepteur. Durant ma thèse, je me suis intéressé

à la myosine VIIa, dont le déficit est à l'origine du syndrome de Usher de type IB (USH1B) qui

associe une surdité à une rétinopathie. La myosine VIIa est une myosine non conventionnelle, dont

l'expression, au sein de l'oreille interne, est restreinte aux cellules sensorielles.

Deux myosines non-conventionnelles, la myosine 1c et la myosine VIIa, ont été impliquées

dans le processus d'adaptation du courant de transduction dans les cellules ciliées en réponse à la

stimulation sonore. J'ai entrepris la recherche de nouvelles molécules impliquées dans ce processus,

par un crible « double-hybride » chez la levure. J'ai identifié PHR1, une protéine transmembranaire à

domaine Pleckstrin Homology (PH), comme partenaire de liaison commun aux myosines 1c et VIIa.

J'ai caractérisé leurs domaines d'interaction et j'ai également montré que PHR1 peut se dimériser. En

supposant que PHR1 soit localisée dans les stéréocils, cette protéine pourrait ancrer les deux myosines

à la membrane, et jouer, elle-aussi, un rôle dans le processus d'adaptation du courant de transduction.

Je me suis ensuite concentré sur le rôle de la myosine VIIa aux jonctions apicales entre les

cellules sensorielles et leurs cellules de soutien. Ces jonctions jouent notamment un rôle crucial dans

le maintien du potentiel endocochléaire, qui contribue à la dépolarisation cellulaire en réponse à une

stimulation sonore. L'identification de shroom2, par un crible double-hybride, comme partenaire de

liaison de la myosine VIIa, m'a amené à étudier le rôle de cette myosine aux jonctions serrées. J'ai

montré, à partir d'extraits de cochlée, que shroom2 fait partie du même complexe que ZO1, protéine

des jonctions serrées. Shroom2 se lie aussi aux filaments d'actine qu'elle peut protéger de l'effet

dépolymérisant de la cytochalasine D. L'abondance particulière de shroom2 aux jonctions serrées entre

les cellules ciliées et leurs cellules de soutien, continuellement soumises à des forces de cisaillement

en réponse à la stimulation sonore, incite à penser que shroom2, en conjonction avec la myosine VIIa,

est impliquée dans le renforcement des jonctions serrées.Enfin, j'ai poursuivi l'étude du rôle de la myosine VIIa dans la morphogenèse des jonctions

apicales entre cellules sensorielles et cellules de soutien. J'ai observé une transition phénotypique

jonctionnelle des cellules ciliées externes, entre les jours post-natals 3 et 8 chez les souris sauvages: le

pourtour cellulaire passe d'une forme circulaire à une forme polygonale avec une échancrure dans la

partie proximale. Cette transition ne s'opère pas chez les souris déficientes en myosine VIIa. Ce travail

a mis en évidence, pour la première fois, l'implication de la myosine VIIa dans la morphogenèse des

jonctions apicales des cellules ciliées externes.

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