LA DIAGNOSI DEI

LINFOMI MALIGNI ATTRAVERSO

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE

Dott.ssa Cristina Colarossi

Anatomia Patologica

Istituto Oncologico del Mediterraneo

Catania

Linfomi

• I Linfomi sono malattie monoclonali neoplastiche

caratterizzate dalla proliferazione di linfociti B o T negli

organi linfoidi.

• Causano un sovvertimento strutturale del linfonodo

• Nella maggioranza dei casi la diagnosi si basa su aspetti• Nella maggioranza dei casi la diagnosi si basa su aspetti

morfologici ed immunofenotipici

• Nel 5-15% dei casi sono necessarie analisi molecolari per

conferma diagnostica

ANATOMIA DEGLI ORGANI LINFOIDI

Classificazione dei linfomi

A CELLULE B

• Immature

• Mature

• CLL/SLL

• A CELLULE T/NK

• Immature

• Mature

• NOS

• Angioimmunoblastico• Folliculare

• Marginale

• Diffuso a grandi cellule

• Mantellare

• Burkitt

• Mieloma plasmacellulare

• Angioimmunoblastico

• Micosi fungoide/Sézary

• Anaplastico a grandi cellule

• LINFOMA DI HODGKIN

Clonalità dei linfomi

• L’analisi della clonalità delle cellule linfoidi attraverso

l’amplificazione, mediante PCR, delle regioni VDJ dei geni

delle immunoglobuline (IG) e del recettore dei linfociti T

(TCR) permette di distinguere processi reattivi (policlonali)

dalle neoplasie (monoclonali)dalle neoplasie (monoclonali)

• I segmenti genici V (Variable) sono collocati

all'estremità 5' di ciascun locus delle Ig. Sono lunghi

mediamente 300 bp.

• I segmenti genici D (Diversity) sono collocati oltre i

segmenti V e sono presenti solo nel locus per le catene

pesanti delle Ig

LOCI DELLE IMMUNOGLOBULINE

pesanti delle Ig

• I segmenti genici J (Joining) sono collocati a valle dei

segmenti D. Ciascun segmento J è lungo 30-50 bp.

• I segmenti genici C (Constant) codificano per la

regione costante delle catene pesanti e delle catene

leggere Ig

Loci delle catene delle immunoglobuline

TCR

• I loci codificanti per le quattro catene del TCR (α, β, γ, δ)

sono collocati

• sul cromosoma 7

• sul cromosoma 14• sul cromosoma 14

• Nei loci per i geni del TCR la struttura è simile a quella dei

loci genici per le Ig, si riscontrano ancora una volta

segmenti V, D, J e C.

• Le catene α e γ non possiedono segmenti D

Loci del TCR

Riarrangiamenti genici

• I geni delle immunoglobuline e del TCR contengono molti

segmenti VDJ che vengono riarrangiati durante lo

sviluppo iniziale dei linfociti

• Il processo di riarrangiamento affianca casualente un

segmento V, uno D, ed uno J in modo da creare le regionisegmento V, uno D, ed uno J in modo da creare le regioni

variabili di geni ricombinati che possono essere trascritti

in mRNA e codificare per i recettori dell’antigene.

Fasi del Riarrangiamento

• I riarrangiamenti sono mediati da un complesso

enzimatico nel quale le proteine RAG1 e RAG2

agiscono tagliando a livello di speciali sequenze

segnale (regioni RSS)

• Dopo il taglio inserzioni o delezioni di nucleotidi

aumentano la diversificazione

• L’ultima tappa è l’avvicinamento dei segmenti

genici

Clonalità dei linfomi

• Clonalità linfomi B

• Valutazione molecolare delriarrangiamento del geneIgH:(catena pesante delleimmunoglobuline)

• Clonalità linfomi T

• Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene gamma del recettore dei linfociti T (TCR gamma)immunoglobuline)

• Valutazione molecolare delriarrangiamento del geneIgK: (catena leggera delleimmunoglobuline)

linfociti T (TCR gamma)

• Valutazione molecolare del riarrangiamento del gene beta del recettore delle cellule T (TCR beta).

BIOMED 2

• Uno studio coordinato dal gruppo BIOMED 2 (ora

chiamato euroclonality consortium) ha standardizzato i

protocolli con multipli set di primers (Van Dongen,

Leukemia, 2003)

• Numerosi lavori scientifici nel decennio successivo hanno• Numerosi lavori scientifici nel decennio successivo hanno

confermato la sensibilità, specificità e riproducibilità dei

test

• Tali protocolli possono essere applicati allo studio di

campioni fissati in formalina ed inclusi in paraffina,

agoaspirati e biopsie osteomidollari decalcificate

Limiti degli studi molecolari• Sensibilità limitata in caso di un normale background

policlonale, (es Linfoma B T cell rich) con percentuale di

linfociti clonali < 10%

• Clonale non è sempre sinonimo di malignità (processi

linfoproliferativi EBV correlati o proliferazioni cutanee

benigne a fenotipo T)benigne a fenotipo T)

• I riarrangiamenti di Ig e TCR non sono esclusivi di

una linea cellulare: riarrangiamenti di TCR possono

riscontrarsi in neoplasie immature a fenotipo B o alcune

leucemie mieloidi acute.

