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/Nombre : RnIDo SANCHEZ MONICA ALEJANDRA

Matrinili : 93329665

JLicencLtun: INGENfERlA DE LOS ALIMENTOS UNIDAD IZTAPALAPA

/DIVISION CIENCIAS BIOuxilCAS Y DE LA SALUD.

Fecha i n i i .

,/Fecha de brainieióa :

Claw :

Nombre h y e c t o :

6.73.32.52

97-0

20 Horas .

2 DE OCTUBREDE 1997.

2 DE ABFULDE 1998 1 IA056.97

INTRODUCCION; ADAFl'AClON Y DESARROLLO DE LA "ECNOLWIA DEL CULTIVO DE LA

TA DE AGUA DULCE (Cherm quadncMn0fusl

Firma aiumno:- Pulid

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cUib*<pdmpO

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA DiviSdN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD Departamento de Biotecnología Area de Microbiologia

3 de Noviembre da 1998.

DR. JOSE LUIS ARREDONDO FIGUEROA DIRECTOR, DIVISION CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD P R E S E N T E

Por medio de la presente, le comunicamos que la alumna Mónicn Alejandra Pulido Sánehez, matricula 93329665 de la carrera de Jngeniena de los Alimentos, desarrollo y concluyó satisfactoriamente el proyecto y reporte find del trabajo titulado: “CARACXERIZACION DE PEPTIDOS OBTENIDOS A PARTIR DE LA RECUPERACION DE PROTEMA DE SUBPRODUfXOS DE U INDUSTRU PESQUERA, MEDIANTE LA HIDRÓLISIS ENZIMATICA CON ALCALASA”. Dicho proyecto se realizó en la planta piloto 4 del departamento de Biotecnología, bajo nuestra dirección y supervisión.

Así mismo, hacemos de su conocimiento que el retraso en la entrega del reporte h a l se debió a la necesidad de la repetición de ensayos durante el desarrollo del proyecto.

Sin otro particular, aprovechamos la ocasión para reiterar a usted nuestra más atenta consideración.

~

A T E N T A M E N T E ‘Tasa abierta al tiempo”

Dra. Li Y ia Arely Prado Barragán Profesor Titular Profesor Titular

UN I DAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y la Purisirna. Coi. VicenUna, lzíapaiapa 09340, D.F. Tel.: (5)7234365. Fax: (6)7234355

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SERVICIO SOCIAL

8 '

A QUIEN , , CORRESPONDA:

I Por medio de la presente se hace constar que el (la): DR. SERGIO HUERTA OCHOA

del Departamento de BlOTECNOLOGíA de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO Caracterización de péptidos obtenidos a partir de la recuperación de proteína de subproductos de la industria pesquera, mediante la hidrólisis enzimática con alcalase@

ALUMNO Pulido Sánchez Mónica Alejandra MATR~CULA 93329665 LICENCIATURA Ingeniería de los Alimentos PERIODO

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de MBxico, D.F. a veinticinco de Noviembre de mil novecientos noventa y ocho.

A T E N T A M E N T E 'Cara Abierta al Tiempo"

Octubre 2, 1997 a Noviembre 3, 1998.

I

. , , .

. .

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P s-

‘31.

N I C E

Pig.

INTRODUCCI~N .................................................................................................. I

* CONCEPTOS GENERALES .................................................................................... 1

&TODOS DE OBTENCI~N DE HIDROLIZADOS DE PESCADO .........

EL PROCESO DE HIDR~LISIS Y su CONTROL ... .......................................... 8

CARACTER~STICAS GENERALES DE LAS ENZIMAS .............. ......... 9

PROTEAS AS.. ...................................... ......... .... 11

CII&TICA DE LAS REACCIONES CATALEADAS POR ENZIMAS ................... 13

FUNDAMENTO DE UNA HIDR~LISIS ENZIMÁTICA 16

SELECCI~N DE LA ENZIMA A UTILIZAR ........................................................... 19

ELECTROFORÉSIS EN GEL DE UNA D~MENSI~N ......................

OBJETIVOS.. ................... .<.. ..... ............ .......... ............ 23

MET OD O LOG í~ ....... ................................................................. 24

ANÁLISIS BROMATOLÓGICO ...... .................. 24

PREPARACI~N DE SUSTRATOS ...................... ........ ..... 24

PREPARACI~N DE LA SOLUCI~N DE ENZIMA 24

~

................................................. i

TRABAJOS PREVIOS REALIZADOS EN HEMOGLOBINA ................................. 24

DETERMINACIÓN DE L A CIh.ÉTiCA EKZIMÁTICA DE .ALCALASE @ UTiLIZANDO COMO SUSTRATO DESECHO DE PESCADO ..............................

MÉTODO ELECTROFORÉTICO ............................................................................. 28

26

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS ...................................... ............. 30

.................. 31 RESULTADOS Y DISCUSIONES.. ............................................

31 ANÁLISIS BROMATOL~GICO ...................

CARACTERIZACI~N DE LA ENZIMA ALCALASE @ UTILIZANDO~~MO SUSTRATO ALTERNO HEMOGLOBINA., ..................................................

CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA ALCALASE @ UTILIZANDO COMO

.................................

32

38 SUSTRATO DESECHO DE PESCADO .....................................................

MUESTRAS DE HIDR~LISIS EN EL:GEL SDS-PAGE ................... 50

51 usos ALTERNATIVOS DE LOS HIDROLIZADOS DE PROTEÍNA DE PESCADO ............................. ......................................................

CONCLUSIONES ................................ ................... 52

RECOMENDACIONES.. ............................. 53

BIBLH)GRAF~. ................... ............................. 54

AWXWS.. .......................... ......................................................................... 57

....................

INTRODUCCION

CONCEPTOS G~NERALES

PROTEiNAS DE ORIGEN ANIMAL

Los productos de origen animal (came, pollo, pescado, lácteos y huevos), han incrementado en la dieta de los seres humanos desde un 509? en 1910 hasta UII 66% en 1970, y el porcentaje se ha estabilizado en ese nivel (Altschul, 1981) . La proteína de origen animal es única como una fuente nutricional de proteína para el ser humano El consumo de proteína animal varía de menos de 10 g/cap/día en algunos países no industrialidos hasta más de 60 g en países indumialízados. Se vuelve entonces indispensable asegurar para toda la población la alimentación adeeurdq por lo que se tiene que incrementar tiempo, esfuerzo y mejorar la tecnoiogk (Aitschut, 1981).

Sin embargo, en un estudio mundial sobre la alimentación y n u ~ c i ó n (NRC,1977) se ha observado que alrededor de 450 millones de persona, no reciben la alimentación suficiente. En algunas sociedades, el 4O?h de los niños mueren antes de llegar a los 5 años principalmente por causas de mal nutrición

IMPACTO MJTRICIONAL DEL CONSUMO DE PROTEINA

El ser humano posee en su tracto gastrointestinal, enzimas proteolíticas (entre otras) que hidrolizan a las proteínas en sus constituyentes “aminoácidos”. Estos aminoácidos son absorbidos por las células de la mucosa intestinal a través de un mecanismo selectivo.

En trabajos realizados por Nasset (1962), se demostró que antes de que las proteínas pudieran ser absorbidas por el tracto gastrointestinal, este debía secretar no solamente enzimas digestivas, sino también mucoproteínas y mezclas de aminoácidos que constituyen una “matriz molecular” a través de la cual las proteínas provenientes de la dieta pueden ser absorbidas Así, las proteínas endógenas aparentemente regulan la concentración de aminoácidos disponibles para la absorción de las proteínas ingeridas. Mediante este mecanismo el ser humano se provee de las cantidades y concentraciones óptimas de aininoácidos para la &tesis de otias proteínas biológicas, sin embxgo, se ve modificado por el estado de salud 5 el estado nutricional del organismo

1

Urn mgestión de mezclas incompletas de proteína de bajo valor biológico, trae como consecuencia una mala absorción de las mismas por el tracto gastrointestinal (Harper,1974) El consumo de “cantidades adecuadas de proteína animal” es una ventaja nutncional ya que se pueden sintetizar hormonas y &mas. Después de que los aminoácidos son canalizados al hígado, comienza una síntesis de un gran complejo de proteínas y lipoproteínas, las d e s son utilizadas por el organismo para la formacibn de céluias nuevas y para reemplazar las células viejas

’

VALOR 3IOLÓGICO DE LAS PROTEINAS d

. Para poder apreciar la contribución de la proteína animal en la nutrición, debemos considerar el concepto de valor biológica de las pmiehs.

El valor biológico de una proteína se expresa como el porcentaje de nitrógeno absorbido retenido por el organismo para el mantenimiento de los tejidos y la integridad de los órganos

El valor biológico es función de la composición de aminoicidos (Gutbrie, 1979). Mientras más aminokidos esenciales pmea un alimento, mayor será su valor biológico (Albanesc y Orto, 1973) En la tabla I se representa el valor biológico de fuentes de proteína animal Así, el consumo de protei^ animal, combmadas adecuadamente con otros nutrienies (proteínas de ongen vegetal) provee de los aminoácidos d o s para O p t ¡ las condiciones fisiológicas y metabólicas (Finot, 1973)

TABLA I. Valor biológico de proteínas representativas. ‘

De Guthne, Helen nuidreus (1979) En “Introduclory Nuhition.” 4* ed

2

CALDDAD PROTEICA DEL PEsCADo

En la d i d a d es reconocido el alto vaior nutritivo del pescado, hecho que se debe al gran contenido de aminoácidos esenciales en sus proteínas, las que, por tal motivo, se consideran de una excelente calidad El contenido de aminoácidos esenciales del pescado, se ha comparado con el de otras fuentes proteicas de origen animal o vegetal, resultando que el valor nutritivo de &e es similar, y en algunos casos supefior, ai de los estándares internacionales, como se desprende de la tabla comparativa il (Rivera, 1990)

' TABLA ii. Comparación del perfil de aminoácidos de diferentes fuentes proteicas con el de estándares internacionales .

* MACARELA Shing Sbm Jey 1981

Cálculos globales indican un volumen potencial de captura mundial de pescado, entre 5 y 16 millones de toneladas al año (Yañez, 1984), cifra que coloca al pescado como el recurso con el potencial más alto para ser utilizado como materia prima en la elaboración de productos proteicos.

En la tabla III, se muestra el porcentaje de tejido muscular de diferentes especies, y se observa que este porcentaje es mayor en el pescado que en res o pollo. Tan solo la cantidad de energía obtenida de un pescado es equivalente a 113 de la obtenida de una res o un cerdo (Altschul, 1981)

TABLA iii. Porcentaje de tejido muscular de diferentes especies.

ESPECIE DESECEO TEdIDo MUSCULAR. -,.; .4 NI M .4 L ("A) ("/I (keaü100 g)

. .... Pescado f"' 13.7 -- 80.9 I12

Cerdo I - 7 1 31 402 ._ . . . . . . 51 - 323 ReS 15

Pollo 32 64.7 84

. . . . . .. ..

lavcllyAmmrrmao(1974) 3

La cantidad de proteha contenida en el pescado varía de d o a las divasas especies, como se desprende de la composición bromatológica que se presenta ai la tabla N.

TABLA N Análisis bromatológico de algunas especies de pescado

.

De una pesca mundial anual de 71 millones de toneladas, 20 millones son capturados específicamente para su conversión en harina de pescado y el resto, posiblemente mfmos del SO??, es actualmente usado en fiesm para la alimentación humana. Muchas especies de pescado usadas para la manufactura de harina, están limitadas al uso en la formulación de alimentos para animales, ya que la harina no posee las características funcionales y organolépticas necesarias para ser incorporada en la alimentación humana, o en la manufactura de otro tipo de productos en los que se usen materiales proteicos, además de que no es soluble, ni dispersable en agua, y de poseer un olor desagradable y un bajo valor agregado en general

A nivel internacional, al igual que en México, se han planteado alternativas para la industrialización deespecies de pescado no utilizadas, así como de los desechos del mismo En nuestro país, se pueden señalar los intentos de Productos Pesqueros Mexicanos, S A de C V (1979) para introducir en el mercado nacional pulpa de pescado para consumo inmediato, también se ha intentado producir pastas de pescado en las que se usa como materia prima principal la pulpa de pescado, a la que se le adiciona sazonadores y aglutinantes, i.palmente se ha intentado introducir pastel de pescado, salchichas de prwdo, jamón de pescado (Bojorquez, 1979), sin obtener el éxito esperado al encontrar como barrera el rechazo de estos productos por parte del consumidor, debido a los habitos de alimentación de la población

4

Por io ant& se &ve necesario busur altanativas pan el mejor tprovscbrm#ai . ode este recurso, lo cual se puede lograr a través del desarrollo básico de tecnobgh que permitan obtener un producto de mayor valor agregado y con una gama de aplicaciones más amplia y novedosa que los intentados hasta ahora (Rivera, 1990), una posibilidad atractiva es la abstención de hidrolizados de pescado con las cualidades nuttitivas, organolépticas y funcionales necesarias para su adecuado aprovechamiento

HIDROLIZADOS DE PROTE~NA d

Las proteínas al ser hidrolizadas, forman agregados de diferentes pesos moleculares (tabla. V), entre los que se encuentran péptidos, mezclas de péptidodamino8cidos, mezclas de aminoácidos libres (Braun, 1994)

TABLA V. Productos del hidrolizado de proteína

'Rotdos&suao bHiQoliLadourmaculpodunQpg.DatowSpeQihta,NY = p e s o m o l & d € i ~ p G l H P L c

Los hidrolizados de proteína poseen un gran número de propiedades funcionales, lo cual los hace atractivos como una fuente de proteína para la nutrición de los seres humanos (Sven Fr~kjaer, 1994)

La proteína del pescado ha sido puesta a pnieba, en diferentes estudios como matexia prima para la producción de hidrolizados (Lalasidis, 1978) Los hidrolizados de proteína de pescado podrían ser incorporados en alimentos tradicionalmente consumidos por el ser humano, podrían ser utilizados en la formulación de alimento para el ganado, para la agricultura Así mismo, podrían ser usados en la formulación de.medios de cultivo para microorganismos, como sustrato en proceso fermentativos, en medios para el cultivo de tejidos, en la estabilización de vacunas, en productos veterinarios, como atrayentes de insectos, en cosmetología y en la elaboración de dietas especiales para pacientes con pru'.iemas de absirición intestinal o para fenilcetoníiricos (Rivera, 1390)

Sin embargo, si se pretende utilizar los hidrolizados proteicos en la industria alimentaria, estos deben ser preparados por métodos que conserven sus cualidades nutritivas, por esta razón el proceso de hidrólisis debe realizarse en condiciones controladas @vera, 1990).

