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LOCI ASOCIADOS CON ENFERMEDADES GENÉTICAS Y CALIDAD DE CARNE EN BOVINOSRev Mex Cienc Pecu 2015;6(4):361-375

Loci asociados con enfermedades genéticas ycalidad de carne en bovinos Charolais mexicanos

Loci associated with genetic disorders and meat quality inCharolais cattle in Mexico

Ana María Sifuentes Rincóna, Williams Arellano Veraa, Gaspar Manuel ParraBracamontea, Pascuala Ambriz Moralesb, Luis Arístides López Bustamanteb

RESUMEN

Se determinaron las frecuencias alélicas y genotípicas de ocho marcadores localizados en los genes calpaína (CAPN, 4751y 316), calpastatina (CASTT1) y tiroglobulina (TG5), asociados a calidad de carne, y en los genes, miostatina (MSTN,Q204X), arginino succinato sintasa (ASS), monofosfato sintasa (UMPS) y miofosforilasa (PYGM), asociados aenfermedades genéticas de ganado bovino. Se muestrearon 493 animales Charolais de registro de dos hatos ubicados enSonora (n=157) y tres en Nuevo León (n=336). No se encontraron portadores de los alelos T-ASS y T-UMPS, pero síportadores del alelo Q204X del gen MSTN en frecuencias de 1 % en las poblaciones de Sonora y de 8.6 a 14.4 % enlas de Nuevo León. Además, se identificaron portadores del marcador del gen PYGM, en frecuencias del 6.5 y de 1.0 %para un hato de Sonora y otro de Nuevo León, respectivamente. El análisis de diferenciación génica pareado entre laspoblaciones y con los cuatro loci mostró que hay diferencias altamente significativas dentro de poblaciones del noroeste(P<0.0001) y entre éstas y las del noreste (P<0.001), la cual es explicada principalmente por los loci CAPN-316 y TG5.De acuerdo a los resultados obtenidos se recomienda el monitoreo del marcador del gen PYGM y del alelo Q204X del genMSTN, así como también implementar estrategias para confirmar la utilidad de los marcadores asociados a calidad yproductividad como herramienta para complementar los programas de mejoramiento genético.

PALABRAS CLAVE: Defectos genéticos, Marmoleo, Suavidad de la carne, ADN.

ABSTRACTAllelic and genotypic frequencies of eight markers previously associated to genetic disorders and meat quality andlocated in the calpain (CAPN1-4751 and CAPN1-316) , calpastatin (CAST-T1), thyroglobulin (TG5), myostatin (MSTN,Q204X), argininosuccinate synthase (ASS), monophosphate synthase (UMPS) and myophosphorylase (PYGM) genes,were determined from 493 registered Charolais animals sampled from two herds located at Sonora (n= 157) andthree at Nuevo León (n= 336), Mexico. No carriers of mutated alleles of ASS and UMPS genes were found, but carriersof the MSTN Q204X allele were identified at frequencies of 1 % in Sonora populations and 8.6 to 14.4 % in NuevoLeon. In addition, carriers of PYGM marker were identified at frequencies of 6.49 and 1% in a herd from Sonora andother from Nuevo León, respectively. Analysis of gene differentiation among herds and with four loci showed thatthere are highly significant differences within Northwest populations (P<0.0001) and between them and the Northeast(P<0.001), differentiation is mainly explained by the loci CAPN-316 and TG5. According to the obtained results, theperiodic monitoring of the PYGM marker gene and of the allele Q204X the MSTN gene is propose; also it is importantto implement strategies to confirm the usefulness of those markers associated with quality and productivity as a toolto complement breeding programs.

KEY WORDS: Genetic defects, Marbling, Tenderness, DNA.

Recibido el 22 de mayo de 2014. Aceptado el 9 de julio de 2014.a Laboratorio de Biotecnología Animal, Centro de Biotecnología Genómica. Instituto Politécnico Nacional. Boulevard del Maestro esq. Elías Piña S/N, Col. Narciso

Mendoza, 88710 Cd. Reynosa, Tamaulipas, México. Tel: (899) 924 36 27. [email protected]. Correspondencia al primer autor.b Charolais Herd Book de México A.C. Comité Técnico. México.Proyecto apoyado por fondos FORDECYT y FOMIX Tamaulipas 177460.

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Ana María Sifuentes Rincón, et al. / Rev Mex Cienc Pecu 2015;6(4):361-375

INTRODUCCIÓN

Actualmente, las pruebas de ADN sonherramientas disponibles para los criadores deganado y todos aquellos interesados en llevara cabo el monitoreo de la calidad y saludgenética de los animales del hato(1,2). Enbovinos, se han descrito pruebas de ADN paraidentificar portadores de al menos 40desórdenes genéticos(1,3).

En el caso de la raza Charolais, diferentesAsociaciones en el mundo reportan oficialmenteel fenotipo doble músculo (DM). Esta es unacondición genética que es producto demutaciones disruptivas en el gen de lamiostatina (MSTN)(4). Además del fenotipo DM,otros desórdenes genéticos reportados para laraza Charolais son la Citrulinemia bovina (ASS),la Enfermedad de Almacenamiento delGlucógeno tipo V (EAG-V), y la Deficiencia dela Uridina 5 Monofosfato Sintasa (DUMPS); todosestos desórdenes son recesivos y son causadospor mutaciones en genes específicos(5).

