papel do zinco no sistema nervoso central: defesas antioxidantes e
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM NEUROCINCIAS
PAPEL DO ZINCO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:
DEFESAS ANTIOXIDANTES
E SINALIZAO CELULAR VIA PI3K/AKT
CRISTINA FLORES BOROWSKI
FLORIANPOLIS, OUTUBRO DE 2006.
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PAPEL DO ZINCO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:
DEFESAS ANTIOXIDANTES
E SINALIZAO CELULAR VIA PI3K/AKT
Dissertao apresentada Universidade
Federal de Santa Catarina como
requisito parcial para obteno de grau
de Mestre em Neurocincias.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Bainy Leal
Co-orientador: Prof. Dr. Alcir Luiz Dafre
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM NEUROCINCIAS
FLORIANPOLIS, OUTUBRO DE 2006.
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Nossas limitaes esto dentro
das nossas mentes. Se conseguirmos ter
essa percepo, no existir limites, e
seremos do tamanho dos nossos sonhos.
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AGRADECIMENTOS
Concluir o mestrado foi um grande desafio. Muitas pessoas dedicaram seu tempo e
esforo, dando sua contribuio para me ajudar nesse processo. Esse perodo foi de grande
aprendizado e crescimento, no s intelectual, mas pessoal. Essas pessoas a quem gostaria
de agradecer contriburam de vrias formas pra esse crescimento. Portanto, agradeo...
A minha me, por todo o amor, conselhos e pela fora nos momentos difceis.
Tambm por ter possibilitado a minha vinda pra Florianpolis sem bolsa de estudos. E aos
meus irmos pela amizade e pelo amor. Enfim, muito obrigada por tudo, de todo o meu
corao. Amo vocs.
Ao Professor Alcir, meu co-orientador, gostaria de agradecer pela oportunidade,
pela fora, amizade, e pela grande ajuda que tornou possvel a realizao desta dissertao.
Obrigada tambm pela orientao e por todos os ensinamentos no perodo em que
trabalhamos juntos.
Ao Jeferson, que idealizou boa parte deste trabalho, e me ajudou muito com os
experimentos. Obrigada, tambm, pela amizade e pela fora.
Ao Professor Rodrigo Leal, meu orientador, pela oportunidade de realizar este
trabalho, pelos ensinamentos e por toda a ajuda. s meninas do lab, Thas, Camila, Ana e
Fernanda, obrigada pelo companheirismo e pela ajuda neste trabalho. Sem todos vocs, ele
no seria possvel. Ao Francesco, obrigada epla amizade e pela fora. Sara, obrigada pela
fora.
Aos Professores Carlos Alberto Gonalves e Carmem Gottfried, pela amizade e pelo
carinho. Ao pessoal do lab 33, agradeo pela amizade, pelo apoio, pelo carinho, enfim, foi
um grande prazer ter conhecido e convivido com todos vocs.
Aos Professores Nlson, Carla, Ana Lcia e Marcelo, com quem tive a oportunidade
de conviver e aprender muito, seja nas disciplinas ou pelo convvio neste prodo.
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Ao Professor Adair, por todos os conselhos e incentivo, pela amizade e pelo apoio.
Ao Secretrio da Ps-Graduao Nivaldo, por todo o apoio e ajuda neste perodo.
Maria Carmelita, pela preciosa ajuda nesse processo.
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SUMRIO
RESUMO.................................................................................................................ix ABSTRACT...........................x LISTA DE FIGURAS.............................................................................................. xi LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................. xii 1. INTRODUO .................................................................................................... 1
1.1. Zinco nos Processos Biolgicos ........................................................................ 1
1.2. Zinco no Sistema Nervoso Central ................................................................... 2
1.3. Radicais livres e espcies reativas de oxignio (ERO) ................................. 7
1.3.1. Defesas Celulares .......................................................................................... 10
1.3.1.1. Defesas No Enzimticas .......................................................................... 11
1.3.1.2. Defesas Enzimticas .................................................................................. 12
1.4. Zinco e estresse oxidativo ................................................................................ 17
1.5. Sinalizao Celular ............................................................................................ 19
1.5.1. Protenas Quinases ........................................................................................ 20
1.5.1.1. Akt como Elemento Regulatrio Essencial ............................................. 21
1.5.1.2. Papel de Radicais Livres e ERO na Sinalizao Celular...................... 24
2. OBJETIVOS...................................................................................................... 27 3. MATERIAL E MTODOS ................................................................................. 28
3.1. Animais ................................................................................................................ 28
3.2. Tratamentos in vivo ........................................................................................... 28
3.2.1. Tratamento Agudo ou com Doses Repetidas de ZnCl2 ........................... 28
3.3. Tratamentos in vitro ........................................................................................... 29
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3.3.1. Tratamento das Fatias de Hipocampo. ....................................................... 29
3.4. Avaliao da Viabilidade Celular. .................................................................... 30
3.5. Parmetros Antioxidantes................................................................................. 31
3.5.1. Avaliao da Atividade Glutationa Peroxidase (GPx) .............................. 31
3.5.2. Avaliao da Atividade Glutationa Redutase (GR) ................................... 32
3.5.3. Avaliao da Atividade Glutationa S-Transferase (GST)......................... 32
3.5.4. Avaliao da Atividade Catalase (CAT) ...................................................... 33
3.5.5. Avaliao da Atividade -Glutamil Transpeptidase (GGT) ...................... 33
3.5.6. Mensurao dos Nveis de GSH Total (GSH-t) ......................................... 34
3.6. Dosagem de Protenas ..................................................................................... 34
3.7. Separao de Protenas ................................................................................... 35
3.8. Eletrotransferncia e Imunodeteco ............................................................. 36
3.9. Anlise Estatstica.............................................................................................. 37
4. RESULTADOS.................................................................................................. 38 4.1. Estudos in vivo ................................................................................................... 38
4.1.1. Glutationa no hipocampo e no crtex de ratos jovens tratados com
ZnCl2 de forma aguda. .............................................................................................. 38
4.1.2. Enzimas antioxidantes em hipocampo e crtex de ratos jovens tratados
com ZnCl2 de forma aguda. ..................................................................................... 39
4.1.3. Glutationa no hipocampo e no crtex de ratos jovens tratados com
doses repetidas de ZnCl2. ........................................................................................ 41
4.1.4. Enzimas antioxidantes em hipocampo e em crtex de ratos jovens
tratados com doses repetidas de ZnCl2. ................................................................ 42
4.2. Estudos in vitro com fatias hipocampais de ratos jovens ............................ 45
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4.2.1. Enzimas antioxidantes em fatias de hipocampo tratadas com diferentes
concentraes de ZnCl2. .......................................................................................... 45
4.2.2. Avaliao da viabilidade celular em fatias hipocampais expostas ao
ZnCl2. ........................................................................................................................... 47
4.2.3. Efeito do pr-tratamento com ZnCl2 sobre a inibio de viabilidade
celular causada pelo perxido de hidrognio em fatias hipocampais............... 48
4.2.4. Fosforilao da Akt em fatias hipocampais de ratos jovens tratadas com
ZnCl2. ........................................................................................................................... 49
4.2.5. Ao do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a fosforilao da Akt
induzida pelo ZnCl2. .................................................................................................. 51
4.2.6. Ao do inibidor da PI3K (LY294002) sobre a viabilidade celular em
fatias hipocampais expostas ao ZnCl2. .................................................................. 51
5. DISCUSSO..................................................................................................... 54 6. CONCLUSES ................................................................................................. 64 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................. 66
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RESUMO
O zinco um metal de transio presente nas sinapses, especialmente do crtex cerebral e hipocampo, onde desempenha um papel modulatrio sobre diversas protenas, incluindo enzimas e receptores. Neste trabalho foi realizado um estudo das aes do zinco in vitro (10-100 M; 2h) sobre a atividade de enzimas antioxidantes, sobre a viabilidade celular e sobre a modulao da via PI3K/AKT em fatias de hipocampo de ratos imaturos (14 dias de idade). Alm disso, foram tambm avaliados os efeitos da administrao in vivo do zinco sobre a atividade de enzimas antioxidantes em hipocampo e crtex cerebral de ratos jovens. Neste caso, foram utilizados tratamentos via intraperitoneal com ZnCl2 seguindo dois protocolos: a) tratamento agudo de ratos com 13 dias de idade, atravs da administrao de dose nica de ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/Kg); b) tratamento com doses repetidas dirias de ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/Kg) por 5 dias no perodo ps-natal (PN) entre o 8 e 12 dia de idade. Os animais foram avaliados no 14 dia PN. Os resultados do estudo in vivo mostraram que no houve alterao nos nveis de glutationa total (GSH-t) em nenhum dos tratamentos ou estruturas analisadas. Entretanto, nos dois modelos de tratamento, foi observado um aumento na atividade das enzimas glutationa S-transferase (GST) e glutationa peroxidase (GPx) no hipocampo, mas no no crtex cerebral. A atividade das enzimas glutationa redutase (GR) e catalase no foram alteradas pelos diversos tratamentos com zinco e em nenhuma das estruturas analisadas. Nos estudos in vitro utilizando fatias hipocampais de ratos jovens todas as doses testadas de ZnCl2 (10 a 100 M) produziram uma significativa e progressiva inibio da enzima GR, o que no aconteceu com as enzimas GST, GPx e -glutamil-transpeptidase (GGT), sugerindo um efeito seletivo do metal sobre a enzima GR. A viabilidade celular foi analisada pela medida da reduo do MTT. Os resultados mostraram que o ZnCl2, nas concentraes mais elevadas (100-300 M), reduziu significativamente a viabilidade celular em fatias de hipocampo. Em funo da inibio in vitro da enzima GR pelo zinco, responsvel pela regenerao intracelular de glutationa reduzida (GSH), foi analisado um possvel efeito de sinergismo entre o ZnCl2 e o agente pr-oxidante H2O2. Os resultados mostraram que o pr-tratamento com zinco (10-100 M; 2h) no alterou a citotoxicidade (avaliada pelo MTT) produzida pelo H2O2 (1 mM). Este resultado sugere que a inibio da GR pelo zinco no est diretamente relacionada toxicidade do H2O2. O zinco 100 M, mas no 30 M, promoveu ativao significativa da AKT, observada atravs de um significativo aumento de fosforilao na Serina 473. O uso de LY294002, um inibidor de PI3K, enzima responsvel pela ativao da AKT, inibiu a fosforilao no sitio 473, indicando que o efeito do zinco sobre AKT dependente desta via.
