Enzimi di restrizione

• riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento.

• Queste sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.

-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile

-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti

-Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi).

Il nome deriva dal batterio da cui è stato isolato:EcoRI E = genere Escherichia

co = specie coli GAATTC R = ceppo RY13 CTTAAG I = prima endonucleasi isolata

BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens GGATCC H = ceppo H CCTAGG I = prima endonucleasi isolata

Simmetria binaria

Tipi di taglio

• -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO • Es. SmaI• 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’• 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’

• -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE:• -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE)• -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE)

– Es. Eco RI (5’ PROTRUDING)• 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’• 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’

– Es. Kpn I (3’ PROTRUDING)• 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’• 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’

Quante volte taglia un enzima

• Probabilità di trovare un sito di restrizione:

• basi probabilità

• 4 (1/4)4 = 1/256

• 5 (1/4)5 = 1/1024

• 6 (1/4)6 = 1/4096

• 8 (1/4)8 = 1/65536

DNA ligasi

defosforilazione

Gel elettroforesi

Southern blot

• Il Southern Blot è una tecnica che permette di identificare la presenza del frammento di DNA che a noi interessa tra una miscela di tantissimi frammenti.

Chimica del DNA

• Soluzione viscosa a pH 7• Diminuzione viscosità a pH estremi o a

T> 80°C• Denaturazione ( aumento D.O)• Rinaturazione (diminuzione D.O.)• Formazione di ibridi anche tra catene di

specie diverse• I nucleotidi vanno incontro a

trasformazioni chimiche (mutazioni)

DENATURAZIONE E RINATURAZIONE

La denaturazione del DNA consiste nella separazione completa dei due filamenti complementari che lo costituiscono. Il processo inverso è detto rinaturazione.

ANALISI FISICA

Effetto ipercromico:Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA.

Temperatura di melting (Tm):Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%.

Maggiore è G+C, maggiore è Tm.

Gra

do d

i d

en

atu

razi

on

e

(%)

40 60 80 100

50

0

1.3

1.2

1.1

1.0

Temperatura (°C)

Assorb

an

za a

26

0 n

m

Tm

Curva di fusione

CINETICA di RINATURAZIONE

Effetto ipocromico:

Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA.

Parametri che influenzano la rinaturazione:

1) C0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume

2) Tempo

La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA

Log CotR

inatu

razi

on

e (

%)

DNA arinaturazionerapida

0

50

100

-2 -1 0 1 2 3 4 5

Curva C0t

DNA arinaturazionelenta

forma A forma B forma Z

Senso elica destrorsa destrorsa sinistrorsa

Diametro 26 A 20 A 12 A

Coppie di basiper ogni girodi elica 11 10.5 12

Distanza tra basi 2.6 A 3.4 A 3.7 A

Piegamento basirispetto all’assedell’elica 20° 6° 7°

Conformazionedello zucchero C-3’ endo C-2’ endo C-2’ endo per pirimidine

C-3’ endo per purine

ConformazioneLegame glucosidico anti anti anti per pirimidine

sin per purine

Cot

Fig. 13 Curva di Cot

% ss DNArimanente

SONDE E MARCATURA

• La sonda è un frammento specifico di DNA (o RNA), reso radioattivo, capace di riconoscere una sequenza complementare di DNA o RNA in una popolazione di tanti frammenti.

Metodi di marcatura

• Nick transaltion

• Random priming

• Marcatura terminale

5’P -3’OH

3’OH -5P’

nick con un -OH disponibile

5’P -3’OH

3’OH -5P’

5’P -3’OH

3’OH -5P’

5’P -3’OH

3’OH -5P’

L’attività 3’5’ esonucleasicarimuove il nucleotide

L’attività 5’3’ polimerasicasostituisce il nucleotide

L’attività 5’3’ esonucleasicasposta il nick verso il 3’

-3’OH5’P

3’OH -5P’

Denaturazione ed appaiamento

degli esanucleotidi casuali

5’P -3’OH

3’P 5’OH

Enzima Klenow + dNTP*

5’P -3’OH

3’P 5’OH

MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE

RANDOM PRIMING Metodo dell’innesco casuale

NICK TRANSLATIONSpostamento dell’incisione

3’- -5’

-3’3’- -5’5’-

DNA

denaturazione

aggiunta di inneschi esanucleotidici3’-GCATGC-5’

5’-TGCAGT-3’

5’-GCATAC-3’

3’-TAGCAG-5’

ibridizzazazione

-3’5’-3’-TAGCAG-5’3’-TAGCAG-5’

-5’3’-

5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’