En el caso de las pruebas de ADN para predecirla calidad de la carne y la productividad, lasque a la fecha han alcanzado mayor difusiónson las de rasgos sensoriales de la carne(6),específicamente suavidad y contenido de grasaintramuscular (marmoleo). El marcador TG5 delgen tiroglobulina, es una transición C/Tlocalizada en el sitio consenso de unión de laRNA polimerasa III, 537 pb río arriba del iniciodel primer exón del gen de tiroglobulina(NW_001493192.1.g.290170C>T). El polimorfismode este marcador está definido por los alelos 2y 3, mientras que el alelo 2 muestra la secuenciaGATC, y el alelo 3 tiene una secuencia GATT, elcual se ha asociado a mayor marmoleo. Aunqueya hay estudios en los que se ha validado suasociación a marmoleo(6), hay reportes en losque no se ha encontrado efecto significativosobre la característica(7). Para suavidad oterneza, dos marcadores localizados en el gende la micro-calpaína 1 (CAPN1-316 y CAPN1-4751) y dos ubicados en el gen de lacalpastatina (CAST), son a la fecha los más

INTRODUCTION

For cattle producers and all those interested inmonitoring animal quality and genetic health,DNA testing is a widely available and importanttool(1,2). To date, DNA tests have been doneidentifying carriers of at least 40 geneticdisorders in cattle(1,3). In the Charolais breed,different cattle associations worldwide havereported the double muscle (DM) phenotype, agenetic condition produced by disruptive mutationsin the myostatin gene (MSTN)(4). Additionaldisorders reported for the Charolais breedinclude bovine citrullinemia (argininosuccinatesynthetase - ASS); type-V glycogen storagedisease (GSD-V); and uridine-5'-monophosphatesynthase deficiency (UMSD). All these disordersare recessive and caused by mutations in specificgenes(5).

Among DNA tests currently used to predict meatquality and animal productivity, the mostcommon are those focused to meat sensoryfeatures, such as tenderness and intermuscularfat content (marbling). The TG5 marker of thethyroglobulin gene is a C/T transition at theunion consensus site of the RNA polymeraseIII, 537 bp upstream from the beginning of thethyroglobulin gene’s first exon (NW_001493192.1.g.290170C>T). This marker’s polymorphismis defined by alleles 2 and 3; allele 2 exhibitsthe GATC sequence while allele 3 has a GATTsequence (associated with greater marbling).Some studies have validated an association withmarbling(6), while others report no significanteffect on this trait(7). For tenderness, twomarkers localized in the micro-calpain 1 gene(CAPN1-316 and CAPN1-4751), and two othersin the calpastatine gene (CAST) have receivedthe most attention and have a validated effecton tenderness(6). The marker CAPN1-316 is aG/C transversion at position 5709 of exon 9 inthe CAPN1 gene, while CAPN1-4751 is alocalized C/T transition at position 6545 betweenintron 17 and 18 of the same gene(6). In bothmarkers, the C allele has been reported andvalidated as favoring meat tenderness(6). Themarker UoG CAST is a G/C transversion at

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estudiados y su efecto sobre la suavidad hasido validado(6). El marcador CAPN1-316, esuna transversión G/C en la posición 5709 delexón 9 del gen CAPN1, mientras que el marcadorCAPN1-4751 es una transición de C/T localizadaen la posición 6545 entre el intrón 17 y el exón18 del mismo gen(6). En ambos marcadores elalelo C ha sido reportado y validado comofavorable para la suavidad de la carne(6). Elmarcador UoG CAST es una transversión G/Cque se encuentra en la posición 282 entre elexón 5 y 6 y el CAST-T1 es una transición G/Alocalizada la región 3’ no traducible del gen.Los alelos C y A, respectivamente se hanidentificado como favorables para la suavidadde la carne en bovinos.

En este trabajo se tipificaron poblaciones deganado Charolais de registro, utilizando un panelde marcadores asociados con enfermedadesgenéticas y con rasgos sensoriales de la carne,con el fin de determinar sus frecuencias alélicasy conocer el potencial genético-molecular delas poblaciones estudiadas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Utilizando el estuche comercial Promega Wizard,se realizó la extracción de ADN a muestras desangre de 493 animales provenientes de cincoranchos de registro de ganado Charolais. Dosde ellos localizados en Sonora, región noroestede México, SoR1 (n=83) y SoR2 (n=74), y tresen la región noreste del estado de Nuevo León,NLR1 (n=79), NLR2 (n=100) y NLR3 (n=157).Con excepción de 21 muestras de machos, todaslas muestras fueron de hembras.

Las muestras se tipificaron por discriminaciónalél ica con los marcadores CAPN1-316(transversión G/C), CAPN1-4751 (transición deC/T), CAST-T1 (transición A/G) y alelo Q204X(transición C/T), utilizando los iniciadores ysondas específicos para cada SNP (Cuadro 1),las cuales se sintetizaron en la compañía AppliedBiosystems. Todos los ensayos se realizaron enel equipo ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem, utilizando las siguientes condiciones:

position 282 between exons 5 and 6, and theCAST-T1 marker is a localized G/A transition inthe gene’s untranslatable 3' region. Allele C inUoG CAST, and allele A in CAST-T1 have beenidentified as favoring meat tenderness in cattle.

The present study objective was to typifyregistered Charolais cattle populations fromNorthwest and Northeast Mexico, using a SNPspanel associated with genetic diseases and meatsensory traits in order to determine their allelefrequencies and understand their moleculargenetic potential.

MATERIALS AND METHODS

Blood samples were taken from cattle at fiveregistered Charolais breed ranches: two in thestate of Sonora (SoR1 [n=83]; SoR2 [n=74])in northwest Mexico, and three in the state ofNuevo Leon (NLR1 [n=79]; NLR2 [n=100];NLR3 [n=157]) in the country’s northeast. Totalsample size was 493 (21 bulls, 472 cows).

A Wizard® Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, WI, USA) was used toextract DNA from the blood samples. Thesewere typified by allelic discrimination using themarkers CAPN1-316 (G/C transversion), CAPN1-4751 (C/T transversion) and CAST-T1 (A/Gtransition), the allele Q204X (C/T transition),and primers and probes specific to each singlenucleotide polymorphism (SNP) (AppliedBiosystems, Mexico City, Mexico) (Table 1).Analysis was done using 250 ng DNA, 12.5 µlTaqman PCR master mix (Applied Biosystems),and 0.625 µl primer and probe mixture (AssaySNP mix). All assays were achieved in athermocycler (ABI Prism 7000 SequenceDetection System) under the fol lowingconditions: 50 °C for 2 min; 95 °C for 10 min;and 40 two-step cycles of 92 °C for 15 s and60 °C for 1 min. Genotype identification foreach marker was done with the ABI Prism 7000Sequence Detection System software.