Valutazione qualità del DNA

• Il DNA estratto da tessuti FFPE è di qualità subottimale e

potrebbe contenere inibitori della PCR

• E’ essenziale valutare l’integrità e l’amplificabilità del DNA

• Il protocollo BIOMED 2 ha standardizzato una multiplex

PCR contenente i primers di geni housekeeping di 100,PCR contenente i primers di geni housekeeping di 100,

200, 300 e 600 paia di basi

• Per l’analisi di IGH/TCR la PCR di controllo dovrebbe

amplificare prodotti di almeno 300 bp

Analisi qualitativa DNA

AF4

PLZF

RAG1

TBXAS

La presenza delle 4 bande indica che il DNA genomico

è integro. La qualità del campione è idonea per

effettuare amplificazioni, mediante PCR, anche di

frammenti di grosse dimensioni

Clonalità IGH

• Tre set di primers amplificano 3 regioni nella regione

variabile e la regione J

• Due set di primers amplificano la regione D e J

• L’analisi dei prodotti di PCR può essere condotta con

metodica:metodica:

• Heteroduplex: i prodotti di PCR vengono denaturati a

95°, rinaturati a 4°e poi corsi su gel di poliacrilamide al 6%

• Gene scanning: i primers devono essere marcati con

fluorocromo per analizzare i prodotti di PCR con metodi

automatizzati (es sequenziatore 3500)

Clonalità IGH

Analisi dei prodotti di PCR

Analisi riarrangiamento del gene IGH

Ipermutazione somatica (Maturazione

dell’affinità• Negli organi linfoidi periferici i linfociti B maturi

(centrociti o cellule del centro germinale)

subiscono un’ulteriore diversificazione nel sito di

riconoscimento antigenico tramite il processo di

ipermutazione somatica.ipermutazione somatica.

• Dopo l’incontro con l’antigene e la stimolazione del

linfocita B da parte di un linfocita T helper, si

generano delle mutazioni puntiformi nelle regioni

geniche codificanti per i domini variabili di IGH.

Leucemia Linfatica Cronica

• In circa il 50% dei casi la cellula neoplastica origina in una

fase di maturazione linfocitaria antigene indipendente

(pre-centro germinativo nel linfonodo). Non sono

presenti mutazioni somatiche del gene IgVH

• Nel restante 50% dei casi circa la cellula neoplastica

origina in fase maturativa Ag dipendente, post centro

germinativo. Sono presenti mutazioni somatiche del

gene IgVH

Stato mutazionale di IGVH nella LLC

• M-CLL (mutata): a buona prognosi;

• U-CLL (non mutata) a prognosi infausta

• Cut-off: 98% di identità con la sequenza germline• Cut-off: 98% di identità con la sequenza germline

• Linee guida per l’analisi molecolare (EuropeanResearch Initiative on CLL, ERIC reccomendation)

• Lo stato mutazionale puo’essere determinato in qualsiasi momento.

IGH Hypermutation

Traslocazioni e riarrangiamenti nei linfomi

Riarrangiamenti

B-cell Linfoma/Leuk Catene pesanti Ig

T-cell Linfoma/Leuk T-cell receptor

Patologia Traslocazione Geni coinvolti

Linfoma follicolare t(14;18) BCL2-IgH

Linfoma mantellare t(11;14) BCL1-IgH

Linfoma di Burkitt t(8;14) MYC-IgH

Linfoma anaplastico t(2;5) ALK-NPM

BCL2/IGH t(14;18)(q32;q21)

• Presente nel 90% dei FL e nel 20% dei DLBCL

• Giustappone il gene che codifica per l’elemento J delle

catene pesanti delle immunoglobuline, (14q32), al gene

Bcl-2 (18q21)

• Pone BCL2 sotto il diretto controllo trascrizionale di• Pone BCL2 sotto il diretto controllo trascrizionale di

enhancers del locus IGH e successiva alterazione

dell’espressione della proteina

• La valutazione della traslocazione è di ausilio diagnostico

per distinguere il linfoma da iperplasia linfoide benigna

• Monitorare la recidiva neoplastica e la malattia minima

residua.

BCL2/JH

• Maior Breakpoint Region (MBR): 70% delle rotture del

gene bcl2 al livello del terzo esone

• Minor cluster region (mcr) :I rimanenti punti di rottura

sono situati 20 kb a valle del terzo esone.

• Analisi cariotipica

• FISH

• Southern blotting

• PCR

Traslocazione t(14;18) BCl2/JH

Dimensione ampliconi di controllo

CT (+): 250 bp

CT (-): --- bp

FOLLOW UPLa malattia minima residua

• La presenza di un basso numero di celluleneoplastiche dopo terapia viene definito comemalattia minima residua (MRD)

• Metodiche di RT PCR consentono di evidenziare• Metodiche di RT PCR consentono di evidenziarela presenza di numerose traslocazioni conmaggiore precisione e sensibilità (1x105) rispettoalla citogenetica convenzionale (1x102)

• RT-PCR è pertanto il metodo di scelta permonitorare la risposta al trattamento el’eradicazione completa di cellule neoplastichedurante il corso della malattia

NEXT GENERATION SEQUENCING

NGS

NGS

• Le due tipologie di piattaforme NGS più diffuse

permettono il sequenziamento parallelo massivo

di molecole di DNA amplificate in modo clonale.

• Nelle tecnologie NGS, il sequenziamento viene• Nelle tecnologie NGS, il sequenziamento viene

effettuato mediante cicli ripetuti di estensioni

nucleotidiche ad opera di una DNA-polimerasi.

• La procedura è parallela e massiva, e consente

di sequenziare da centinaia di Mb fino a Gb di

DNA in un’unica seduta analitica.