Frammento di Klenow,dNTP

dATP32P-dCTP

dTTPdGTP Sintesi DNA

-3’5’-3’-TAGCAG-5’

-5’3’-

5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’

3’-TAGCAG-5’

DNA sonda

marcato

denaturazione

riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del

nucleotide successivo

-3’3’- -5’5’-

DNAG C G C A A G

C G C G T T C

-3’3’- -5’5’- G G C A A G

C G C G T T C

-3’

3’- -5’5’- G C C A A G

C G C G T T C

-3’3’- -5’5’- G C G A A G

C G C G T T C

-3’3’- -5’5’- G C G C A G

C G C G T T C

32P-dCTP

32P-dCTP

dGTP il taglio si muove in direzione 5’-3’

taglio di un’elica e rimozione di un nucleotide

mediante la DNA polimerasi I

Pol I

3’OH -5P’

5’P -3’OH

Trattamento con fosfatasi

3’OH -5’OH

5’OH -3’OH

Polinucleotide chinasi+[32P]dATP

3’OH -5P’

5’P -3’OH

• I tipi di marcatura non radioattiva sono essenzialmente:

• -marcatura isotopica diretta (incorporazione di nucleotidi modificati conteneti un fluorocromo, cioè un gruppo chimico in grado di emettere fluorescenza se esposto alla luce di una certa ;

• -marcatura indiretta ( associazione tra una molecola indicatrice e un precursore nucleotidico).

• I sistemi più usati sono:• -Il sistema biotina-streptavidina

-La digossigenina

HN

O

O NdUTP

Uracile

Desossiribosio

Trifosfato

HN

O

S

NH

Biotina

Uracile

C U C G A G A U G U C A UG A G C T C T A C A G T A

B B B B

DNA sonda

DNA target

A U G U CT A C A G

B B

EA

EA

A U G U CT A C A G

B B

FA

FA

Ibridazione del DNA sonda colDNA bersaglio dei cromosomi

(A) Avidina-enzima (B) Avidina-fluoroforo

PRINCIPIO DELLE SONDE NON RADIOATTIVE:

Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina

E = molecole reporter fosfatasi alcalina o -galattossidasi

F = molecole reporter

Ibridazione

• L’ibridazione è quel processo per cui due filamenti di DNA (o RNA) possono appaiarsi e formare un ibrido (doppia elica) più o meno stabile mediante la formazione di legame idrogeno per un certo numero di basi complementari.

• L’ibrido può formarsi tra DNA/DNA e DNA/RNA.

• L’ibridazione può avvenire anche tra molecole di DNA non perfettamente complementari.

• Sono molto importanti le condizioni sperimentali.

Condizioni stringenti• Vengono definite condizioni stringenti, quelle condizioni

sperimentali che permettono la migliore ibridazione.

• Condizioni di ibridazione piu’ stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio):– maggiore Temperatura– minore concentrazione salina– presenza di denaturanti chimici

• Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio):– minore Temperatura– maggiore concentrazione salina– assenza di denaturanti chimici

Mappe di restrizione in diagnostica

...MAPPATURA di RESTRIZIONE

62 1

A B

TRATTAMENTO DIMENSIONE deiFRAMMENTI (Kb)

INTERPRETAZIONE

Nessuna digestione

Enzima A

Enzima B

Enzima A+ B

9

A

2 7

A

3 6

B

A

36

B

4 3

A B

2

9

2 + 7

3 + 6

2 + 3 + 4

1 + 2 + 6

Sequenziamentocon isotopi radioattivi

a = adeninac = citosinag = guaninat = timina

g t a c g t a c g t a c g t a c

MICROSATELLITE

ripetizione: adenina e citosinaacacacacacacacacacacacacacacac

dinucleotide :(ac)15

SanguePeli Seme

1) ESTRAZIONE DEL DNA

Doppia

Elica

DNA

Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo

3 paia di cromoso

mi

omologhi

2) PCR Polymerase Chain Reaction

3) ELETTROFORESI

Sequenziatore Automatico

Immagine Computerizzata dell’ elettroforesi

Elettroferogrammadi un campione con 12 microsatelliti

PADRE

MADRE

FIGLIO

FIGLIO

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GENOTIPO: 263/263

DIAGNOSI POSITIVA

Profilo genetico di un campione

MADRE

FIGLIO

PADRE

FIGLIO

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263

263 277

263

263 277

MADRE

FIGLIO

FIGLIO

PADRE

FIGLIO

GENOTIPO: 128/140

GENOTIPO: 128/146

GENOTIPO: 128/128

GENOTIPO: 124/128

GENOTIPO: 128/128

128 140

128 146

128

124128

128

DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA