infezioni da hpv: prime esperienze nel campo della
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Infezioni da HPV:
prime esperienze nel campo della
Biologia Molecolare
Taranto, 3 Novembre 2004
Dott.ssa Rosa Tripaldi
Dr.ssa Rosa Tripaldi 2
HPV
Dr.ssa Rosa Tripaldi 3
Papovaviridae
• 2 Genera:
– Papillomaviruses:
• Human, Rabbit, Bovine, Canine, Equine
– Polyomaviruses:
• Mice, BK & JC viruses (man), RK virus (rabbit), SV40
(monkey)
• ds DNA, 45nm, non-enveloped, icosahedral
• Cyclic, infectious when separated from capsid
Human Papillomavirus (HPV)
General:
• Ether-resistant, acid & heat stable
• Circular dsDNA ~8kb, non-enveloped
• Icosahedral,72 capsomeres, 55nm diameter
• Surface Antigen
• Over 100 genotypes*, High & Low Risk strains
• Causes warts; transforms cells
• Polycistronic, 8 ORF
• Genome: 3 Regions
• Replicates in Nucleus
• Plasmid-like state
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Incidenza e distribuzione dei tumori da HPV
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Il primo tumore solido che è stato
riconosciuto essere di origine virale è
il carcinoma della cervice …
e l’ HPV ne è l’agente causale
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Ruolo dell’HPV nel tumore cervicale“ A partire dalla seconda metà degli anni ‘90 numerosi studi hanno dimostrato che il Papilloma Virus Umano (HPV) è presente nella quasi totalità dei tumori cervicali
“ La persistenza di alcuni tipi virali aumenta la probabilità di sviluppo di un tumore cervicale
“ Attualmente sono stati identificati 200 tipi di HPV, di cui 85 genotipi ben caratterizzati
“I genotipi HPV coinvolti nelle infezioni genitali sono circa una trentina, distinti in basso e alto rischio oncogeno
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La prevalenza dell’HPV nei Carcinomi
della cervice è praticamente totale: 99.8%
Una relazione più forte di quella
tra tabacco e CA polmonare
tra epatite B e CA epatico
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A livello mondiale il carcinoma cervicale è la prima causa di morte per tumore nella popolazione femminile:
470 mila nuovi casi/233 mila decessi all’anno
In Europa è la seconda, dopo il tumore al polmone:
65 mila nuovi casi/28 mila decessi all’anno
Struttura del virus
3 Regioni:LLR=Long Regulatory Region (non coding)E=Early Region (encodes proteins)L=Late Region (encodes capsid proteins)
HPV: virus a dsDNA circolare di circa 8000 bp con capside proteico
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HPV: Life Cycle
Copyright © 1999 Academic Press
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HPV Genome: Proteins
• E1: Initiation of DNA replication (helicase)
• E2: Transcriptional regulation/DNA replication
• E4: Late NS protein; Disrupts cytoskeleton
• E5: Transforming protein, interacts with growth
factor receptors, e.g. PDGF
• E6: Transforming protein, binds to p53 leading to
degradation
• E7: Transforming protein, binds to pRB
• L1: Major capsid protein (capsomeres)
• L2: Minor capsid protein
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La persistenza dell’infezione da HPV
è condizione necessaria allo sviluppo
del cervicocarcinoma
Progressione a Carcinoma indotta da HPV“ L’HPV è responsabile della alterata regolazione del ciclo cellulare
che conduce alla trasformazione maligna “ La presenza persistente di HPV è condizione essenziale……anche se da sola non basta allo sviluppo del Carcinoma cervicale
HPV
infezione
HPV
infezione
persistente
Alterata
regolazione
cellulare
CIN
“High grade
Carcinoma
Invasivo
Fattori
Immunologici Co-carcinogeni
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Progressione della malattia: dall’infezione HPV a Cervicocarcinoma : > 10 anni
Infezione
Clearance
Progressione
Regressione
Invasione
Cervice
con
Infezione
HPV
6-13 anni
Persistenza
(oltre 1 anno)
Cervice
normaleCancro
Anormalità citologiche
moderate
Risoluzione spontanea
nell’ 80 % delle infezioni
Lesione
precancerosa
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“Lo sviluppo del tumore cervicale è preceduto dalla comparsa di lesioni pre-cancerose che impiegano molti anni ad evolvere in carcinoma invasivo
“poiché sono lesioni asintomatiche possono essere rilevate solo grazie a programmi di screening
“se rilevate per tempo possono essere eliminate con intervento ambulatoriale di efficacia quasi del 100%
UN CORRETTO PROGRAMMA DI SCREENING POTREBBE ELIMINARE COMPLETAMENTE IL TUMORE CERVICALE
Terminologia“ CIN: cervical intraepithelial neoplasia, di grado I, II o III stabilito in seguito a prelievo bioptico ed esame istologico
“ ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance; è la forma più lieve di anomalia citologica
“ LSIL: low-grade squamous intraepithelial lesion (CIN I nel vecchio sistema di classificazione) di solito a regressione spontanea
