fundamentos da cromatografia
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8/19/2019 Fundamentos da Cromatografia
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SENAI - Curso de Tecnologia emProcessos Quimicos
Analise Instrumental -Prof Eduardo Louzada 1
11
EDUARDO SANTOSEDUARDO SANTOS
LOUZADA LOUZADA
FUNDAMENTOSFUNDAMENTOSDEDE
CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA
Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange Curso de Tecnologia em Processos Quimicos
22
CROMATOGRAFIAMichael Tswett - 1906
Separação da clorofila de umamistura de pigmentos de planta.
33
Carbonato de cálcio em pó
Pequena quantidade de amostra
Éter de petróleo
Bandas separadas e de cores distintas.
CROMATOGRAFIA
44
CROMATOGRAFIAéter depetróleo
CaCO3
mistura dePigmentos(clorofila)
pigmentosseparados
55
CROMATOGRAFIA
Kroma = cor Graph = escrever
Escrevendo em cores
66
CROMATOGRAFIAUma amostra a ser analisada é
freqüentemente uma mistura de vários
componentes numa matriz complexa.
Para amostras que contenham
componentes desconhecidos, eles precisam ser
separados dos demais, de modo que cada
componente individual possa ser identificado .
PROBLEMA:
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CROMATOGRAFIA
Separação de misturas por interaçãodiferencial dos seus componentes entre
uma FASE ESTACIONÁRIA e umaFASE MÓVEL .
Princípio Básico
88
Nos processoscromatográficos , estãoenvolvidos duas fases,
sendo que uma selocomove através de uma
outra. Assim, a fase que semove denomina-se
fase móvel, e a que não selocomove denomina-sefase estacionária ou
suporte.
FASE ESTACIONÁRIA
99 1010
CROMATOGRAFIA
1111TEMPO 1212
CROMATOGRAFIAUSOS E APLICAÇÕES
Ferramenta analítica para separação demisturas.
Combinada com química convencional ouinstrumental – identificar espécies químicas.
Qualitativamente e Quantitativamente
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Métodos CromatográficosCromatografiaCromatografia
PlanarPlanar ColunaColuna
F.M. LíquidaF.M. Líquida
C.CamadaC.Camada
DelgadaDelgadaC.PapelC.Papel
F.M. GasosaF.M. Gasosa F.M. LíquidaF.M. Líquida
C. GasosaC. Gasosa CLAECLAECCCCCC
CCCCCC-Cromatografia em Coluna Clássica.CLAECLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
1414
CROMATOGRAFIA PLANARCROMATOGRAFIA PLANAR
A FaseA FaseEstacionária éEstacionária é
colocada em umacolocada em umasuperfície planasuperfície plana
(Placa de Vidro(Placa de Vidroou Papel)ou Papel)
1515
CROMATOGRAFIA EM COLUNACROMATOGRAFIA EM COLUNA
A Fase Estacionária é colocada em umtubo cilíndrico (Coluna Cromatográfica)
1616
1) Quanto ao método de aplicação daamostra e seu subseqüente
desenvolvimento:
Eluição
Deslocamento
Análise Frontal
Critérios de Classificação
1717
Eluição:A Introdução da amostra é feita
em uma única aplicação, com uma fasemóvel pura, que arrasta a amostra
ao longo da placa ou coluna.Este é o método mais utilizado
na cromatografia analítica.
1818
Deslocamento:Os componentes da amostra são
retirados da fase estacionária usandouma fase móvel que tem mais
afinidade poreles. Este método é mais utilizadoem cromatografia preparativa, em
nível industrial.
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1919
Análise Frontal:Análise Frontal:
A amostra éA amostra écontinuamentecontinuamenteaplicada à umaaplicada à uma
coluna, contendo acoluna, contendo afase estacionária,fase estacionária,
sendo osendo ocomponentecomponente
menos retido, omenos retido, oúnico que sai naúnico que sai naforma pura.forma pura.
2020
2) Mecanismos de separação:
Físico
Químico
Mecânico
Critérios de Classificação
2121
Físico:
Quando se trata dafase estacionáriasólida , a adsorçãodo soluto ocorre nainterface entre o
sólido e a fasemóvel, devido apresença de grupos
ativos na suassuperfícies.
