11

Sveuilite u SplituPrirodoslovno-matematiki fakultet

Odjel za kemiju

prof. dr. sc. Maja Pavela-Vrani

enzimi su PROTEINI

Svojstva enzima:

golema KATALITIKA MO ubrzavaju kemijske reakcije 106 do 108 puta

VISOKOSPECIFINI kataliziraju samo jednu reakciju ili skup srodnih

reakcija

2

j apsolutna stereospecifinost

nema sporednih produkata aktivnost se moe regulirati

2 In vivo kataliziraju hidrolizu peptidne veze

Specifinost proteolitikih enzima

In vitro kataliziraju srodnu reakciju, hidrolizu esterske veze

Razlikuju se po stupnju specifinosti prema supstratu

mjesto hidrolize tripsinom mjesto hidrolize trombinom

3

LIZINili

ARGININARGININ GLICIN

International Union of Biochemistry

Podjela i nazivi enzima

yEnzyme Commission (EC)

enzimi se dijele prema VRSTI REAKCIJE koju kataliziraju

6 osnovnih skupina koje se dijele na podskupine

NAZIV ENZIMA odreuje se prema supstratu i reakciji

4

koju kataliziraju, uz sufiks aza ATPaza : razgrauje ATP ATP sintaza : sintetizira ATP

3NAZIV VRSTA REAKCIJE1 k id d kt k id ij d k ij

Osnovne skupine enzima

1. oksidoreduktaza oksidacija-redukcija

2. transferaze prijenos skupina

3. hidrolaze reakcije hidrolize (prijenos funkcionalne skupine na vodu)

4. liaze adicija ili eliminacija skupina radi stvaranja dvostruke veze

5

5. izomeraze izomerizacija (intramolekulskiprijenos skupina)

6. ligaze vezanje dvaju supstrata na teret hidrolize ATP

Oznaka od 4 broja kojoj prethodi kratica EC

Klasifikacijski broj enzima

j j j p

Primjer: nukleozid-monofosfat-kinaza EC 2.7.4.4.

Katalizira:ATP + NMP ADP + NDP

1. broj: klasa (transferaza)

2 b j dkl ( f k j i f f k i )

6

2. broj: podklasa (transferaza koja prenosi fosfatnu skupinu)

3. broj: skupina (fosfatna skupina kao akceptor)

4. broj: preciznije opisuje akceptor (nukleozid monofosfat)

4Prijelazno stanje)

Reakcijska kinetikaENERGIJA AKTIVACIJE G#

energija koja je potrebna da bi d l d t b kt t

Energija aktivacijeG#]

Slobodna energijareakcije G

j j

dn

a en

erg

ija

(G)

SLOBODNA ENERGIJA REAKCIJE G

G G G

dolo do pretvorbe reaktanata u produkte

G# = Gprijelazno stanje Gsupstratodreuje brzinu reakcije

7

reakcije G

Slo

bo

d

Tijek reakcije

G = Gprodukata - Greaktanatane zavisi od puta tj. molekulskog mehanizma pretvorbe

ne daje podatke o brzini reakcije

odreuje spontanost, odnosnosmjer reakcije

Prednost enzimske katalize pred kemijskom katalizom

KEMIJSKA kataliza esto zahtijeva: visoku temperaturu tlak ekstremne pH vrijednosti

8

ENZIMSKI katalizirane reakcije odvijaju se u blaim reakcijskim uvjetima enzimska kataliza uinkovita je u fiziolokim uvjetima

(pH=7, T=37 oC)

5Enzimi ubrzavaju kemijske reakcijetako to smanjuju energiju aktivacije

Enzimi olakavaju nastajanje ij l t j

Energija aktivacijenekatalizirane reakcije G#]

Energija aktivacijekatalizirane reakcije

Slobodnaenergija

reakcije G

dn

a en

erg

ija

(G)

reaktanti

prijelazno stanje!

supstratiprodukti

prijelaznog stanja

9

Tijek reakcijeSlo

bo

d

produkti

supstrati: reaktanti u enzimskikataliziranim reakcijama

k1, k-1 = konstante brzine

Temeljna svojstva enzimske katalize

k1 k-1A B K =

k-1 k1

enzimi jednako ubrzavaju reakciju u oba smjera

b j ti j

kemijske reakcije

Ea kataliziranepovratnereakcije

Ea nekataliziranepovratne reakcije

Ea nekataliziranereakcije

Ea kataliziranereakcije

10

ubrzavaju postizanje ravnotee, ali ne mijenjajupoloaj ravnotee

enzimi ubrzavaju samo termodinamiki povoljne reakcije (G < 0)

reaktantiprodukti

Tijek reakcije

6 katalizirana reakcija

Enzimski katalizirane reakcije najee se odvijajuu vie reakcijskih stupnjeva

jprolazi kroz nekoliko prijelaznih stanja (TS1, TS2, TS3)

ukupnu brzinu reakcije odreuje najsporiji stupanj stupanj s najveom energijom aktivacije

odn

a en

erg

ija

(G)

11

Slo

bo

Tijek reakcije

Stvaranje enzim-supstrat kompleksaprvi je korak u enzimskoj katalizi

reakcija enzima i supstrata je vrlo specifina

supstrat se vee za specifino mjesto na enzimu: AKTIVNO MJESTO

ES kompleks pribliava supstrate te ih povoljno orijentira za reakciju

supstrat

12

interakcija enzima i supstrata u aktivnom mjestu potie stvaranje prijelaznog stanja

7Model klju-brava (1890.)

