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    Manual de ProcedimientosLaboratorio deReproduccin Asistida

    2006

    Red Latinoamericana De Reproduccin Asistida ...............................................................

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    Este documento fue preparado por:

    Dr. Ariel Ahumada (Chile) Dr. Santiago Brugo Olmedo (Argentina) Dr. Juergen Liebermann (Alemania) Dra. Ana Lcia Mauri (Brasil) Dr. Randolfo Medina (Venezuela) Dra. Maria Natalia Posada (Colombia) Dr. Luis Roblero (Chile) Dra. Estrella Rosenberg (Venezuela) Dra. M. Teresa Olivieri (Venezuela) Dra. M. Soledad Seplveda (Chile) Dr. Michael Tucker (USA) Dra. M. Teresa Urbina (Venezuela) Dr. Roberto Coco (Argentina) Dra. Catherine Staessen (Blgica)

    Traducido al portugus por:

    Sra. Marina Diaz (Brasil)

    Corregido por:

    Dra. Ana Lcia Mauri (Brasil) Dra. M. Soledad Seplveda J. (Chile)

    Abril, 2006Abril, 2006Abril, 2006Abril, 2006Abril, 2006

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    CREDITOS ...............................................................

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    EDITORIAL ...............................................................

    El Manual de Laboratorio en su nueva edicin busca mantenerlas caractersticas de la versin anterior, o sea, la estandardizacinde los procedimientos laboratoriales de Reproduccin Asistida enLatinoamrica segundo la opinin de sus embrilogos clnicos.Adems, el Manual servir como modelo para los Centros que deseanformar parte de la RED y que quieren adaptar su laboratorio segundolas normas de acreditacin de nuestra institucin.

    La Direccin Ejecutiva de la RED agradece la participacin de todoslos embrilogos clnicos, especialmente Soledad Seplveda, quinha coordinado ese grupo.

    La edicin en espaol y ahora tambin en portugus hace posiblela propagacin de las informaciones y respeta la individualidadidiomtica de los diferentes pases que compone la RED.

    Finalmente, mis votos de suceso para esa nueva realizacin de laRED.

    Prof. Dr. J.G. Franco JuniorDirector EjecutivoRed Latinoamericana de Reproduccin Asistida

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    INDICE ...............................................................

    INTRODUCCION:1. Maduracin meitica del ovocito.2. Fecundacin en mamferos.3. Desarrollo preimplantacional.

    CAPITULO I:PREPARACION DE UN LABORATORIO PARAREPRODUCCION ASISTIDA

    1. Recomendaciones para la construccin de un Laboratorio deReproduccin Asistida.

    2. Normas de trabajo para el Laboratorio de Reproduccin Asistida.

    3. Normas de aseo del personal que participa en un procedimientode Reproduccin Asistida.

    4. Acondicionamiento fsico de un Laboratorio de ReproduccinAsistida cuando se trabaja en ciclos.

    5. Rutinas diarias de chequeo en un Laboratorio de ReproduccinAsistida.

    6. Otras normas de trabajo.

    7. Certificacin de equipos.

    8. Controles biolgicos.

    CAPITULO 2:PROCEDIMIENTOS DE REPRODUCCION ASISTIDA

    1. Tipos de procedimientos.

    2. Medios de cultivo.

    3. Mtodos de preparacin y seleccin de espermatozoides.

    4. Recepcin de ovocitos durante la aspiracin folicular.

    5. Clasificacin de la madurez somtica del complejo cmulo-corona-ovocito.

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    6. Inseminacin.

    7. Evaluacin de la fecundacin.

    8. Desarrollo preimplantacional in vitro.

    9. Evaluacin del desarrollo embrionario.

    10.Transferencia de embriones.

    CAPITULO 3:FECUNDACION ASISTIDA : INYECCIONINTRACITOPLASMATICA DE ESPERMATOZOIDES (ICSI)

    1. Preparacin de los ovocitos para ICSI: tratamiento conhialuronidasa.

    2. Realizacin de la tcnica de ICSI.

    3. Procesamiento de las muestras de espermatozoides segnsu clasificacin.

    4. Puncin de epiddimo.

    5. Biopsia testicular.

    6. Protocolos accesorios.

    CAPITULO 4:CRIOPRESERVACION DE GAMETOS, CIGOTOS Y EMBRIONES.

    1. Criopreservacin de espermatozoides.

    2. Criopreservacin de ovocitos.

    3. Criopreservacin de cigotos y embriones.

    4. Tips para mejorar la tasa de sobrevida de los embriones.

    5. Mantenimiento de los equipos y problemas ms frecuentes.

    6. Vitrificacin y descongelacin de ovocitos, cigotos yembriones: una alternativa a la criopreservacin convencional.

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    CAPITULO 5:CULTIVO Y CRIOPRESERVACION DE BLASTOCISTOS.