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ABSTRACT
Zinc is a transition metal found on synapses, specially in cerebral cortex and hippocampus, where it has a modulatory role upon several proteins, including enzymes and receptors. The present work was undertaken in order to investigate the effects of zinc in vitro (10-100 M; 2h) on antioxidant defense systems, on cell viability, and on modulation of PI3K/AKT pathway in hippocampal slices of young rats (14 days old). Additionally, we assess the actions of zinc in vivo on the activity of antioxidant defense systems in cerebral cortex and hippocampus of young rats. In this case, ZnCl2 was administered intraperitoneally (i.p.) with the following two protocols: a) acute treatment was performed in 13 days old rats through the administration of a single dose of ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/Kg); b) repeated dosing was performed by the treatment with daily injections of ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/Kg) for 5 consecutive days in the postnatal period between 8th and 12th days old (PN8-12). The animals were analyzed on 14th post-natal day (PN14). The results showed that in vivo administration of zinc was unable of inducing changes total glutathione (GSH-t) levels in either treatments or structures analyzed. However, the results showed an increase of glutathione S-transferase (GST) and glutathione peroxidase (GPx) activity on hippocampus, but not in cerebral cortex, in both treatments used. The glutathione reductase (GR) and catalase activity did not change in either in vivo treatments or structures analyzed. The study using hippocampal slices of young rats (PN14) exposed in vitro to ZnCl2 (10-100 M) for 2 h, showed a significant and progressive inhibition of GR, with no changes in GST, GPx and gamma-glutamyl-transpeptidase (GGT) activity, suggesting a specific in vitro effect of zinc upon GR. Cell viability was analyzed by measurement of cellular capacity to reduce MTT. The results showed that ZnCl2 in the highest concentrations tested (100-300 M), decreased cell viability of hippocampal slices. Once zinc can inhibit GR in vitro, and this enzyme is responsible for intracellular regeneration of reduced glutathione (GSH), a possible sinergistic effect between ZnCl2 and H2O2 was analyzed. The results showed that pretreatment with ZnCl2 (10-100 M; 2h) did not change the citotoxicity (measured by MTT) produced by H2O2 (1 mM), suggesting that the inhibition of GR by zinc is not directly related to H2O2 toxicity. ZnCl2 100 M, but not 30 M, promoted activation of AKT, observed through a significant increase of the phosphorylation on Ser 473. The use of LY294002, a PI3K inhibitor, prevented this activation, indicating that the effect of ZnCl2 on AKT is dependent of PI3K pathway.
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LISTA DE FIGURAS
Fig. 1. Localizao do zinco no crebro de ratos. ................................................... 2
Fig. 2. Transporte do zinco para o interior do crebro............................................. 3
Fig. 3. Distribuio do zinco nas clulas nervosas. ................................................. 4
Fig. 4. Transporte de zinco sinptico....................................................................... 5
Fig. 5. Alguns exemplos de espcies reativas de oxignio. .................................... 7
Fig. 6. Reduo univalente do oxignio e formao de intermedirios reativos...... 8
Fig. 7. Estresse oxidativo. ....................................................................................... 9
Fig. 8. Ciclo redox esquemtico mostrando a relao entre enzimas antioxidantes
e a glutationa......................................................................................................... 11
Fig. 9. Alvos bioenergticos potenciais para inibio pelo zinco. .......................... 18
Fig. 10. Diagrama esquemtico do sistema de fosforilao de protenas. ............ 19
Fig. 11. Alvos da regulao da sobrevivncia celular pela Akt.............................. 23
Fig. 12. Vias que podem ser mediadas por estresse oxidativo. ............................ 25
Fig. 13. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens
tratados com o metal de forma aguda................................................................... 38
Fig. 14. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas
antioxidantes em hipocampo de ratos jovens........................................................ 40
Fig. 15. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade de enzimas
antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. ................................................ 41
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Fig. 16. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens
tratados com doses repetidas do metal................................................................. 42
Fig. 17. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade
das enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. ................................. 43
Fig. 18. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade
das enzimas antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. ........................... 44
Fig. 19. Atividade de enzimas antioxidantes de fatias hipocampais em resposta ao
tratamento in vitro com ZnCl2. ............................................................................... 46
Fig. 20. Efeitos do ZnCl2 sobre a viabilidade de fatias de hipocampos. ................ 47
Fig. 21. Efeito do tratamento de zinco e H2O2 na reduo do MTT em hipocampo
de ratos jovens. ..................................................................................................... 49
Fig. 22. Efeito do ZnCl2 sobre a fosforilao da protena Akt em fatias hipocampais
de ratos jovens. ..................................................................................................... 50
Fig. 23. Ao do inibidor de PI3K, LY294002, sobre a fosforilao de Akt em
resposta ao tratamento in vitro com zinco............................................................. 52
Fig. 24. Ao do inibidor da PI3K/Akt, LY294002, sobre os efeitos do ZnCl2 na
reduo do MTT. ................................................................................................... 53
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LISTA DE ABREVIATURAS
AMPA: -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid
AMPc: monofosfsto de adenosina clcico
ARE: elemento de resposta a antioxidantes
ATP: trifosfato de adenosina
BSA: albumina srica bovina
CAT: catalase
CDNB: clorodinitrobenzeno
CFS: fluido crebro espinhal
Cu/ZnSOD: cobre-zinco-superxido dismutase
DMSO: dimetil sulfxido
DNA: cido desoxirribonuclico
ECL: quimioluminescncia
EDTA: cido etileno-dinitrilo-tetra-actico
EGFR: receptor do fator de crescimento epidrmico
ERK: quinase regulada por sinal extracelular
ERO: espcies reativas de oxignio
FAD: flavina adenina dinucleotdeo
Fe-SOD: ferro-superxido dismutase
G6PDH: glicose-6-fosfato desidrogenase
GABA: cido -aminobutrico
GCL: -glutamil-cistena sintetase ou glutamato-cistena ligase
GMPc: monofosfato de guanosina cclico
GPx: glutationa peroxidase
GR: glutationa redutase
GSH: -glutamil-cisteinil-glicina ou glutationa
GSH-t: glutationa total
GSSG: dissulfeto de glutationa
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GST: glutationa S-transferase
HEPES: cido N-2-Hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfnico
JNK: quinase c-Jun NH2-terminal
MAPK: protena quinase ativada por mitgenos
MDA: malonildialdedo
Mn-SOD: mangans- superxido dismutase
MTT: brometo de 3-(4,5-Dimetiltiazol-2,5-difenil-tetrazolium)
NADPH: nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato
NFB: fator de transcrio nuclear kappa B
NMDA: N-Methil-D-Aspartato
NrF2: fator nuclear relacionado ao fator E2
p38MAPK: protena quinase ativada por mitgeno de 38 kDa
PCA: cido perclrico
PH: domnio de homologia plecstrina N-terminal
PI3K: fosfoinositol 3-quinase
PIP2: fosfatidilinositol 3,4-bifosfato
PIP3: fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato
PI(4,5)P2: fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
PKB: protena quinase B
PKC: protena quinase C
RNA: cido ribonuclico
RNAm: cido ribonuclico mensageiro
RTK: receptor tirosina quinase
SDS: dodecil sulfato de sdio
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS
SNC: sistema nervoso central
SOD: superxido dismutase
TBARS: substncias reativas ao cido tiobarbitrico
t-BOOH: hidroperxido de tert-butila
TBS: tampo tris-salina
TBS-T: tampo tris-salina com Tween-20
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TCA: cido tricarboxlico
TEMED: N, N, N, N-Tetrametiletilenodiamina
TGF: fator de crescimento tumoral
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1. INTRODUO
1.1. Zinco nos Processos Biolgicos
O zinco (Zn2+) um metal de transio que modula a funo de diversas protenas
regulatrias associadas a uma variedade de atividades celulares (Eom et al., 2001). Nas
clulas de mamferos, o zinco o micronutriente essencial mais abundante depois do ferro.
Aproximadamente 300 enzimas diferentes requerem zinco, inclundo DNA e RNA
polimerases, metaloproteinases e enzimas do metabolismo intermedirio, como piruvato
carboxilase e lactato desidrogenase (Tapiero & Tew, 2003; Vallee & Auld, 1996; Vallee &
Falchuk, 1986). Fisiologicamente, em baixas concentraes, o zinco contribui para
importantes processos biolgicos, incluindo expresso gnica, sntese de DNA, catlise
enzimtica, sinalizao celular e neurotransmisso (Frederickson et al., 2000). Por outro
lado, o excesso de zinco livre nos tecidos do corpo pode ser txico (Choi & Koh, 1998).
O crescimento e a diferenciao de clulas eucariticas geralmente so induzidos
por hormnios e fatores de crescimento que acionam elementos que esto envolvidos em
cascatas intracelulares de sinalizao, envolvendo receptores, mensageiros intracelulares,
protenas cinases, protenas fosfatases e fatores de transcrio (Lau & Huganir, 2006). O
zinco est envolvido em diversos pontos nas vias de transduo de sinal, podendo ser um
componente estrutural ou modulador da atividade de enzimas, protenas regulatrias e
fatores de transcrio (Vallee & Falchuk, 1993; Beyersmann & Haase, 2001). Entretanto,
perturbao na homeostase do Zn2+ intracelular pode, em determinadas situaes, ser letal
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para as clulas (Koh & Choi, 1994; Manev et al., 1997; Lobner et al., 2000; Marin et al.,
2000).
1.2. Zinco no Sistema Nervoso Central
Similar a outros compostos endgenos, o zinco pode ser tanto um neuromodulador
essencial quanto uma potente neurotoxina, dependendo da sua concentrao intracelular
(Baranano et al., 2001). Baixos nveis de zinco possuem uma ao anticonvulsivante e
neuroprotetora, enquanto altas concentraes de zinco podem matar neurnios e induzir
atividade epiltica (Frederickson & Moncrieff, 1994).
Fig. 1. Localizao do zinco no crebro de ratos. Quadrante caudal esquerdo do crebro de rato (seco horizontal) mostra o zinco vesicular na colorao marrom-escura a preta, a partir da colorao para zinco vesicular pelo mtodo de Danscher. A quarta camada do isocrtex e o hipocampo se mostram bem coradas para o zinco vesicular. A maioria das regies corticais cerebrais fortemente inervada por terminais que contm zinco, enquanto o crtex cerebelar (Ctx Cer) e o tlamo no esto corados para o zinco vesicular. A quarta camada do isocrtex (IV), as regies CA1, hilo do giro denteado (H), estrato oriens (O), estrato radiato (R) e crtex subicular (Sub), todas pertencendo ao hipocampo, se mostram bem coradas para o zinco vesicular (Frederickson et al., 2004).
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O zinco um nutriente essencial para as funes neurolgicas normais. Dentre os
tecidos, o crebro possui o maior contedo de zinco, apresentando concentraes cerca de
dez vezes maiores que o plasma (cerca de 100 150 M) (Mocchegiani et al., 2005).