“ HSIL: high-grade squamous intraepithelial lesion; è l’anomalia non cancerosa più grave e richiede trattamento immediato
“ Displasia: anomalie nella divisione cellulare o nella morfologia
“ Carcinoma in situ: forma di HSIL refertata al Pap test come tumore cervicale
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Prevalenza di HPV
010
20
30
40
5060
70
80
90
100
Normal ASCUS Low-CIN High-CIN InvasiveCancer
11.2%
55.0%
88.8%
72.9%
>95%
HPV HPV
DNADNA
%%
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Contatto con HPV: quasi sempre regressione spontanea
La persistenza di HPV ‚high risk‛ può condurre a stati pre-cancerosi (CIN)
La presenza di HPV e CIN3 è condizione necessaria per l’accumulo di mutazioni random che possono portare allo sviluppo del tumore cervicale
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Sensibilità relativa delle tecniche di analisi
degli acidi nucleici
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PCR
1984 Kary Mullis at Cetus
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Tipologia di campione
• Materiale istologico
sezioni tagliate al microtomo di materiale fissato
ed incluso
• Materiale cellulare a fresco prelevato in
sede cervico-vaginale
sospensione di cellule prelevate mediante
Bactopick o Cytobrush dall’eso-endocervice,
fornici e vagina
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Percorso diagnostico
HPV DNA screening
Se positivo
HPV Genotipizzazione
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Fasi del processo analitico
HPV DNA screening
• Estrazione
• Amplificazione
• Rilevazione
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Estrazione
• In generale l’acido nucleico è liberato dalla cellula per digestione con proteinasi K, lisi con agenti caotropici, lisi osmotica a caldo o lisi alcalina a caldo.
• A questa prima fase può seguire una purificazione con solventi organici, resine, matrici di silice, precipitazione in alcoli.
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Amplificazione
.
• Viene utilizzata una
sequenza della
regione L1, comune a
circa 40 tipi di HPV,
compresi tutti quelli
d’interesse clinico.
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Rivelazione
• La rivelazione degli
amplificati è condotta
mediante elettroforesi
in gel di agarosio, in
tampone TBE 1x,
colorato con bromuro
di etidio
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standard interno 600 bp
Frammento
specifico 450 bp
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HPV GENOTIPIZZAZIONE
• Sui casi positivi si esegue la tipizzazione:
alto rischio (16,18,31,33,35,45,52,58)
basso rischio (6,11)
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Strategie di tipizzazione dell’HPV
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HPV – Genotipizzazione
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HPV ” Genotipizzazione
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1. Organizzazione di
Laboratorio e strumentazione
necessaria
2. Aspetti pre-analitici
3. Fattori interferenti con le procedure
analitiche
4. Il Sistema di Garanzia di
Qualità Totale
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Preparazione del campione
Preparazione del reagente e conservazione
Pre-amplificazione reazione iniziale
Amplificazione
Conservazione del kit
Analisi del prodotto della PCR
Stoccaggio concentrato di controlli positivi
conservati
Area priva del prodotto PCR
Area contenente il prodotto PCR
Ricevimento e accettazione del campione
Flusso di lavoro unidirezionale
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Abbinamento dello screening con Pap test e conferma con HPV
Citologia cervicale di routine: Pap test
Positivo Negativo
ASC-US: diagnosi citologica
Eseguire Colposcopia
Eseguire Colposcopia citologia cervicaledi screening
citologia cervicale
di screening
* Source: ACCSP Guidelines – JAMA
Risultati Pap Anomali,ASC-USe HPV
positivo
Risultati NormaliPap test
ASC-US Pape HPV
negativo
Ripetere il Pap Test entro 6 mesi
HPV DNA test sui campioni cellulari
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Linee guida dell’ESIDOG (European Society for Infectious and Immunological Diseases in Obstetrics and Gynaecology)
L’impiego di test HPV è stato valutato per le seguenti categorie:
“donne > 30 anni: screening primario del tumore cervicale in combinazione con l’esame citologico
“ pazienti con referti citologici indefiniti (ASC-US)
“ pazienti con stadi precancerosi lievi e moderati (LSIL, HSIL) per prevederne la regressione, la persistenza o la progressione
“ pazienti già sottoposte a trattamento per CIN (displasia) e carcinoma cervicale
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Attuale utilizzo clinico accettato del test HPV DNA :
“ Conferma dei casi ASCUS ( TRIAGE )“ Follow up dei casi CIN 2, 3 per predire la regressione ”
progressione“ Dopo trattamento per displasia per predire la possibilità di recidive