Samples were also typified using four markersin PCR-RFLP assays. The specific primer

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un ciclo de 2 min a 50 °C y 10 min a 95 °C,seguido de 40 ciclos de dos pasos 15 s a 92°C y 1 min a 60 °C. Se utilizaron 250 ng ADN,12.5 µl of Taqman PCR master mix (AppliedBiosystems), y 0.625 ml de la mezcla de sondase iniciadores (Assay SNP mix). La llamada delos genotipos para cada marcador se llevó acabo utilizando el software ABI Prism 7000Sequence Detection System.

Adicionalmente, las muestras se tipificaron concuatro marcadores mediante ensayos de PCR-RFLP; para estos, las secuencias de losiniciadores y las enzimas de restricciónespecíficas para detectar el SNP se tomaron dela literatura y se describen a continuación. LaPCR para el marcador TG5 se realizó utilizandolos iniciadores TG5U2 5´ggg gat gac tac gagtat gac tg 3´ y TG5D1 5´gtg aaa atc ttg tggagg ctg ta3´ que generan un fragmento de545pb(8), la transición C/T se identificódespués de digerir el fragmento con la enzimaMbo I, el alelo 2 produce fragmentos de 17 pb,73 pb, 177 pb y 278 pb mientras que el alelo3 se caracteriza por el patrón de bandas de 73pb, 194 pb y 278 pb. Para el marcador asociadoa la EAG-V, se usaron los iniciadores reportadosF-5´-CCA GGA AGA CCC TCA TTC CA-3 y R-5´-AGG GAA ACA CAC ACA CAG-3´(5). La transiciónC/T en el codón 489 del gen de la miofosforilasafue detectada con la enzima Sty I, donde los

sequences and restriction enzymes for SNPsdetection were taken from the literature. ThePCR runs for marker TG5 were done usingthe primers TG5U2 5’ggg gat gac tac gag tatgac tg 3' and TG5D1 5’gtg aaa atc ttg tggagg ctg ta3', which generate a 545 bpfragment. The C/T transition was identifiedafter digestion with the Mbo I enzyme. Allele2 produces 17, 73, 177 and 278 bp fragments,while Allele 3 is characterized by a 73, 194and 278 bp band pattern. For the GSD-Vmarker, the primers F-5'-CCA GGA AGA CCCTCA TTC CA-3' and R-5'-AGG GAA ACA CACACA CAG-3' were used(5). The C/T transitionin codon 489 of the myophosphorylase genewas detected with the Sty I enzyme. A bandpattern of 119 and 133 bp was used to identifythe TT homozygotic carriers, and a 252 bppattern used for unaffected CCs. Markersassociated with DUMPS were typified with theprimers DUMPS-F 5'-GCA AAT GGC TGA AGAACA TTC TG-3' and DUMPS_R 5'-GCT TCTAAC TGA ACT CCT CGA GT-3', while for ASSASS-F 5'-GTG TTC ATT GAG GAC ATC-3' andASS-R 5'-CCG TGA GAC ACA TAC TTG-3 wereused(5).

The C/T transition in the uridine-5'-monophosphate synthase associated withDUMPS was identified with the Ava I enzyme inwhich normal homozygotes exhibit a pattern of

Cuadro 1. Iniciadores y sondas específicos para los marcadores Q204X, CAPN1-316, CAPN1-4751 y CAST-T1Table 1. Primers and probes specific to markers Q204X, CAPN1-316, CAPN1-4751 and CAST-T1

Marker Primers (5'-3') Probes

Q204X F-GGAATCCGATCTCTGAAACTTGACA VIC-CAATGCTCTGCCAAATAR-GCTCTGCAACACTGTCTTCAC FAM-ATCAATGCTCTACCAAATA

CAPN1-316 F-GCAGTGCCGTTTTCCTACAG VIC-CCACGGCGTTCCAR-AGCTGCTCCCGCATGTAAG FAM-CCACGCCGTTCCA

CAPN1-4751 F-TGGCATCCTCCCCTTGACT VIC-CTGCGCCTCTGTTTR-CCCCCGTCACTTGACACA FAM-CTGCGCCTCCGTTT

CAST-T1 F-CTCACGTGTTCTTCAGTGTTCTG VIC-CCTTTCCTCTTAGACTTGTR-CAACCCAAAGAAACATCAAACACAGT FAM-CTTTCCTCTTGGACTTGT

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portadores homocigotos TT fueron identificadospor un patrón de bandas de 133 pb y 119 pby los no afectados CC una banda de 252 pb.Los marcadores asociados a DUMPS y ASS setipificaron utilizando los iniciadores DUMPS-F5´-GCA AAT GGC TGA AGA ACA TTC TG-3´:DUMPS_R 5´-GCT TCT AAC TGA ACT CCT CGAGT-3´y ASS-F 5´-GTG TTC ATT GAG GAC ATC-3,ASS-R 5´-CCG TGA GAC ACA TAC TTG-3,respectivamente(5).

La transición (C/T) en el gen de uridinamonofosfato sintasa asociado a la DUMPS, sedetectó con la enzima Ava I, donde loshomocigotos normales muestran un patrón debandas de 23, 36 y 19 pb y los homocigotosrecesivos de 89 y 19 pb. Mientras que para laASS la transición C/T del codón 86 de la proteínadel gen ASS se detectó con la enzima Ava II,donde un producto sin digerir identifica a losportadores mutados y un patrón de bandas de118 y 80 pb a los portadores no afectados(5).

Todas las amplificaciones se realizaron en unvolumen de 12.5 µl utilizando 50 ng de ADN,2 mM de MgCl2, 0.25 µM de cada iniciador y0.125 U de GoTaq DNA polimerasa. Para lasampli f icaciones se uti l izó un perfi l detemperaturas tipo “touchdown” que consistióen incubación a 95ºC/10’, 5 ciclos de 95°C/45",65°C/45’’ (disminuyendo 2 °C cada ciclo) y 72°C/45’’; posteriormente 25 ciclos a 95°C/45’’, 60°C/45’’ y 72°C/45’’, finalmente a 72ºC/10’. Laamplificación se confirmó por electroforesis enun gel de agarosa al 1.5% teñido con SyberGold, posteriormente se visualizó en elfotodocumentador Kodak Gel Logic 112.

