RESUMEN La giardiasis es un padecimiento intestinal provocado por el protozoario

flagelado Giardia duodenalis, tiene distribución mundial y se calculan 2.5

millones de decesos asociados a diarrea y deficiencias nutricionales en niños

de países en vías de desarrollo. Giardia presenta dos estadios en su ciclo de

vida: el quiste, la forma infectante y el trofozoito. La infección se adquiere por

ingesta de agua o comida contaminada o por medio de transmisión directa

fecal-oral. Los síntomas de la giardiasis están caracterizados por episodios

agudos de diarrea, dolor abdominal y flatulencia. Las evacuaciones acuosas

pueden estar intercaladas con periodos de movimientos intestinales normales o

constipación. Si el individuo no es tratado, la sintomatología persiste por meses

y conduce a un problema de mala absorción y disminución de peso por

deficiencia de nutrientes. En niños, las infecciones prolongadas pueden cursar

asintomáticas y provocar retraso en el crecimiento.El tratamiento de giardiasis

se ha efectuado clasicamente con tinidazol, metronidazol, furazolidona y

quinacrina con una eficiencia de menos del 90% y albendazol con una

eficiencia del 10 al 95 %. El albendazol fue introducido en 1982 como un

antihelmintico. El primer reporte exitoso se hizo en 1986. Se han desarrollado

otras drogas para ser utilizadas cuandose presente resistencia del parásito a

los fármacos que se usan al momento. Sin embargo, en nuestro pais las

plantas medicinales juegan un papel importante en la práctica de medicina

tradicional, Euphorbia serpyllifolia se utiliza para reumatismo, afecciones

hepáticas, cólicos renales, dolor estomacal, disentería, gastritis, empacho, bilis,

como purgante, para subir de peso, para el postparto y combinado con las

flores para la vesícula

INTRODUCCION La giardiosis es un padecimiento intestinal con distribución mundial. Se

estima que de 3000 millones de personas que viven en condiciones no

adecuadas en países en vías de desarrollo, el 30% padecen giardiosis, lo que

arroja casi 1000 millones de casos y contribuye a los 2.5 millones de muertes

anuales por enfermedades diarreicas (WHO 1998).

Giardia duodenalis (Giardia intestinalis o G. lamblia) presenta dos

estadios en su ciclo de vida: el quiste, forma infectante y el trofozoito. Los

quistes, resistentes al medio ambiente al ser ingeridos desenquistan --por

efecto del pH ácido del estomago-- a su forma vegetativa, el trofozoito que

se replica en el intestino delgado. Algunos trofozoitos, después de su

exposición a las sales biliares se enquistan y son expulsados en las heces. La

infección se adquiere por ingesta de agua o comida contaminada o por medio

de transmisión directa fecal-oral (Adam 2001).

La giardiosis presenta diversas manifestaciones clínicas. Los individuos

infectados pueden cursar con molestias intestinales ligeras que se resuelven

completamente. También pueden desarrollar síntomas más complejos:

episodios agudos de diarrea, con frecuencia se presenta nausea, dolor

abdominal, flatulencia y disminución de peso; incluso el apetito es normal. Las

evacuaciones pueden estar intercaladas con periodos de movimientos

intestinales normales o constipación. Dichos síntomas pueden prolongarse

hasta siete semanas (Farthing 1993). Los factores que determinan la

variabilidad de los síntomas clínicos no están bien entendidos. La severidad de

la infección puede estar relacionada con factores del individuo como estado de

su sistema inmune, estado nutricional y edad, así como diferencias en

virulencia y patogenicidad de las cepas de Giardia infectantes (Thompson et

al. 1993). Si el individuo no es tratado, la sintomatología persiste por meses y

conduce a un problema de mala absorción y disminución de peso. En niños, las

infecciones pueden cursar asintomáticas y si son prolongadas, provocan

retraso en el crecimiento (Farthing 1993). Los individuos asintomáticos que

sufren esta forma crónica pueden permanecer así por años (Adam 2001).

La mayor incidencia se presenta en niños de uno a 9 años y en adultos

de 25 a 44 años, que corresponden a la población económicamente activa. Las

cifras muestran a aquellos individuos con diagnostico positivo para giardiosis.

Sin embargo muchos casos de giardiosis pueden cursar asintomáticos y tener

un impacto social y epidemiológico más significativo ya que estos individuos

incide en la enfermedad como portadores sanos. Las cifras revelan que, a

pesar de los esfuerzos del Sector Salud por difundir un cambio de hábitos, la

giardiosis ha permanecido por décadas como un padecimiento de alto impacto

en la salud pública en el país.

Tratamiento

En el tratamiento de la giardiosis se han utilizado compuestos como

nitroimidazoles que incluyen metronidazol, tinidazol, ornidazol y secnidazol. Los

efectos adversos de este son; dolor de cabeza, vértigo, nauseas, sabor

metálico, no tan frecuente: pancreatitis, toxicidad en el sistema nervioso

central, neuropatía periférica. Se ha observado que este tipo de compuestos en

ratas y en ratones son agentes carcinogénicos y mutagénicos es por eso que

su uso se ha disminuido para el consumo humano.

Quinacrina. Fueron introducido inicialmente como agentes antimalaricos, en la

segunda guerra mundial, después de la guerra se constituyó un agente

importante contra Giardia lamblia con una eficacia del 90% o más. Sus efectos

adversos son; dolor de cabeza, náuseas, decoloración del pelo y las

membranas mucosas, rara vez psicosis toxica.

Furazolidona. Este tipo de compuestos se han utilizado como agentes

antibacteriales, además se encontró que es un buen agente anti – Giardia,

solamente que su presentación en la cual esta autorizado para el consumo

humano es en suspensión por lo tanto este fármaco solamente esta

diagnosticado para poblaciones pediátricas. Sus efectos secundarios son:

nauseas, vomito, diarrea, orina de color café, es un inhibidor de la enzima

mono amino oxidasa (MAO).

Herbolaria En nuestro país existe una tradición en el uso de las plantas medicinales que

data de la época precolombina. Las evidencias arqueológicas señalan la

relación con las plantas en pinturas, esculturas y cerámicas. El Teotihuacan el

mural de Tepantitla presenta una gran variedad de plantas y remedios de los

que se tenía conocimiento. Por otro lado se representa a Xochipilli, el principe

mexica de las flores sentado en un pedestal que se asemeja a un templo

ornamentado con bajorrelieves de plantas entre las que se puede distinguir a

Psylosybe aztecorum y Turbina corimbosa, Nicotiana tabacum y Heiaia

salicifolia. Finalmente el conocimiento médico guardaba una relación estrecha

con lo sagrado y la religión.

Los conocimientos de nuestros ancestros quedaron registrados por Fray

Bernardino de Sahagún en “Historia de las cosas de la Nueva España

Martín de la Cruz médico indígena quien estudio en el Colegio de Santa Cruz

de Tlatelolco, indico a los dibujantes las formas de las plantas e hizo

anotaciones sobre las enfermedades para las que eran útiles. Juan Badiano

tradujo los manuscritos al latín, el documento se llamó Libellus de Medicinlibus

Indorum herbis o Códice Badiano (Alberti-Manzanares, 2006).

Nuestras poblaciones indígenas actuales, en virtud de su contacto con la

naturaleza han adquirido por tradición amplios conocimientos sobre las

propiedades curativas de las plantas.

Euphorbia serpyllifolia Pers. Chamaesyce serpyllifolia ((Pers.)Small.) Pertenece a la familia Euphorbiaceae, son hierbas anuales rastreras que

alcanzan 25 cm de alto. Poseen tallos delgados a veces rojizos. Las hopjas son

eneralmente pequeñas de 3 a 10 mm de laro por 2 7 mm de ancho. con flores

masculinas o femeninas que se pueden encontrar en la misma planta. Se

desarrolla en suelos con textura franca-arcillosa y lugares soleados. Su

distribución va desde el estado de la Columbia Británica, a Michigan Wisconsin,

Sur de California, Texas y México.

En México las especies de Euphorbia se conocen como hierba de la golondrina

a la que se considera que posee propiedades antisépticas en forma de

cocimiento en tratamiento de heridas o llagas. El látex se emplea para

tratamientos de la piel. La infusión también se consume para tratamientos de

diarrea y controlar hemorreas vaginales. En forma de cataplasma se aplica en

mordeduras de víboras, amigdalitis, erupciones cutáneas (salpullido y ronchas)

y verrugas. Es útil en tratamientos de diarreas y como emético, lactogogo y

catártico (González, et al 2004).

MATERIALES Y METODOS

Derivados del albendazolo extractos de E. serpyllifolia

Evaluación del efecto sobre Citoesqueleto de los trofozoitos.

Trofozoitos.

Concentración inhibitoria 50%

Determinación de Viabilidad con azul de tripan

Microscopía de barrido.

Anticuerpos comerciales anti tubulina y anti actina

Microscopia Confocal

Cultivo de Giardia en medio TYI-S-33 (10% suero bovino) 72 horas.

Determinación de curvas de crecimientoa 24, 48 y 72 h.

/

Diagrama de flujo de la estrategia experimental Se probaron los extractos de E. serpyllifolia o los derivados de albendazol

sobre trofozoitos de G. duodenalis para establecer la IC50. Posteriormente se

trataron los trofozoitos durante 24, 48 y 72 h para establecer los modificaciones

al citoesqueleto a través de microscopia de barrido y microscopia confocal

empleando anticuerpos primarios anti actina y antitubulina seguido de

anticuerpos secundarios unidos a FITC o rodamina.