5

MÉTODOS DE OBTENClbN DE HlDROLIZADOS DE PESCADO

Los procesos tradicionales para solubilizar proteína de pescado involucran el colocar el pescado en contacto con altas concentraciones de sal en grandes tanques de concreto, en donde la proteólisis ocurre espontáneamente por acción de las enzimas presentes en el pescado, lográndose que aproximadamente el 50% de la proteína sea convertida a su forma soluble, estos procesos tienen una duración aproximada de un año en promedio dando como r e d d o un líquido café claro el cual es separado del material sólido residual (Rivera, 1990)

Las desventajas de estos proceso son la siguientes

a) Por ser necesario una largo periodo de fermentación, los costos de producción son elevados,

b) Se tienen bajos rendimientos (5Ph de hidrólisis); c) Una gran cantidad de proteína es desperdiciada por la baja eficiencia del proceso; d) La producción de los compuestos que dam el sabor y aroma no es controlada; e) No son utilizados pescados que son considerados de desecho, y f) Es necesario utilizar altas concentraciones de sal para evitar la contaminación

microbiana

.

a) HIDR~LISIS QU~MICA

Se ha intentado solubilizar la proteína de pescado por medios químicos (Tannembaum, 1970), se ha visto que los productos obtenidos les falta el sabor característico de los fermentados tradicionales, por lo que no son aceptables. La hidrólisis ácida o alcalina - que es un método puramente químico - puede destruir los aminoácidos con forma “L“ produciendo D- aminoácidos, e incluso formar sustancias tóxicas como la lisino-alanina. (Lahl y Grindstaff, 1989). Esto es especialmente perjudicial para los hidrolizados.de proteína, donde las proporciones de aminoácidos, dipéptidos, y-tripéptidos, son críticas para obtener una absorción efectiva de los mismos (Matthews et al, 1976). Tanto en los procesos ácidos como alcaiinos la principal desventaja, es el hecho de que posteriormente es necesario neutralizar el sobrenadante obtenido, lo que provoca que los ‘costos se eleven (Rivera, 1990). Un hidrolizado obtenido por métodos químicos presenta una composición de aminoácidos diferente a la de la proteína de la cual deriva, esto es por que se da una racriniz~zción y des?mcción de alpnos aminoácidos (serina, cisteína; metionina, trionina) (BaSo~i, 1976) Este efecto es nihs pronunciado con la presencia de otros conlpuestos, especialmente carbohidratos. Después de una hidrólisis ácida, la glutamina y asparagina se convierten en sus respectivos ácidos (Finot, 1973).

I I

6

b) HlDR6LISIS ENZIMATICA

Considerando los problemas que se suscitan con la hidrólisis química, Roe1 en 1969 evaluó la posibilidad de realizar la solubilización directa de un coflcentrado protéico de pescado con ayuda de microorganismos. En el mismo año, Hale estudió el comportamiento de 20 &mas proteolíticas comerciales en la hidrólisis de proteína de pescado, encontrando que, la más activa &e la pepsina.

En 1973 Ar8er observó, en un sistema de hidrólisk de proteína de pescado, con una proteasa de Bacillus subtilis, que .el aumento de la cuenta microbians podía controlarse modificando el pH, encontrando que en condiciones de aidkidad el crecimiento microbian0 se detuvo totalmente.

Ante el hecho de que en varios sistemas involucran la interacción de una enzima soluble y un sustrato insoluble, la velocidad de reacción es proporcional a la cantidad de enzima absorbida, Archer evaluó sí esto se presentaba en d sistema con &lo de pescado, encontrando que la enzima interacciona con el sustrato a b s o r b i i rápidamente en las partículas sólidas, dando como resultado la solubilizaci6n de la prokina y posteriormente la proteolísis de los fragmentos de proteína en solución.

La hidrólisis enzimática es un método válido para la recuperación de proteína de subproductos de la industria alimenticia. Ésta tiene diversas ventajas sobre la hidrólisis química, ya que gracias a UM proteólisis controlada, es posible obtener perfiles de péptidos bien definidos, pues se puede manipular la hidr6lisis y las propiedades de los prdluctos resultantes (Lahi, 1994).

La hidrólisis enzimática de proteinas es un proceso complejo que depende de la temperatura, pH, agitación, concentración de enzima y de proteína

Varias enzimas son ahora conocidas comercialmente con variables pH óptimos, desde pH 2 de la pepsina hasta pH 8.5 de Alcalase (3. La pepsina y la bromelina son activadas óptimamente a pH neutro y a temperatura de 7PC, una temperatura arriba de la temperatura de sobrevivencia de muchas bacterias.

En general, el pescado es mezclado con la enzima en el recipiente de digestión, después se adiciona un volumen igual de agua, una vez que la hidrólisis ha sido completada la mezcla es calentada a IOPC para inactiva la enzima y para esterilizar la suspensión. Los huesos son removidos por un tamiz. Esta suspensión contiene residuos insolubles en una solución de aniinc.kidos y péptidoc la cual es coiicenlrada y secada. Aiternativmente la sucpención puede ser separada en una fiacción soluble y una insoluble por centrifugación. La fracción soluble obtenida es concentrada y secadawvera, 1989).

~~

7

En condiciones de digestión para la enzima, el tejido dd pescado convertido rápdamente de una mezcla viscosa a un líquido libre fluido después de unos pocos minutos. Subsecuentemente la proporción de hidrólisis disminuye entrando a una fase estacionaria sin UM hidrolisis aparente, tal cinética es típica del hidrolizado del músculo de pescado(Rivera, 1989)

EL PROCESO DE HIDR~LISIS Y su CONTROL d

La hidrólisis de proteína a escala comercial, generalmente se lleva a cabo en procesos "Batch, utilizando grandes recipientes en donde existe la mezcla del sustrato con la - enzima. El proceso puede ser controlado a través de los parámetros de hidrólisis. En la producción comercial, los parámetros críticos a controlar son-nincipalmente tempenaira, tiempo, pH y grado de hidrólisis. I& condiciones de hidrólisis son controladas con el fin de obtener características específicas tales como son distribución de aminoácidos, distribución de pesos moleculares, y la cantidad de proteína resimial intacta. La tempemtun de procesamiento se selecciona normalmente para OptimUar la cinética de la enzima seleccionada. El pH de operación también es determinado para encontrar un rango óptimo en donde la enzima tenga una máxima actividad. La elección de una enzima, tmbién esta determinada por la combinación de su eficacia y economía. Una concentración elevada de enzima puede ser utilizada para incrementar la velocidad del proceso de hidrólisis (Lahl, 1994).

Otra consideración que se tiene que tomar en cuenta durante la hidrólisis, es el crecimiento de microorganismos. Actualmente el problema de UM infección es controlada con procesos más rápidos, con un mayor control en la temperatura y pH, y una mayor atención a las condiciones sanitarias (Braun, 1994).

El material y condiciones de hidrólisis deben ser también controlados para cuidar el sabor, solubilidad y ciertas propiedades físicas del hidrolizado. U sabor de los hidrolizados proteicos enzimáticos se caracteriza por un sabor amargo el cual se asocia a la presencia de péptidos cuyos procesos moleculares son bajos y cuyas -denas tienen grupos aminoácidos hidrofóbicos (Nagodawithana, 1993). Según la regla Q,.formulada por Ney en 1971, un péptido presentará un sabor más amargo si su hidrofobicidad (Q) se encuentra por arriba de 1400 caUmol, y por el contrario, no presentará un sabor amargo, si este valor se encuentra por debajo de 1300 cal/mol.

'

Eyisten, al menos, 5 variables que influyen en la obtención de péptidos amargos [Adier- Nissen, 1986): 1. La hidrofobicidad del sustrato; 2. El grado de hidrólisis, el cual influye en la concentración y longitud de los pkptidos

hidrofóbicos solubles;

' Los valores de hidrofobicidad para las cadenas de aminoácidos utilizaQs en el calculo de Q se obtwieron de Tanford, 1962: 8

3. La enzima, la a>al en combinación con el grado de hidrólisis influye en la distnaucón de los péptidos hidrofóbicos;

4 La especificidad de la enzima, ya que influye en cierto grado en la posición de las cadenas hidrofóbicas (teminales o no terminales); y

5 Cualquier método de separación involucrado en el proceso de hidrólisis' (Nagodawithana, 1993).

CARACTEI~STICAS C E N E ~ L E S DE LAS ENZIMAS - Una enzima se define como un polipéptido, que cataba una reacción con cierto grado de. especificidad (Nagodawithana, 1993)

Todas las enzimas son proteínas La funcionalidad de las enzimas es consecuencia directa de la secuencia de aminoácidos de la proteína (estructura primaria), del doblamiento del polipéptido (estmctura secundaria), de las interacciones entre los aminoácidos de las cadenas por fuems electrostáticas e hidrofóbicas y por puentes disulfuro (estructura terciaria) y del arreglo espacial de las subunidades de proteína (estructura c u a t k a ) El tamaño molecular de las enzimas varia, aproximadamente, de entre 13,000 a varios millones de Daltons, sin embargo la mayona de ellas presenta un peso molecular entre 30,000 y 50,000 Daltons (Page, 1987)

A pesar de que las enzimas son proteínas que contienen cientos de residuos de aminoácidos, sólo unos pocos residuos están involucrados directamente en la unión con sus Sustrato La naturaleza de la reacción que es catalizada por una enzima es dependiente del reconocimiento de los aminoácidos que constituyen el sitio activo Estos residuos determinan la especificidad de la reacción y su mecanismo Los otros residuos de aminoácidos de la cadena de polip6ptido dan la adecuada orientación espacial entre el sitio activo y el sustrato (Nagodawithana, 1993)

Una de las principales características de las enzimas es que son catalizadores de reacciones La catálisis se define como la aceleración de un proceso que podría ser más lento, bajo ciertas condiciones Esta propiedad junto con la de especificidad, son de los principales critenos para seleccionar una enzima Los mecanismos de acción más comunes en la catálisis enzimática, comprenden comportamiento ácido-base, neutralización de cargas, ataque nucleofilico y electrofilico, entre otros Los mecanismos de las reacciones hidrolíticas involucran la formación de un intermediario enzima-sustrato (Nagodawithana, 1993)

La especificidad de una reacción enzirnática es consecuencia directa de la estructura del sitio activo y del sustrato (Page, 1987). La estructura o forma del sustrato, son muy importante para que la enzima lo reconozca. Los residuos de aminoácidos cercanos al sitio activo, pen, que no están involucrados directamente en la catálisis, también juegan un papel importante en proveer el acceso al sustrato.

9

REPRESPTTACIÓN ESQUEMA’IICA DE UNA ENZlMAUPARIE SOMBREADAC0RREs”DE ALSITIOACTIVO

EFECTO DEL ENTORNO EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

.

Las reacciones catalizadas por enzimas dependen de las reacciones del entorno, estas características son importantes en sistemas y procesos alimenticios, en los cuales, existe un amplia gama de condiciones El conocimiento de cómo una reacción enzimática es afectada por su entorno, es indispensable para poder optimizar o controiar cuaiquier proceso enzimático (Nagodawithana, 1993)

Los principales factores que afectan la actividad enzimática son pH, temperatura y fuerza iónica

El efecto del pH en las reacciones enzimáticas, es causado por una ionización reversible del sustrato o los aminoácidos de la enzima, estos efectos se manifiestan como cambios en la actividad enzimática, estabilidad o como un cambio en el equilibrio de la reacción. Los efectos del pH en las enzimas, también dependen de la presencia o ausencia de iones específicos, temperatura, constantes dieléctricas y fuerza iónica. El pH óptimo de las enzimas puede variar en un amplio rango, así por ejemplo podemos encontrar enzimas cuyo pH óptimo sea 2 (pepsina) y otras cuyo pH es 10 (fosfatasa alcalina), sin embargo la iiia) oria de l a s eiiziiiias presenian tin pH óptimo neutral (Whitaker, 1994)

La fuerza ¡¿mica en un sistema alimenticio puede incrementarse por la adición de electrolitos El efecto de la fuerza iónica en la actividad enzimática, puede ser causada por efectos específicos o no específicos de los electrolitos (Richardson y Hyslop, 1985) La fuerza iónica afecta la proteína y la solubilidad de la enzima por fenómenos de salinización. En la mayoria de los cosos es necesario que la enzima este soluble para que pueda tener actividad, ya que las reacciones requieren de la difusión del sustrato a la enzima

10

. .,

Los efectos espcdficos de los dectroliios dependen de las conaatracicmeS de i0r wptcs que estabilizan, activan, inactivan, o inhiben una &ma particular Los iones metálicos son muy importante ya que ellos son cofactores o cosustratos para las reacciones enzimáticas, y otros pueden inactivar a las enzimas (Nagodawithana, 1993)

La temperatura es un factor importante en la actividad enzimática En general, la velocidad de la reacción incrementará con la temperatura La energía de activación de un proceso puede ser calculada según la ecuación de Arrhenius. Con un incremento en la temperahira, la movilidad de los segmentos de proteína aument* mientras la fuerza de las interacciones hidrofóbicas disminuirá Esto trae como consecuencia un decremento en la actividad catalitica, y si aumentamos más la temperatura habrá una desactivación La desnaturalización térmica de una proteína trae consigo una agregación de la misma la cual . no es siempre reversible La temperatura óptima de operación es menor si el tiempo de reacción es mayor (Draw, 1995)

PROTEAS AS

Las proteasas utilizadas para procesos alimenticios, catalizan la degradación de p&nas, que provienen de las siguientes fuentes principalmente

Pueden estar presentes en el alimento, Pueden ser excretadas por microorganismos que se encuentren en el alimento,

Las proteasas se clasifican de acuerdo a su fuente (animal, vegetal, microbiana), su acción catalítica (endopeptidasas o exopeptidasas), y la naturaleza del sitio catdítico. En la nomenclatura internacional, las proteasas (o hidrolasas peptidicas) se encuentran en la subclase 3 4, la cual se divide en 3 4 11-19 para las exopeptidasas, y en 3 4 21-24 para las endopeptidasas Las endopeptidasas son las proteasas más utilizadas en los proctsos alimenticios. Las endopeptidasas rompen las cadenas de polipéptidos en al@ enlace distribuido a lo largo de la cadena, mientras que las exopeptidasas h idroh los aminoácidos terminales

-

1. Endopeptidasas

Las 4 principales clases de endopeptidasas son serin proteasas (EC3 4 2i), cistein proteasas (EC3 4 22), pioteasas aspárticas (EC 3 4 23)). metaloproteasas (EC 3 4 24)

Como su nombre lo indica, las proteasas serin, cistein y aspática, tienen en su cadena lateral serina, cisteina y ácido aspártico, como parte esencial del sitio activo Una modificación o bloqueo de esta cadena lateral, trae como consecuencia una inactivación total de la enzima

11

.. !