Las digestiones enzimáticas se realizaronutilizando 10 µl del producto de PCR y 2.5 U deenzima de restricción específica para cadapolimorfismo; los patrones de bandeo de ladigestión se analizaron por electroforesis engeles de agarosa Nusieve al 4.5%, la cual sepreparó siguiendo las instrucciones de la casacomercial (Karlan Research ProductsCorporation, Phoenix, AZ 85070).

bands at 23, 36 and 19 bp, and recessivehomozygotes have a pattern with 89 and 19bp. For ASS, the C/T transition of codon 86 inthe ASS gene protein was identified with theAva II enzyme in which an indigested productindicated mutated carriers, and bands at 118and 80 bp identified unaffected carriers(5).

All amplifications were done in a 12.5 µl finalvolume containing 50 ng DNA, 2 mM MgCl2,0.25 µM of each primer, and 0.125 U GoTaqDNA polymerase. A touchdown temperatureprofile was used in the assay: 95 °C for 10 h;5 cycles at 95 °C for 45 min 65 °C for 45 min(decreasing 2 °C per cycle) and 72 °C for 45min; 25 cycles at 95 °C for 45 min, 60 °C for 45min and 72 °C for 45 min; and 72 °C for 10 h.Amplification was confirmed by electrophoresisin 1.5% agarose gel stained with SYBER® Gold;gels were viewed in a photodocumentor (GelLogic 112, Kodak).

Enzymatic digestions were done using 10 µlPCR product and 2.5 U restriction enzymespecific to each polymorphism. Digestion bandpatterns were analyzed with electrophoresis in4.5% Nusieve agarose gel prepared followingmanufacturer instructions (Karlan ResearchProducts Co., Phoenix, AZ, USA).

Genotype and allele frequencies were thenestimated with the Cervus 3.0 program(9). Usingthe Genepop 4.2 program(10), Hardy-Weinbergequilibrium (HWE) was calculated, and geneticdifferentiation between the studied populationswas analyzed for the four meat quality-associated markers. In the genetic differentiationanalysis, the tested null hypothesis was Ho=allele distribution identical across populations.For populations, the test was done automaticallyby pairs of populations using contingency tables.A non-biased estimate of the P value or a Fischerexact test was run(10). Graphic illustration ofdifferentiation by allele segregation among thesemarkers was done with a correspondenceanalysis in the SAS ver. 9.0 program (SASInstitute Inc., Cary, NC, USA).

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Cuadro 2. Frecuencias alélicas y genotípicas de los cuatro marcadores asociados a enfermedades genéticas y calidadde carne en ganado Charolais de registro (%)

Table 2. Allele and genotype frequencies of four markers associated with genetic disorders and four associated withmeat quality in registered Charolais cattle (%)

Genotype AlleleMarker SNP* Population 1 12 2 1 2

Q204X T/C SoR1 100 0 0 1 0SoR2 98.64 1.35 0 0.066 0.934NLR1 85.54 14.45 0 0.0723 0.9277NLR2 89.8 10.20 0 0.0510 0.9490NLR3 91.37 8.62 0 0.0449 0.9551

GDS-V C/T SoR1 100 0 0 1 0SoR2 93.43 6.57 0 0.100 0.8998NLR1 100 0 0 1 0NLR2 99.01 0.99 0 0.01 0.9999NLR3 100 0 0 0 1

DUMPS C/T SoR1 100 0 0 0 1SoR2 100 0 0 0 1NLR1 100 0 0 0 1NLR2 100 0 0 0 1NLR3 100 0 0 0 1

ASS C/T SoR1 100 0 0 0 1SoR2 100 0 0 0 1NLR1 100 0 0 0 1NLR2 100 0 0 0 1NLR3 100 0 0 0 1

CAST-T1 A/G SoR1 89.5 9.2 1.31 0.9400 0.0600SoR2 96.4 3.6 0 0.9769 0.0231NLR1 44.8 47.5 7.7 0.6859 0.3141NLR2 64.4 26.7 8.9 0.7750 0.2250NLR3 80.4 19 0.6 0.8994 0.1006

CAPN316 C/G SoR1 3.0 23.3 73.7 0.1333 0.8667SoR2 5.1 6.4 88.5 0.0844 0.9156NLR1 2.5 26.5 71 0.1582 0.8418NLR2 18.4 3 78.6 0.7921 0.2079NLR3 0 60.8 39.2 0.6960 0.3040

CAPN1-4751 C/T SoR1 18.4 55.3 26.3 0.5400 0.4600SoR2 26.1 43.8 30.1 0.5156 0.4844NLR1 24 53.2 22.8 0.5063 0.4937NLR2 17 50 33 0.5879 0.4121NLR3 22.9 44 33.1 0.5514 0.4486

TG5 T/C SoR1 27.7 19.4 52.8 0.3803 0.6197SoR2 5.1 17.9 76.9 0.1429 0.8571NLR1 5.12 39 55.1 0.2500 0.7500NLR2 6.3 29.4 64.2 0.2105 0.7895NLR3 24.2 15 60.8 0.3152 0.6848

*Single nucleotide polymorphisms: ½.

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Posteriormente, se estimaron las frecuenciasgenotípicas y alélicas de los ocho marcadoresanalizados utilizando el programa Cervus 3.0(9).Se analizó el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE)y se evaluó la diferenciación genética entre laspoblaciones de estudio para los cuatro marcadoresasociados a calidad de la carne, utilizando elprograma Genepop 4.2(10). En el análisis dediferenciación genética, la hipótesis nula probadafue Ho= la distribución alélica es idéntica a travésde las poblaciones. Para poblaciones, la pruebase realiza automáticamente por medio de tablasde contingencia por pares de poblaciones, y selleva a cabo una estimación no sesgada delvalor de P prueba exacta de Fisher como ladescriben Raymond y Rousset(10). Para ilustrargráficamente la diferenciación por segregaciónalélica en estos marcadores se realizó un análisisde correspondencia utilizando el programa SASver. 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

RESULTADOS

Marcadores asociados a desórdenes genéticosEn las poblaciones estudiadas, no seencontraron portadores de los alelos asociadosa ASS y DUMPS. Sin embargo, se encontraronanimales portadores para las variantes génicasasociadas a la EAG- V y al doble músculo

RESULTS

Markers associated with genetic disordersNo carriers of ASS- or DUMPS-associated alleleswere identified in the present data. However,some carriers were identified of genetic variantsassociated with GDS-V and DM (Table 2). AlleleQ204X is associated with DM and was found in28 (5.87 %) cows with frequencies in differentherds varying from 0 to 14.4 %.