    1. Cultivo de blastocistos en medios secuenciales.

    2. Congelacin lenta de blastocistos.

    3. Vitrificacin de blastocistos con el sistema de hemi-pajuela.

    CAPITULO 6:DIAGNOSTICO GENETICO PREIMPLANTATORIO (PGD)

    1. Quines podrian acceder al PGD?

    2. Las principales ventajas del PGD.

    3. Cmo se realiza el PGD?

    4. Cmo se realiza la biopsia?

    5. Es seguro el PGD?

    6. Requisitos para realizar el PGD.

    7. Consideraciones especiales.

    8. Equipos y materiales.

    9. Realizacn de la tcnica de PGD/PGS.

    10. Procedimiento para realizar el FISH en dos etapas.

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    En los mamferos, los ovocitos permanecen detenidos en la profasede la primera divisin meitica, hasta que la hembra experimenta lamadurez sexual. Con el estmulo hormonal apropiado, el ovocitoadquiere gradualmente la competencia para entrar en la etapa final de laprimera divisin meitica, a medida que aumenta de tamao durante lamaduracin folicular. La estimulacin por la hormona luteinizante (LH),ocasiona la maduracin nuclear del ovocito, el que experimenta rupturade la vescula germinativa. Los cromosomas se ensamblan en el husomeitico I y ocurre la primera divisin meitica: un set de cromosomashomlogos rodeado por una pequea cantidad de citoplasma es extruidocomo primer corpsculo polar. En este estado cada cromosoma estcompuesto por cromtidas hermanas las que no se separan hasta laanafase de la segunda divisin meitica (figura 1).

    Figura 1: Meiosis en el Ovocito

    La meiosis II prosigue y el ovocito entra en arresto de divisin, conlos cromosomas alineados en la placa ecuatorial del segundo husomeitico. En este estado el ovocito es liberado del folculo y ocurre laovulacin, en respuesta al pico de LH.

    1. MADURACION MEIOTICA DEL OVOCITO HUMANO

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    La fecundacin de un ovocito comprende una serie de eventosque ocurren en un orden cronolgico y que llevan a la incorporacindel material gentico del espermatozoide en el citoplasma del huevo,dando origen a la formacin de un zigoto.

    Durante el trnsito por el tracto genital hasta las trompas deFalopio, el espermatozoide se capacita, es decir, le ocurren cambiosfisiolgicos y estructurales que le permiten hiperactivarse y luegoexperimentar la reaccin acrosmica. La cabeza delespermatozoide hiperactivo se une a la zona pelcida del ovocito(unin primaria), mediante la interaccin de residuos carbohidratode un componente de la zona pelcida ZP3 con molculas ligandoen la superficie del espermatozoide. Esta unin provoca lareaccin acrosmica, en que se fusiona la membrana acrosomalexterna con la membrana plasmtica del espermatozoide,liberando el contenido acrosomal, cuyo componente principal esla serina proteasa, acrosina.

    La unin primaria progresa a una unin denominada uninsecundaria que corresponde a una interaccin especie-especficaentre otro componente de la zona pelcida ZP2 y acrosina. Mediantela accin protesica de acrosina el espermatozoide se suelta y vuelvea interactuar con la zona pelcida, penetrndola luego de ciclosalternados de unin y lisis. El espermatozoide alcanza as el espacioperivitelino, toma contacto con la membrana plasmtica del ovocitoy la cola cesa de batir. Se fusiona la membrana plasmticapostacrosomal con la membrana plasmtica del ovocito,incorporndose el espermatozoide al citoplasma.

    La fecundacin induce la reaccin cortical en el ovocito, que asu vez provoca la reaccin de zona. La reaccin cortical consisteen la liberacin del contenido enzimtico de los grnulos corticalespor fusin de la membrana plasmtica del ovocito con la membranade los grnulos. La difusin de este contenido a travs de la zonaprovoca cambios estructurales que impiden la unin de nuevosespermatozoides.

    2. FECUNDACION EN MAMIFEROS

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    La fecundacin activa el ovocito que se encontraba detenido en lametafase de la segunda divisin meitica (figura 2 a y b).

    Se completa esta divisin eliminndose el segundo cuerpo polar(figura 2 c). El material gentico haploide del ovocito y delespermatozoide se rodea de membrana nuclear, constituyendo losproncleos femenino y masculino, que migran hacia el centro de laclu