RESULTADOS Crec imiento ce lu lar . Para establecer el crecimiento celular se sembraron tubos con 1x106 células

por mililitro y por triplicado, se incubaron durante 24, 48 y 72 horas con 10

µg/ml de cada compuesto o el extracto metanolico de E. serpillifolia.

Derivados de Albendazol

Si se compara el crecimiento celular con los derivados de albendazol y los

controles a las 24, 48 y 72 h. Se observa una inhibición en el crecimiento en las

células tratadas con los compuesto estudiados. En el caso del RCB20 dicha

inhibición es considerable en comparación con los controles tanto de vehículo

(DMSO) como células no tratadas a las 72 horas. En el caso del compuesto

JVG9 se observa un inhibición del crecimiento aproximadamente al 50% en

comparación con los controles.

Con el objeto de determinar la inhibición del crecimiento de los compuestos

RCB y JVG a diferentes concentraciones (4, 8 y 12 µg/ml se incubaron

trofozoitos por 72 h a las concentraciones mencionadas. Los datos arrojados

indican que existe una inhibición del crecimiento en los compuestos con una

relación de a mayor concentración mayor inhibición en el crecimiento. En el

caso del compuesto RCB20 con la concentración más baja hay una notable

inhibición del crecimiento celular, en comparación con el vehículo y el control

normal.

En el caso del compuesto JVG9 aunque su efecto fue menor que el del

compuesto RCB hubo una inhibición del crecimiento a una mayor

concentración, En comparación con los controles, en la concentración menor

llega casi a la IC50.

Al aplicar en análisis estadístico unifactorial se observa que existe hay

diferencia significativa entre los grupos tratados con respecto al control y el

vehículo de una probabilidad menor de 0.002, lo que indica que el efecto

encontrado es por el tratamiento y no por el vehículo.

Se hizo una comparación de los compuestos RCB20 y JVG9 con el vehículo.

Se observa la tendencia inhibitoria con los derivados y con el vehículo una

ligera tendencia a la disminución probablemente por que es un compuesto

muy polar.

Con los datos obtenidos se determinó la IC50 de cada compuesto.

La concentración inhibitoria al 50% que se obtuvo de la ecuación es

2.50746X10-1 µMOL para el compuesto JVG9.

La concentración inhibitoria al 50% que se obtuvo de la ecuación de la grafica

es 1.14610X10-1 µMOL para el compuesto RCB20.

Grafica 1. Efecto de los derivados de albendazol sobre el crecimiento de los

trofozoitos de G. duodenalis.

Microscopia electrónica de barrido.

Con el objeto de determinar las modificaciones estructurales

producidas al citoesqueleto de los trofozoitos por los compuestos utilizados se

hizo un análisis de microscopia electrónica de barrido. En trofozoitos de G.

duodenalis en células que no recibieron tratamiento, se pueden observar

intactos la estructura del disco ventral y los flagelos (Figura no mostrada). Las

lcélulas conservan su estructura característica con bordes regulares, presencia

de flagelos y disco suctorio no alterado. El JVG9, que mostró inhibir el

crecimiento en una forma ligeramente menor que el RCB20 indujo un daño

considerable en la estructura general de las células. En la Figura 1 se muestras

imágenes donde los trofozoitos sufrieron un efecto sobre toda la estructura

detectandose perforaciones en el citoplasma y disco vetral (panel A) y

alteraciones en los bordes (panel B). Por otro lado, también en los flagelos en

algunos casos se detectó la retracción o ausencia de ellos (panel C). Un

hallazgo importante fue observar que el compuesto JVG9 in dujo el

enquistamiento en un podentaje bajo en las células (panel D). Los quistes

también se ven deterioradospor este compuesto ya que se ve un

desprendimiento de la pared quística. Por lo tanto el compuesto JVG9 tiene

efecto desestabilizador en toda la estructura celular.

El otro derivado utilizado fue el RCB20 que al comparar las graficas de

crecimiento celular se observa que redujo el crecimiento de forma más eficiente

que el compuesto JVG9. La figura 1 muestra la microscopia electrónica de

barrido, de trofozoitos tratados con este compuesto por 72 h, se observan

daños en el citoplasma, en el disco ventral y en los flagelos y en algunos casos

células redondeadas. Cuando se comparan las imágenes de microscopia

electrónica de barrido, se observa que el vehículo (en comparación de las

células control) solo inhibe el crecimiento de las células por ser un compuesto

muy polar pero no altera ninguna de las estructuras celulares, en comparación

de los compuesto trabajados, el JVG9 y el RCB20, que deterioran la estructura

celular afectando los flagelos y provocando perforaciones en el disco ventral e

irregularidades en la membrana (Fig. 2).