When analyzed by region, the ranches innortheast Mexico had higher Q204X frequencies(8.6 to 14.4 %) than those in the northwest(maximum frequencies= 1 %). This discrepancymay be due to the source of the genetic materialused in herd improvement. It is common in thenortheast, particularly in the analyzed herds, touse European genetic material (mainly Frenchsemen). In some studies, carrier sire frequencyis as high as 27 %(11,12). To support this result,the pedigree data for the carrier cows identifiedin the study allowed them to be grouped intosix families of half-sisters with French fathers.A biological sample was acquired from theseFrench sires and DNA testing confirmed themto be Q204X carriers.

Five cows and one bull were also found tocarry the GDS-V-associated marker (Figure 1).

Figura 1. Detección de portadores de la EAG-V. Se muestran los resultados de PCR-RFLP de individuos de lapoblación SoR2

Figure 1. Identification of GDS-V carriers. PCR-RFLP results for individuals in SoR2 population

Rows 3, 4, 7 and 14 exhibit the 252, 133 and 119 bp pattern corresponding to carriers of the GDS-V associated allele in thispopulation. Row 1= undigested PCR product; M= marker for 300, 200 and 100 bp molecular weights.

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(Cuadro 2). Para el alelo Q204X asociado aldoble músculo, se encontraron en la poblacióntotal 28 hembras portadoras (5.87 %) y entrehatos las frecuencias de portadoras variaronentre 0 a 14.4 %.

El análisis por región permitió observar quelos hatos ubicados en la región noreste deMéxico, tienen mayores frecuencias del aleloQ204X (8.6 a 14.4 %) respecto a laslocalizadas en el noroeste, que mostraron unamáxima frecuencia de 1 %. Este resultadopodría explicarse por el origen del materialgenético con el que se mejoran estos hatos,ya que es común que en el noreste y enparticular en los hatos analizados, la fuentede mater ia l genét ico sea europeo(pr incipalmente semen Francés), y laf recuencia de sementales por tadoresreportadas para este alelo en algunos estudioses hasta del 27 %(11,12). Para apoyar esteresultado, con la información de pedigrí delas hembras portadoras identificadas en elestudio, se lograron formar seis familias demedias hermanas cuyos padres son de origenfrancés. De estos últimos se logró obtener unamuestra biológica y la prueba de ADN confirmóque estos son portadores del alelo Q204X.

En el estudio también se encontraron cincohembras y un macho portadores del marcadorasociado a la EAG-V (Figura 1). En este caso lamayor frecuencia se registró en un hato delnoroeste (6.49 %), y sólo una portadora en unhato del noreste (1 %). La verificación delpedigrí de dos de las vacas portadoras permitesuponer que es posible que el alelo haya sidotransmitido por vía paterna, de un sementalproveniente de Estados Unidos no incluido eneste estudio.

Marcadores asociados a calidad de carneEn la Cuadro 2 se muestran las frecuenciasalélicas y genotípicas de los cuatro marcadoresasociados a calidad de la carne. El análisis dediferenciación génica pareado entre laspoblaciones y con los cuatro loci mostró que

The highest frequency (6.49 %) was recordedin a herd in the northwest, with only one carrierin the northeast (1 %). Pedigree verification oftwo of the cows carrying this allele suggestedit had been transmitted through the paternalline from a sire in the United States that wasnot included in this study.

Markers associated with meat qualityPaired genetic differentiation analysis betweenpopulations using the four analyzed loci showedhighly significant differences within the twopopulations in the northwest (P<0.0001), andbetween these two populations and the threein the northeast (P<0.001) (Table 2). In thenortheast, population NLR3 differed from theother two northeast populations (NLR1 andNLR2). Analysis by loci identified a differencesbetween the four markers. The most significantwas in the TG5 marker between SoR1 and SoR2,and between these two populations and NLR3.No differences between the populations wereobserved in marker 4751.

Allele segregation identified a strong influencefrom markers CAPN1-316 and CAST-T1 indifferentiation between the northeast andnorthwest herds (Figure 2). It also indicatedvariability for the analyzed loci to be lowestamong the two northwest herds.

In the expected and observed heterozygositydata (Table 3), only two markers exhibiteddeviation in HWE. For TG5, this deviation wassignificant in the two northwest herds and NLR3,while for CAPN316 it was significant for SoR1,NLR2 and NLR3. All deviations were caused bya heterozygote deficit.

DISCUSSION

Markers associated with genetic diseasesCattle associations worldwide officially recognizegenetic disorders in different cattle breeds andrecord them in animal registers. This is vitaldata that can be made available to animal andsemen buyers, allowing them to exclude affected

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hay diferencias altamente significativas dentrode las dos poblaciones del noroeste (P<0.0001)y entre estas dos poblaciones y las tres delnoreste (P<0.001). Adicionalmente entrepoblaciones, la población NLR3 fuesignificativamente diferente de las otras dospoblaciones del noreste (NLR1 y NLR2). Elanálisis por loci demostró que existe diferentecomportamiento para los cuatro marcadores,siendo las diferencias más significativas en elmarcador TG5 entre las poblaciones del noroestey estas dos poblaciones y la NLR3. En elmarcador 4751 no se observaron diferenciassignificativas entre las cuatro poblaciones. Anivel de segregación alélica la Figura 2muestra una fuerte influencia de los alelosdel marcador CAPN1-316 y CAST-T1 en ladiferenciación de los hatos del noreste contralos del noroeste, e indica una menorvariabilidad entre los hatos de esta última regiónpara los loci analizados.