Apesar de neurnios que contm zinco serem encontrados em vrias regies do crebro,
incluindo neocrtex, amdala e bulbo olfatrio, os neurnios do hipocampo (Fig.1) tm a
maior concentrao de zinco e so particularmente vulnerveis ao dano celular mediado
pelo on (Haug, 1967; Perez-Clausell & Danscher, 1985; Frederickson, 1989; Frederickson
et al., 2000; Li et al., 2001a). No sistema lmbico, o zinco regula tanto a transmisso
sinptica inibitria quanto excitatria no hipocampo. Alm disso, o zinco pode ter um
importante papel na formao da memria (Takeda, 2000).
Fig. 2. Transporte do zinco para o interior do crebro. A albumina e os aminocidos histidina e cistena ligados ao zinco so fontes deste metal no plasma. O zinco pode atravessar a barreira hematoenceflica e a barreira hemato-fluidocrebroespinhal. No interior do crebro, pode se ligar a metaloprotenas ou ser incorporado a vesculas sinpticas em neurnios glutamatrgicos (modificado a partir de Takeda, 2004).
O transporte de metais-trao para dentro do crebro rigorosamente regulado pelas
barreiras hemato-fluidocrebroespinhal e hematoenceflica (Fig. 2). O zinco atravessa a
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barreira hematoenceflica ligado albumina, ou a aminocidos como histidina e cistena
(Takeda, 2000). No crebro, em condies normais, 90% do zinco se encontra ligado a
protenas, como metalotionenas (Cole et al., 1999). O restante, cerca de 10%, ser
seqestrado nas vesculas sinpticas de neurnios que contm zinco, e posteriormente
liberado dos terminais neuronais (Crawford & Connor, 1973; Frederickson et al., 2004;
Takeda, 2004) (Fig.3).
Fig. 3. Distribuio do zinco nas clulas nervosas. O zinco pode ser encontrado ligado metaloprotenas ou no interior de vesculas sinpticas. O transporte do zinco feito pelas protenas transportadoras ZnT e ZIP. Uma vez liberado na fenda sinptica, o zinco pode se ligar a receptores de membrana ou entrar no neurnio ps-sinptico, atravs de canais proticos ou pela ao de transportadores, acionando cascatas de protenas quinases que, atravs da sinalizao celular, podem induzir a expresso gnica. Em altas concentraes, o zinco pode levar o neurnio apoptose. (Adaptado de Colvin et al., 2003).
A captao de zinco nas clulas neuronais ocorre ao nvel de corpo celular, bem
como pelo terminal neuronal. Como os terminais pr-sinpticos liberam zinco, e o corpo
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celular e os dendritos do neurnio ps-sinptico possuem canais permeveis ao zinco, sob
condies favorveis, o zinco poder translocar do interior do neurnio pr-sinptico para o
interior do neurnio ps-sinptico. Durante atividade neuronal intensa pode se esperar uma
intensificao desta translocao (Atar et al., 1995; Yin et al., 1998; Sensi et al., 2000;
Kerchner et al., 2000).
Fig. 4. Transporte de zinco sinptico. Vesculas com a protena transportadora de zinco vesicular, ZnT3 (1), reunidas no Aparelho de Golgi de neurnios glutamatrgicos que contm zinco, so transportadas pelo axnio (2). Uma vez no terminal pr-sinptico, essas vesculas podem ser vistas contendo tanto zinco livre quanto glutamato (3). O zinco e o glutamato so liberados por exocitose dependente de clcio e impulso nervoso (4). Na fenda sinptica o zinco modula uma variedade de canais transportadores e receptores (5-10) em neurnios e clulas gliais. Os canais de clcio possuem certa permeabilidade ao zinco (5 e 9), permitindo sua entrada na clula ps-sinptica, onde ele ligado s metalotionenas (MT) (11). Oxidao e nitrosilao de tiis das metalotionenas pelo xido ntrico (NO) promovem a liberao somtica do zinco (12) (Frederickson et al., 2005).
A liberao de zinco na sinapse juntamente com o neurotransmissor glutamato tem
sido bem documentada (Fig. 4), e o termo gluzinrgico tem sido proposto para descrever
esse tipo de neurnios (Frederickson, 1989; Frederickson & Bush, 2001). Durante
atividades fisiolgicas, incluindo memria e aprendizado, as fibras musgosas do hipocampo
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podem transmitir informao aos neurnios desta estrutura em freqncias
excepcionalmente altas. Durante esses perodos, o zinco liberado sinapticamente pode agir
de forma a proteger os neurnios contra os potenciais de ao excitotxicos conseqentes
da transmisso glutamatrgica aumentada atravs da inibio dos receptores N-Metil-D-
Aspartato (NMDA) via um stio de ligao de alta afinidade (Paoletti et al., 1997). A
concentrao de zinco nas vesculas glutamatrgicas de aproximadamente 300-350 M
(Perez-Clausell & Dansher, 1985; Takeda, 2000). Durante a atividade neuronal, estimado
que o zinco atinja um pico de concentrao sinptica de 10-100 M (Vogt et al., 2000),
podendo chegar a nveis ainda maiores aps uma atividade sinptica aumentada (Assaf &
Chung, 1984; Howell et al., 1984; Molnar & Nadler, 2001).
Durante estmulo normal, o zinco liberado dos terminais pr-sinpticos
glutamatrgicos pode ser translocado para a clula ps-sinptica atravs dos canais de Ca2+
dependentes de voltagem ou dos receptores AMPA/cainato, podendo acionar cascatas de
sinalizao neste neurnio (Sensi et al., 1999a). H evidncias de que tal translocao
contribui para a injria celular induzida pelo zinco na excitotoxicidade (Li et al., 2001b).
Assim, apesar dos importantes papis neuromodulatrios do zinco livre, a liberao
excessiva deste metal nos botes sinpticos pode resultar em morte neuronal ps-sinptica
(Frederickson, 1989; Frederickson et al., 1989; Koh et al., 1996; Ahn et al., 1998).
Portanto, os estudos que investigam os mecanismos de neurotoxicidade do zinco tm
focado, principalmente, sua interao com o sistema glutamatrgico.
Considerando os aspectos relacionados neurotoxicidade do zinco, tem sido
indicado que a excessiva liberao pr-sinptica do metal pode contribuir ou participar de
eventos bioqumicos relacionados neurodegenerao aps isquemia global transitria e
trauma cerebral (Aniksztejn et al., 1987; Suh et al., 2000; Weiss e Sensi, 2000; Koh, 2001).
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-
Alm disso, tem sido proposto que o aumento nos nveis intracelulares de zinco aps um
evento de estresse, pode tambm se originar de compartimentos dos prprios neurnios
ps-sinpticos, como estoques mitocondriais e zinco ligado a metalotionenas (Frederickson
et al., 2004).
1.3. Radicais livres e espcies reativas de oxignio (ERO)
Radicais livres so molculas que possuem eltrons desemparelhados no seu orbital
mais externo (Marks et al., 1996) e podem ser tanto molculas orgnicas, tais como
quinonas, ou inorgnicas como o nion superxido (O2-). So altamente reativos e,
portanto, com tempo de vida muito curto. So formados durante o metabolismo celular
normal e, tambm, quando o organismo exposto a uma srie de estmulos como radiao
ionizante e biotransformao de xenobiticos (Comporti, 1989).
Fig. 5. Alguns exemplos de espcies reativas de oxignio. Fonte: http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/ROS.html Acessado em Julho de 2006.
Espcies reativas de oxignio (ERO) so compostos contendo oxignio (Fig. 5).
ERO incluem os radicais livres como o nion superxido, (O2-), o radical hidroxila (OH),
radicais hidroperoxil (HO2), e as espcies no radicalares como o perxido de hidrognio
(H2O2) e o oxignio singlet (O2) (Halliwell & Gutteridge, 1999). Estas espcies so
altamente reativas e podem agir como sinalizadores celulares, ou ainda como causadores de
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dano ao DNA, ativadores pr-carcingenos, e podem alterar o sistema de defesa
antioxidante celular (Comporti, 1989; Cerutti, 1994; Liochev e Fridovich, 1999).
O oxignio molecular, em seu estado fundamental, um bi-radical contendo dois
eltrons desemparelhados no seu orbital mais externo. Entretanto, estes dois eltrons
desemparelhados apresentam spins de mesma orientao, tornando o O2 uma molcula
pouco reativa, podendo reagir com apenas um eltron por vez. O O2 capaz de aceitar
quatro eltrons, o que o reduz gua. Entretanto, redues parciais do O2 conduzem ao
aparecimento de diversas espcies reativas (Fig 6).
Fig. 6. Reduo univalente do oxignio e formao de intermedirios reativos. Os quatro passos para a reduo de O2 geram, progressivamente, superxido, perxido de hidrognio, radical hidroxila e gua (modificado a partir de Marks et al., 1996).
Quando o O2 aceita um eltron, formado o nion superxido, considerado um
radical por possuir um eltron desemparelhado. Essa reao no termodinamicamente
favorvel e requer um agente fortemente redutor como, por exemplo, a CoQ na cadeia
transportadora de eltrons. Quando o superxido recebe um eltron, reduzido a perxido
de hidrognio, que no um radical, mas pode gerar o radical hidroxila em conseqncia
de uma nova reduo. Finalmente, em um ltimo passo, a entrada de mais um eltron reduz
o radical hidroxila gua (Marks et al., 1996).
Durante o metabolismo basal das clulas aerbicas, existe uma produo constante
de radicais livres e ERO acompanhada pela sua contnua inativao atravs da ao de
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antioxidantes, de modo a manter a integridade celular estrutural e funcional. A condio de
estresse oxidativo foi definida como um distrbio no balano pr-oxidante e antioxidante
(Fig.7), em favor do primeiro, podendo causar danos celulares (Sies, 1997; Ho et al., 1998).
Desta forma, o estresse oxidativo pode resultar: (1) da maior gerao de ERO, (2) da defesa
insuficiente das enzimas antioxidantes, (3) da liberao de metais de transio, potenciais
geradores do radical hidroxila, (4) da combinao destes fatores (Halliwell, 2001).
Fig. 7. Estresse oxidativo. Estresse oxidativo ocorre quando a taxa de produo de espcies reativas de oxignio e radicais livres excede a taxa de sua remoo pelos mecanismos de defesa antioxidantes. Fonte: http://www.asiaandro.com/1008-682x/6/59htm. Acessado em Julho de 2006.
Os danos causados pelo estresse oxidativo incluem, principalmente, clivagem do
DNA pela hidroxilao da guanina e metilao da citosina (Lee et al., 2002), lise
mitocondrial, influxo de clcio, oxidao de protenas, gerando derivativos carbonil e
nitrotirosina (Adams et al., 2001), e peroxidao de lipdios da membrana celular (Marks et
al., 1996). Os organismos aerbicos desenvolveram, portanto, diferentes mecanismos de
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http://www.asiaandro.com/1008-682x/6/59htmhttp://www.asiaandro.com/1008-682x/6/59htm
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defesa antioxidante, enzimticos e no-enzimticos, que podem prevenir a formao das
ERO, reagir com estes intermedirios reativos, bem como reparar os danos causados pelos
mesmos (Sies, 1993).
