1

Enzimska dijagnostika

oboljenja mišića

Predavanja iz kliničke enzimologije

Integrisane akademske studije: Farmacija- medicinska biohemija

Školska 2014/2015. godina

2

Mišićni enzimi

• Kreatin kinaza

• Glikogen fosforilaza

• Aldolaza

• Laktat dehidrogenaza

• Aspartat aminotransferaza

3

Glikogen fosforilaza

• EC 2.4.1.1;

• 1,4-alfa-D-glukan: ortofosfat alfa-D-glikoziltransferaza;

• Skraćenica GP

• Igra ključnu ulogu u metabolizmu ugljenih hidrata jer mobiliše

glikogen

• Katalizuje prvu rekciju u glikogenolizi u kojoj se glikogen prevodi u

glukozu-1-fosfat

4

Mehanizam reakcije

glikogen fosforilaze

5

Glikogen fosforilaza

Struktura i izoenzimi GP

• GP postoji kao dimer i sastoji se iz dve identične subjedinice

• U humanom organizmu postoje tri izoenzima:

• GP-LL, GP-MM i GP-BB.

Distribucija izoenzima:

• GP-LL u jetri

• GP-BB u humanom mozgu

• U srcu su GP-BB i GP-MM, ali dominantan izoenzim je GP-BB.

R i T stanje glikogen fosforilaze

6

Glikogen fosforilaza

• Uloga mišićne glikogen

fosforilaze

• obezbedjuje dovoljno energije za

mišićnu kontrakciju

• Lokacija u miocitima

• asocijacija sa glikogenom i

sarkoplazmatičnim retikulumom i

gradi makromolekulski kompleks.

• Stepen asocijacije GP sa ovim

kompleksom zavisi od

metaboličkog stanja mišića

Kada dođe do tkivne hipoksije, glikogen se razlaže i nestaje, GP postaje

rastvorljiv i može da se pomera sa odeljka peri-sarkoplazmatičnog retikuluma

direktno u ekstracelularnu tečnost

7

Klinički značaj određivanja glikogen fosforilaze i

njenog izoenzima BB

• Preliminarna ispitivanja su polazala:

• GP-BB senzitivniji od CK i CK-MB za dijagnozu AIM u toku prvih 4

sata od pojave bola u grudima

• Rani marker akutnog infarkta miokarda

• Slično drugim citoplazmatičnim proteinima kao što su mioglobin i

CK-MB, dinamika GP-BB može biti pod uticajem reperfuzije

koronarne arterije, sa mnogo bržim povećanjem i većim pikom.

• GP-BB nije specifičan protein za srce

• primena ograničena

8

Klinički značaj određivanja glikogen fosforilaze BB

u akutnom infarktu miokarda

Dinamika promena GP BB

9

Klinički značaj određivanja glikogen fosforilaze BB

u akutnom infarktu miokarda

10

Metode određivanja glikogen fosforilaze i

izoenzima glikogen fosforilaze BB

1. Određivanje aktivnosti glikogen fosforilaze

a. Metode se zasnivaju na određivanju glukoze-1-fosfata u

kuplovanim reakcijama

2. Separacija i određivanje izoenzima GP BB

a. Elektroforetsko razdvajanje izoenzima GP-BB

b. Novija metoda imunoenzimsko određivanje

– Gornja referentna vrednost ovog eseja je 7 µg/L

11

Aldolaza

• EC 4.1.2.13;

• D-fruktoza-1,6-difosfat-D-gliceraldehid-

3-fosfat-lijaza;

• Skraćenica ALD

• Ovaj enzim katalizuje reakciju hidrolize

tj prevođenja fruktoza-1,6-difosfata u D-

gliceralaldehid-3-fosfat (GLAP) i

dihidroksiaceton (DAP), važne reakcije

u glikolitičkom razlaganju glukoze do

laktata.

12

13

Aldolaza

• Struktura i genetika

• ALD je tetramer sa subjedinicama koje su određene sa tri različita

genska lokusa.

• Dva lokusa produkuju A i B subjedinice, koje su aktivne u većini

tkiva

• 5 izoenzima od kombinacija A i B subjedinica

• dva odgovaraju A i B homopolimerima

• Izoenzimski profil mozga

– C subjedinica je aktivna samo u mozgu

– Zajedno sa A subjedinicom

– 5 izoenzima (dva homopolimera)

14

Klinički značaj aldolaze

• Serumska ALD ima klinički značaj kod primarnih bolesti

skeletnih mišića.

• Neki istraživači smatraju da povećane aktivnosti ALD se mogu

koristiti za razlikovanje neuromuskularne atrofije od miopatije u

kombinaciji sa odnosom CK/AST.

• Generalno merenje ALD ne pruža dodatne informacije u odnosu

na druge enzime prevashodno CK.

• Ispitivanja su pokazala da određivanje ALD nema benefita u

odnosu CK u evaluaciji pacijenata sa suspektnim oboljenjem

mišića.

15

Metode određivanja aktivnosti aldolaze

• Sve metode određivanja se zasnivaju na reakciji cepanja F-1,6-difosfata.

• Postoje 2 grupe metoda:

– fotometrijska sa fiksnim vremenom i

– kontinuirana

• Osnovna reakcija za određivanje aktivnosti ALD se nadovezuje na dve

kuplovane enzimske reakcije

• Warburgov optički test

• Triozafosfat izomeraza (EC 5.3.1.1) se dodaje kako bi se GLAP brzo

konvertovao u DAP

• Glicerol-3-fosfat dehidrogenaza (EC 1.1.1.8) se dodaje da redukuje DAP u

glicerol-3-fosfat, sa NADH koji deluje kao donor hidrogena

• Meri se porast koncentracije NADH

16

Određivanje aktivnosti aldolaze

Stabilnost enzima

• ALD aktivnost je dosta stabilna

• Aktivnost se ne menja na sobnoj temperaturi do 48 sati i na 4o C

nekoliko dana.

• Hemolizirani uzorci ne treba da se koriste

• Plazmi se daje prednost u odnosu na serum zbog mogućeg otpuštanja

enzima iz trombocita u toku koagulacije.

Referentne vrednosti

• Odrasli: 2,5 do 10 U/L na 37o C

• postoje razlike po polu, muškarci imaju više vrednosti

• novorođenčad imaju 4x veću aktivnost

• deca 2x veću u odnosu na starije

• U pubertetu se dostižu vrednosti kao kod odraslih