En el Cuadro 3 se muestran las heterocigosidadesesperadas y observadas; sólo en dos marcadoresse observó desviación al equilibrio Hardy-Weinberg. La desviación al EHW fue significativapara el marcador TG5 en las dos poblacionesdel noroeste y la población NLR3 del noreste,mientras que en el marcador CAPN316 lo fueen la población SoR1 del noroeste y dospoblaciones del noreste (NLR2 y NLR3). En todoslos casos la desviación fue debida a un déficitde heterocigotos.

Figura 2. Gráfico factorial de correspondencia desegregación alélica de marcadores asociados a calidadde la carne en hatos del noroeste y noreste de MéxicoFigure 2. Allele segregation of markers associated withmeat quality in herds of Charolais cattle in northwest andnortheast Mexico

Cuadro 3. Heterocigocidades esperadas y observadas para los marcadores de calidad de la carneTable 3. Observed and expected heterozygosities for meat quality markers

TG5 CAPN1-316 CAPN1-4751 CAST-T1Herd Ho He HW Ho He HW Ho He HW Ho He HW

SoR1 (83) 0.169 0.329 *** 0.064 0.154 *** 0.494 0.502 ns 0.036 0.036 nsSoR2 (74) 0.189 0.524 *** 0.270 0.235 ns 0.541 0.500 ns 0.095 0.115 nsNLR1 (79) 0.397 0.377 ns 0.266 0.268 ns 0.532 0.503 ns 0.474 0.434 nsNLR2 (95) 0.295 0.334 ns 0.031 0.320 *** 0.500 0.490 ns 0.270 0.351 nsNLR3 (148) 0.155 0.446 *** 0.573 0.410 *** 0.446 0.494 ns 0.185 0.179 nsHo= observed heterozygosity; He= expected heterozygosity; HW= Hardy-Weinberg equilibrium; ns= not significant.

animals from breeding or adequately managethem within a herd. In this way, cattleassociations can control dissemination ofcompromised genetic material and eventuallyeliminate carriers from the gene pool.

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Frequency of the DM phenotype varies amongdifferent cattle breeds. This is because the traitsassociated to this phenotype have been selectedfor at varying intensities depending on theproduction goals of a given herd orpopulation(4). In the Charolais breed, the DMphenotype has been promoted mainly toproduce carriers in terminal crosses(12,13,14).Due to problems with dystocia, Charolaisproducers in Mexico have opted to reduce andeven eliminate DM presence from their herds.Visual examination of animals is used to identifyDM phenotype traits and manage themaccordingly to each herd objective.

Allele frequencies in the present data rangedfrom 0 to 14 % and al l carriers wereheterozygotic. Presence of the allele in theanalyzed Charolais populations could be due tothe difficulty of identifying carrier animals fromnormal animals, because Charolais DM carriersdo not exhibit the marked muscle developmentcharacteristic of the phenotype(15). In thesesituations, DNA tests are a valuable tool becausethey generate data that can assist producers inmaking decisions based on herd objectives,taking into account the productive andreproductive advantages and disadvantages ofthe DM condition.

Carriers were also identified of the markerassociated with GDS-V. This muscular diseaseis induced by a point mutation in the glycogenphosphorylase enzyme gene that causesintolerance to exercise, myalgia and recurrentmyoglobinuria. Very little data is available onthe prevalence of this recessive disorder incattle, and most reports in Charolais animalsare of carriers(16). In a study of a carrier familyin Charolais herds in New Zealand, presence ofthe allele was found to most probably be causedby import of animals from England and theUnited States(17). The present study is the firstreport of carriers of the GDS-V-associatedmarker in Charolais cattle in Mexico. Of particularnote is identification of a male carrier thatcurrently has at least 38 registered progeny(34 males, 4 females) in the Asociación Charolais

DISCUSIÓN

Enfermedades genéticasA nivel mundial, las Asociaciones Ganaderasreconocen oficialmente, en las diferentes razasde bovinos, desórdenes genéticos que sereportan en el registro del animal. A través deesta práctica, se obtiene importante informaciónque la Asociación Ganadera puede hacerdisponible a los compradores de animales y desemen, lo que hace posible su exclusión comoreproductor o manejo adecuado dentro del hato,mientras que para la Asociación es una formade controlar la diseminación y lograr la eventualeliminación de los portadores.

Se ha descrito que el fenotipo doble músculomuestra diferencias en la frecuencia entre razas;esto se puede deber a que durante muchasgeneraciones los rasgos que se relacionan aeste fenotipo tienen intensidades de selecciónque dependen de los objetivos productivos delhato o población donde se presenta(4). Deacuerdo a diferentes reportes, la presencia deldoble músculo en la raza Charolais se hapromovido principalmente para obtenerportadores en cruzas terminales(12,13,14). EnMéxico, productores de la raza Charolais reportanque han optado por limitar e incluso eliminarsu presencia en el hato, debido a los problemasde distocia. Para lograrlo, ellos se han basadoen la inspección visual de los animales buscandolas características del fenotipo DM.

En este estudio se encontraron frecuenciasalélicas de 0 a 14 % y todos los animalesfueron portadores heterocigotos. La presenciadel alelo en las poblaciones de Charolaisanalizadas puede ser consecuencia de que losanimales heterocigotos o portadores del aleloson difíciles de diferenciar de los portadoresnormales, ya que los portadores heterocigotosno muestran el marcado desarrollo muscularque es característico de los animales DM(15).En situaciones como ésta, las pruebas de ADNrepresentan una herramienta valiosa, ya queesta información dará al productor laoportunidad de decidir y manejar, de acuerdo

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al objetivo del hato, las ventajas y desventajasproductivas y reproductivas asociadas a lapresencia de esta condición genética.