O crebro particularmente sensvel aos danos causados por radicais livres e
espcies reativas de oxignio (ERO) devido a sua alta taxa metablica e sua capacidade
relativamente reduzida de regenerao celular comparada com outros rgos (Andersen,
2004). Alm disso, os tecidos cerebrais contm grandes quantidades de cidos graxos
poliinsaturados, que podem ser oxidados por radicais livres. Finalmente, o crebro contm
altos nveis de ferro, o qual tem sido referido como importante elemento associado
produo de radicais livres e injria neural (Herbert et al., 1994).
1.3.1. Defesas Celulares
O organismo possui defesas antioxidantes que o protegem dos danos oxidativos.
Estas defesas podem ser definidas como qualquer substncia que, presente em baixas
concentraes quando comparadas a de um substrato oxidvel, retarda ou inibe
significativamente a oxidao deste (Halliwell e Gutteridge, 1999). Estas defesas podem
ser fornecidas por compostos no enzimticos assim como por enzimas especficas
(Halliwell, 2001). Os antioxidantes protegem as clulas do dano oxidativo (Halliwell, 1992;
Sies, 1996). Portanto, frente a um estresse oxidativo, estas defesas so acionadas para
restabelecer o equilbrio, evitando o dano oxidativo.
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1.3.1.1. Defesas No Enzimticas
Existem vrias molculas que podem agir como antioxidantes no enzimticos,
entre elas podemos citar: os tocoferis, o cido ascrbico, assim como os carotenides e a
glutationa (GSH) (Sies et al., 1992).
A GSH um tripeptdeo (-glutamil-cisteinil-glicina), sendo considerada o
antioxidante endgeno universal devido a sua importncia na proteo celular contra a
formao de ERO, na homeostase tilica, na manuteno da homeostase redox da clula, e
na defesa contra agentes eletroflicos (Cooper, 1997; Dringen, 2000; Bharath et al., 2002).
Fig. 8. Ciclo redox esquemtico mostrando a relao entre enzimas antioxidantes e a glutationa. A glutationa sintetizada em duas reaes enzimticas seqenciais dependentes de ATP. O primeiro passo da sntese da glutationa (GSH) sintetizado pela -glutamil-cistena sintetase ou glutamato-cistena ligase (GLC), a qual liga os aminocidos L-glutamato e L-cistena. A enzima glutationa sintetase (GS) liga L--glutamato-L-cistena com o aminocido glicina para formar L--glutamil-L-cisteinil-glicina (GSH). Modificado a partir de Haddad & Harb, 2005.
A GSH utilizada por uma srie de enzimas, como a glutationa peroxidase (GPx) e
a glutationa S-transferase (GST). A GSH sintetizada em dois passos, por duas enzimas
distintas: -glutamil-cistena sintetase ou glutamato-cistena ligase (GCL), que
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considerada o ponto regulatrio da produo da GSH, e pela glutationa sintetase, que
responsvel pela adio de glicina (Sies, 1999) (Fig. 8). O termo glutationa total (GSH-t)
usado para a soma do dissulfeto da glutationa (GSSG) com sua forma tilica (GSH).
Os grupos tiis contidos na glutationa podem ser oxidados enzimaticamente,
levando formao de pontes dissulfeto (-S-S-). Por outro lado, as pontes dissulfeto so
facilmente reduzidas, formando novamente os grupos tiis. Desta forma, a taxa de reduo
e oxidao dos grupos tiis pode ser o principal fator determinante do potencial de reduo
celular (Galaris & Evangelou, 2002). A razo entre a GSH reduzida e a oxidada
(GSH/GSSG) varia entre os vrios compartimentos celulares, variando de 2:1 no retculo
endoplasmtico a mais de 100:1 em outros compartimentos (Hwang et al., 1992). O
balano entre a GSH reduzida e a oxidada representa um fator chave no estado redox
celular (Meister, 1994).
Foi demonstrado que neurnios em cultura so mais vulnerveis compostos como
perxido de hidrognio (H2O2), hidroperxido de tert-butila (t-BOOH), ou peroxinitrito
(ONOO-)(Ben-Yoseph et al., 1994; Bolaos et al., 1995; Abe & Saito, 1998). Isso
provavelmente ocorre porque neurnios em cultura contm glutationa em uma
concentrao mais baixa do que clulas astrogliais em cultura (Raps et al., 1989; Bolaos et
al., 1995).
1.3.1.2. Defesas Enzimticas
As principais enzimas antioxidantes so: superxido dismutase (SOD), catalase
(CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PDH), glutationa S-transferase (GST) e -glutamil transpeptidase (-GT).
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a) Superxido Dismutase (SOD)
A enzima SOD catalisa a dismutao do radical O2- em H2O2 e O2 (McCord e
Fridovich, 1969), conforme representado na equao [1] e [2]. Esta enzima encontrada em
diferentes isoformas. A cobre-zinco-SOD (Cu/Zn-SOD) uma metaloprotena dimrica que
possui em cada subunidade um stio ativo com um tomo de cobre e um tomo de zinco.
encontrada no citoplasma e ncleo das clulas de mamferos (Halliwell e Gutteridge, 1999).
Eq. [1] Enz-Cu2++ O2- Enz-Cu++ O2Eq. [2] Enz-Cu++ O2-+ 2H+ Enz-Cu2++ H2O2
Outras isoenzimas SOD foram identificadas. A enzima mangans-SOD (Mn-SOD)
possui mangans no stio cataltico. Nas clulas humanas, a Mn-SOD encontrada
principalmente na matriz mitocondrial (Halliwell & Gutteridge, 1999). A enzima
extracelular-SOD (EC-SOD) encontrada na superfcie celular, em quantidades muito
pequenas na maioria dos tecidos se comparada s isoformas Cu/Zn-SOD e Mn-SOD
(Marklund, 1984; Oury et al., 1996). Embora os nveis de EC-SOD no crebro sejam
baixos, existem regies especficas, como o hipocampo, nas quais a presena da enzima
EC-SOD necessria para as funes normais de aprendizado e memria (Levin et al.,
1998). A isoforma ferro-SOD (Fe-SOD), que possui ferro no stio cataltico, no
encontrada nas clulas de mamferos (Wandres & Denis, 1992).
b) Catalase (CAT)
A maioria das clulas aerbicas possui atividade catalsica. A localizao
intracelular da catalase basicamente peroxissomal. Nos animais, a CAT est presente em
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todos os principais rgos do corpo, especialmente no fgado e nos eritrcitos (Halliwell &
Gutteridge, 1999). No sistema nervoso central, a catalase encontrada nos quatro principais
tipos celulares, sendo eles astrcitos, neurnios, oligodendrcitos e microglia (Dringen et
al., 2005).
A CAT decompe o H2O2 em H2O e O2 (Farber et al., 1990), conforme as equaes
abaixo:
Eq. [3] Cat-Fe3++ H2O2 Composto 1 + H2O
Eq. [4] Composto 1 + H2O2 Cat-Fe3++ H2O + O2
c) Glutationa Peroxidase (GPx)
No crebro, a enzima GPx encontrada em astrcitos, neurnios, microglia e
oligodendrcitos (Dringen et al., 2005). Esta enzima est presente principalmente na matriz
mitocondrial, no citoplasma e no ncleo das clulas (Halliwell & Gutteridge, 1999). A
isoforma citoslica de GPx, GPx1, parece ser muito importante para o sistema de defesa
antioxidativo do crebro (Zhang et al., 2000; Crack et al., 2001; Flentjar et al., 2002).
A GPx possui atividade peroxidase, utilizando doadores de eltrons para reduzir o
perxido de hidrognio gua (Little & OBrien, 1968) conforme as equaes abaixo:
Eq. [5] H2O2+ 2GSH 2H2O + GSSG
Eq. [6] LOOH + 2GSH LOH + H2O + GSSG
A GPx possui selnio no stio cataltico e utiliza o tripeptdeo tilico GSH como
doador de eltrons para a reduo do H2O2 (Eq. [5]) e de outros perxidos orgnicos
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(LOOH, Eq. [6]), tais como os lipoperxidos provenientes da lipoperoxidao lipdica,
impedindo assim a fase de propagao deste processo (Keeling & Smith, 1982). Durante o
processo catalisado pela GPx ocorre a oxidao da GSH, e conseqente formao de uma
ponte dissulfeto entre duas molculas de glutationa (GSSG), com concomitante formao
do lcool (LOH) derivado do perxido orgnico.
d) Glutationa Redutase (GR)
A importncia da enzima GR consiste em manter o equilbrio GSH/GSSG na clula,
pois a GSH uma molcula que tem como funo essencial manter as clulas no seu estado
reduzido. Portanto, ela atua como um agente antioxidante, reduzindo perxidos atravs da
ao da glutationa peroxidase (Meister, 1983; Stamler, 1994; Fujii et al., 2000). No sistema
nervoso central, assim como a GPx, a GR encontrada em astrcitos, neurnios, microglia
e oligodendrcitos (Dringen et al., 2005).
A GR contm um grupo prosttico flavina adenina dinucleotdeo (FAD) transferidor
de eltrons que catalisa a reduo da glutationa oxidada (GSSG) em glutationa reduzida
(GSH) de forma dependente de NADPH (Voet et al., 2000), conforme equao abaixo:
Eq. [7] GSSG + NADPH 2GSH + NADP+
e) Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH)
A enzima G6PDH est presente no citoplasma de todas as clulas. Ela faz parte do
ciclo das pentoses e participa da produo de NADPH, uma molcula necessria em vrios
processos de biossntese e, tambm, na manuteno da atividade da glutationa redutase. A
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G6PDH catalisa a oxidao da glicose-6-fosfato a 6-fosfogliconolactona, hidrolisada em 6-
fosfogliconato. No processo cataltico, esta enzima utiliza NADP+ como aceptor de
eltrons, gerando equivalentes reduzidos de NADPH que mantm parte do poder redutor
intracelular (Voet et al., 2000).
Eq. [8] Glicose-6-P + NADP+ NADPH + H+ + 6-P-Glucono-1,5-lactona
f) Glutationa S-Transferase (GST)
GST constitui uma famlia de enzimas multifuncionais envolvidas na detoxificao
metablica de agentes eletroflicos incluindo agentes alquilantes, herbicidas, pesticidas e
outros xenobiticos (Ketterer et al., 1988; Mannervik & Danielson, 1988; Vos & Van
Bladeren, 1990). GST possui diferentes isoformas, presentes na maioria dos rgos de
mamferos. So protenas dimricas consistindo de duas subunidades pertencentes mesma
classe, que pode ser , , , e (Mannervik & Danielson, 1988; Meyer et al., 1991). No
crebro de ratos, GST est presente em neurnios, astrcitos, clulas endoteliais e
oligodendrcitos. Alm disso, h diferenas regionais no padro de expresso das classes ,
, de GST (Johnson et al., 1993).