Las serin proteasas preaentan una actividad máxima apH's akalinos; las cistein pmteam, sin embargo, presentan una actividad máxima a pH neutral Las proteasas aspbths," en cambio, presentan una actividad catalítica máxima, a pH's ácidos

. I

'

Las metaloproteasas contienen un metal (generalmente Zn) y tienen una actividad óptima a un pH cerca del neutro. Los iones calcio generalmente estabilizan a estas enzimas y son inhibidas por agentes qdantes como lo es el EDTA.

2. Exopeptidasas. .

Las exopeptidasas son importantes en el procesamiento de alimentos, ya que quitan los residuos amargos a los hidrolizados proteicos, en este aspecto Ins gminopePtidasas y carbopeptidasas, pueda ser aplicadas con gran éxito (Nag&* 1993).

En cuanto a su clasificación en comparación de su sitio activo, mecanismo de acción y estructura tridimensional, se conocen 4 clases reconocidas por la UNÓn Internacional de Bioquímica, y junto con es& clases existen 6 familias de proteasas reconodas. Cada familia tiene su caracterísiica o residuo de aminoácido funcional el cual está situado en una configuración particular del sitio activo. (Tabla i)(Beyond,l989)

TABLA VI. Familia de enzimas proteoliticas.

La actividad de las proteasas debería ser dada en unidades internacionales (iü), es decir, como los microequivalentes de enlaces peptídicos rotos por minuto. Sin embargo, por razones históricas existe una amplia gama de unidades arbitrarias según los ensayos particulares que se realicen con cada una. La mayoría de estos ensayos son realizados sobre hemoglobina o caseína como sustratos. La unidad de actividad es calculada como la cantidad de materia poteica digerida (que sea soluble en TCA) después de un determinado

12

- I .

tiempo Por ejemplo, la actividad de las proteasas neutras o aidinas es comúnmente determinada por el ensayo propuesto por Anson (1939) En este método, la hemoglobina desnaturalizada es digerida a pii 7 5 y a 2 f C por 10 min La cantidad de producto soluble en TCA es determinado con el reactivo de Folin y Ciocakeau En contraste, una unidad Anson (AU) es la cantidad de enzima que digiere a la hemoglobina a tal grado que la cantidad de producto soluble en TCA liberado por minuto da el mismo color que 1 mmol de tirosina La actividad especifica de una preparación enzimática esta dada en Unidades Anson por gramo de preparación (Nagodawithana, 1993)

Las preparaciones de proteasas, así como las de otras enzimas, deben ser almacenadas en lugares secos y fnos o en refngeración, de acuerdo a las instrucciones dadas por el proveedor A nivel industrial, las preparaciones enzimáticas deben ser preparadas al momento de utilizarse, y no deben ser mezcladas o diluidas c o n otros reactivos antes de ser utilizadas En los experimentos de laboratorio, sin embargo, es necesario realizar algunas diluciones debido a las pequefías cantidades que se wesitan, y em este caso, la solución diluida debe ser preparada inmediatamente antes de ser utilizada Se ha demostrado, que las proteasas en solución pueden perder mucha actividad, a pesar de permanecer solo unos pocos días en el refrigerador, debido a que las proteasas son susceptibles a la inactivacion por autólisis o, como en el caso de las cistein proteasas, a la inactivacion por oxidacibn (Nagodawithana, 1993)

d

CmÉTICA DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS. ECUACI~N DE MICHAELIS WEN.

Es necesario conocer las caractensticas cinéticas de una reacción enzimática para poder modificar enzimáticamente cualquier alimento. La cinética enzimática es la rama de la enzimología que tiene que ver con los factores que afectan las reacciones cataiizadas por enzimas. Los factores más importantes .wn la concentración de enzima, de sustrato, pH y temperatura. Cuando todos estos factores se analizan adecuadamente, es posible conocer mucho acerca de la naturaleza de la enzima. Así por ejemplo, ai variar la concentración de sustrato es posible deducir los mecanismos cinéticos de la reacción, es decir, el orden en el cuál el sustrato se une a su enzima. Un estudio del efecto de la variación de pH y temperatura en las constantes cinéticas, da información a cerca de da identidad de los aminoácidos del sitio activo (Segel, 1993).

La primera ecuación general para reacciones que involucran enzimas fie descrita en 1903 por Henri. ILa ecuación de Henri indica que la velocidad inicial es dii-ecjamente yroporciunai a la concentración de enzima, pero incrementa de una forma no lineal cuando se incrementa la concentración de sustrato amba de la velocidad máxima.

13

La derivación de la ecuación de Henri, se basó en los siguientes puntos

La enzima es un catalizador La enzima y el sustrato reaccionan rápidamente para formar un complejo enzima- sustrato Solamente existe un sustrato y un complejo enzima-sustrato, el cual al romperse forma enzima libre y producto La enzima. sustrato y complejo enzima-sustrato, están en equilibrio, Ib decir, la velocidad a la cual ES se disocia a E + S es más rápida que la velocidad a la cual ES se rompe para dar E + P La concentración de sustrato es mucho más grande que la concentración de enzima, por lo que la formación del complejo ES no altera la concentración de S La velocidad de la reacción es limitada por el rompimiento de ES para dar enzima libre y producto La velocidad es medida durante las etapas iniciales de la reacción, en donde las reacciones reversibles son insignificantes

.

La ecuación de Henri es v 1+[S1

ks

donde: [SI= Concentración de sustrato. v = velocidad inicial a una concentración de sustrato dada.

Ks= la constante de disociación del complejo ES. K= constante característica de la enzima.

Michaelis y Menten, posteriormente hicieron una modificación a la ecuación de Henrt

v = K s + S

Si puede ser observada cuando toda l a enzima esta presente como ES

v=Kp[ES], entonces Kp[E]t podría ser Vmax, la velocidad máxima limitante que

14

r-

- 1 -, .

Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas, son aplicables a las reacciones catalizadas por enzimas; pero éstas muestran un razgo característico. la

I saturación con el sustrato.

Si examinamos la curva de Vo vs. ‘[Sustrato], encontramos tres regiones distintas, donde la velocidad responde de una forma característica al increment.0 de la concentración de sustrato (fig. (a)). A muy bajas concentraciones de sustrato ([S]<O.OiKm) la curva Vo vs. [Sustrato] es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es directamente proporcional a& concentración de sustrato (fig. e)). Esta es la región de cinética de primer orden. A muy altas concentraciones de sustrato ([S]>lOOKm), la velocidad es esencialmente independiente de la concentración de sustrato, y se aproxima asintóticamente a una velocidad constante. Esta es la región de cinética de orden cero (fig. (c)). A concentraciones intermedias de sustrato, la relación entre Vo y [SI no sigue una reacción de primer orden ni una de orden cero. (Segel,1993). ’

Fig 1. -0 de la mncenbaci6n de sumato sobre la velocidad de una reaa2ón catalizada enzimáticamene.

La teoría de Michaelis Menten supone que la enzima E, se combina en primer lugar con el sustrato S, para formar el complejo enzima-sustrato ES, a continuación este último se escinde en una segunda etapa, para formar enzima libre y producto P. Se supone que estas reacciones son reversibles.

La ecuación de Michaelis Menten es la ecuación de velocidad para las reacciones catalizadas por enzimas que sólo actúan sobre un sustrato; relaciona la velocidad inicial, la velocidad máxima y la concentración inicial del sustrato a través de una constante llamada ‘Constante de Michaelis Menten”.

15 . .

!

U'

14

(hi

La ecuación de Michaelis Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son más útiles para la expresión de los datos experimentales Una de las transformaciones más usuales se obtiene, tomando los recíprocos de ambos miembros de la ecuación de Michaelis Menten obteniendo

. Esta ecuación es la de Linewaver-Burk. Cuando 1No se representa fiente a l/[S]. se obtiene una línea recta. La pendiente de la recta es KmN- y la interUecci6n sobre el eje ]No, es IN&; la intersección del eje i/[S] es -]/Km. Tal representación tiene la ventaja de que permite una detenninación mucho más exacta del valor de Vmáx, ya que la representación sencilla de Vo frente [SI d o se obtiene un valor aproximado.

FUNDAMENTOS DE UNA EIDR~LISIS ENZIMATICA

Lac: proteasas catalizan In degradacih hidrolítica de la cadena de péptidcs

Ri H H H R1 H H U I I I PROTEASA I I 1 I

- C - C - N - C f &N-C - - C - C - N - C + H2N-C I I I I I 7 I I I I I

se muestren los En la figura, no se observas los mecanismos de la catatisis, unmmatc productos y reactantes netos De acuerdo a Svendsen (1976) la catálisis de las serin proteasas (la principal clase de proteasas) ocurre en 3 reacciones consecutivas (1) Formación del complejo de Mochales entre la cadena de péptido original (el sustrato) y la enzima (2) Rompimiento del puente péptidico para liberar uno de los 2 péptidos resultantes (3) Un ataque nucleofilico ai complejo péptidico sobrante para liberar asi a la enzima.

, .

Si el sustrato lo simbolizamos como S y a los péptidos resultantes, P y F, y si la reacción ocurre en un sistema acuoso el cual impida que la reacción será reversible, la reacción hidrolítica puede ser simplificada por el esquema siguiente: .

K+1 K+2 K+3

2 E + S , ES-EP + E-P’ -E+P-OH + E-P’

K-1 + n2o

De esta serie de reacciones, la segunda de las tres, es la deteminan& . Esto significa que la reacción total es determinada por K +2 y que Km es aproximadamente igual a la contante de disociación, K-IíK+l, En otras palabras, se lleva a cabo una cinética clásica de Michaelis-Menten.

En la reacción anterior, no solo el agua, sino también los grupos amino libres pueden reaccionar como nucleófilos, mientras Ocurre la siguiente reacción de transpeptidación.

R~ H n holW~ Ri n I I I I I

- C - C - N - C - + HzO, \-C-CoO- + &Pi- C - II I I I

n o r4 H Rz

Existe una competencia entre el agua y el HzN-, y a pesar de que la hidrólisis se ve favorecida por el alta concentración de H20, el ataque nucleoflico del HzN- a menudo ocurre más rápido

El grupo carboxil libre y el grupo amino libre formados después de la hidrólisis serán de una forma más o de una forma menos ionizables dependiendo del pH de la reacción Los \alore$ de pk (25°C) de -COO13 y +HIN- en los polipeptidos se estima que son 3 1 - 3 6 y 7 5 - 7 8 respectivamente

El grupo carboxilo estará

. . . No disociado debajo de pH 2 Parcialmente disociado a pH 2 - 5 Completamente disociado arriba de pH 5 17

El grupo amino estará . Completamente protonado debajo de pH 6 1 Parcialmente protonado a pH 6 - 9 5 . No protonado arriba de pH 9 5

Por lo anterior se puede observar que en la hidróiisis de la proteína se da una liberación o toma de H+ Esto quiere decir que el pH cambiará durante la reacción de hidrólisis, excepto en la región alrededor de pH 5-6, donde la toma y liberación de protones se cancelan una a la Otra Debajo de pH 3 1 - 3 6 el grupo carboxilo estará menos de la mitad disociado y el grupo amino estará completamente protonado, y si no se umiroia el pH. habrá un incremento del mismo, ya que se tendrh UM toma de H+ de alrededor de 0.5 a 1 equivalente por cada puente W d i c o hidrolizado Por el contrario, a valores de pH arriba de 7 5 - 7 8 (25°C) el grupo amino estará menos de la mitad protonado pero el grupo carboxilo estará completamente disociado, lo cual permitirá una iibgpción de H+ de 0.5 a 1 equivalente por cada puente péptidico hidrolizado, y como consxuencia el pH d d si no es controlado

Siempre que se lleve a cabo una hidrólisis con un sustrato y una enzima determinada, se tendrá que describir, bajo los llamados “parámetros de hidróüsis”, los cuales son concentración de sustrato, proporción enzima-sustrato, pH y temperatura Estos cuatro parámetros de hidrólisis son determinantes en cuanto a que tan rápido proceda la reacción, así como para otras características del proceso

La concentración de sustrato se abrevia con una S, y es usualmente dada como un por ciento en peso de la masa total de la mezcla de reacción cuando esta se inicia. La proporción enzima-sustrato, es usualmente más característica de la velocidad de la reacción que la concentración por si misma de enzima Esto es porque el proceso de hidrólisis se llevan a cabo a menudo a altas concentraciones de sustrato donde prevalece una saturación del mismo

Las condiciones iniciales de la reacción son declaradas, ai tener bien definidos al sustrato, la enzima y los parámetros de hidrólisis. Durante la reacción estos parámetros tenderán a cambiar de sus valores iniciales. En el curso de la reacción, el grado de hidrólisis , el cual es una medida de que tanto se ha dado la degradación hidrolítiq incrementa de cero y usualmente sigue una curvatura ligera. Esta curva, la cual desnibe el grado de hidrólisis en función del tiempo, se llama curva de hidrólisis (Adler-Nissen, 1986).