Figura 1. Microscopia electrónica de barrido de trofozoitos tratados con el

compuesto JVG9 por 72 h. Las flechas indican las zonas de daño. La barra

indica la magnificación.

Figura 2. Microscopia electrónica de barrido de trofozoitos tratados con el

compuesto RCB20 por 72 h. Las flechas indican las zonas de daño. La barra

indica la magnificación.

Evaluación biológica del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia sobre Giardia lamblia

Para la evaluación del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia

sobre Giardia lamblia se adicionó el extracto a tubos de cultivo del parásito

para observar si el extracto presentaba alguna inhibición sobre el crecimiento

del mis.

El crecimiento del parásito Giardia lamblia en presencia del extracto

metanolico, del vehículo en el que fue disuelto el extracto (DMSO) y una cepa

control a la cual no se le coloco ningún tratamiento. Se observó que el extracto

utilizado presentó una inhibición del crecimiento de las células de Giardia

lamblia, comparado con el crecimiento del control además el vehículo (DMSO)

no afecta el crecimiento del parásito por lo cual podemos asegurar que le

inhibición del crecimiento se debe al extracto metanolico de Euphorbia

serpyllifolia (Grafica 2).

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Grafica 2. Efecto del extracto metanolico sobre el crecimiento de los trofozoitos de G. duodenalis. Determinación de la C.I. 50% del extracto metanolico de Euphorbia

serpyllifolia sobre Giardia lamblia.

Se determinó también la C.I.50% del extracto sobre Giardia lamblia para

lo cual se utilizaron tres concentraciones diferentes del extracto (50, 100 y 200

µg/mL) y se incubaron a 37ºC por 72 horas y se contó el numero de células.

En la grafica 4 se presenta el crecimiento del parásito a diferentes

concentraciones del extracto y comparando con el control (sin tratamiento) se

observa que la C.I.50% se encuentra entre las concentraciones de 100 y 200

µg/mL.

Evaluación del efecto del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia

sobre los trofozoitos de Giarda lamblia utilizando microscopia electrónica de barrido.

Con el objeto de determinar a nivel de estructura el daño provocado por

los extractos de E. serpyllifolia se realizó microscopía electrónica de barrido de

trofozoitos de Giardia lamblia. En imágenes de trofozoitos no tratados se

pueden observar las células con los bordes enteros y la morfología celular

característica del parásito (Figura no mostrada).

En la Figura 3 se muestra la microscopia de barrido electrónica de barrido

de trofozoitos tratados con extractos de E. serpyllifolia a una concentración de

200 µg/mL. Se observa un daño muy claro ya que el extracto provoca

malformaciones estructurales en el parásito como perforaciones y

desintegración de la célula.

Evaluación del efecto del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia

sobre los trofozoitos de Giarda lamblia utilizando microscopia confocal Para determinar el posible daño provocado por el extracto de E.

serpyllifolia sobre el citoesqueleto de tubulina se efectuó microscopio confocal

de trofozoitos tratados, fijados, permeabilizados y teñidos con anticuerpo anti

tubulina. La Figura 3 muestra como las células tratadas con el extracto a

comparación del control sufren modificaciones estructurales sobre el

citoesqueleto de tubulina.

Con el objeto de determinar el posible efecto del extracto de E.

serpyllifolia sobre el enquistamiento se indujeron trofozoitos a enquistar y se

administró el extracto a una concetración de 200 µg/mL. Las células se

incubaron a 37°C por 72 h. En la Figura 4, los paneles A y B muestran la

microscopia electrónica barrido de quistes de Giardia lamblia a los cuales no

se les administro el extracto (controles).

Fig 3. Microscopia de trofozoitos de Giardia lamblia tratados con el extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia a una concentración de 200

µg/mL

Fig. 4. Microscopia de barrido de trofozoitos inducidos a enquistamiento

y tratados con el extracto metanólico de Euphorbia serpyllifolia. Panel A :

células control (sin tratar). Panel B: trofozoitos inducidos y tratados a una

concentración de 200 µg/mL.

IMPACTO De acuerdo a los objetivos planteados se alcanzó el 100%. El impacto sobre el

conocimiento de tratamiento de la giardiosis es relevante ya que es necesario

contar con nuevas drogas puesto que en algunos casos hay pacientes que son

multiresistentes a los tratamientos convencionales. Por otro lado, en el caso de

los extractos de Euphorbia serpyllifolia es crítico fundamentar el uso de esta

planta “hierba de la golondrina” como antiparasitario ya que en muchas

poblaciones de nuestro país alejadas de los centros de salud se utiliza para

este fin.

A B