A catlise de GST propicia a conjugao destes agentes eletroflicos com o grupo -
SH da GSH [Eq. 9], tornando os compostos mais hidroflicos, facilitando sua
metabolizao e excreo (Ketterer et al., 1983). GST apresenta tambm atividade
glutationa peroxidase [Eq. 6] independentemente de selnio, podendo reduzir perxidos
orgnicos (Mosialou et al., 1993).
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Eq. [9] GSH + X GS-X
g) -Glutamil Transpeptidase (-GT)
-glutamil transpeptidase (-GT ou GGT) uma enzima glicoprotica ligada
superfcie da membrana celular, onde catalisa a transferncia do grupo -glutamil da GSH
nas suas formas reduzida e oxidada por hidrlise de uma ligao -glutamil para outros
aminocidos aceptores, peptdeos ou gua, (Meister et al., 1981). No final da reao
catalisada por GGT so formados aminocidos -glutamil (ou peptdeos -glutamil) e o
dipeptdeo CysGly.
No sistema nervoso central de ratos adultos, a GGT est principalmente localizada
nos ps astrocticos perivasculares que circundam os vasos sangneos, e em alguns
pericitos (Zhang et al., 1997; Cambier et al., 2000).
1.4. Zinco e estresse oxidativo
Tanto o excesso quanto a deficincia de zinco podem levar ao estresse oxidativo e,
conseqentemente, ativar ou inibir fatores de transcrio sensveis oxidao, podendo
afetar a funo, a proliferao e a sobrevivncia celular (Oteiza et al., 2004). Embora o
zinco no seja ele prprio um oxidante, este metal pode inibir a produo da energia celular
atravs de mecanismos que aumentam o estresse oxidativo (Fig. 9) (Dineley et al., 2003).
Alguns estudos evidenciam que o estresse oxidativo pode ser o principal causador de morte
neuronal pelo zinco (Kim et al., 1999b; Noh et al., 1999; Noh & Koh, 2000).
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-
Fig. 9. Alvos bioenergticos potenciais para inibio pelo zinco. O zinco pode comprometer a produo de energia celular atravs da inibio da gliclise pela inibio da enzima gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), da inibio do ciclo do cido tricarboxlico (TCA) pela inibio docomplexo -cetoglutarato desidrogenase (KGDHC), e da inibio da cadeia transportadora de eltrons. Possveis conseqncias do aumento da concentrao de zinco intracelular incluem consumo reduzido de O2, nveis de ATP reduzidos, aumento na gerao de ERO, permeabilidade mitocondrial transitria (PTM), e morte neuronal. O impacto do zinco na permeabilidade mitocondrial, bem como os mecanismos responsveis pela captao de zinco pela mitocndria permanecem obscuros (modificado a partir de Dineley et al., 2003).
Um aumento no zinco intracelular pode causar disfuno mitocondrial, o que pode
levar gerao de espcies reativas de oxignio (Sensi et al., 1999b). A inibio do ciclo
do cido tricarboxlico (TCA) pelo zinco poderia estimular a produo de ERO atravs da
inibio do complexo da -cetoglutarato desidrogenase (Gazaryan et al. 2002). Alm disso,
um aumento nos nveis de zinco intracelular causa a inibio da atividade da GR in vitro
(Mize & Langdon, 1962), e aumenta a gerao de nion superxido pela enzima NADPH
oxidase (Noh & Koh, 2000), resultando em elevada produo de ERO. Por fim, tem sido
sugerido que o zinco tambm pode contribuir na patobioqumica de desordens
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neurodegenerativas, tais como Mal de Parkinson, algumas formas de Esclerose Lateral
Amiotrfica, e Mal de Alzheimer (Cuajungco & Lees, 1997; Puttaparthi et al., 2002;
Friedlich et al., 2004).
1.5. Sinalizao Celular
Nos organismos multicelulares, as clulas necessitam utilizar vias de sinalizao
para comunicar-se entre si e para comandar diversas funes relacionadas, entre outras,
migrao, proliferao, diferenciao e morte (Davis, 2000). Neste processo, a fosforilao
de protenas representa uma via comum e de fundamental importncia.
Fig. 10. Diagrama esquemtico do sistema de fosforilao de protenas. As protenas cinases catalisam a transferncia de -fosfato (P) do ATP a resduos de serina (Ser), treonina (Thr), ou tirosina (Tyr) presentes nas protenas substratos. As protenas fosfatases catalisam a hidrlise da ligao fosfoster, causando a liberao do fosfato inorgnico (Pi). Fonte: modificado a partir de http://www.emdbiosciences.com. Acessado em Julho de 2006.
Sinais extracelulares, dentro ou fora do SNC, so conhecidos por produzir muitos de
seus efeitos fisiolgicos atravs da regulao do estado de fosforilao de protenas
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http://www.emdbiosciences.com/
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especficas em suas clulas-alvo (Robinson & Cobb, 1997; Hunter, 2000; Greengard,
2001). Um sistema de fosforilao de protenas consiste de: uma protena cinase, uma
protena fosfatase, um substrato protico e ATP (Fig. 10).
1.5.1. Protenas Cinases
Protenas cinases so classificadas como protenas serina/treonina ou tirosina
cinases porque so capazes de fosforilar substratos proticos em resduos de serina/treonina
ou tirosina. As protenas cinases catalisam a transferncia de um grupo fosfato do ATP
para o grupo hidroxila no respectivo resduo de aminocido em seu substrato protico (Fig.
10) (Nestler & Greengard, 1999).
A fosforilao de protenas realiza um papel fundamental na regulao de diversas
funes celulares, sendo o principal mecanismo acionado no processo de transduo de
sinal em resposta a diversos sinais extracelulares (Hunter, 1995; Pawson & Scott, 1997;
Lau & Huganir, 1999; Nestler & Greengard, 1999; Schillace & Scott, 1999; Hunter, 2000;
Lau & Huganir, 2006). A fosforilao de uma protena altera sua carga e, por conseqncia,
sua conformao de forma reversvel. Esse mecanismo regula a atividade funcional de
diversas protenas, desencadeando respostas biolgicas especficas. Dessa forma, a
fosforilao/defosforilao de protenas pode regular importantes processos biolgicos,
como a atividade cataltica de enzimas, abertura/fechamento de canais inicos, atividade de
receptores, atividade de fatores de transcrio, localizao intracelular de protenas e
dinmica do citoesqueleto (Greengard, 2001).
No SNC, tem sido bem documentada a cascata de sinalizao da via PI3K-Akt e seu
envolvimento na regulao da sobrevivncia celular atravs de diversos mecanismos,
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incluindo fosforilao e inibio de mediadores pr-apoptticos (Datta et al., 1999), e
upregulation da expresso de genes com potencial antiapopttico (Andjelkovic et al.,
1997; Meier et al., 1997). Alm disso, h evidncias do envolvimento da via PI3K-Akt no
metabolismo, atravs da sua atuao na captao de glicose (Kohn et al., 1995; Kohn et al.,
1996).
1.5.1.1. Akt como Elemento Regulatrio Essencial
A protena quinase B (PKB) ou Akt amplamente expressa em mamferos, sendo
que trs membros desta famlia de serina/treonina cinases so conhecidos, sendo eles PKB
ou Akt1, PKB ou Akt2, e PKB ou Akt3. A expresso celular da Akt pode variar entre os
diferentes tipos de tecidos e clulas (Chong et al., 2005). A Akt1 a isoforma mais
expressa. Embora a Akt2 seja expressa em nveis menores do que a Akt1, ela ocorre em
tecidos responsivos insulina, como msculo esqueltico, fgado, corao, rins e tecido
adiposo (Altomare et al., 1995). Akt parte da superfamlia de protenas cinases AGC
(protena cinase dependente de cAMP/protena cinase G/protena cinase C), e consiste de
trs domnios funcionais. O domnio N-terminal com homologia plextrina (PH) fornece
stios de ligao para os fosfolipdios de membrana, os quais esto envolvidos no
recrutamento da Akt para a membrana plasmtica (Brazil et al., 2004). O domnio cataltico
da Akt tem especificidade por resduos de serina ou treonina de protenas substrato para
Akt (Frech et al., 1997). O domnio carboxil terminal possui um motivo hidrofbico
caracterstico da famlia AGC (Peterson & Schreiber, 1999). A fosforilao dos resduos de
serina e treonina desse motivo hidrofbico necessria para a completa ativao da cinase
(Andjelkovic et al., 1997; Yang et al., 2002; Brazil et al., 2004; Hanada et al., 2004).
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Em diversos tipos celulares, fatores trficos ou citocinas, via modulao de
receptores tirosina cinases ou mesmo de receptores acoplados protena G, causam
ativao da enzima fosfatidil inositol 3 quinase (PI3K), junto membrana celular (Fig. 11).
Aps a ativao, PI3K fosforila, na posio 3, os glicerofosfolipdeos de membrana
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato [PI(4,5)P2] ou fosfatidilinositol 4-monofosfato [PI(4)P],
resultando na produo de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) e fosfatidilinositol 3,4-
bifosfato (PIP2). Este evento conduz ao recrutamento de Akt junto membrana plasmtica,
que, atravs da regio com homologia plextrina, liga-se aos PIP2 ou PIP3 de membrana,
sendo sua transio do citosol para a membrana plasmtica um evento essencial para sua
ativao (Thomas et al., 2002; Brazil et al., 2004; Hanada et al. 2004). Assim, a Akt se
torna disponvel para a fosforilao pela PKD1 na Treonina (Thr)308 e por uma outra
protena cinase ainda no estabelecida na posio Serina (Ser)473 (Stephens et al., 1998;
Datta et al., 1999; Brazil et al., 2004; Hanada et al. 2004). A fosforilao dos resduos de
Thr-308 e Ser-473 considerada crtica para a ativao da Akt (Bellacosa et al., 1998;
Yang et al., 2002). Muitos dos efeitos antiapoptticos desses fatores de crescimento podem
ser atribudos, em parte, ativao desta via, o que foi primeiramente demonstrado em
clulas PC12 por Yao e Cooper (1995).
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Fig. 11. Alvos da regulao da sobrevivncia celular pela Akt. Modificado a partir de Song et al., 2005.
Muitos estudos tm demonstrado que a ativao da Akt necessria para a
sobrevivncia celular, sendo que a apoptose induzida pela retirada de fatores de
crescimento, radiao UV, dano ao DNA, e tratamento com TGF, em muitos tipos
celulares, reduzida atravs da transfeco da Akt constitutivamente ativa. Em contraste, a
introduo da Akt dominante negativa (ou inativa) bloqueia a sobrevivncia de clulas
mesmo na presena de fatores de crescimento, reforando a significncia desta via na
preveno de morte celular (Dudek et al., 1997).
