6a. enzimi ctf 2014
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ENZIMI
catalizzatori organici per lo più di natura proteica
• a differenza dei catalizzatori inorganici sono altamente specifici nei confronti del reagente (substrato) e nel tipo di reazione catalizzata
Enzimi (nel fermento)
• sono necessari in piccole quantità in quanto il processo catalitico non comporta modificazioni permanenti della molecola enzimatica NON SONO COMPONENTI STECHIOMETRICI delle REAZIONI in cui INTERVENGONO
• accellerano la velocità di una reazione senza alterarne la costante di equilibrio
Fino a 10 14
p-nitrofenil fosfato p-nitrofenolo (PN)
02N PO4 PO4 OH +
02N
PNP
P+
substrato
prodotti
PN fosfato libero
reagente
PNP
P+
prodotti
PN fosfato libero
enzima
•accellerano la velocità di una reazione senza alterarne la costante di equilibrio
Come misurereste la velocità della reazione PNP PN ?
V= [nmol PN /min ]
[PN ] µ 0
0
Reazione non catalizzata
3
1.5
P
P
P
P
Reazione catalizzata
P
PP
P
P
0
0
[PN ] 0
V=
[n
mo
l P
N /
min
)
0
[PN ]
la velocità della reazione non
aumenta in maniera indefinita
all’aumentare del substrato
3
1.5
Reazione non enzimatica
A B
[A]
V
Reazione enzimatica
[S]
Vo
Cinetica ordine 0
Cinetica primo ordine
S E K1
K2
K3
K4
ES E + + P
Complesso
Enzima -Substrato Substrato
+ K1
K2 Enzima
Prodotto
P
+
K3
K4
Enzima
Fasi di una reazione enzimatica
Evidenze sperimentali dell’esistenza del
complesso enzima-substrato
• cristallografia a raggi X
• modifiche spettro assorbimento dell’enzima
• modifica altre proprietà chimico-fisiche dell’enzima
(i.e. solubilità)
• isolamento del complesso enzima-substrato
• ha struttura tridimensionale (garantisce specificità)
SITO ATTIVO
• rappresenta una piccolissima
parte dell’enzima (1-2%)
• è in genere una cavità da cui è esclusa l’acqua
Include sia gli amminoacidi implicati nel legame del substrato (SITO DI LEGAME) sia quelli responsabili del processo catalitico (SITO CATALITICO)
SITO ATTIVO
Legami enzima-substrato
Le interazioni tra l’enzima ed il substrato sono in genere di tipo debole:
legami idrogeno interazioni elettrostatiche forze di van der Walls
Più raramente di tipo covalente
Nome sistematico • il nome del substrato o substrati
• il tipo di reazione catallizzata (-asi) (Lattico:NAD ossidoreduttasi)
Nome raccomandato: es. Lattico deidrogenasi)
Enzyme Commission Number: es. E.C.1.1.1.27
L'enzima può essere identificato mediante:
E.C. n1.n.2.n3.n4
1. tipo di reazione
2. tipo di substrato
3. tipo di accettore, o gruppo rimosso
4. numero di serie identificante l'enzima
IN CHE MODO GLI
ENZIMI ACCELLERANO
UNA REAZIONE?
+ +
Perchè una reazione avvenga….
……è necessario ……………
1. che i reagenti collidano
2. che collidano nel giusto orientamento
Perchè una reazione avvenga è necessario :
3. che i reagenti posseggano sufficiente energia per superare il livello energetico dello stato di transizione
tensione dei vecchi legami e incompleta formazione dei nuovi legami
Perchè una reazione avvenga è necessario :
Gli enzimi accelerano le reazioni
TERMODINAMICAMENTE possibili ( G<0) in quanto
consentono la formazione di stati di transizione
a più basso contenuto energetico :
“abbassano l’energia di attivazione”
in quanto consentono la formazione di stati di
transizione a più basso contenuto energetico….
• via polarizzazione dei legami da
rompere
• via stabilizzazione dello stato di
transizione (legami deboli)
• riducendo la solvatazione dei
reagenti
“Il potere catalitico degli enzimi deriva dall’energia
rilasciata durante la formazione di legami e
interazioni deboli tra l’enzima e il substrato
ENERGIA DI LEGAME
(interazioni ottimali allo stato di transizione)”
L’ENERGIA DI LEGAME
<<forza trainante la catalisi>>
L’ Energia di legame contribuisce sia alla catalisi che
alla specificità
“Il potere catalitico degli enzimi deriva dall’energia
rilasciata durante la formazione di legami e
interazioni deboli tra l’enzima e il substrato
ENERGIA DI LEGAME
L’ENERGIA DI LEGAME
<<forza trainante la catalisi>>
L’ Energia di legame contribuisce sia alla catalisi che
alla specificità
(interazioni ottimali allo stato di transizione)”
Modelli interazione Enzima-substrato
Chiave-serratura
Sito attivo complementare al substrato
Adattamento indotto
Più comunemente usata : International Unit ( IU)
1.0 IU = la quantità di enzima in grado di convertire
1.0 mmole di substrato in prodotto in 1 minuto in
condizioni standard (specificate)
ed a [substrato] >> [enzima]
In teoria ciascun laboratorio può
stabilire la propria “unità”
UNITA’ ENZIMATICA
1.0 katal = that amount of enzyme that will convert
1.0 mole of substrate to product in 1 second
given the initial [substrate] >> [enzyme]
and all relevant conditions stipulated
1.0 DEA Unit = that amount of phosphatase that will
hydrolyze 1.0 mmole of PNP per min
@ 370C in diethanolamine buffer at
pH 9.6. Initial [PNP] 6.0 mM
In teoria ciascun laboratorio può stabilire la propria “unità”
Standard” UNIT = that amount of phosphatase that will
produce 1.0 mmole of PN per min @
room temperature in TRIS-HCl buffer
at pH 7.5. Initial [PNP] 50 mM
Catalisi
acido-base
Catalisi
acido-base
Ossicatione instabile
Generale
donatore/accettore di protoni
diverso dall’acqua
Specifica
l’acqua è donatore/
accettore di protoni
Come è possibile che uno stesso aa
possa agire da acido o base?