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SELECCI~N DE LA ENZIMA A UTILIZAR

La hidrólisis enzimática al representar una alternativa para la recuperación de proteína, y en vista del interés económico y nutritional hacia el aprovechamiento de proteína de subproductos de la industria pesquera, es necesario la selección de UM enzima que produzca los péptidos con las características nutricionales y funCional~ requeridas

Se han realizado varios estudios utilizando enzimas de diferente origen para soiubilizar la proteína del pescado Las enzimas más exitosas han sido a) origen animal pepsina y mpsina, b) origen vegetar bromelina y papaina y, c) origen microbiauo. Se han u t i l i 0 enzimas de Asoernillus flavus, Actinomices fiadiac, Therm oactinomices vulgaris, Streptomices miceus, Bacillus licheniformis, Bacillus wlvmma y Bacillus subtillis

A nivel nacional las enzimas de origen animal tiene precios elevados, ya que su produwión se ve reducida a niveles muy bajos por ser un subprodudo de los procesos implementados con el fin de obtener carne, además es necesario importarias; por ello su utiiiiión se. ve reducida a la industria farmacéutica, la que requiere voiúatmes muy pequeños de enzima

Con las enzimas de origen vegetal se presenta el problema de que las plantas de las que se obtienen, &n sujetas a factores climatológicos y ciclos de producción que limitan su disponibilidad, e igualmente son importadas Además de que ser cultivos cuyos htos se destinan para consumo humano, lo que hace más crítica la situación

En este sentido las enzimas proteolíticas de origen microbiano, poseen un gran potencial, ya que pueden generarse anualmente grandes cantidades, sin necesidad de extensas áreas de cultivo, ni de ciclos de producción ni variaciones climatológicas

Por otro lado, como ya se ha mencionado, uno de los principales problemas en la hidrólisis de proteínas, es la formación de compuestos que generan sabores amargos, debido al alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos en el hidrolizado Además se ha observado que el tipo de enzima usada para la hidrólisis tiene influencia en la presencia de sabores amargos

. .

Además, considerando lascaracterísticas de las proteasas animales y vegetales antes mencionadas, las proteasas microbianas pueden y deben ser utilizadas para desarrollar proceso dirigidos a la producción de concentrados de péptidos solubles y aminoácidos.

Las enzimas se caracterizan por sus curvas de actividad de pH y temperatura. Estas curvas junto c m las wnw de estabilidad son indicadores útiles para definir las condiciones bajo las ciraies una enzima debe ser aplicada.(Kivera, 1990)

La enzima ALCALASE 8, es una proteasa grado alimenticio. Es una proteasa del tipo senna, caracterizada por un excelente rendimiento a temperaturas elevadas y aldinidad moderada para un substrato alterno de cam'na, se produce mediante fermentación sumergida de una cepa seleccionada de Bacillus licheniformis. La enzima Alcalase @ se presenta en diferentes productos granulados y líquidos, su actividad proteolítica se

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i

expresa en Unidades Anson (AV), su actividad óptima se presenta a pH's aicrlinos y ea un rango de temperatura entre 55 y 65" C, dando también homogeneidad en la hidróiisis de los desechos de la industria pesquera

Alcalase @ es fácilmente. soluble en los líquidos detergentes a cualquier concentración, temperatura e índice de pH de uso normal. En cuanto a su toxicología, ésta se produce a base de microorganismos no toxicogénicos y no patógenos por lo que esta clasificada como no tóxica, y es fácilmente biodegradable.

Alcalase @ está clasificada en "Chemical Abstract Service" como una "wbtilisina" (CAS núm. 9014-01-1) . El ' número correspondiente de "Enzyme Classification" (Unión Internacional de Bioquímica) es EC núm. 3.4.21.62.

*

DETERMINACI~N DE PROTE~NA POR EL MÉTODO DE UIWRY.

Dentro de los métodos más utilizados para la determinación de proteína, se encuentra el método de Lowry. El constituyente activo del reactivo de Folin Ciocaiteu, es el ácido fosfomoiibdico-tungstico. Este ácido se reduce por acción de ciatas proteinas, dando un sin número de especies reducidas, las cuales se caracterizan por tener un color azui. Los iones de cobre presentes en el reactivo, quelan con el puente peptídico y esto facilita la transferencia de electrones entre el constituyente activo y la proteína, dando así la formación de un cromógeno. La reacción tiene que realizarse en condiciones aidinas. Los residuos de aminoácidos con los que reacciona son tnptofano, tirosina, cisteina, cistina, histidina

La principal ventaja del método de Lowry es su gran sensibilidad, y su principal desventaja es el número de sustancias que interfieren. El rango sobre el cual el color es lineal es limitado, pero esto se puede solucionar utilizando diluciones. Entre una de las alternativas para eliminar trasferencias, se encuentra la precipitación de las proteínas con al ácido tricloroacético (TCA), dejando a la sustancia que interfiere en solución (Sterens, 1980).

ELECTROFORESIS EN GEL DE UNA DIMENSIdN

SDS-PAGE (gel de electroforesis duodecil sulfato de sodio-poliacrilarnida), es un método ?\relente pare! identificar, nionitorear, cuantificar y aislar proteinas especificas en mezclas complejas. SDS-PAGE es utilizado comúnmente para la estimación de pesos nioleculares de subunidades de proteína y para determinar su composición.

En una separación electroforética, se induce a que las partículas cargadas, migren hacia el electrodo de signo opuesto bajo la influencia de un campo eléctrico externo. El movimiento de las partículas se retarda por la interacción de la matriz del gel, en donde están suspendidas, las cuales actúan como filtros moleculares. Debido a que la fuerza

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eléctrica y el filtro molecular son fuerzas opuestas, dan como resultado una migración diferente para las proteínas que constituyen la muestra

En general, la separación por electroforesis en gel, se basa en el tamafio, forma y cargas netas de las macromolkulas Durante la preparación de las muesíras, las proteínas se tratan con SDS caliente El detergente aniónico se une fuertemente a la mayoría de las proteínas (1 4 mg de SnS/mg protelna) impartiéndoles una carga negativa al complejo resultante La interacción c o g D S rompe todos las proteínas unidas por enlaces no covalentes, causando que la molécula se desdoble Si se realiza un tratamiento paralelo con un agente redudor, como lo es el 2-mercaptoetan01, la proteína sufke una mayor desnaturahción, por lo que se rompe en sus subunidades constituyentes

La migración de los complejos del SDS es hacia el ánodo y la velocidad es inversamente proporcional al iogaritmo de sus pesos moleculares Los poiipéptidos SDS se mueven a través de los geles de una manera predecible, los complejos con bajo peso molecular migran más rápido que los más grandes Lo que significa que el peso molecular de una proteína puede estimarse por su movilidad en el gd SDS-PAGE

La mayoría de las electroforesis se realizan en cámaras verticales, en un gel que se forma entre dos platos de vidrio En el gel se pueden corren diferentes muestras U espesor dd gel se logra por espaciadores que se colocan entre los platos de vidrio. Los geles convencionales son del orden de 16 a 20 cm de longitud, 16 cm de ancho y O 5-3 O mm de espesor, y pueden llegar a albergar hasta 25 muestras

.

Los geles de poliacrilamida se forman por la copoiimerización de un monómero de acrilamida CHz%H-CO+J"H, y por la unión con N,N' metilenbisacrilamida CH2=CH=CO-NH-CHz-NH-CO-CH=CH2. El mecanismo de la formación del gel es por UM polimerización catalizada por un sistema generador de radicales libres compuesto de persulfato de amonio (el iniciador) y un acelerador, tetrametiletilen-diaina (TEMED). TEh4ED provoca la formación de radicales libres del persulfato y cataliza la polimerización. El oxígeno interfiere con la polimerización (secuestra radicales), por io que es necesario una adecuada desaereación para remover el oxígeno disuelto de la solución de acrilamida y obtener un gel adecuado:

Las propiedades filtrantes del gel se establecen por la matriz formada por las cadenas de poliacrilamida. Al incrementar la concentración de acnlamida en un gel, el tamaño de poro disminuye. El tamaño de poro efectivo en un gel, se define por sus propiedades fikrantes, es decir, por la resistencia que imparte a la migración de las moléculas de proteína. Un dr:erminado pel, esta caracterizado fisicatnente por un par de f i p r a s (%T, % C), donde %T es el peso en porcentaje del monómero (acrilamida+ ligador, en gramos por 100 A), y %C es la proporción del ligador (como % del monómero total) en el gel. Los límites prácticos para %T se encuentran entre 3 y 30%, en general, el tamaño de poro de un gel decrece al incrementar el %T.

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1

E!l uao de resctivos de aha Calidad w un pre-requisito para obtaia geies reproduQbla de aita resolución, principalmente para la acrilamida la cual constituye el componente mas abundante en la mezcla del gel-monómero Los componentes del buffer deben de ser de grado readivo y solo debe utilizarse agua destilada o desionizada para preparar las soluciones

El método de electroforético mas popular es el sistema SDS-PAGE desarrollado por Laemmli (1979) Este es un sistema discontinuo que consiste en dos geles Contiguos pero diferentes un gel para resolver o “separating” (inferior) y un gel “stacking” (superior) Estos geles tienen diferentes poroBades, pH y fuerza iónica, aunado a esto se utilizan diferentes iones moviles en los buffers de gel y de electrodo. La discontinuidad del buffer actúa para concentrar grandes volúmenes de muestra en el gel “stacking”, obteniendo así una mayor resolución @eutscher, 1990)

.

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OBJETIVOS

GENERAL

Obtención y caracterización, en base al peso molecular, de péptidos obtenidos a uartk de la recuucración de ~ k e i m de SubDroductos de la 'ndustna -peSquera mediante la ahidrólisis e&mhtica con Al A ase8

ESPECÍFICOS: .

Caracterización enzimática de ALCALME @ en términos de pii, temperatura y tiempo, utilizando como substrat0 un homogeneizado de desechos de la industria pesquera.

Caracterización bromatológica general de un homogeneizado de desechos de la industria pesquera.

Separación y caracterización en base a pesos moleculares de los péptidos obtenidos.

Proponer usos alternativos para las diferentes fracciones peptídicas

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ME TO DO LOG^

ANALISIS BROMATOL~GICO

El análisis bromatológico de las muestras de desecho de pescado (DP), se efectuaron de acuerdo a métodos oficiales Los análisis practicados fueron determinación de Nitrógeno Total por el método de weldah1 de acuerdo con el A O A C (1970); c o a i d o de grasa de acuerdo a la norma de calidad NMX-F-89-S-1978, cenizas con la NMX-F-66-S-1978, y humedad con la norma NMX-116-SSAI-1994 . PREPARACIÓN DE SUSTRATOS:

a) Hemoglobina como sushato alterno

Se preparó una solución de hemoglobina ai 2%, disolviendo con agitación suave, 5 g de hemoglobina (Worthington Biochemical Corp ) en una solución de 80 g de urea en 80 ml de agua Posteriormente se incubo a 37°C por 1 h, se ajusto el pH según el experimento a realizar, con buffer universal O O5 My se aforó a un volumen de 250 mL (Beynon,1989)

b) Desecho de pescado:

Se fileteb ath obtenido en la Central de Abastos de la Nueva Viga. El desecho del fileteado fue triturado y homogenizado en una picadora Osteiizer, empacado ai vacío (lotes 200 g) y congelado (-ZOOC) hasta su uso

PREPARACIÓN DE LA SOLUCI()N DE ENZIMA:

La solución enzimática se preparó diluyendo en agua destilada la enzima Alcaiase @, obtenida de las industrias Novo Nordisk, en una presentación granular con una actividad declarada de 3.0 AU/g.

1. TRABAJOS PREVIOS REALE.4DOS EN HEMOGLOBMA

Todos los análisis fueron realizados por triplicado.

1 .- Método para determinar la actividad proteolítica sobre hemoglobina:

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Este método es el reportado por Sarhah (1989), el cual es una prueba de endopeptidasas con proteina como sustrato. Primeramente se equilibró la solución (de hemoglobina) a la temperatura Óptima (5OOC) y pH óptimo (8) reportada en la ficha técnica proporcionada por el proveedor (Novo Nordisk).

Se tomaron alicuotas de 2.5 mL de la solución de hemoglobina y se adicionó 0 . 5 mL de la solución enzimática al O.l%, se mezcló y se incubó a diferentes tiempos ( O, 5 , I O , 15 y 20 minutos) La reacción fue detenida por la adición de 5 mi de Ac. Tricloroacétjco al 5%. Posteriormente se centrihgó (21500 x g) durante 10 minutos, y se leyó la absorbancia a 280 nm.

Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima necesaria para - causar un incremento en una unidad en el valor de la absorbancia leída a 280 nm, a través de 1 cm de longitud (Beynon,l989).

Se preparó un testigo para cada tiempo el cual se trató de manera similar a las muestras pero la solución enzimática se incorporó después de la adición del TCA. El blanco fue preparado de manera similar a las muestras sustituyendo la solución enzimática (0.5 mL) por agua destilada. Dicho blanco y testigo, se prepararon de la misma forma, en cada uno de los experimentos postenores.

2.- Determinación de pH Óptimo de reacción de Alcalase 8

Se prepararon soluciones de hemoglobina a diferente pH ( 6,7,8,9,10,11 y 12). Se tomaron alicuotas de 2.5 mL y se llevaron a 50 "C, posteriormente se adicionó 0.5 mL de la solución enzimática ( O. 1%) y se incubó durante 15 min. La reacción fue detenida por la adición de 5 mL. de TCA al 5%. Se llevó temperatura ambiente (20 "C), se clarificó por centrifugación ( 1 O min,2 1500 x g) y se leyó absorbancia a 280 nm.

3.- Determinación de temperatura óptima de reacción de Alcalase @

Se tomaron alicuotas de 2.5 mL de la solución de hemoglobina al pH óptimo de reacción, y se adicionó 0.5 mL de la solución enzimática (O.l%), posteriormente se incubó durante 15 min a diferentes temperaturas ( 30, 40, SO, 60, 7OoC ). La reacción fue detenida por la adición de 5 mL de TCA al 5%. Se llevó a temperatura ambiente (20 "C), se clarificó por centrifugación (10 min, 21500 x g) y se leyó absorbancia a 280 nm.