Akt um fator de sobrevivncia crtico que pode modular vias celulares no sistema
nervoso central e perifrico. Numerosos estudos identificaram a Akt como um fator chave
na proteo contra a morte celular (Lawlor & Alessi, 2001). Estudos anteriores
demonstraram que a superexpresso da Akt nos neurnios do SNC previne apoptose
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induzida pela privao celular de fatores de crescimento (Datta et al., 1997). Akt previne
apoptose promovendo a sobrevivncia celular. Isso ocorre, primariamente, via fosforilao
da protena pr-apopttica BAD, desfazendo sua interao com as protenas anti-
apoptticas Bcl-2/Bcl-XL e evitando a liberao mitocondrial do citocromo c (Datta et al.,
1997; Prasad et al., 2000).
Portanto, tem sido bem documentado que Akt necessria para a sobrevivncia de
neurnios (Crowder & Freeman, 1998). O aumento da forma ativa da Akt (fosfo-Akt) pode
promover a sobrevivncia celular durante exposio a radicais livres ou estresse oxidativo
(Matsuzaki et al., 1999; Chong et al., 2003; Kang et al., 2003a,b), dano ao DNA (Henry et
al., 2001; Kang et al., 2003a), pr-condicionamento hipxico (Wick et al., 2002), exposio
ao peptdeo -amilde (Wick et al., 2002), e administrao de TGF- (Conery et al.,
2004).
A ativao da Akt, porm, nem sempre desejada. Sob certas condies, a
sobrevivncia celular aumentada durante a ativao da Akt poderia fomentar o crescimento
de clulas neoplsicas. Um estudo recente identificou a Akt como um alvo potencial a ser
bloqueado durante o tratamento de clulas cancerosas que contm mutaes no fator de
crescimento epidrmico (EGF) (Sordella et al., 2004).
1.5.1.2. Papel de radicais livres e ERO na sinalizao celular
Recentemente, tem sido proposto que as espcies reativas de oxignio possuem um
papel no mecanismo coordenado da sinalizao celular. Foi demonstrado que elas
estimulam um grande nmero de vias de transduo de sinal que so importantes na
manuteno da homeostase celular neuronal (Borg & London, 2002).
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-
As complexas redes de sinalizao envolvem numerosas vias bioqumicas, e tm
sido extensivamente estudadas quanto ao seu papel na sobrevivncia ou morte celular em
consequncia de processos neurodegenerativos ou de injria ao SNC. Como mostrado na
Fig. 12, muitas dessas vias podem ser reguladas pelo estado redox celular como
consequncia, por exemplo, da modificao oxidativa de protenas ou de stios especficos
(Finkel, 1998).
Fig. 12. Vias que podem ser mediadas por estresse oxidativo. ERO ativam muitas vias de sinalizao celular. Algumas podem estar envolvidas na promoo de morte celular, como as vias de p38, JNK, p53 e JAK/STAT, enquanto outras cascatas, como aquelas envolvendo ERK1/2, Akt e HSF-1 tm sido propostas como citoprotetoras (modificado a partir de Martindale & Holbrook, 2002).
As cascatas de sinalizao envolvidas na sobrevivncia celular so complexas e os
mecanismos de modulao destas vias pelos diversos fatores, incluindo ERO, no so bem
compreendidos. Estudos tm demonstrado que a ativao de JNK e p38MAPK por ERO
implica na promoo de morte celular, e que a ativao de vias como ERK1/2 e AKT tm
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se mostrado neuroprotetoras (Martindale & Holbrook, 2002; Hanada et al., 2004; Murphy
& Blenis, 2006). Entretanto, na dependncia do tempo de ativao e do compartimento
celular, podem ser observadas variaes na ao de cada uma das MAPK quanto
capacidade de causar dano ou proteo celular nas resposta de estresse (Chen et al., 2004;
Waetzig & Herdegen, 2005; Murphy & Blenis, 2006).
No que tange especificamente a modulao de Akt por ERO pode ser citado que o
perxido de hidrognio pode levar ativao endgena da Akt em diversas linhagens
celulares, tais como clulas Hela, A549 e glioblastoma humano (Sonoda et al., 1999; Wang
et al., 2000). Alm disso, a ativao da Akt tem sido demonstrada durante estresse
oxidativo em linhagens de clulas neuronais (Kang et al., 2003a,b; Salinas et al., 2003),
clulas primrias de hipocampo (Matsuzaki et al., 1999) e neurnios corticais
(Crossthwaite et al., 2002; Chong et al., 2003).
Diante da importncia do zinco na promoo de estresse oxidativo e na regulao de
diversos alvos proticos, incluindo a possvel modulao de Akt, considerando o papel
fundamental desta protena na regulao neural, se faz importante aprofundar o
entendimento das aes moleculares do zinco sobre estes parmetros. Desta forma, atravs
da compreenso destas aes pretende-se contribuir para a melhor compreenso do papel
neuroprotetor e neurotxico do zinco no SNC.
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2. OBJETIVOS
Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho investigar as aes do zinco sobre as defesas
celulares antioxidantes in vivo e in vitro. Alm disso, o estudo pretende investigar possveis
aes do zinco na modulao de alguns alvos moleculares relacionados sinalizao
celular e que poderiam intermediar aes fisiolgicas ou patolgicas do metal.
Objetivos Especficos
1. Determinar o contedo de glutationa total e enzimas antioxidantes (GPx, GST, catalase
e GR), em hipocampo e crtex cerebral de ratos jovens tratados in vivo com zinco.
2. Determinar a atividade das enzimas antioxidantes (GPx, GST, GR e GGT) em fatias de
hipocampo de ratos jovens frente ao tratamento in vitro com zinco.
3. Investigar uma possvel interao entre a ao do zinco e do perxido de hidrognio,
relativo modulao da viabilidade celular em fatias hipocampais de ratos jovens.
4. Caracterizar a modulao pelo zinco da fosforilao da protena quinase Akt em fatias
hipocampais de ratos jovens expostos in vitro ao metal, identificando o possvel papel
desta regulao na modulao da viabilidade celular.
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-
3. MATERIAL E MTODOS
3.1. Animais
Nos modelos experimentais foram utilizados ratos da linhagem Wistar provenientes
do Biotrio Central da Universidade Federal de Santa Catarina. Foram usados ratos jovens
entre 8 e 13 dias de idade. Os animais tiveram acesso irrestrito a gua e comida, e foram
mantidos em ambiente com temperatura entre 22 e 24C, e ciclo claro-escuro de 12 horas
(luzes ligadas das 7:00 s 19:00 h). Os animais foram manipulados e mortos de acordo com
o cdigo de tica de utilizao de animais para pesquisa, conforme protocolo aprovado pela
CEUA-UFSC (Protocolo No. 297/CEUA; Processo No. 23080.012517/2004-36).
3.2. Tratamentos in vivo
3.2.1. Tratamento Agudo ou com Doses Repetidas de ZnCl2
Para o estudo da ao do ZnCl2 in vivo sobre os nveis de GSH-t ,e sobre a atividade
das enzimas antioxidantes GPx, catalase, GR e GST, os animais com 13 dias de idade
foram tratados com uma dose aguda de ZnCl2 com uma injeo intraperitonial de soluo
salina (NaCl 0,9%; controle) ou ZnCl2 (1, 4 ou 16 mg/kg, diludo em soluo salina). Os
animais foram sacrificados 24 horas aps a injeo.
No tratamento com doses repetidas, os animais foram tratados por cinco dias
consecutivos (do 8 ao 12 dia ps-natal) com uma injeo diria intraperitonial (i.p.) de
soluo salina (NaCl 0,9%; controle) ou ZnCl2 (1, 2 ou 4 mg/kg, diludo em soluo
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salina). Os animais foram sacrificados no 14 dia ps-natal, ou seja, 48 horas aps a ltima
injeo.
Os animais foram mortos por decapitao e as estruturas rapidamente dissecadas
sobre gelo. Para a determinao de GSH-t foi utilizado tecido fresco, enquanto que, para a
determinao da atividade das enzimas antioxidantes, as estruturas foram preservadas em
ambiente contendo gelo seco at seu armazenamento em freezer -80C para posterior
anlise.
3.3. Tratamentos in vitro
Os animais foram mortos por decapitao e o crebro rapidamente retirado e a
seguir dissecado (4C) sob papel filtro umidecido com tampo HEPES/salina (124 mM de
NaCl, 4 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 25 mM de HEPES, 12 mM de glicose e 1 mM de
CaCl2, pH 7.4), previamente oxigenado por 30 minutos. Os hipocampos foram isolados e
rapidamente fatiados na espessura de 400 m, utilizando um fatiador de tecidos de
McIlwain. Aps este procedimento, mantendo as fatias imersas em tampo HEPES/salina
(4C), foi realizada a seleo das fatias hipocampais com aproximadamente o mesmo
tamanho para os procedimentos subseqentes.
3.3.1. Tratamento das Fatias de Hipocampo.
As fatias hipocampais foram usadas para o estudo da ao do ZnCl2 sobre a
viabilidade celular, sobre a atividade das enzimas antioxidantes GPx, catalase, GR e GST.
Neste sentido, fatias de hipocampo (10 fatias/tratamento) foram pr-incubadas, por 30 min,
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com tampo HEPES/salina (300l), em temperatura ambiente, para recuperao metablica
do tecido. Aps esse perodo, o meio foi retirado e as fatias submetidas a incubaes por
um perodo de 2 horas (37C), em tampo HEPES/salina (controle), ou este mesmo meio
contendo 10, 30, 100 ou 300 M de ZnCl2. Nos estudos de modulao de viabilidade e de
fosforilao de AKT, foi seguido o mesmo protocolo, exceto pela utilizao de apenas uma
fatia/tratamento, realizado em triplicata.
Para determinar se a ao do zinco sobre a viabilidade celular poderia ter sinergismo
com a ao de agentes pr-oxidantes, as fatias foram incubadas com o zinco e, a seguir,
com perxido de hidrognio. Neste protocolo, aps pr-incubao (30 min) com tampo
HEPES/salina, as fatias foram incubadas com diferentes concentraes de zinco (10100
M) por 2 horas (37C). A seguir as fatias foram lavadas com tampo HEPES/salina e,
ento, foi adicionado H2O2 1 mM por 1 hora adicional. Fatias incubadas com ZnCl2 (10-
100 M; 2h) seguidas da incubao apenas com tampo HEPES/salina serviram como
controle relativo ao do zinco isoladamente.