Emil Fischer1852 1919

ES kompleks

1852-1919.

enzim

supstrat

aktivnomjesto

13

Aktivno mjesto enzima ima strukturukomplementarnu strukturi supstrata

Model izazvanog pristajanja(1958.) Daniel Koshland

1920-2007.

supstrat

ES kompleksglukoza-heksokinaza

14

enzim

Komplementarni oblik aktivnog mjestastvara se tek nakon vezanja

supstrata na enzim

glukoza heksokinazakompleks

8Svojstva:

zauzima mali dio enzima

Aktivno mjesto enzima

zauzima mali dio enzima

trodimenzionalni procjepi iliutori u strukturi enzima

sadri vezne AK koje veu supstrate i kofaktore slabim silama

sadri katalitiki znaajne AKkoje s djel j nastajanj i

15

koje sudjeluju u nastajanju i kidanju kemijskih veza

specifinost vezanja ovisi oprecizno odreenom rasporeduatoma u aktivnom mjestu

Aktivno mjesto ukljuuje AK koje sumeusobno udaljene u primarnoj strukturi

3D struktura

Aktivno mjestogoveeg

kimotripsina

3D struktura

161 57 102 189 195 216 226 245193

1 57 102 189 195 216 226 245193

primarnastruktura

9Supstrat se vee za enzim slabim silama

Neuraminidaza u kompleksusa sijalinskom kiselinom vodikovevezeveze

17

ES kompleks tvore slabe nekovalentne interakcije izmeuveznih aminokiselinskih ostataka u aktivnom mjestu enzima

elektrostatske interakcije (6 kJ/mol) ovise o

Reverzibilne interakcije u ES kompleksu

elektrostatske interakcije (6 kJ/mol) ovise o elektrinom naboju ioniziranih skupina enzima i supstrata

H-veze izmeu proton donora i proton akceptora

van der Waalsove interakcije (2-4 kJ/mol) kao posljedica asimetrine raspodjele elektronskog oblaka

18

hidrofobne interakcije: asocijacija nepolarnih molekula poveava entropiju vode

10

sudjeluju u KIDANJU i NASTAJANJU kovalentnih veza

Katalitiki aminokiselinski ostaci

j j stabiliziraju prijelazno stanje

19

Enzimska kinetika

prua informaciju o BRZINI enzimski katalizirane reakcije

mjeri AFINITET enzima prema supstratuili inhibitoru

id k ij ki

20

prua uvid u reakcijski MEHANIZAM

11

k1

Brzina kemijske reakcije

Reakcija A + B C + Dk-1

Brzina reakcije = k1ABk1 je konstanta brzine reakcije

21

Brzina povratne reakcije = k-1 CDk-1 je konstanta brzine povratne reakcije

Jednostavni model enzimski katalizirane reakcije

S

E

P

22

k1 k2E + S ES E + P

k-1

V = k2 ES

E

12

Ustaljeno stanjeKoncentracija meuprodukata se ne mijenja,

dok se koncentracija ishodnih tvari i produkata mijenja

brzina stvaranja ES = brzina raspadanja ES

brzina stvaranja brzina raspadanjaES kompleksa ES kompleksa

ES ES_______ = k1ES - _______ = k-1ES + k2ESt t

23

k1ES = k-1ES + k2ESESES =

k-1+ k2/k1

Michaelis-Mentenina kinetika

Leonor Michaelis1875-1949.

Maud Menten1879-1960.

Ovisnost brzine enzimski katalizirane

KM

Ovisnost brzine enzimski kataliziranereakcije V o koncentraciji supstrata S

Michaelis konstanta

Michaelis-Mentenina jednadba

24

Michaelis konstanta k-1 + k2

KM =k1

Kinetika reakcije pokazuje zasienje postie se MAKSIMALNA BRZINA reakcije

Kinetika reakcije pokazuje zasienje postie se MAKSIMALNA BRZINA reakcije

13

Maksimalna brzina reakcije

V = k2 ESEnzim-supstrat Ukupni enzimEnzim supstrat Ukupni enzimkompleks

ES = Eo

25

Maksimalna brzina Vmax postie se kada susva enzimska mjesta zasiena supstratom

Vmax = k2Eo

Granini sluaj:vrijednost za k2 je zanemarivo mala

k2 odreuje ukupnu brzinu reakcijek-1 + k2

KM = k1

Za sluaj da je k2

14

KM mjera afiniteta enzima prema supstratu

visoki KM = slabi afinitetenzima prema supstratu

niski K = visoki afinitet

k-1k1

= KM = Kd

k2 [S]