En el estudio también se encontraron portadoresdel marcador asociado a la enfermedad dealmacenamiento del glucógeno tipo V. Esta esuna enfermedad muscular inducida por unamutación puntual en el gen de la enzimaglucógeno fosforilasa, lo que causa intoleranciaal ejercicio, mialgia y mioglobinuria recurrente.Son pocos los reportes sobre la prevalencia deeste desorden recesivo en ganado bovino, y enganado Charolais la mayoría de los reportesson casos de portadores(16). Jolly et al(17)reportaron la presencia de una familia portadoraen hatos de ganado Charolais en Nueva Zelandae identificaron que la presencia del alelo recesivopudo deberse a importaciones de animales deInglaterra o América. En México, este es elprimer reporte de portadores del marcadorasociado a la enfermedad de almacenamientodel glucógeno tipo V en ganado Charolaismexicano; el caso más relevante de esteresultado, es la identificación de un portadormacho, el cual a la fecha tiene al menos 38crías registradas en las bases de datos de laAsociación Charolais HerdBook de Mexico (34Machos y 4 hembras), y a las cuales a la fechano se les ha realizado la prueba de ADN paraidentificar el alelo recesivo. Aun cuando lasimplicaciones productivas de la enfermedad dealmacenamiento del glucógeno tipo V paraanimales portadores no han sido reportadas, elefecto de la presencia de portadores en loshatos es potencialmente dañina.

Marcadores asociados a calidad de carneEn México no se cuenta con amplia informaciónsobre la calidad de la carne de bovinos, estoen parte se debe a que aún no estáncompletamente definidos los criterios para suclasificación(18). Sin embargo, dado que laaplicación de la biotecnología ha alcanzado a laindustria de la carne y el uso del diagnósticomolecular de genes asociados a su calidad estándisponibles para los ganaderos, es de interésdar el primer paso para determinar las frecuencias

HerdBook de Mexico. To date, no DNA testshave been done to identify the recessive genein these progeny. No reports exist on theproductive consequences of GDS-V carriers, buttheir presence in herds is potentially damaging.

Markers associated with meat qualityPartially due to lack of completely definedcriteria, data on meat quality in beef cattle inMexico is limited(18). However, the advent ofbiotechnology in the meat industry now allowsapplication of molecular diagnosis of the genesassociated with meat quality. This is animportant first step in identifying the allelefrequencies of these markers in registered cattle.The production process in Mexico requires thatany genetic improvement program begin in thepure cattle breeds. For complex traits such asmeat quality, improvement can be expected toappear in cattle for slaughter.

The meat quality markers analyzed here areincluded in commercial tests for meat tendernessand marbling, which is why the favorable effectof each allele variant has been reported(6). Allelicand genotype frequencies observed in thepresent study, showed that the herds to havehigh to medium frequencies of the allelesreported as favorable for the markers CAST-T1(allele A) and CAPN1-4751 (allele C). The allelereported as unfavorable for the markersCAPN316 and TG5 had the highest frequency(91.5 and 69.1 %, respectively).

The values in the present study are similar tothose in a study of allele frequencies in FrenchCharolais cattle for the markers CAST-T1 (highfrequency) and CAPN316 (low frequency). Thetwo markers of the CAPN1 gene have beenreported to explain up to 25 % of geneticvariation in meat tenderness(19) and up to 18 %of phenotype variability(6). However, otherreports indicate that this effect depends ongenetic background and the populationsevaluated(20).

Two of the four markers analyzed in the presentstudy were included in a study of young

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alélicas de estos marcadores en ganado deregistro, ya que de acuerdo a la cadenaproductiva que prevalece en México, cualquierestrategia de mejoramiento genético empiezaen las razas puras y para rasgos complejoscomo la calidad de la carne, se esperaría queel impacto de este mejoramiento se refleje enel ganado de sacrificio.

Los marcadores de calidad de la carneanalizados en este estudio están incluidos enlas pruebas comerciales para suavidad ymarmoleo de la carne, por lo que se hareportado el efecto favorable de cada variantealélica(6).

De acuerdo a las frecuencias alélicas ygenotípicas obtenidas en las poblacionesanalizadas, todos los hatos muestran frecuenciasde altas a moderadas del alelo reportado comofavorable para los marcadores CAST-T1 (aleloA) y CAPN1-4751 (alelo C), mientras que paralos marcadores CAPN316 y TG5 el aleloreportado como desfavorable fue el de mayorfrecuencia (de 91.5 a 69.1 %, respectivamente).

En un estudio realizado en ganado Charolaisfrancés, Allais et al(11) reportaron frecuenciasalélicas similares a las encontradas en estetrabajo para los marcadores CAST-T1 (altafrecuencia) y CAPN316 (baja frecuencia). Se hareportado que los dos marcadores del genCAPN1 explican hasta el 25 % de variacióngenética en la suavidad de la carne(19) y hastael 18 % de su variabilidad fenotípica(6); sinembargo otros autores han encontrado que esteefecto es dependiente del fondo genético y delas poblaciones donde se evalúa(20).

Recientemente, dos de los cuatro marcadoresanalizados en este trabajo han sido estudiadosen toretes de ganado Charolais Mexicano(21)encontrándose que el marcador CAPN1-4751tiene efecto significativo sobre el área delmúsculo Longissimus dorsi (REA) y grasaintramuscular (IMF) medidos por ultrasonografía;mientras que el marcador TG5 mostró una

Charolais bulls in Mexico(21). The marker CAPN1-4751 had a significant effect on rib eye musclearea (REA) and intramuscular fat (IMF)measured by ultrasound, and the marker TG5tended to associate with yield grade (YG).Research confirming this association, possiblysupported by the National Council on GeneticResources (Consejo Nacional de los RecursosGenéticos - CONARGEN), could help to measuremeat quality traits using ultrasound.

The only study to date on the association ofphenotypic variables to meat quality markers inMexico supports a favorable association betweenmarkers 4751 and TG5, and the traits of cuttingforce and marbling(7). However, this study’slimited sample size and is not considered as avalidation study quantifying the effects of thegenotypes of each marker in these traits. Inthe present study, the frequencies observed forthe four studied meat quality markers justifyimplementation of management strategies aimedat increasing their frequencies, as well as designof studies to evaluate the effect of phenotypein marker-assisted management.

Although genetic differentiation was observedin the studied populations, and deviation waspresent in the HWE of two loci, it is unlikelythat this can be explained by selection for meatquality traits (tenderness and marbling) sincethese are not included in genetic improvementstrategies. The differentiation between thepopulations in the northwest (P<0.0001) andnortheast (P<0.001) could be explained by thesource of genetic material used in herdmanagement. Producers in the northwestcommented that they use Charolais animals andgenetic material from the United States, withalmost no influence from European geneticmaterial. In contrast, producers in the northeastprimarily use genetic material from France. Thiscoincides with a study evaluating moleculargenetic variation in three populations ofCharolais cattle in Mexico(22) in which geneticdifferentiation between populations was aconsequence of selection of genetic materialfor herd management(22).