3.4. Avaliao da Viabilidade Celular.
A viabilidade celular das fatias foi medida pelo mtodo do MTT. Aps os
respectivos tratamentos, as fatias hipocampais foram incubadas com MTT (0,5 mg/ml em
tampo HEPES/salina) por 30 minutos a 37C. O MTT (brometo de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-
il]-2,5-difenil-tetrazolium = Thiazolyl blue) um sal de tetrazlio solvel em gua, o
qual convertido em um formazam prpura aps clivagem do anel de tetrazlio por
desidrogenases mitocondriais (Liu et al., 1997). O formazam solubilizado com a adio
de dimetil sulfxido (DMSO), formando um composto colorido cuja densidade ptica
30
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medida em 550 nm em uma leitora de placas de 96 poos. A atividade mitocondrial
(viabilidade celular) diretamente proporcional capacidade redutora sobre o MTT e,
portanto, produo de cromgeno.
3.5. Parmetros Antioxidantes
O hipocampo ou crtex cerebral foram homogeneizados em 300 l de tampo
HEPES 20 mM, pH 7,0 e centrifugados a 20.000 g por 30 min. O sobrenadante foi coletado
para as dosagens das enzimas antioxidantes.
3.5.1. Avaliao da Atividade Glutationa Peroxidase (GPx)
A GPx catalisa a reduo do H2O2, bem como de perxidos orgnicos, utilizando a
glutationa reduzida (GSH) como co-substrato para esta reao para produzir glutationa
oxidada (GSSG). A GSSG reduzida pela glutationa redutase com o consumo de NADPH
( = 6.220 M-1 cm-1), que pode ser acompanhado espectrofotometricamente em 340 nm
(Wendel, 1981; Floh & Gnzler, 1984). Para este ensaio, o meio de reao continha
tampo fosfato 0,1 M, pH 7,0, 1 mM EDTA, GSH 1 mM e NADPH 0,1 mM. Adicionou-se
amostra neste meio para mensurar o consumo inespecfico de NADPH atravs de uma
leitura por 2 min a 340 nm. Ao adicionar o substrato t-BOOH (hidroperxido de tert-butila)
1 mM, a leitura foi realizada por mais 2 min. Ao decrscimo de absorbncia por minuto
obtido descontou-se o consumo inespecfico de NADPH. O valor obtido foi dividido pelo
coeficiente de extino molar do NADPH ( = 6.220 M-1 cm-1) e multiplicado pelas
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diluies. O valor foi expresso como mUnidades/mg de protena. Uma Unidade
corresponde a 1 mol/ml/min.
3.5.2. Avaliao da Atividade Glutationa Redutase (GR)
A GR catalisa a reduo da glutationa oxidada (GSSG) atravs da oxidao do
NADPH. Ao utilizar o substrato GSSG, a enzima leva ao consumo de NADPH, que
acompanhado em 340 nm. A velocidade de consumo do NADPH, em condies de
saturao, expressa a atividade enzimtica (Carlberg e Mannervik, 1985). O meio de reao
continha tampo fosfato 0,1 M (pH 7,0), 1 mM de EDTA e NADPH 0,2 mM. Aps
adicionar a amostra, o consumo inespecfico de NADPH foi medido por 2 min a 340 nm.
Ao adicionar o substrato GSSG 1 mM, a leitura foi realizada por 2 min adicionais. Do
decaimento por minuto obtido descontou-se o consumo inespecfico de NADPH. O valor
obtido foi dividido pelo coeficiente de extino molar do NADPH ( = 6.220 M-1 cm-1) e
multiplicado pelas diluies. O valor foi expresso como mUnidades/mg de protena. Uma
Unidade corresponde a 1 mol/ml/min.
3.5.3. Avaliao da Atividade Glutationa S-Transferase (GST)
A GST catalisa a conjugao da GSH com o substrato sinttico 1-cloro-2,4-
dinitrobenzeno (CDNB) que produz um conjugado que detectado em 340 nm. A atividade
enzimtica proporcional velocidade de produo do composto conjugado (Habig &
Jakoby, 1981). Para este ensaio, o meio de reao continha tampo fosfato 0,1 M, pH 7,0, 1
mM de EDTA e GSH 1 mM. Foram feitas leituras independentes realizadas por 2 min para
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mensurar a velocidade da reao espontnea do CDNB com GSH, neste caso, sem a
presena da amostra. Depois de acrescentar a amostra e o segundo substrato (CDNB 1 mM)
ao meio de reao, realizou-se a leitura por 2 min a 340 nm. Ao decaimento por minuto
obtido com a amostra, descontou-se a velocidade da reao espontnea. O valor obtido pelo
coeficiente de extino molar do conjugado GSH/CDNB ( = 9.600 M-1 cm-1) foi
multiplicado pelas diluies. O valor foi expresso como mUnidades/mg de protena. Uma
Unidade corresponde a 1 mol/ml/min.
3.5.4. Avaliao da Atividade Catalase (CAT)
A alta velocidade de reao desta enzima, associada a uma baixa afinidade,
permite a determinao de sua atividade na presena de concentraes elevadas de H2O2
(10 mM). A atividade determinada pela velocidade de consumo da H2O2 no primeiro
minuto da reao. A leitura foi realizada em 240 nm (Aebi, 1984).
3.5.5. Avaliao da Atividade -Glutamil Transpeptidase (GGT)
A atividade da GGT foi analisada nos pellets das fatias submetidas
centrifugao, os quais foram ressuspensos em tampo HEPES 20 mM pH 7,0. Os tecidos
foram incubados com -glutamyl p-nitroanilide e o dipeptdeo glicil-glicina. A GGT
transfere a poro -glutamyl da -glutamyl p-nitroanilide. No processo de transferncia do
grupo gama-glutamil do substrato sinttico gama-glutamil-p-nitroanilida para glicil-glicina,
um cromforo formado e lido em 410 nm. A formao da cor diretamente proporcional
atividade da enzima (Meister et al., 1981; Griffith, 1981).
33
-
3.5.6. Mensurao dos Nveis de GSH Total (GSH-t)
O hipocampo e o crtex cerebral foram homogeneizados em cido perclrico (PCA)
0,5 M. As amostras foram centrifugadas por 2 min a 15.000 g, e o sobrenadante foi retirado
e diludo 10 vezes em tampo fosfato de potssio, 0,1 M, pH 7,0, para assim neutralizar a
amostra.
O mtodo utilizado enzimtico e foi originalmente descrito por Tietze (1969), e
posteriormente modificado por Akerboom e Sies (1981). Este mtodo cclico e detecta
tanto GSSG como GSH, definido como glutationa total (GSH-t). As leituras foram feitas
em espectrofotmetro a 412 nm por 2 min, contendo fosfato de potssio 0,1 M pH 7,0, 0,2
U/ml de GR, 0,1 mM DTNB, 1 mM EDTA e 0,2 mM NADPH. A concentrao de
glutationa foi obtida atravs da realizao de uma curva padro com concentraes
conhecidas de GSSG. Os valores so expressos em mol/g tecido fresco.
3.6. Dosagem de Protenas
Para a anlise atravs de Western Blotting, as protenas foram dosadas atravs do
mtodo de Peterson (1977). Sobre alquotas de 3l das amostras foram adicionados 397l
de gua e 400l do reagente de Lowry (0,2 N de NaOH, 2,5% de SDS, 5% de Na2CO3,
0,2% de CuSO4 e 0,1% de tartarato duplo de sdio e potssio). As amostras foram agitadas
imediatamente e deixadas em repouso por dez minutos. Em seguida foram adicionados 200
l do reagente de FOLIN 0,4 N, seguido de agitao imediata, e incubadas por 30 minutos.
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A leitura foi realizada em 750 nm e as concentraes foram obtidas atravs de uma curva-
padro utilizando albumina de soro bovino (BSA).
Para a anlise da atividade da glutationa e das enzimas antioxidantes, o contedo de
protenas foi quantificado pelo mtodo de Bradford (1976). A absorbncia foi lida em
espectrofotmetro a 595 nm, usando albumina de soro bovino como padro.
3.7. Separao de Protenas
As fatias hipocampais foram colocadas individualmente em tampo de amostra (4 %
de SDS, 50 mM de Tris e 100 mM de EDTA , pH 6.8) e aquecidas por cinco minutos para
permitir a solubilizao do tecido. Foram usados 100l de tampo de amostra por fatia.
Cada fatia hipocampal de animais de 14 dias tinha, em mdia, 150g de protena. Em
seguida foi adicionada a soluo de diluio de amostra (40% de glicerol, 25mM de Tris e
Bromofenol Blue; pH 6.8), numa proporo soluo de diluio/soluo de amostra de
25:100 (v/v), e 8% de -mercaptoetanol. As protenas (50g/poo) foram separadas por
eletroforese em minigel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE), usando gel de
separao a 10% e gel de entrada a 4% de acrilamida. A eletroforese foi realizada com
corrente fixa de 20 mA por placa e voltagem mxima de 140 V, por aproximadamente 2,5
h, em temperatura ambiente, utilizando-se o tampo superior (190mM de glicina, 25mM de
Tris e 0,1% de SDS) e o inferior (50 mM de Tris; pH 8.3). Aps a corrida, os gis foram
submetidos eletrotransferncia.
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3.8. Eletrotransferncia e Imunodeteco
Aps a eletroforese o gel foi fixado durante 1 hora em soluo fixadora (50% de
metanol e 8% de cido actico) e a seguir foi lavado com tampo superior de eletroforese
(25 mM de Tris, 190 mM de glicina e 0,1% de SDS) por 30 minutos. Aps esse perodo, o
gel foi equilibrado em tampo de transferncia (50 mM de cido Brico e 4 mM de EDTA;
pH 8.9) durante 30 minutos. As protenas foram transferidas do gel para a membrana de
nitrocelulose no sentido do plo negativo para o positivo, utilizando um sanduche
compreendido de espuma de suporte, papel filtro, gel, nitrocelulose, novamente papel filtro
e espuma de suporte. A transferncia foi realizada a 4C usando corrente de 400 mA por 3
horas em uma cuba contendo tampo de transferncia. Aps a eletrotransferncia, as
membranas foram coradas com soluo de Ponceau [0,5% de Ponceau (w/v) em 1% de
cido actico (v/v)] para controle da transferncia.
Para a imunodeteco as membranas foram lavadas primeiro com gua miliQ,
depois com TBS (10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7.5). A seguir foram bloqueadas
por 1 hora com 5% de leite desnatado em TBS em temperatura ambiente. Aps esse
primeiro bloqueio, as membranas foram lavadas por 3 vezes de 5 minutos com TBS-T
(Tween-20 0,05%, 10 mM de Tris e 150 mM de NaCl, pH 7.5) e submetidas a um segundo
bloqueio de 1 hora usando uma soluo de 1,5% de gelatina em TBS. As membranas foram
novamente lavadas 3 vezes (5 minutos cada) com TBS-T, para finalmente serem incubadas
com o anticorpo primrio anti-fosfo Akt (p-serina-473) durante 12-14h e anti-Akt total por
um perodo de 2 horas temperatura ambiente.