4.- Determinación del pH de estabilidad

Se prepartiron soluciones de enziiiia ( O. 1%) en buffers a diferente pK (6, / ,& ,? ' I@, ! 1 y 12) y en agua destilada. Se almacenó durante 18 horas (4OC) y se determinó actividad proteolítica (I5 min).

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5 - Determinación de la termoestabilidad

Alicuotas de solución enzimática (O 1%) fueron almacenadas (18 h) a diferentes temperaturas ( 4, 20, 30, 40, 50 y 60°C ) posteriormente se determinó la actividad proteolitica residual

6 - Determinación de la estabilidad enzirnática de Alcalase @ a pH y temperaturas Óptimas.

Alicuotas de solución enzimática (O 1%) se almacenaron en condiciones óptimas de pH y temperatura ( 26 horas) Se determinó la actividad proteolitica residual cada 2 h en condiciones óptimas de reacción

11. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA DE ALCALASE @ ~

UTMZANDO COMO SUSTRATO DESECHOS DE PESCADO (DP) -

1 .- Elaboración de curva patrón de tirosina

Se preparó una solución patrón de tirosina a una concentración de 2 mg/mL en TCA 0.3M de la cual se realizaron diluciones para obtener diferentes concentraciones (O 2 mg/mL - 3 mg/mL). De cada solución se tomaron 25 pL para realizar el método de Lowry y determinar la proteina soluble (mg tirosindml ) el cual se describe a continuación.

2 - Método de Lowry: Se tomaron alicuotas de 25pL y se adicionó 0.225 mL de agua destilada, 1.25 mL de NaOH 0.5N y 0.25 mL de Reactivo de Fohn & Ciocalteus Fenol IN. Las muestras se mezclaron inmediatamente y se incubaron a 30°C por 15 minutos. Se leyeron sus absorbancias a 578 nm y los resultados se extrapolaron en la curva patrón de tirosina Se elaboró un blanco adicionando 25pL de agua destilada, O 225 mL de agua destilada, 1.25 mL de NaOH 0.5N y 0.25 mL de Reactivo de Fohn & Ciocalteus Fenol IN. Se le dio el mismo tratamiento que a las muestras.(Beynon,1989)

3.- Hidrólisis enzimática de desecho de pescado (DP).

Se preparó una mezc1a'sustrato:buffer universal (0.05 M), en una proporción 1:3 y se ajustó el pH a 8.5. La mezcla fué preincubada a 60 "C por 30 minutos. Se adicionó una solución enzimática ai 2% en relación ai sustrato' y se mantuvo en agitación constante. Se tomaron zliciioias (por triplicado) de 1 mL a diferentes tiempos ( 0; 2, 4: 6. 8. 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, ?5,40, 45, 50, 60, b5 min.), y se incorpoi-aron a tubos que contenían 2 mL de 7CA (0.3M). Las muestras se llevaron a temperatura ambiente (20 "C) y se clarifico por centriíügación ( I O min, 21500 x g). Se tomaron alicuotas de 25 pL y se determinó proteína por el método de Lowry (Morrisey,l997).

Q

El sustrato corresponde a la cantidad de proteina encontrada en el desecho de pescado, la cual es del 13%. 26

4 - Efecto de la proporción substrato:buffer en la hidrólisis enzimática de DP.

Se realizó la hidrólisis enzimática de DP variando la proporción substrato:buffer ( I : 1 , 1:2, 1-3 y 1:4 ). En este caso el tiempo de reacción fue de 20 minutos y las condiciones de hidrólisis fiieron pH 8.5 y temperatura 600C(Momsey, 1997).

5 - Efecto de la concentración de enzima en la hidrólisis enzimática de DP

Se realizó la hidrólisis enzimática de DP manteniendo constante la concentración de sustrato y variando la concentración de enzima (0,50,100,150,200,250,300 y 350 pg Alcalase @/mL ) El tiempo de reacción fue de 10 minutos y las condiciones de hidrólisis pH 8.5 y temperatura 60 "C (Morrisey,l997).

6 - Efecto de la concentración de substrato en la hidrólisis enzimática de DP.

Diferentes cantidades de DP (2, 3, 4, y 5 g) fueron hornogenizadas en 100 mL de buffer universal (0.05 M, pH 8) . Cada uno de los homogenizaáos se llevó a 60°C ( 30 min) y posteriormente se adicionó la solución enzimática ( 2?40). Para cada concentración de substrato se tomaron muestras de 1 mL cada 2.5 minutos en un intervalo de tiempo de O a 10 minutos y fueron incorporadas a tubos que contenían 2 mi. de TCA (0.3M). Las muestras se llevaron a temperatura ambiente (20 "C), se clarifico por centrifugación (10 min, 21 500 x g). Posteriormente se realizaron los cálculos necesarios para determinar Km y Vmax según el método Michaelis Menten y la doble recíproca de Lineweaber Burk (Whitaker,l994).

7 - Determinación de pH óptimo de reacción de Alcalase 8.

Se mezcló DP con buffer universal (0.05M) ajustado a diferente pH ( 6, 7, 8, 9, I O y 1 1 ) en proporción sustrato:buffer de 1:3 . Cada UM de las mezclas se llevaron a 60°C (30 min ) y posteriormente se les adicionó una solución enzimática al 2%. Para cada pH se tomaron muestras de I mL cada 2.5 minutos en un intervalo de tiempo de O a IO minutos y fueron incorporadas a tubos que contenían 2 mL de TCA (0.3M). Las muestras se llevaron a temperatura ambiente (20 "C), se clarificó por centrifugación (10 min, 21500 x g) (Whitaker,l994). Se tomaron alicuotas de 25 pL y se determinó proteína por el método de Lowry.

8.- Determinación de temperatura óptima de reacción de Alcalase 8

Sr inezcló TIT' coii buffti imiversal (O.OSM) Rjustado a pH óptimo de reacción en proporción su strato. buffer 1 :3. Se realizó la hidrólisis enzimática a diferentes temperaturas ( 30,40, 50,60 y 7OOC) adicionando solución enzimática al 2%. Para cada temperatura se tomaron muestras de 1 mL cada 2.5 minutos en un intervalo de tiempo de O a IO minutos y fueron incorporadas a tubos que contenían 2 mL de TCA (0.3M). Las muestras se llevaron a temperatura ambiente (20 "C), se clarificó por centrifugación (IO min, 21500 x g) (Whitaker, 1994). Se tomaron alicuotas de 25 pL y se deteminó proteína por el método de

27 Lowry.

I

9.- Determinación del grado de hidrólisis (GH) como péptidos solubles en TCA O 3 M

El grado de hidrólisis (GH) se determinó según el método descrito por Baek and Cadwallader (1995) y se calcula como:

(Dt - DO) GI3 = * 100

(Dmax - Do) donde.

Dt = péptidos solubles en TCA 0.3M al tiempo t (IO, 20, 30, 60, 90 y 120 min.), expresados como tirosina (mgímL). Do = péptidos solubles en TCA 0.3M al tiempo cero. Dmax = péptidos solubles en TCA 0.3M después de una hidrólisis total (0.5 mL de hidrolizado en 4.5 mL de HCI 6N A lOO"C, durante 24 h.)

.

Se adicionó 0.5 mL de la solución muestra en I mL de TCA (0.3 M) se mantuvo a temperatura ambiente (2OOC, 20 min), se clarifico por centnfugación (10 min, 21500 x 9). Se tomó una alicuota de 25 pL y se determinó proteína por el mktodo de Lowry.

MÉTODO ELECTROFOR~TICO

Se utilizaron las soluciones que se muestran en la tabla I y 11. La composición de las mezclas de acrilamida y de los geles se define con las letras T y C. La letra "T" denota la concentración total en porcentaje de la acrilamida y bisacrilamida. La '%" denota la concentración del ligador (crosslinker) relativo a la concentración total de T. Todas las soluciones se mantuvieron a temperatura ambiente con excepción de las mezclas de acrilamidabisacrilamida, las cuales se almacenaron a 4 "C. La composición del gel espaciador, separador y el gel Stacking se muestran en la tabla IU.

Tabla 1. Soluciones buffer utilizadas para la elaboración del gel SDS-PAGE

Buffer ). .Tricina (M) . PH ~~~~ ~~~~~~

Buffer del anodo - 8.9 Buffer de catodo 0.1 8.25 ~ 0.1

Bufferdegel ; 3.0 - 8.45 0.3 ........ .,.. ..,,.. ~ . ~ . . . ~ ~ ~ .... ~ ~ ..,. ~ .......

Tabla 11. Soluciones de acrilamida bisacrilamida

Mezcla acnlamida- Porcentaje de aeriiamidr e de bisacrilrm bisacrilamida

49.5% T, 6% C 46.5 3.0

j ~~ .. . C~~~ w/v) ~~ ~~ ~~~ ~.~ . . . ~~ ~~ ~ .

49.5% T, 3?4& I 48

28

....

d: Tabla In. Composición del gel separador, espaciador y stacking.

Gei Sticking Gei espaciador Gel separador 49.5%T, 3% c O. 5 I -

3.3 49.5%T,6?h C ~ . . .

1.65 3.3 - 1 Buffer de gel 1.55

- - .. .- .......

- Glicerol . . . . ~~ ~~

Urea - * Añadir agua a un volumen final de 5mL - -

5mL 10 mL

. Primero se colocó el gel de poro pequeño (16 5% T), después el gel espaciador (IO?? T, 3%C) (2-3 cin) y por último, el gel stacking ( 4 O oT, 3% C)

El gel separador y el gel espaciador se polimerizaron juntos ( I S min) al adicionar 100 pi- de una solución de persulfato de amonio al I O ? ? y 10 pL de TEMED por cada 30 mL de mezcla.

El gel stacking fue polimerizado con la adición de 100 pL de una solución de persulfato al 10% y 10 pL de TEMED por cada 12.5 mL

PREPARACION DE LAS MüESTRAS

Las muestras de proteina obtenidas a través de hidrólisis de pescado a los O, IO, 20,30,60 y 120 min, fueron centrifugadas (21500 x g, 10 min). Se tomaron alicuotas de 10 pL a las que se les adicionó azul de bromofenol, cada muestra se inyectó dentro de los geles polimerizados, así como el marcador.

CORIUDA DEL GEL

Se colocaron los electrodos después de haber colocado el buffer de cátodo y ánodo (la comente debe fluir hacia el ánodo). La electroforesis se llevó a cabo a temperatura ambiente (2.5 horas). El voltaje inicial de la corrida fue de 30 V, posteriormente a que la rni:rcti'a entro completamente a l stackins 10 S h), el voltaje se cambió a 85 V.

FIJACION, TEÑIDO Y DESTENIDO

Las bandas de proteína fueron fijadas (30 min) en una solución de metano1 (50%) y ácido acético (IVA). Posteriormente se tiñeron con azul de koomasi y ácido acético (IG??) durante Ih. El desteñido se realizó con una solución de ácido acético (1O"h) durante 2 h. 29

OaTETIVOS Y METAS ALCANZADOS

1 Se caracterizó la actividad enzimática de Alcalase @, utilizando hemoglobina como sustrato alterno - pH Óptimo

Temperatura óptima pH de estabilidad Temperatura de estabilidad Estabilidad de reacción a pH y temperatura óptimos .

2 Se caracterizó la actividad enzimática de Alcalase 8, utilizando el desecho de pescado como sustrato

Efecto de la relación E/S . Efecto de la relación enzima buffer . Determinación de pH óptimo = Determinación de temperatura óptima . Determinación de grado de hidrólisis

3 Se caracterizó en base al peso molecular, las diferentes fracciones peptidicas obtenidas a partir del hidrolizado de desecho de pescado a diferentes tiempos de reacción

4 Se determinó la composición bromatológica del desecho de atun

30

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Al ser uno de los principales objetivos del proyecto el recuperar proteinas de subproductos de la industria pesquera, fue necesario decidir que especie seria la más adecuada para utilizar como sustrato. La especie seleccionada para trabajar fue el atún

Entre los cn@ios que se tomaron en cuenta para la selección de la especie tenemos en primer lugar que el atún es la principal especie que se captura por año (129,415 ton) (SEMARNAP, i996), así mismo es una de las especies que más se industrializa, y de la cual existe un mayor desecho

El atún se compró en la ‘Wueva Viga”, se fileteó y la cantidad de desecho obtenido fue el 65% respecto al peso total, dato que concuerda con los datos reportados por Monkey (1997), quien menciona que durante el procesamiento del pescado, se generan desechos sólidos que incluyen vísceras, cabeza, piel, hueso y algo de tejido muscular, los que pueden llegar a ser hasta el 70% de la materia prima original.

.

ANÁLISIS BROMATOL~GICO

El desecho de atún tuvo, la siguiente composición bromatológica.

PROTEJNA” LIPiDOS CENIZA HZ;MEDAD (base húmeda)

DESECHO DE ATUN 22 83% 2 89% 2 48% 71 79%

* El Nitrógenci Total fue de 3 65%, utilizando el factor de 6 25

31

.. n . ,..- .- a>

El atún al ser una especie de la familia de los túnidos, presenta un contenido de proteína semejante a las especies de su grupo, asi por ejemplo Rivera (1990) reporta que el bonito (perteneciente a esta familia) tiene un porcentaje de proteina del 23 5%

Del análisis bromatológico del desecho de atún, se desprende que su contenido de proteína es alto (22.83%), en comparación con otras especies como son la merluza (17%) y el bagre (1 7 S%) (Rivera, 1990) Este alto contenido de proteína en el desecho de atún justifica la obtención de hidrolizados ya que se esta recuperando proteína a partir de un desecho con alto contenido proteice

Así mismo, es recomendable utilizar especies cuyo contenido de Iípidos sea reducido (especie magra) para que así durante el proceso de obtención de hidrolizados proteicos la oxidación de lípidos no sea un factor desfavorable, ya que los hidrolizados pueden adquirir un sabor a rancio o una posible formación de compuestos tóxicos, resultado de la oxidación lipidica. A este respecto, el desecho de atún presenta una cantidad de Iípidos del 2.89?h, y a pesar de que el atún no es UM especie magra, este valor no es tan elevado como lo seria el del arenque, el cual presenta una porcentaje de lipidos del 8%. Por lo anterior, el desecho de atún es un substrato favorable para la obtención de hidrolizados proteicos.

