magnitud del€¦ · avanzada existe una correlación entre las mutaciones encontradas en el tumor...
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Magnitud del problema
In Spain, the adjusted mortality
rates were 13 per 100,000
males and 5.5 per 100,000
females.
• Global survival rates are
poor, lower than 28% at 5
years [2].
Ferlay J, Int J Cancer 2010, 127:2893–2917. Garcia-Esquinas E, BMC Cancer 2009, 9:346.
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Biopsia Líquida:
Introducción, conceptos Aplicaciones clínicas Métodos
cf DNA mRNA, miRNAs CTC
Conclusiones
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Objetivos:
Entender los diferentes métodos de detección de la “enfermedad tumoral circulante” en CG
Revisar los principales estudios
Apuntar las potenciales Aplicaciones clínicas en CG
Apuntar desarrollos potenciales de investigación
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Introducción
En los pacientes con cáncer existe una diseminación sistémica precoz de células tumorales, bien en órganos a distancia como células tumorales diseminadas (CTD), como células tumorales circulantes (CTC) o partículas subcelulares “tumorales” en sangre o en forma de ácidos nucleicos circulantes.
La presencia de esta enfermedad subclínica, no detectable con los estudios de extensión habituales, puede conducir a la aparición clínica de metástasis, servir como factor indicador de un mayor potencial invasivo y un peor pronóstico y ayudar en la selección del tto.
Comprender desde el punto de vista molecular y biológico el proceso de diseminación tumoral es de utilidad en la “medicina de precisión”.
Fidler. IJ. NATURE REVIEWS. Jun 2003. Gupta GP, Massague J. Cell 2006; 127: 679-95. Pantel, K.,
Brakenhoff, R.H. Nat Rev Cancer 2004; 4, 448–456. Gupta & Massague. N Engl J Med 2008;359:2814-23
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Un poco de historia
La presencia de células tumorales circulantes en sangre en pacientes con neoplasias sólidas avanzadas ya
fue descrita por T.R. Ashworth en 1869 [1].
Los primeros trabajos con inmunohistoquímica e inmunocitoquímica se llevaron a cabo en la década de los
1980 [2] empleando estos autores por primera vez el término de “micrometástasis”
El término “biopsia líquida” del inglés “liquid biopsy” fue empleado inicialmente para la detección de CTC
en sangre [3, 4]
Actualmente se prefiere para definir el análisis de ácidos nucleicos en sangre, en las CTC aisladas y
también en plasma o suero [5, 6] incluyendo el estudio de potenciales dianas terapéuticas moleculares y
alteraciones genéticas, especialmente mutaciones, relacionadas con la eficacia de los fármacos [7-9].
1. Ashworth TH. Aus Med J 1989; 146-7 . 2. Sloane JP, et al. Cancer Res 1980; 40: 3079-82. 3. Pachmann K, et al. J Cancer Res Clin Oncol 2011; 137: 1317-27. 4.Alix-Panabieres C, Pantel K. Clin Chem 2013;59:110–8. 5. Schwarzenbach H, et al. Clin Cancer Res 2009;15: 1032–8. 31. 6. Leary RJ, et al. Sci Transl Med 2010;2:20ra14. 7. Diaz LA Jr, et al. Nature 2012;486:537–40. 8. Murtaza M, et al. Nature 2013; 497:108–12. 9. Pantel K, Alix-Panabieres C. et al. Cancer Res 2013; 73: 6384-8.
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Biopsia Líquida: Aplicaciones
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Biopsia Líquida: cfDNA
• Estudios cuantitativos • Spectrophotometer
• PicoGreen fluorophore
• real-time qPCR
• Estudios cualitativos
– Monitorización de alteraciones genéticas del cáncer en sangre
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Biopsia Líquida: cfDNA • Estudios cuantitativos
• Spectrophotometer
• PicoGreen fluorophore
• real-time qPCR
- Detectan cantidad de DNA circulante, tanto procedente como no procedente del tumor
- No estandarización de los métodos, uso de distintas fuentes (suero, plasma...)
- Ventaja: sencillez, coste, menor necesidad de infraestructura
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54 patients with gastric cancer and the 59 age-matched healthy controls
MÉTODO: Alu81-qPCR
mean concentration of plasma cfDNA was 2.4-fold higher in patients with gastric cancer (71.4±55.4 ng/ml) than that in
healthy individuals (29.8±14.4 ng/ml).
Based on the cut-off value of 32.3 ng/ml for plasma DNA, patients with gastric cancer may be discriminated from healthy
individuals with 75% sensitivity and 63% specificity using the Alu81-qPCR test.
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[Ann Surg Treat Res 2014;86(3):136-142]
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DNA was extracted from plasma TaqMan qPCR assay of the housekeeping gene cyclophilin, Serially diluted standard DNA was used to generate a standard curve.
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cfDNA en cáncer
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En pacientes con CG existe un aumento de cfDNA en sangre
Este cfDNA disminuye tras la cirugía y se correlaciona con estadio y progresión del tumor
Podría ser útil para discriminar pacientes de controles y detección preco de recidivas
CUESTIONES
¿ Representa este cfDNA el DNA del propio tumor ?
¿ Podemos caracterizar alteraciones moleculares del tumor en el cfDNA ? ¿Qué alteraciones?
¿ Correlación con resultados: SG, SLP, respuesta?
Estudios cuantitativos
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Biopsia Líquida: cfDNA
• Estudios cualitativos
– Monitorización de alteraciones genéticas del cáncer en sangre
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cfDNA comprises a good representation of the tumor genome in late stage gastric (n=2) and lung cancer.