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tendencia de asociación al grado de rendimiento(YG), por lo que estudios para confirmar estaasociación podrían llevarse a cabo con lasiniciativas por parte del Consejo Nacional delos Recursos Genéticos (CONARGEN) para medirrasgos de calidad de la carne basándose enultrasonografía. El único trabajo de asociacióncon variables fenotípicas con los marcadoresde calidad de la carne reportado a la fecha enMéxico(7), apoya la asociación favorable de losmarcadores 4751 y TG5 a la fuerza de corte ymarmoleo; sin embargo, dado el tamaño demuestra estudiado, no se podría considerar comoun estudio de validación que permita cuantificarel efecto de los genotipos de cada marcador sobreestos rasgos. Las frecuencias encontradas paralos cuatro marcadores de calidad de la carneen las poblaciones Charolais estudiadas justificanla implementación de estrategias de manejo,tendientes a aumentar su frecuencia, así comopara diseñar estudios para evaluar su efectofenotípico del manejo asistido por marcadores.

Aunque se encontró diferenciación genética enlas poblaciones estudiadas y desviación al EHWpara dos loci, es improbable que este resultadopueda explicarse por la selección de los rasgosde calidad de la carne (suavidad y marmoleo),ya que estos rasgos no son considerados en lasestrategias de mejoramiento genético. Estadiferenciación por regiones (poblaciones delnoroeste (P<0.0001) y del noreste (P<0.001)podría explicarse por el origen del materialgenético con el que se manejan los hatos. Deacuerdo con los propietarios de los hatos delnoroeste, su ganado es Charolais americano yla influencia de material genético europeo escasi nula, contrario a los tres hatos del noresteque tienen una alta influencia de materialgenético proveniente principalmente de Francia.Sifuentes-Rincón et al(22) en un estudio paraevaluar la variación genética molecular en trespoblaciones mexicanas de ganado Charolaisuti l izando marcadores microsatéli tes,encontraron diferenciación genética en lapoblación estudiada, la cual fue seleccionadacon base al material genético con el que semejoraban las poblaciones, por lo que concluyen

All four quality markers used in the presentstudy have been validated in the United Statesas predictors of meat marbling and quality.Commercial services are now available offeringDNA tests for these and many other qualityand productivity markers in cattle. This opensthe possibility of producers or cattle associationsemploying these tests as tools to support geneticimprovement programs, thus avoiding selectionof individuals with unfavorable phenotypes.Further research is stil l needed on theassociation of these markers with traits in localpopulations, and validation of these associationsto identify and quantify their effects on all traitsof interest.

CONCLUSIONS AND IMPLICATIONS

No DUMP or ASS carriers were identified in thestudied populations, showing them to haveadequate genetic health. Some carriers of GDS-V were found, highlighting the need for ongoingmonitoring, especially of imported semen.Frequencies of the Q204X allele of the MSTNgene varied among herds, perhaps due to thesource of genetic material used in herdmanagement. Charolais producers need tounderstand the advantages and disadvantagesof this allele in their herds, and use DNA testingto increase or eliminate it, depending on theirproduction goals. Significant genetic differentiationbetween herds was present in the loci associatedwith quality and productivity. The frequenciesof the alleles -reported and in some casesvalidated in the literature- identified in thestudied populations and which are known to befavorable for different quality traits supportimplementation of strategies to confirm theiruse as a tool to complement genetic improvementprograms in the Charolais breed in Mexico.

ACKNOWLEDGEMENTS

Thank to producers of the five studied Charolaisherds and the Asociación Charolais HerdBookde México for providing study materials.

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que la estructura encontrada es consecuenciade este manejo.

Como se expuso, los cuatro marcadores decalidad utilizados en este estudio, han sidovalidados en EU como predictores de la calidady marmoleo de la carne. Existen actualmentecompañías comerciales que ofertan pruebas deADN para estos y muchos otros marcadores decalidad y productividad en ganado bovino, loque ha abierto la posibilidad para que ganaderoso Asociaciones ganaderas las incluyan comoherramienta para apoyar los programas demejoramiento genético, evitando la selecciónde individuos con genotipos no favorables; sinembargo, es muy importante hacer estudios deasociación y validación de los marcadores enlas poblaciones locales, a fin de precisar ycuantificar sus efectos en todos los rasgos deinterés.

CONCLUSIONES E IMPLICACIONES

De acuerdo a los resultados, la salud genéticapara la población estudiada es adecuada paralos desórdenes recesivos UMP y ASS ya que nose detectaron portadores. Se recomienda elmonitoreo de la enfermedad de almacenamientode glucógeno donde se encontraron algunosportadores; este monitoreo es importante sobretodo en los casos de importación de semen.Respecto al alelo Q204X del gen MSTN, susfrecuencias varían entre hatos y podríanrelacionarse con el origen del material genéticoque se utiliza en ellos; es muy importante quelos criadores de esta raza reconozcan lasventajas y desventajas de la presencia de estealelo en los hatos y utilicen la prueba de ADNpara aumentar o eliminar su presencia en suspoblaciones. Las poblaciones estudiadasmostraron diferenciación genética significativacuando se evaluó con los loci asociados a rasgosde calidad y productividad. Las frecuenciasencontradas en la población de estudio de losalelos previamente reportados y en algunoscasos validados en la literatura como favorablespara los diferentes rasgos de calidad, justificanla implementación de estrategias para confirmar

su uti lidad como herramienta paracomplementar los programas de mejoramientogenético de la raza Charolais en México.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el apoyo brindado por losproductores de los cuatro hatos de ganadoCharolais y la Asociación Charolais HerdBookde México, para la obtención del material deestudio.

Proyecto apoyado por fondos FORDECYT116152 y FOMIX Tamaulipas 177460.

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Financial support from FORDECYT 116152 andFOMIX Tamaulipas 177460.

End of english version

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loci asociados con enfermedades genéticas y calidad de ... · sondas específicos para cada snp...

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