Una vez seleccionada la especie, fue necesario trabajar primeramente con hemoglobina como sustrato alterno y de esta forma evaluar la actividad enzimática de Alcala& en un sistema definido, para posteriormente poder trabajar sobre el desecho de pescado, el cual es un sistema complejo, y en donde pudieran intervenir diferentes factores como son cantidad de grasa, materia no proteica, colágeno, pigmentos, etc.

CARACTERIZACI~N DE LA ENZIMA UTILIZANDO COMO SUSTRATO ALTERNO HEMOGLOBINA

Usualmente los proveedores comerciales de enzimas industriales, no garantizan que los productos puedan emplearse, según la descripción de la ficha técnica, sin ensayos previos; es por este motivo, que se realizaron ensayos utilizando como sustrato alterno hemoglobina

Se realizó un experimento preliminar para observar la actividad enzimática respecto al ' tiempo, en este experimento se determinó la actividad enzimática a el pH y la temperatura reportados como óptimos en la ficha técnica del proveedor (Novo Nordisk) @H 8.5 y ie:iipc:a:iirz 60"C), y l a ronccntración de eniinia sc dzterniinh de manera arbitraria (0.0r.ii YO). L a iigu!a 1 niucs:ra cl perfil del efecto del tiempo en la actividad eiizimática de Alcalase E9 a las condiciones descritas, en donde se muestra una curva típica de actividad, en la cual se 0bsen.a un aumento acelerado de la actividad durante los primeros 5 min para posteriormente disminuir y mantenerse constante (Sege1,1993).

32

7 , , . .

, ..... .

.

Fig. 1 tiempo. Condiciones de bidrúlisis: T = 60" C, pii 8.

Actividad Proteolítica Alcalase @ con respecto ai

Susirato Hb 2%, [enzima] = 0.1%,

Para caracterizar una enzima es necesario conocer su pH y temperatura de actividad, así como su pH y temperatura de estabilidad. Estas propiedades se representan como curvas.

Las curvas de actividad, muesiran ésta a diferentes valores de pH o temperatura. Por su parte, las curvas de estabilidad muestran la actividad residual después de la exposición durante un periodo definido a ciertos valores de pH y temperatura (Nagodawithana, 1993)

> DETERMINACI~N DE PH ÓPTIMO DE ACTIVIDAD

Para determinar el pH óptimo para la actividad enzimática de Aicalase @, se fijó la temperatura a 25' C y se utilizó la misma concentración de enzima que e! experimento anterior y un tiempo de reacción de 15 minutos. Los rangos depH evaluados fueron de 7 a 11, encontrándose que Aicalase @ presenta un amplio perfil de pH de actividad con un máximo entre 8 y 9 ( figura 2 ), comportamiento semejante al presentado en la ficha técnica (Novo Nordisk). A un pH de 10 la actividad disminuye.

Así mismo, Nzgix!awitlian? (1993) repi:a que la <,::rima Alcalase 8 es cmiisiderada una proieasa alcalina de acuerdo al pH para SII actividad ináxima, los cuales se encuentran entre 8 y 9, además menciona que existen proteasas que pueden ser utilizadas con éxito a condiciones que normalmente difieren de 1-2 unidades de pH de la actividad enzimática óptima declarada.

33

I

Fig. 2 Curva de pE de actividad de Akplwe @ Condiciones de bidrólisis: Sustrato = Ab 2%, [enzima]= 0.1%, T= 25' C, 1= 15 min.

> DETERMINACI~N DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA DE ACTIVIDAD

Para la determinación de la temperatura óptima para la actividad enzimática, la reacción se llevó a cabo a diferentes temperaturas de incubación (30,40, 50,60, y 70 "C). En este caso, el pH de reacción fue el determinado como el óptimo en el experimento anterior (8.5). En la figura 3 se puede observar que a 60 "C se obtiene la máxima actividad enzimática. Dicho resultado concuerda con lo reportado en la ficha técnica en donde se da una temperatura de 6VC, como la temperatura en donde se presenta la máxima actividad (alrededor del 98%). A temperaturas elevadas, la inactivación térmica de la enzima se vuelve más ~ pronunciada.

El incremento en la temperatura (> 60T) trae consigo un decremento en la actividad, pero en contraste con el perfil de pH de actividad en el cual, se obtiene un verdadero valor de pii , la tempemtura Óptima es función del tiempo de reacción utilizado en el ensayo. A mayor tiempo de reacción, menor será la temperatura óptima como lo muestra NagndauTithano (1993), en donde demostr0 que la temperatura +tima de la enzima AicalaseO parar aislados de soya fue de 58, 60 y 70 "C a tieinpos de reacción de 240, 60 y 10 min. respectivamente.

34

I

3 E

8 2.5 C

.u * d 1 1.5

1 U

20 30 40 50 60 70 . 80

temperatura (O C)

Fig. 3 Curva de temperatura de actividad de Akainse @A Condiciom de hidróüsir: Sustrato = W 2%. [endmap 0.1%, pH 8.5, t = 15 min.

Las curvas de estabilidad de las figuras 4 y 5 muestran la actividad enzimática residual después del almacenamiento durante 18 horas a diferentes valores de pH y de temperatura.

La curva de pH de estabilidad (fig. 4) muestra que la enzima es estable en un rango de pH de 6 a 10 (información que concuerda con la ficha técnica). Ottesen y Svendsen (1970), mencionan que una proteasa puede ser estable a valores de pH en donde no presenta actividad, y en otros casos, la exposición a valores extremos de pH causa que la enzima se desdoble, fenómeno que se observa para la enzima Alcalase (3 a pH ácido, lo cual incrementa su susceptibilidad a la degradación proteolítica.

La curva de temperatura de estabilidad (fig. 5) muestra que la actividad residual de la enzima es mayor al ser almacenada a 4"C, lo que indica que a esta temperatura presenta una mayor estabilidad. En contraste, al almacenar la enzima a temperaturas mas elevadas la actividad residual de Alcalase 8 disminuye considerablemente, ya que se presenta una reacción autolitica.

1,as curvas de estabilidíd iisiia!inente w de:rr-iiiinan cii solución buffer a \-alores de p H CciíCíIIiüS ai Óptiriio. L'n caiiibio eri el valor de pi3 icjos del óptimo, !1ae consigo que fa estabilidad se vea disminuida, lo cual puede ser práctico cuando se necesite la inactivación de una enzima, lográndose al combinar el pH y la temperatura (Nadogawithana, 1993).

35

P DETERMWACION DE pH Y TEMPERATURA DE ESTABILIDAD

5 o N 1.5 .9

i ' 8 ' 0.5

pH de l- I abnacearmknto L .

Fig 4. pH de estibitidid de Aledase @. Enzima dmacenada durante 18 hrs en buffer a pH de 6 a 12 y en agua destilada. Condiciones de hidrólisis: Sustrato: Ab 2%. [EpO.l"/., pH 8.5 e 1 5 min, T-25"C

.., temperatura (%)

Fig 5. Temperatura de esíabüidad de Aicaiase @ . Enzima incubada I U Iirs B difereniea ternpcratiti':!!. Condiciones de hidrólisis: Sustrafa H b 2% ~Ej=O.l%, pii 0.5 e15 min T= 25°C

1

36

Por último se determinó el efecto del tiempo en la actividad de la enzima a el pH y temperatura óptimos (8 y 60 "C respectivamente). Para este experimento, se tomaron muestras cada 2 horas durante 20 horas. Como se aprecia en la figura 6, durante las primeras 2 horas hay un ligero decremento en la actividad enzimática, pasado ese tiempo la actividad permanece aproximadamente constante hasta las 10 horas de incubación, y a partir de este momento se observa una disminución gradual en la actividad hasta las 26 horas en donde se tuvo UM reducción del 50% con respecto a la actividad inicial, De este experimento podemos decir que Alcalase 8 es una enzima estable, la cual es importante si se trata de utilizar esta enzima en proceso en donde sea necesario *ntener temperaturas elevadas durante tiempos prolongados, pues en 24 hrs la enzima Alcalase 03 pierde la mitad de su actividad. .

f.

5 MPatmin)

Fig 6. Estabüidad de reacción de Alcalase @ a pH y temperaíurr óptimos Reacción de hidrólisis Wizada durante 26 hrrr Condiciones de hidmlisis: Sustrato Ab 2%. [Ej=O.i%., pH 8.5 e26 brs, T 4 " C

37

e..

CARACTERIZACI~N DE LA ENZIMA ALCALASE @ UTILIZANDO DESECHO DE PESCADO (DP)

Una vez concluida la caracterización enzimática de AlcalaseB sobre un sustrato alterno (hemoglobina) Se realizó un experimento preliminar en donde se procedió a llevar a cabo la hidrólisis de desecho de pescado (I hr.) a las condiciones de pH y temperaturas determinadas experimentalmente como óptimas. En éste se pretendía observar cual era el perfil de hidrólisis al utilizar un sustrato complejo como lo es el DP. Nagodawithana (199) menciona que en la hidrólisis de proteina, el número total de enlaces peptídicos rotos por unidad de tiempo, es la suma de una serie de reacciones que involucran diferentes polipéptidos. Cada una de estas reacciones puede ser descritas por variables cinéticas, y la a

reacción total debe ser descrita por todas las reacciones, sin embargo, en la práctica la curva de reacción total o curva de hidrólisis de un sistema enzima-sustrato, debe ser obtenida experimentalmente y esta curva depende tanto de la enzima como del sustrato.

La curva de hidrólisis de DP con la enzima Alcalase 8, se presenta en la figura 7, y se observa que durante los primeros diez minutos la hidrólisis se llevo cabo rápidamente, posteriormente la actividad' se mantuvo constante. Una curva similar fue reportada para la hidrólisis con Alcalase 8, de subproducto de cangrejo (Beak y Cadwallader, 1995) y de sardina (Quaglia y Orban, 1987).

La rápida velocidad inicial obtenida, se presenta debido a que la enzima se adhiere rápidamente a las partículas insolubles de proteína, para romper las cadenas de polipéptidos que están unidas a la superficie. Mientras más compactada se encuentre la proteina, su hidrólisis será más lenta (Momsey, 1997). Alcalase @ presenta una especificidad amplia y rompe muchos tipos de enlaces peptídicos y enlaces ester, preferentemente aquellos que presenten cadenas hidrofóbicas en el grupo wbonilo (Nagodawithana, 1993) y aquellos que presentes residuos de aminoácidos aromáticos (Ward, 1983). La preferencia de Alcalase O por aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos, se explica por la presencia de un área hidrofóbica en su molécula (Nagodawithana, 1993).

b EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZiMA

AI incrementar la concentración de enzima, la actividad2 de Alcalase 8, también incremento (fig. 8). A diferencia de la curva obtenida por Momsey (i997), en donde se obiiene u n canihio significativo en el grado de hidrólisis con l a coli! entrac6ii enzimá!fca de 0-34 AU/Kg, la curva obtenida en este rango muestra un ligero aumento en la actividad. A concentraciones mayores (100 pg Alcalase WmL) no se observó cambio significativo al igual que en la curva obtenida por Morrisey, en donde se observa el mismo efecto a partir de una concentración de enzima mayor de 57 AUíKg.

La aciiyidad es reportada como la cantidad de @@idos solubles en TC4 expresados como mgtirosindmL Ver anexo 1 Ibid

I

38

1 9 :

La importancia del efecto de la concentración de enzima en UM proteólisis es especialmente relevante cuando se considera el reciclamiento de la misma (Cheflel, 1971)

0.1 -4

,/ ' .

Fig 1. Curva de bidrólisis que prsenta la actividad proteolitka de Alcalase @ sobre DP cm respecto ai tiempo. Condiciones de hidrólisis: Sustrato DP, ~ / S I = l % , p H 85 , t = 1 hr T=60nC Sustrato:Buffer 1:3

Fig 8. Efeclu de la concinirüción tic civima cn la activióad ptvteoiíiica de Alcalase EJ. Condiciones de hidrólisis: Sustrato DP, pH 8.5, t-10 miu, T=óO'C , Sustrato:Bufíer 1:3

39

& EFECTO DE LA PROPORCI~N SUSTRATO:BUFFER

Respecto a la proporción sustratohuffer, encontramos que al incrementar la cantidad de buffer existe UM disminución de péptidos solubles en TCA (ver figura 9), debido a que la concentración de sustrato disminuye al diluirse Sin embargo, con una proporción de buffer igual que de sustrato, es decir 1:1, el sistema se vuelve mucho más denso, viscoso y complejo, la que trae como consecuencia un dificil manejo, a diferencia de una proporción mayor (1:3 o 114) en donde el manejo de las muestras se facilita. Aunado esto, según Momssey ('I 997), un incremento de proporción sustratohuffer mayor de 1 :@incrementa significativamente la concentración de aminoácidos solubles debido a que da a la reacción capacidad amortiguadora, así mismo, es el medio de dispersión de la enzima y es un factor. muy importante para la hidrólisis. Ai incrementar el agua añadida al sustrato hay una mejor homogeneidad de la enzima y se reduce la concentración localizada de los productos de la hidrólisis (Surowka y Fik, 1994). De los~resultados podemos decir entonces, que una proporción sustratohuffer 1 :3, es adecuada para la reacción enzimática.

i 1 ? a

l a 3 1 8 4

..

....

Fig 9. Efecto de la proporción sustrato:buffer en la acthidad proteolitica de Akalase @. Condiciones de hidnilisis: Sustrato DP, w/Spi%, pE 8.5, t=10 min, T.. 60°C

40

> CINÉTICA DE ALCALASE 8

Para poder tener un control sobre la modificación enzimatica en un sistema, es necesario conocer las características cinéticas de la reacción enzimática Las constante cinéticas claves son Km y Vmax. La mejor forma de estimar estos parámetros es mediante los estudios de la dependencia de la velocidad de reacción con respecto a la concentración de sustrato (modelo Michaelis Menten) y la transformación de los datos a la línea doble recíproca de Lineweaver-Burk (Nagodawithana, 1993).