Whole-genome sequencing ofcfDNA samples with matching tumor and whole blood samples
Ma X, Zhu L, Wu X, Bao H, Wang X, Chang Z, et al. (2017) Cell-Free DNA Provides a Good Representation of the Tumor Genome Despite Its Biased Fragmentation Patterns. PLoS ONE 12(1): e0169231. doi:10.1371/journal.
pone.016923
Hierarchical clustering and PCA of the fraction of nucleotides
covered in each 10kbp window
CNV profile of each patient.
¿ Es el cfDNA representativo del “genoma” del tumor?
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Mutation detection in the primary tumours.
Deep sequencing of the amplified target
regions in Cell-free DNA
¿ Qué mutaciones, amplificaciones, genes
de fusión, CNV…podrían ser de interés en
CG?
¿ Podemos caracterizar alteraciones
moleculares del tumor en el cfDNA ?
¿Qué alteraciones?
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2016 ASCO EDUCATIONAL BOOK | asco.org/edbook
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For 13 patients who were treated with trastuzumab, 12 were HER2 positive by routine methods, and seven patients showed plasma HER2 amplification. Interestingly, a more effective response to trastuzumab (partial response) was found in all seven patients with plasma HER2 amplification, whereas a less effective response to this treatment (stable disease or progressive disease) was found for four of six patients (three stable disease patients and one progressive disease patient) without plasma HER2 amplification (P = 0.0210; Fisher’s
exact test).
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The median concentration of extracted cell- free DNA of all samples
from the three cases was 43.1 ng ml plasma (range 9.5–1338 ng ml
The mutant fraction range was 0.001–77.8% (median 0.90%).
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Lo próximo, caracterizar alteraciones moleculares “conductoras” y “accionables” en biopsia líquida, también en CG
• Detection rate of actionable mutations using a liquid biopsy (blood) circulating tumor cell DNA - CTC
Oncotarget, Vol. 7, No. 9 - 2016 Detection rate of actionable mutations in diverse cancers using a biopsy-free (blood) circulating tumor cell DNA assay
Maria Schwaederle
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Dr. Hernández, VHIO
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CTC detection: CellSearch system (Veridex) 52 patients with AGC were enrolled into a prospective study. The chemotherapy regimen was an S-1-based regimen (S-1 with or without cisplatin) or paclitaxel. CTCs of whole blood at baseline, 2 weeks, and 4 weeks after initiation of chemotherapy, were isolated and enu- merated using immunomagnetics.
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CTCs: Valor predictor y pronóstico
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Identificar microRNAs biomarcadores de células tumorales circulantes en cáncer gástrico.
Asociación de los diferentes biomarcadores de microRNA con los parámetros clínicos y
patológicos
Impacto de los microRNAs circulantes en sangre en la progresión de la enfermedad y la
supervivencia, en pacientes con cáncer gástrico.
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qRT-PCR miRNA Detection in total blood • Blood microRNA isolation and qRT-PCR
• To isolate the miRNA fraction: the RiboPure-Blood Kit
• Reverse-transcription (RT) & PCR was performed with 25 ng. of total RNA using the mirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit
• To control input variability and sample normalisation: U6 snRNA and 5S rRNA
• The Relative Expression Software Tool (REST) was used to analyse the relative miRNA expression and to determine the fold difference for every miRNA.
• The expression levels of the target miRNAs were standardised using an index containing 5S rRNA and U6 snRNA
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cutoff value is 62.4 sensitivity, 65.4%; specificity, 100%.
Gastric Cancer: Mir-200c
* Est. I-III vs controles ** Est. IV vs controles
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The relative expression levels for miR-200c in the blood of GC patients were not associated with any of the parameters analysed.
Mir-200c: Clinical Correlations
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high miR-200c: 9 months
low miR-200c: 24 months low miR-200c: 11 months
high miR-200c: 4 months
Gastric Cancer, miR-200c: OS and PFS
To generate survival curves, we converted continuous miR-200c expression levels to dichotomous using its mean levels of expression. miR-200c was overexpressed in the blood of 53.8% (28/52) of patients. The percentage of patients with miR-200c overexpression tended to increase with TNM stage: 33.3% (3/9) in stage I-II patients, 50% in stage III patients (6/12) and 61.3% (19/31) in stage IV patients (p = 0.076).
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miR-200c: Significado Pronostico en CG
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Poster pres. ASACO GI 2017
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Biopsia Líquida, incluyendo cfDNA:
Conclusiones
La detección de CTC y la cuantificación y caracterización de ácidos nucleicos circulantes son
herramientas potencialmente útiles en el manejo de los pacientes con cáncer, también en CG
Distintos métodos y diferentes biomarcadores pueden ofrecer ventajas potenciales en los
diferentes escenarios clínicos
mRNA y microRNA tras cirugía R0
cfDNA para detectar alteraciones “accionables”
En pacientes con enf. Avanzada existe una correlación entre las mutaciones encontradas en el
tumor y en el plasma
Técnicas con elevada sensibilidad: cfDNA: 01-0,01%
La biopsia líquida ofrece la posibilidad de una monitorización continua, no invasiva, de las
alteraciones genéticas y transcriptómicas del tumor
Manuel Valladares Ayerbes, Málaga – febrero 2017
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CTC, AN. Circulantes: Futuro • Multidimensional • En distintos compartimentos • En distintos tumores • Distintas “dianas”
– CTC – cfDNA – ncRNA:
• - miRNAs • - lncRNA
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CTC y Ácidos Nucleicos Circulantes:
Futuro
Manuel Valladares Ayerbes, Málaga – febrero 2017