Promjena brzine enzimski katalizirane reakcijeu ovisnosti od koncentracije supstrata

KM

15

Znaenje vrijednosti KM

KM je brojano jednak koncentraciji supstrata pri

kojoj brzina reakcije postie polovicu svoje

najvee vrijednosti

29

najvee vrijednosti

Odreivanje katalitikih konstanti (Vmax i KM) enzimskikatalizirane reakcije

Nagib = KM/Vmax

30

Dvostruko reciproniLineweaver-Burkov dijagram

linearna zavisnost1/v vs 1/S]

Michaelis-Mentenin dijagramhiperbolina zavisnost

v vs S]

16

k V / E

Prometni broj enzima

kcat = Vmax/Eojedinica: mol s-1/mol = s-1

Molovi supstrata pretvoreni u produktu jedinici vremena (sekunda)

31

u jedinici vremena (sekunda)po molu enzima

kada je enzim potpuno zasien supstratom

enzimi su osjetljivi na uvjete u kojima se reakcija odvija

Enzimi su aktivni kada su unativnoj konformaciji

enzimi gube aktivnost u uvjetima ekstremne temperature, pH, ionske jakosti, prisutnosti detergenata i drugih sredstava koji denaturiraju proteine

denaturacija

32

renaturacija

nativna ribonukleaza denaturirana ribonukleaza

17

Aktivnost enzima moe se inhibirati

Inhibicija enzimske aktivnosti

specifinim malim molekulama i ionima

33

Normalna funkcijaenzima

Aktivnost blokiranavezanjem inhibitora

Ireverzibilna inhibicija je kovalentna modifikacija enzima inhibitorom ili vrsto vezanje inhibitora u

aktivno mjesto enzima

grupno-specifini reagensi kemijski modificiraju aminokiselinske ostatke

u aktivnom mjestu

analozi supstrata strukturno slini supstratu kovalentno modificiraju aminokiselinske

ostatke u aktivnom mjestu

34

samoubilaki inhibitori modificirani supstrati enzim ih prevodi u reaktivni intermedijer koji

inaktivira enzim kovalentnom modifikacijom

18

H

Primjer ireverzibilnog inhibitora

HCCH3 CH3OPO

O

CCH3 CH3H

OCH2CH2OH + EnzimEnzim

CCH3 CH3OPO

F O

CCH3 CH3H

+ HF

35

H

Inaktivacija komotripsina i acetilkolinesterazediizopropil-fosfofluoridatom (DIPF) (nervni bojni otrov)

H

Reverzibilna inhibicija je brza disocijacija enzim:inhibitor kompleksa

kompeticijskisupstrat

Enzim Enzim

supstratkompeticijski

inhibitor

Enzim

nekompeticijskiinhibitor

36

Kompeticijski inhibitor nalikuje supstratu i vee

se na aktivno mjesto enzima

Vezivna mjesta za supstrat i za

nekompeticijski inhibitor se ne

prekrivaju

19

Kompeticijska inhibicija

supstratprodukt

Enzim vee supstrat (ES) ili inhibitor (EI), ali ne oba (EIS)

enzim

supstrat

inhibitor

37

kompeticijski inhibitor usporava katalizu smanjivanjem broja enzimskih molekula na koje je vezan supstrat

moe se nadvladati dovoljno visokom koncentracijom supstrata

CH2-OH CHO COOHI I I

Primjer kompeticijskog inhibitora

I I ICH2-OH CH2OH COOH

CH2-OHI

etilenglikol(antifriz) oksalna kiselina

Inhibicija etanolom

38

CH3etanol

Inhibicija etanolom

20

Nekompeticijska inhibicija

enzim

Enzim istovremenovee

i supstrat i inhibitor

supstratinhibitor

produkt

39

nekompeticijski inhibitor smanjuje prometni broj enzima ne moe se nadvladati poveanjem koncentracije supstrata

Kompeticijska i nekompeticijska inhibicija mogu se razluiti mjerenjem brzine reakcije pri razliitim

koncentracijama supstrata i inhibitora

nekompeticijski inhibitorkompeticijski inhibitor

nagib

nagib

bez inhibitora

kompeticijski inhibitor nekompeticijskiinhibitor

bez inhibitora

nagib

nagib

sjecite

sjecite

40

ne mijenja se Vmax prividno se mijenja

(poveava) KM

ne mijenja se KM smanjuje se Vmax

sjecitesjecite

sjecite