La figura IO muestra la producción de péptidos solubles en TCA (mg tirosidmL) en . función del tiempo. Las pendientes de estas rectas nos proporcionan el valor de las velocidades iniciales'. Es notono que las pendientes van aumentando al incrementar la concentración de sustrato de DP. Las velocidades iniciales obtenidas se graficaron directamente contra las concentraciones de DP, para obtener la gráfica de Michaelis- Menten (Fig. 1 I), en la cual se observa el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción catalizada por Alcalase @.

El efecto de la concentración de sustrato sobre la enzima Alcalase 8, w la característica de las mimas que siguen el modelo de Michaelis Menten, ya que se obtiene una gráfica hiperbólica, la cual nos muestra que a UM concentración de sustrato baja, la velocidad inicial de la reacción es proporcional a la concentración de sustrato y la reacción es por tanto de primer orden' con respecto al mismo. Sin embargo, a medida que la mncentración de sustrato aumenta, la velocidad de reacción disminuye y deja de ser proporcional a la concentración de sustrato. Con un aumento posterior de DP, la velocidad de reacción llega a ser independiente de la misma y se aproxima a una velocidad constante (Vmax). En este punto la reacción es de orden O y la enzima Alcalase 8 llegó a un punto de saturación en el cual, aunque se aumente la concentración de DP, la velocidad de reacción no va a ser incrementada (Segel. 1993).

La gráfica de la figura I I (gráfica de Michaelis Menten) Vo contra [SI, no es muy satisfactoria para la determinación de Km y Vmax, debido a que estos valores no se pueden obtener con exactitud. Para obtenerlos se hace una transformación del modelo de Michaelis Menten, tomando los recíprocos de Vo y de [SI, obteniendo así una linea recta (fig. 12). en donde la pendiente de la recta es m= KmNmax, la intersección sobre el eje 1No es 1Nmax; la intersección sobre el 1/S es -1Km (Método de Lineweaver-Burk), de la figura se obtuvo un valor de Km= 26.31 mg DP/mL, y un valor de Vmax= 0.0388 m g / d min.

El 1,aior <¡e V j j ~ a ~ ~ nos iadica que cs 13 máxima velocidad que puede alcanzarse con una concentración de enzima de 1%, es decir, se ha llegado a la saturación al presentar dicha velocidad.

' Ver anexo 2

verdadero, se da cuando [S]>lOOKm Una reacción $e pnnier orden verdadero, se da cuando [ S]<O.OIKm, as¡ como una reamon de orden O

41

,

Km representa una constante que relaciona la velocidad de una reacción cataiizada enzirnaticamente con la concentración de sustrato. El valor numérico de Km es de interés por varias razones: I ) Km es constante para una determinada enzima y 2) podemos ajustar las condiciones de ensayo tales que [S]>?Km y determinar Vrnax (Segel, 1993).

Una vez obtenidos Km y Vmax, es posible obtener la constante de primer orden “k“’, cuyo significado fisico es la fracción de sustrato presente que es con vertido a producto por unidad de tiempo. As¡ para nuestros datos experimentales, k= 1.47 x IV3 min“, significa que aproximadamente el .14% del sustrato presente a cualquier tiempo es convertido a producto en un minuto, así mismo significa que 2.45 x IO” de la concentración de DP es utilizada por segundo6

La velocidad inicial de una reacción cataiizada enzimáticamente no solo depende de la concentración de sustrato, sino también de la proporción [SI y Km. Esta proporción se conoce como “concentración específica de sustrato”y de denota como [S’], así mismo la velocidad inicial a una [SI dada también puede expresarse como hcción de Vmax y se conoce como “velocidad especifica” (u’). (SegeI,i993)’. El uso de estos valores da UM forma de normalizar los datos para UM variedad de enzima, así por ejemplo, con los datos experimentales obtenidos sabemos que con una [S]=50 mg DP/mL, obtendremos una [S’]=1.9, lo que significa que cuando la [SI es 1.9 veces Km, la velocidad inicial será siempre 65.5?/0 de Vmax, o así mismo, cuando [S]=Km=26.31 mg DP/mL, significa que cuando la [SI es igual a Km, la velocidad inicial será siempre 50% de Vmax (U2 Vmax).

Es importante mencionar que las concentraciones de sustrato seleccionadas, para generar la gráfica de doble recíproco debe estar cerca de Km, ya que si las concentraciones están muy por arriba de Km la curva tenderá a ser horizontal, lo cual traerá como consecuencia que la pendiente de la curva sea aproximadamente O por lo que se volvería dificil calcular Km adecuadamente. Así mismo, si las concentraciones de sustrato seleccionadas están muy por debajo del valor de Km, la curva interceptará a los ejes muy cerca del origen por lo que no se podna determinar adecuadamente las constantes cinéticas Km y Vmax (Segel, 1993).

.

k= vma.m1 k- 1.47 x IO” min-’l 60 seg x m i d = 2.45 x 10.’ seg-’ 6

’ p’l=[S]nOn ennuestrocaso [S’]=50mgDP/mL/26.31 mgDP/mL.= 1.9. Y’ = LS‘J/(l+[S’]>. en nuestro caso v’=(50 mg DP/mL)/(i+50 mg DP/mL)=.65 42

* 1 ~. . ~~ - I

.. . ~~~ . . . . . . . t

0.9

~

--

. *

i

O 2.5 5 7.5 16 O +

~-# .’ . liempo(min) ”

Fig 10. A l c a i a d en función del tiempo a diferentes concen<rneiones de mstrato @P)- Condiciones de hidrólisis: Sustrato DP, [E/sI=l%, pE 85, e l 0 min, T-60.C Sostrato:Bufíer 1:3

Prnducci6n de pkpiidos solubles en TCA por accih cat.otiU de

. .

O O 10 20 u) 60

Fig 11. Modelo de Michaelis Menten Grafica de velocidad inicial en función de 1.1 concentración de Di‘. La5 \rlucidades iniciales a diferentes concentraciones de sustrato se obtienen ai calcular las pendientes de Ips rectas de la fig 10 (ver Anexo 2)

I

43

I - US I

.

Fig 12 Modelo de Lineweaver Bu& Ai linearizpr d modelo de Michaelis Menten #e obtieneagflicamente Km y Vmax.

Para la determinación de las constantes cinéticas, tomamos en consideración el modelo de Michaelis Menten siguiente:

K+1 K+l ALCALASE e + PROTEÍXA 2 COMPLFJO ALCALASE 03 + PhPnDOS SOLUBLES

(DO 7 ALCALASEO-DP K-1

Cabe destacar que para sistemas enzimas-sustratos simples, bajo ciertas condiciones analíticas, la forma de la CURB de reacción sigue el modelo mencionado; pero bajo condiciones industriales, cuando la concentración de sustrato es usualmente muy alta, el sistema enzima-sustrato simple no aplica Se ha demostrado que durante condiciones típicas de procesos de hidrólisis de proteína, prevalece una saturación del sustrato en el curso de la reacción (Adler-Nissen, 1986) La base cinética de este efecto es que los péptidos resultantes del ataque inicial de las proteasas en las moléculas de proteína actúan también como sustrato para su poi.terior degradación a péptidos más pequeííos (Nagodawithana, 1993) .L

44

b EFECTO DE pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCI6N

En la figura 1.3 se observa la producción de péptidos solubles en TCA (mg tirosindml) por la acción catalítica de la enzima Alcalase @, en función del tiempo a diferentes valores de pH. Las pendientes de estas rectas nos dan el valor de las velocidades iniciales de Alcalase @ según el pH del medio. Estas velocidades se grafcan contra los valores de pH, obteniéndose la figura 14, en la cual se observa que Alcalase @ presenta una actividad máxima a valores m H entre 8 y 9, lo que indica que a ese valor el sitio activo esta más disponible debido a la ionización que sufre la enzima, lo que la hace tener la mejor estructura tridimensional para la formación del complejo enzima-sustrato (Whitaker, 1994) .

O ! 1

O 2 4 6 e 10 . 12

tiempo (min) . . .. c

Fig 13. Producci60 de péptidos solubles en TCA por la acción cataiitica de Alcalase @ en funcidn del tiempo, a diferentes valores de pH Condiciones de hidrólisis. Sustrato DP, [EISI=l%, e 1 0 mia, M " C Sustrato:Bufier 1:3

El pH influye en la velocidad de una reacción catalizada enzimáticamente. Los sitios activos de una enzima están constituidos frecuentemente de grupos ionizables los cuales deben estar en la forma iónica adecuada para mantener la conformación del sitio activo, p x a 111iirre a! siirirato o e!i otrsr; pziaba? para caia!izar la reacción htuchas veces un sustrato puede estar consíiiuido de gnipos iunizabies y sólo en la forma ionica del susirato podrá unirse a la enzima (Segel, 1993).

En la curva del efecto de pH sobre la velocidad de la enzima que se observa en la figura 14, muestra que la enzima Alcalasea presenta una mejor actividad en un pH alcalino, mostrando un decremento significativo de la velocidad a un pH a partir de 11, resultados que concuerdan con los obtenidos por Momsey (1997). Este decremento en la velocidad

45

puede ser resultado de la formación de una forma iónica impropia del sustrato yio enzima, o por la inactivación de la enzima, o en todo caso por una combinación de estos efectos (Segel, 1993).

Adler-Nissen (1986) reportaron que Alcalase O era mas reactiva a pH alcalinos y que todavía se mantenía activa a pH de 6. Un cambio en el pH afecta tanto a sustrato como a la enzima ya que cambia la distribución de cargas y la confo&aciÓn de la molécula. La mayoría de las enzimas ween una desnaturalización irreversible en soluciones extremadamente ácidas o alsinas, causando la perdida de estabilidad (Whitaker 1994). El pH también afecta la ionización en como la enzima se une a su sustrato para transformarlo a producto, toda vez que por ionización puede cambiar la conformación del sitio activo . (Whitaker 1994).

PH

Fig 14. Efecta del pH en la actividad de Akaiase @. Se observa la variación de la velocidad conforme cambia el pH. Las velocidades iniciales se obtienen al caicular las pendientes de las mias de In fig 13 (Ver anexo 3)

46

i+ EFECTO DE LA TEWERATüRA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

P-

=JL I

a- +- i

L I

3)

En la figura I S se observa la producción de péptidos solubles en TCA por la acción catalitica de Alcalase (9, en función del tiempo a diferentes temperaturas De la gráfica se obtienen a través de las pendientes, los valores de las velocidades iniciales, las cuales al graficarlas contra la temperatura, da como resultado la figura 16, en donde se observa claramente que la velocidad de la reacción se incremente dentro de un intervalo en el que la enzima es estable y permanece totalmente activa (30°C a 6OOC). El punto más alto nos indica la temperatura óptima de Alcease 8, el cual según la gráfica es de 60°C. Esta temperatura es en realidad la máxima temperatura a la cual la enzima Wabaja, ya que al ser una proteína por la acción del calor se desnaturaliza y se inactiva al sobrepasar esta . temperatura. Las temperaturas elevadas pueden afectar el estado de disociación de los grupos funcioriales involucrados en la reacción enzimática, a la afinidad de la enzima por activadores, o inhibidores, además de inactivar la enzima (Whitaker, 1994).

I I

1 O.' i 1 O J 2 4 6 8 l'o L, 1 tiempo 1 min )

Fig 15. Producción de péptidos solubles en TCA por la acción cataiitica de Alcalase @ en función del tiempo a diferentes ialores de temperatura Condiciones de bidrólisis: Sustrato DP, [EIS]=l%, pH 8.5, e 1 0 min, T=6O"C, Sustrato: Buffer 1 :3

Las reacciones cataiizadas enzimaticamente al aumentar la temperatura Un incremento en la temperatura da más energía cinética a la molécula reactante dando como resultado UM colisión más productiva por unidad de tiempo Al ser las enzimas moléculas de proteína complejas, su actividad catalítica se da gracias a una precisa y ordenada estructura terciaria, la cual contiene grupos específicos de aminoácidos de modo que forman los sitios en donde se unirá el sustrato. La estructura terciaría de una enzima se mantiene principalmente por

47

una gran número de enlaces no covalentes, es decir, la estructura de la enzima es delicada y &ágil. Si la molécula absorbe mucha energía, la estructura terciaria se romperá y la enzima se desnaturalizará, es decir, perderá su actividad catalítica. Una curva de velocidad contra temperatura usualmente muestra un pico referido como temperatura óptima (fig. 16) (Segel, 1993).

Es de relevancia mencionar que la temperatura Óptima depende del tiempo de reacción seleccionado En los experimentos realizados por Momssey ' (1997), se encontró que Alcalase 5) presenta una actividad alta en un rango de temperaturas de 55" C a 700 C, con un optima 60" C Sin embargo, un decremento apreciable en la actividad de la enzima, se observó arriba de 70' C. Esta disminución en la actividad se debe a la desnaturalización térmica. Adler-Nissen (1986) reportó que la actividad de Aicalase E3 se duplicaba por 12" C de aumento de temperatura.

I

-1.