Aps as incubaes, as membranas foram novamente lavadas com TBS-T (4 vezes
de 5 minutos) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com anticorpos secundrios
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especficos (conjugados peroxidase). Para a imunodeteco, as membranas foram lavadas
4 vezes (5 minutos) com TBS-T e 2 vezes com TBS, sendo que as bandas correspondentes
s respectivas protenas foram reveladas utilizando kit ECL (quimiluminescncia)
conforme as recomendaes do fabricante. As medidas de fosforilao e/ou imunocontedo
das protenas foram realizadas atravs de densitometria. Para anlise de uma mesma
membrana com sucessivos anticorpos foi realizado o strip de membrana, que consistia na
sucessiva lavagem das membranas com: 1) gua milli-Q, 2) NAOH 0,2 M, 3) gua milli-Q
e 4) TBS-T (5 min em cada).
3.9. Anlise Estatstica
Os resultados foram analisados pelo teste ANOVA, seguido, quando apropriado, do
teste de Duncan. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0,05.
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4. RESULTADOS
4.1. Estudos in vivo
4.1.1. Glutationa total no hipocampo e no crtex cerebral de ratos
jovens tratados com ZnCl2 de forma aguda.
Os nveis de glutationa total (GSH-t) em resposta ao tratamento agudo com ZnCl2
(1, 4 ou 16 mg/kg) foram avaliados em hipocampo e crtex cerebral de ratos imaturos com
14 dias de idade (PN14). Os resultados mostraram que o tratamento com metal no causou
alterao significativa dos nveis de GSH-t em nenhuma das estruturas analisadas (Fig. 13).
Fig. 13. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens tratados com o metal de forma aguda. Os painis mostram os nveis de GSH-t em hipocampo (A) e crtex cerebral (B) de ratos tratados no 13 dia ps-natal (PN13) com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos foram avaliados no PN14. O contedo de glutationa expresso em mol/g tecido. Os valores representam as mdias + E.P.M. (n = 5 - 6). O tratamento no causou alterao significativa nos nveis de GSH-t nas regies estudadas.
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4.1.2. Enzimas antioxidantes em hipocampo e crtex cerebral de ratos
jovens tratados com ZnCl2 de forma aguda.
O tratamento agudo de ratos imaturos (PN13) com ZnCl2 aumentou
significativamente a atividade das enzimas antioxidantes GPx [F(3,18)= 4,57; p 0,05] e
GST [F(3,18)= 3,68; p 0,05] em hipocampo, quando comparados ao controle (Fig. 14 A e
B). O aumento foi de 55% e 36% para a atividade de GPx e GST, respectivamente, e foi
observado apenas na dose de ZnCl2 16 mg/kg. A atividade das enzimas catalase e
glutationa redutase (GR) no sofreu alterao significativa em resposta ao tratamento com o
metal (Figura 14 C e D). Avaliando o crtex cerebral os resultados mostraram que o
tratamento com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg) no alterou, de forma estatisticamente
significativa, a atividade das enzimas antioxidantes GPx, GST, catalase e GR (Fig. 15).
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Fig. 14. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no hipocampo, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C), glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados no 13 dia ps-natal (PN13) com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no PN14. A atividade da enzima antioxidante GPx (A) demonstrou um aumento de 55% em relao ao controle na dose de 16 mg/kg de ZnCl2. A atividade da enzima GST (B) demonstrou um aumento de 36% em relao ao controle, na dose de 16 mg/kg de ZnCl2. O perfil da atividade das enzimas catalase (C), bem como GR (D) no sofreu nenhuma alterao significativa. Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias dos valores + E.P.M. (n = 5 - 6). * P < 0,05 quando comparado ao grupo controle (soluo salina).
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Fig. 15. Efeito do tratamento agudo com ZnCl2 sobre a atividade de enzimas antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no crtex cerebral, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C), glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados no 13 dia ps-natal (PN13) com ZnCl2 (1, 4 e 16 mg/kg; i.p.). Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no PN14. Os valores de atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam a mdia + E.P.M. (n = 6).
4.1.3. Glutationa total no hipocampo e no crtex cerebral de ratos
jovens tratados com doses repetidas de ZnCl2.
Os nveis de glutationa total (GSH-t) em resposta ao tratamento com doses repetidas
de ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/kg), administradas em ratos imaturos do 8 ao 12 dia do perodo ps-
natal (PN8-12), foram avaliados no hipocampo e no crtex cerebral de animais no 14 dia
41
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ps-natal (PN14). Os resultados mostraram que o tratamento com ZnCl2 no causou
alterao significativa dos nveis de GSH-t no hipocampo ou crtex cerebral (Fig. 16).
Fig. 16. Efeito do ZnCl2 sobre os nveis de glutationa total (GSH-t) em ratos jovens tratados com doses repetidas do metal. Os painis mostram os nveis de GSH-t em hipocampo (A) e crtex cerebral (B) de ratos tratados com doses repetidas de ZnCl2. O tratamento compreendia a administrao i.p. de ZnCl2 (1, 2, e 4 mg/kg) no perodo do 8 ao 12 dia PN. Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no 14 dia PN. O contedo de glutationa expresso em mol/g tecido. Os valores representam as mdias + E.P.M. (n = 5 - 6). Os tratamentos no causaram alterao significativa nos nveis de GSH-t nas regies estudadas.
4.1.4. Enzimas antioxidantes em hipocampo e em crtex cerebral de
ratos jovens tratados com doses repetidas de ZnCl2.
O tratamento de animais jovens com administrao diria de ZnCl2, entre o 8 e 12
dias de vida ps-natal, aumentou significativamente em cerca de 52% a atividade de GPx
na dose de 4 mg/kg [F(3,20)= 3,37; p 0,05] e a atividade de GST em 31% e 28% nas doses
de 2 e 4 mg/kg [F(3,20)= 15,64; p 0,01], respectivamente (Figura 17 A e B) em relao ao
grupo controle.
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Os resultados tambm mostram que o tratamento com ZnCl2 (1, 2 e 4 mg/kg) no
alterou significativamente a atividade das enzimas antioxidantes GR e catalase no
hipocampo de ratos jovens tratados com zinco (Fig. 17 C e D).
Fig. 17. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas antioxidantes em hipocampo de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no hipocampo, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C) e glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados com doses repetidas de ZnCl2. O tratamento compreendia a administrao i.p. de ZnCl2 (1, 2, e 4 mg/kg) no perodo do 8 ao 12 dia PN. Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no 14 dia PN. O tratamento com ZnCl2 na dose de 4 mg/kg causou um aumento de cerca de 52% na atividade de GPx (A) e nas doses de 2 e 4 mg/kg causou aumento da atividade de GST em cerca de 30% (B). Nenhuma das doses de ZnCl2 testadas alterou a atividade das enzimas catalase (C) e GR (D). Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias dos valores + E.P.M. de seis experimentos (n = 6). * P < 0,05 e ** P < 0,01 quando comparado ao grupo controle (soluo salina).
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A atividade enzimtica de GPx, GST, catalase e GR no sofreu alterao no crtex
de ratos jovens por nenhum dos tratamentos com doses repetidas aplicados (ZnCl2 1, 2 e
4mg/kg) (Fig. 18 A - D).
Fig. 18. Efeito do tratamento com doses repetidas com ZnCl2 sobre a atividade das enzimas antioxidantes em crtex cerebral de ratos jovens. Os painis mostram a atividade, no crtex cerebral, das enzimas glutationa peroxidase (GPx) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), catalase (C) e glutationa redutase (GR) (D) de ratos tratados com doses repetidas de ZnCl2. O tratamento compreendia a administrao i.p. de ZnCl2 (1, 2, e 4 mg/kg) no perodo do 8 ao 12 dia PN. Os animais controle recebiam injeo de salina. Todos os grupos eram avaliados no 14 dia PN. Os tratamentos no modificaram a atividade no crtex cerebral de nenhuma das enzimas estudadas. Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias + E.P.M. (n = 6).
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4.2. Estudos in vitro com fatias hipocampais de ratos jovens
4.2.1. Enzimas antioxidantes em fatias de hipocampo tratadas com
diferentes concentraes de ZnCl2.
O tratamento in vitro de fatias hipocampais com ZnCl2 (10, 30, 100 M) diminuiu
significativamente a atividade de GR [F(4,37)=44,46; p 0,001] em todas as concentraes
testadas. O tratamento com ZnCl2 10 M causou uma reduo, em relao ao controle, de
27 % na atividade de GR. Na concentrao de ZnCl2 30 M, a atividade da enzima foi
reduzida em 49%, enquanto na concentrao de 100 M, a atividade enzimtica da GR foi
reduzida em 75%. Estes resultados indicam um forte efeito inibitrio do zinco sobre a
atividade de GR e dependente de concentrao (Fig. 19 D).
A atividade das enzimas antioxidantes GGT, GST e GPx tambm foi medida em
fatias hipocampais de ratos jovens tratados in vitro com zinco. Os resultados mostraram que
o tratamento com ZnCl2 (10 - 100 M) no alterou, de forma estatisticamente significativa
a atividade de nenhuma das enzimas estudadas (Fig. 19 A - C).
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Fig. 19. Atividade de enzimas antioxidantes de fatias hipocampais em resposta ao tratamento in vitro com ZnCl2. Fatias de hipocampo de ratos jovens foram expostas durante 2 h s concentraes indicadas de ZnCl2. Aps homogeneizao as fatias foram ensaiadas para medida da atividade das enzimas: -glutamiltranspeptidase (GGT) (A), glutationa S-transferase (GST) (B), glutationa peroxidase (GPx) (C) e glutationa redutase (GR) (D). A atividade de GR foi fortemente reduzida pelo ZnCl2 de forma dose dependente. Os dados esto expressos como percentagem do controle (100 %). Os valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos como mU/mg de protena. As barras representam as mdias + E.P.M. (n = 5-8). A mdia + E. P. M. da atividade das enzimas antioxidantes no grupo controle foram: GGT 3,39 0,15; GST 34,62 3,99; GPx 7,18 1,74; e GR 17,2 0,71 mU/g . *** P < 0,001 quando comparado ao grupo controle.
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4.2.2. Avaliao da viabilidade celular em fatias hipocampais expostas
ao ZnCl2.
Os resultados mostraram que o tratamento com ZnCl2 diminuiu a viabilidade celular
em fatias hipocampais de forma dependente de concentrao quando comparado aos
grupos-controle. O ZnCl2, aps 2 horas de incubao na concentrao de 100 M, diminuiu
significativamente, em 20%, a viabilidade celular [F(4,26)= 7,13; p 0,001] (Fig. 20). ZnCl2
10 e 30 M no causaram modificao significativa da viabilidade celular. ZnCl2 300 M
causou um efeito similar ao ZnCl2 100 M. Com base nestes dados e considerando os
possveis nveis sinpticos do metal (Frederickson et al., 2005), optamos por utilizar ZnCl2
100 M como concentrao mxima de metal, nos estudos de modulao de vi