Aspartil-proteasi:
pepsina, catepsina D
Anche la dissociazione
dell’acqua è guidata dall’Asp
Catalisi covalente: Serin-proteasi
His
R1-COO- +
+
R2-NH2
Serin-proteasi : Chimotripsina
Catalisi covalente: Cistein-proteasi:
catepsina B, caspasi, calpaina
Catalisi covalente: Cistein-proteasi:
catepsina B, caspasi, calpaina
H2O
ossianione
ossianione
Catalisi da metallo: Metalloproteinasi
(carbossipeptidasi A)
Gly-Phe
da rompere
Aa leganti lo Zn++
Aa implicati nella catalisi
Cofattori molecole non proteiche che partecipano al processo catalitico e che come l’enzima non risultano modificati alla fine del processo
a) ioni metallici
• gruppi prostetici (Apo ed Olo enzima)
• coenzimi (in alcuni casi risultano modificati alla fine del processo
catalitico, ma esistono processi metabolici che ne consentono
il riciclaggio)
b) molecole organiche
a) ioni metallici
Zn Fattori trascrizionali (proliferazione cellulare)
Risposta immunitaria
Coinvolto come cofattore in 200 processi enzimatici
Fe Sintesi collagene (idrossilazione lisina e prolina)
Amplifica l’attivita’ leucocitaria
Cu Favorisce legami crociati nella genesi del collagene
Forma metallo enzimi (ossidasi) essenziali
per il metabolismo energetico tessutale connettivale
Se, Mn, Mg
Cofattori molecole non proteiche che partecipano al processo catalitico e che come l’enzima non risultano modificati alla fine del processo
a) ioni metallici
• gruppi prostetici (Apo ed Olo enzima)
• coenzimi (in alcuni casi risultano modificati alla fine del processo
catalitico, ma esistono processi metabolici che ne consentono
il riciclaggio)
b) molecole organiche
I coenzimi sono derivati di vitamine: ……
- sono ESSENZIALI per la sopravvivenza
- sono di NATURA ORGANICA
- sono necessarie in PICCOLE QUANTITA’
- devono essere introdotte con la DIETA
VITAMINA : “ammina della vita” (Fuck, 1912)
FUNZIONE: preminentemente coenzimi
FUNZIONE: varie (para-ormoni, biosegnalatori, antiossidanti, etc.)
TIAMINA ( Vitamina B1)
Vitamine del gruppo B
RIBOFLAVINA (Vitamina B2)
ACIDO PANTOTENICO ( Vitamina B5)
PIRIDOSSINA (Vitamina B6)
ACIDO FOLICO (Vitamina B9)
COBALAMINA (Vitamina B12)
BIOTINA (Vitamina H, B8)
NIACINA ( Vitamina B3, Vitamina PP)
Vitamina C
RDA (recommended daily intake) U.S. Food and Nutrition Board of the National Research Council
Tiamina (B1) 0.5- 1.5 mg
Riboflavina (B2) 1.4- 1.8 mg
Niacina (B3,PP) 9- 10 mg
Acido pantotenico (B5) -- --
Piridossina (B6) 2- 2.6 mg
Biotina (B8, H) 30- 60 mg
Acido folico (B9 M o Bc) 0.1- 0.2 mg
Cobalamina (B12) 4-6 mg
Acido ascorbico (C) 30- 100 mg
Vit. A 600 RE (1 RE=1 mg RetOH)
Vit. D < 10 mg
Vit. E 15 mg
Vit. K 10 mg
(fillochinone)
LE VITAMINE IDROSOLUBILI SONO quasi sempre
PRECURSORI DEI COENZIMI
Tiamina (B1) Tiaminapirofosfato
Riboflavina (B2) Flavinadenindinucleotide (FAD),
flavin mononucleotide (FMN)
Niacina (B3,PP) Nicotinammide dinucleotidi (NAD)
Acido pantotenico (B5) Fosfopanteteina (CoA, ACP)
Piridossina (B6) PiridossalP
Biotina (B8, H) legata all’enzima
Acido folico (B9 M o Bc) Tetraidrofolico
Cobalamina (B12) legata all’enzima
Acido ascorbico (C) ---------
STRATEGIA n. 7
Intrappolamento nutrienti all’interno della cellula
A
A A-x
VITAMINE LIPOSOLUBILI
Vitamina A Retinolo
Vitamina K fillochinone, menadione, etc.
Vitamina D2 ergocalciferolo Vitamina D3 colecalciferolo
Vitamina E , , , - tocoferolo
Ribozimi