- -. 20 30 40 50 70 80

cada

Fig 16. Efecto de la Temperatura en la aciividad de &alase Q3. Se obsema la vanación dc la velocidad conforme aumenta la temperatura Las velocidades idciaies se obtienen al eilcular las pendientes de las rectas de la fig 15 (Ver anexo 4)

48

P DETERMMACI~N DEL GRADO DE HIDR~LISIS

Es necesario tener una medida de la degradación hidrolítica del sustrato, por lo que se determinó el grado de hidrólisis, encontrándose que fue del 35% para un periodo de 120 min y una concentración de enzima del 1% (pH 8 y T 60"C), como se aprecia en la fig 17 El grado de hidróiisis nos indica el por ciento de enlaces peptidims rotos En el curso de la reacción de hidrólisis, el grado de hidrólisis incrementa hasta que alcanza determinado valor, tiempo en el cual fa reacción se termina por inactiaión de la enzima La ventaja de utilizar grado de hidrólisis en lugar de tiempo, como el parhetro controlador de la reacción es que como regia general, las propiedades de los hidrolizados, dependen solamente del grado de hidrólisis y son independientes de los cambios en la concentración . de enzima, sustrato y temperatura (Nagodawithana, 1993)

En trabajos realizados por Shahidi, (1994), se reporta que el grado de hidrólisis a una concentración de sustrato determinada puede ser influenciada tanto por el tiempo como la temperatura de hidróiisis así como el tipo y la concentración de la enzima utilizada. Se encontró que el grado de hidrólisis alcanzado después de 3 horas usando una concentración de enzima de 30 AU de Aicalasentg de proteina fue del 21.42% Según Olsen (1983), los hidroliiados con un valor de grado de hidróiisis más alto pueden traer sabores amargos, como se encontró en hidrolizados de carne y pescado.

tlempo(min] '

M

Fig 17. Curva quc rei~rtsenla el grado de hidr6lisis ("/O) en función del tiempo. Condiciones de hidrólisis: Sustrato DP, [E/SJ=l%, pH 8.S, i=2 br, T=6O"C. Sus1rato:Buffer 1:3

49

> MUESTRAS DE HIDR~LISIS EN EL GEL SDS-PAGE

En la-figura 18 se muestra el gel SDS-PAGE, en donde se observa la banda del marcador estándar de pesos moleculares bajos (LMW) y las bandas de los hidrolizados enzimáticos a diferentes tiempos de reacción. La “A” indica la enzima Alcalase @ y los números el tiempo de reacción (min).

El marcador estándar de pesos moleculares, presenta bandas cuyos p a s se encuentran en el rango de 1,42326,625 Daltons. A0 es la banda perteneciente a las proteínas de DP sin tratamiento enzimático (tiempo O). Según Momssey (1997) estas bandas son las proteínas ’ nativas (miasina y actina) o los productos de la degradación de la miosina.

Después del tratamiento enzimático de DP con Alcalase @, las bandas de. pesos moleculares mayores a 14,437 Daltons fueron removidos totalmente, y permanecieron bandas de pesos moleculares inferiores. No se encontró UM diferencia notable en las bandas de los tiempos de reacción de 10,20 y 30 minutos, en las que se observa claramente UM región que corresponde a un peso molecular menor de 14,437 Daltons. Después de UM hora y dos horas de reacción, las bandas que se observan corresponden a pesos moleculares inferiores a 6,512 Daltons. Momssey (1997) reporta que después de un tratamiento enzimático de desecho sólido de pescado con Alcalase 0, desaparecieron totalmente las bandas de pesos moleculares mayores a 43,000 Daltons después de 1 hr de reacción.

La obtención de péptidos con pesos moleculares inferiores a 6,512 Daltons corresponde a un grado de liidrólisis del 35%, el cual se obtuvo con un tiempo de reacción de 2 h.

26.625 “““/CI.

Fig 18. SDS-PAGE de Ips diferentes fracciones peptidius obtenidas a diferentes tiempos de reacción.

50

. I

b USOS ALTERNATIVOS DE LOSHIDROLIZADOS DE PROTEINA DE PESCADO

Las proteínas al ser hidrolizadas adquieren una característica funcional Única. "una alta solubilidad de los péptidos obtenidos", así mismo es posible obtener soluciones de baja viscosidad a pesar de utilizar altas concentraciones de Aunado a estas propiedades técnicas, 1os.hidrolizados poseen propiedades fisiológicas de gran importancia La absorción gastrointestinal de hidrolizados, especialmente di y tripéptidos es más efectiva en comparación con la proteína intacta (Ziegler, 1990).

péptidos.

4p Al adquirir los hidrolizados estas propiedades podrían ser incorporados e!? alimentos

41.' tradicionalmente consumidos por el ser humano y así elevar su calidad nutncional, podrían ser utilizados en la formulación de alimento para el ganado y la acuicultura, así mismo, ser usados en la formulación de medios de cultivo para microorganismos, como sustratos en medios fermentativos, como fertilizantes, en la elaboración de dietas especiales para ancianos, para deportistas, dietas para controf de peso, para uso medico en pacientes con problemas de colitis ulcerativa, fistulas, pancreatitis, alergias alimenticias, etc @ram, 1994)

Sin embargo, para poder definir el uso de los hidrolizados, es necesario realizar estudios funcionales de las diferentes fracciones peptidicas obtenidas, así por ejemplo seria conveniente estudiar si los peptidos obtenidos presentan sabores amargos, y que propiedades funcionales y fisiologicas poseen cada una de ellas

51

CONCLUSIONES

La enzima caracterizada fue Alcalase $3 la cual es una endopeptidasa de tipo senna, proteasa obtenida a partir de Bacillus licheniformis; presentó una actividad óptima a pH alcalino (8-9) y a temperaturas elevadas (6OOC). En cuanto a su estabilidad Alcalase @ mantiene su actividad al ser almacenada a 4°C y en pH neutro (agua destilada). El sistema en el que se logra un mejor comportamiento es aquel en el que la proporción sustrato:buffer es 1:3 y con una concentración de enzima de 1% con respecto a la cantidad de proteína en el sustrato @PI, la cual se encontró mediante un análisis bromatológico que fue del 22.83%.

Las constantes cinéticas obtenidas fueron Km=26.31 mg D P / d y V m a ~ 0 . 0 3 8 mg/mLmin. Para la determinación de las constantes cin+cas se utilizó el modelo de Michaelis Menten y de Lineweaver Burk, sin embargo, existen otros métodos para su determinación.

Para poder caracterizar una enzima, es muy importante verificar que su actividad y estabilidad concuerden con la reportada por el proveedor; asi como también estudiar como pueden estos factores verse modificados al utilizar sustratos más complejos (DP).

La hidrólisis enzimática de proteina proveniente de desecho de pescado, es un método válido para la recuperación de proteína de origen animal, ya que se pueden obtener péptidos con características bien definidas si se sigue un control durante la reacción enzimática y en el grado de hidrólisis deseado.

La especie de pescado seleccionada para este estudio fue el atún, sin embargo, existen otras especies que también pueden ser explotadas al máximo, como son la fauna de acompañamiento obtenida durante la captura del camarón, la cual se produce en gran cantidad en todo el pais.

Para la caracterización de los péptidos obtenidos a diferentes grados de hidrólisis, se utilizó el gel electroforétio SDS-PAGE, y un marcador cuyos pesos moleculares se encuentran en el rango de 1,423 - 26,625 Daltons, sin embargo, la enzima Alcalase @ presenta una gran actkidad proteolítica y después de 2 horas de hidrólisis es posible obtener péptidos con pesos moleculares menores a 6,512 Daltons, por lo que para poder determinar con mayor exactitud los pesos moleculares de los péptidos obtenidos sería conveniente utilizar un marcador cuyo rango de pesos moleculares sea menor al utilizado en este trabajo.

52

RECOMENDACIONES

1. E s importante realizar estudios de composición de la especie pesquera a utilizar, ya que algunos componentes (lipidos, pigmentos, tejido cmectivo, etc.) pueden afectar la eficacia de la reacción o dar productos con características indeseables.

2. El homogeneizado del sustrato (DP) es un factor fundamental para llevar a cabo adecuadamente la hidrólisis proteica, ya que UM deficiente homogenización traerá como consecuencia una menor disponibilidad del sustrato lo cual interfiere en la eficiencia del proceso. . 3. Durante los estudios realizados se observó que el pH y la temperatura son dos factores que influyen determinantemente en la actividad enzimática, por lo que es necesario tener un estricto control sobre ellas. El pH durante la reacción de hidrólisis tiende a disminuir por lo que se vuelve indispensable medirlo constantemente, sobretodo cuando el rango de pH óptimo de la enzima a utilizar es pequeño. En contraste, la temperatura del proceso no tiene una variación considerable como el pH, sin embargo, es fundamental controlarla de la mejor manera posible. Lo más recomendable es utilizar un vaso de reacción con chaqueta integrada para un mejor control de la temperatura.

4. Los proveedores de enzimas comerciales no garantizan que el producto pueda emplearse sin un ensayo previo, por tal motivo siempre se recomienda utilizar estos ensayos en sustratos altemos como hemoglobina o caseína, para asegurar que se conserva la actividad reportada.

5. Otra consideración a tomar en cuenta durante la hidrólisis es el crecimiento de microorganismos durante dentro del reactor durante la reacción, por lo que setia recomendable hacer estudios en este sentido, ya que la temperatura y el pH, pueden no ser suficientes para evitar la proliferación microbiana, haciéndose necesario el uso de algún conservador.

6 . A nivel industrial, a diferencia de nivel laboratorio, la cantidad de enzima a utilizar durante el proceso se vuelve de relevante importancia, ya que la falta de un método para la recuperación de la enzima, trae consigo un considerable aumento en los costos, por lo que es necesario la aplicación de tecnologías para la reutilización de la enzima (por ejemplo inmovilización enzimática) y con ello aprovechar su actividad al máximo.

7. Este estudio se limiió a la caracterización poi- peso molecular de los péptidos obtenidos, pero para una aplicación de estos péptidos es necesario realizar estudios adicionales como son la separación de las fracciones peptidicas, el estudio de sus propiedades funcionales, su composición de aminoácidos, calidad microbiológica, etc.

53

t

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.

Production and Characteristics o f protein

ANEXO 1

CURVA PATRON DE TIROSINA.

Para poder tener una medida de la actividad de la enzima, se realizó la curva patrón de tirosina, para así poder extrapolar los valores de la absorbancia obtenidos en los diferentes experimentos, y poder determinar los péptidos solubles en TCA ( mg tirosinahnl ). *

Y = 0.407854545 X + 0.007554545

Rcuadrada = 0.9965

a o;..

O 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 , 2

nigtyild ~

.

57

ANEXO 2

Las pendientes de las rectas que se presentan a continuación, son los valores de las velocidades iniciales al modificar la concentración de sustrato.

pcenhac ion Sustrato 50 mgDP/mL Concenaion Sushato 40 mgDp/mL

O 5 10 15

tkmpoimlif

Concentracion Sustrato 30 mgDP/mL Concentranon Susüaio 20 mgüP/mL

O 5 10 15

tkmpo (mln)

58

ANEXO 3

Las pendientes de las rectas que se presentan a continuación, son los valores de las velocidades iniciales al modificar el pH.

PH7

I 0 5 , *

O 5 10 15

tlcmpo ( min )

1

2 4 6 a 10 12

tIiirp0 In.) I Ob-

03oO(+O.MBI 3 :; ff -0.9811 p 0.1

O

O 5 10 15

tkmpo (min)

pH 10

.

ff -0.9616 e = 0.2 F9.0.928 1

O 5 10 15 O 5 10 15

59

ANEXO 4

Las pendientes de las rectas que se presentan a continuación, son los valores de las velocidades iniciales al modificar la temperatura

Temperatura 30°C

w = 0.-

016 5 10 15

Uempo ( mln )

Temperatura W0C

I

Temperama 50 T Temperatura 60 T

O 5 10 15

tkmpo(mh)

Temperatura 8OT

r-

I O 5 10

tiempo [ min ]

60

Nombre :

Matricula : 93329665

Licenciatura: INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS

PULIDO SANCHEZ MONICA ALEJANDRA

UNIDAD IZTAPALAPA DIVISION CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD.

Título Trabajo: CARACTEFUACION DE P E m OBEIENIDOS A PARTLP.DE CION DE PROTEINA DE SUBPRODUCTOS DE LA

LA INDUSTRIA REcm% SQLJERA. MEDIANTE LA HIDROLISIS

. . ENZiMATiCA CON ALCALASE 8.

Registro Servicio: 2 Octubre 1997 Fecha de entrega: 3 Noviembre 1998

kresores: DRA. ARELY PRADO BARRAGAN DR SERGIO HUERTA WHOA Profesor Titular " E Profesor TIhilar"C'

RESUMEN

OBJETIVOS OMención y &rización, en base al peso molecular, de peptidw obienidos a partir de la reniperación de proteína de subprcducíos de la industria m e r a mediante la hidrókis enzimática con Ai&@

Es de gran importancia el valor nubitivo de la proteina animal, por lo que en los ultllnos &os se ha presentado un aumento en la demanda de ésta, originando un gran interés por el incremento de su producción convencionai y por el desarroiio de nuevas técnicas para su obtención: Un mejor aprovechamiento de los productos de origen animal, además de la utüización de subprodudos y desechos de estos, piedc aydar a resolver el problema de escasez de proteina anunal en el mundo, en especial en los países en Mas de desarrollo, lo que devendria en UM mejor alimentación pua ia población de estos países. Una alternativa para la solución de este problema es la recuperación de prokina a partir de subproducto de la industria pesquen. El susCLTíIto utilizado para la reacción enzimrica fue desecho de atiui (DP) , despés de reaüzu ensayos previos en un sustrato alterno (hemo@obina). El comportamiento de la enzima en un susimto complejo (DP) fue muy similar al presentado en los ensayos realizaQs con hemoglobina.

Alcalase 8 presenta un pH de &\idad en un rango amplio, con un máxuno eo dores de pH 8-9. Es termoestable, la temperatura donde presenta mayor actividad es 55OC a 6OT, sin embargo, presenta todavía actividad a una temperatura de 70°C. A valores menores de pH 4 la enzima es inacihada dpidamente. Las constantes cinéticas Km y Vmax detenninadas maiiantc el modelo de Michaeiis Menten y Lineweaber-Burk fucron Km = 26.3 1 mgDP I d y Vmax = 0.038 mg Imlmin.

El grado de hidrólisis obtenido después de 2 horas de reacción fue de 35Y% enwntrando &idos que presentan un peso molecular cuyo rango vana de 1,4234,512 Daltons.

.

Firma alumno: * Pulido S h e ez Mónita Alejandra

A Firma asesores :

Dr. Sergio Huerta &boa Prof. Titular “c. Profa. Tiulnr “B”.

1 1

. 3 1 1

1 3

1 I