..2222
Químico:É usado em
cromatografia portroca iônica. A
fase estacionáriaé constituída de
uma matriz ondesão adicionadosgrupos funcionais
ionizáveis
2323
Mecânico:É usado emcromatografia por
exclusão. Asmoléculas menores
da amostra sãoseparadas dasmaiores porquesão capazes de
penetrarfacilmente em
todos os poros dafase estacionária. 2424
Centrifugação Cristalização
Destilação Extração
Filtração
PROCEDIMENTO SIMPLES DE SEPARAÇÃO
••CromatografiaCromatografia
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE SEPARAÇÃO
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CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA
PLANAR PLANAR
Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange Curso de Tecnologia em Química Fármaco-Industrial
EDUARDO SANTOSEDUARDO SANTOS
LOUZADA LOUZADA
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Métodos CromatográficosCromatografiaCromatografia
PlanarPlanar ColunaColuna
F.M. LíquidaF.M. Líquida
C.CamadaC.Camada
DelgadaDelgadaC.PapelC.Papel
F.M. GasosaF.M. Gasosa F.M. LíquidaF.M. Líquida
C. GasosaC. Gasosa CLAECLAECCCCCC
CCCCCC-Cromatografia em Coluna Clássica.CLAECLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
2727
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Técnica simples e econômica de separação doscomponentes de uma mistura.
Cromatografia
líquida-líquida e aseparação ocorrepor absorção
(solubilidade) dosoluto entre os dois
líquidos. 2828
Diferentes solubilidades relativas doscomponentes da amostra na fase móvel (líquida -solventes) e na fase estacionária (líquida – Água
retida na celulose).
Componentes menos solúveis na faseestacionária têm uma movimentação mais rápida,enquanto os mais solúveis serão seletivamente
retidos com uma movimentação mais lenta.
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
2929
FASE MÓVEL E
FASE ESTACIONÁRIA
A celulose do papel é constituída por 2.000ou mais unidades de glicose anidra ligadas
por átomos de oxigênio.
Um líquido polar como a água terá grandeafinidade pelas hidroxilas de cada glicose,
formando pontes de hidrogênio: fica retido efunciona como fase estacionária.
3030
Líquidos menos polares (solventesorgânicos): são repelidos por essa estrutura
e funcionam como fase móvel.
n -pentano, ciloexano, tetracloreto de carbono,benzeno, tricloroetileno, clorofórmio, éteretílico, acetato de etila, amônia, acetona,
etanol, metanol, acetonitrila e água
FASE MÓVEL E
FASE ESTACIONÁRIA
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3131
Aplica-se através deum tubo capilar ou
micropipeta.
É recomendávelque a amostra seja
dissolvida numsolvente bastante
volátil
APLICAÇÃO DA AMOSTRA
3232
Ascendente.
TIPOS
Descendente.
Horizontal (circular).
Bidimensional.
3333
Ascendente. Descendente.
3434
Horizontal (circular). Bidimensional.
3535
Cromatografia em papelDetecção
Análise qualitativa: Rf (fator de retenção) Cor da Mancha
Análise quantitativa: Diretamente no papel
– Comparação da intensidade das cores das manchas– Área da mancha– Densitômetria ( Intensidade da cor)
3636
Métodos CromatográficosCromatografiaCromatografia
PlanarPlanar ColunaColuna
F.M. LíquidaF.M. Líquida
C.CamadaC.Camada
DelgadaDelgadaC.PapelC.Papel
F.M. GasosaF.M. Gasosa F.M. LíquidaF.M. Líquida
C. GasosaC. Gasosa CLAECLAECCCCCC
CCCCCC-Cromatografia em Coluna Clássica.CLAECLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.
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3737
A Cromatografia em Camada Delgada(CCD) ou Thin Layer Chromatography(TLC) é uma técnica simples, sendo
desenvolvida sobre uma placa devidro, que contém uma fina camada de
adsorvente.
É um tipo de cromatografia líquido-sólido
INTRODUÇÃO
3838
Consiste num método cromatográficoplanar, com Fase Móvel líquida e Fase
Estacionária sólida.
Seu desenvolvimento é por Eluição e omecanismo de separação, por Adsorção.
INTRODUÇÃO
3939
DesenvolvimentoEluição:
A Introdução da amostra é feitaem uma única aplicação, com uma fase
móvel pura, que arrasta a amostra
ao longo da placa ou coluna.Este é o método mais utilizadona cromatografia analítica.
4040
SeparaçãoFísica:
Quando se trata dafase estacionáriasólida , a adsorçãodo soluto ocorre nainterface entre o
sólido e a fasemóvel, devido a
presença de gruposativos na suassuperfícies.
..
4141
- NoNo estudoestudo preliminarpreliminar dede umum sistemasistema ouou dede umaumasituaçãosituação..
Os farmacêuticos aprendem muito sobre acomplexidade dos componentes do extrato deuma planta, qualitativamente, por exemplo,aminoácidos em vegetais, fermentação, sorosangüíneo, urina etc.
APLICAÇÕES
4242
-- NoNo estudoestudo preliminarpreliminar dede umum sistemasistema ouou dede umaumasituaçãosituação..
A medicina legal investiga casos deenvenenamento; emprega a técnica naidentificação de estimulantes ingeridos poratletas. A técnica pode ainda ser aplicada a reaçõesde síntese e também para reações dedegradação de um produto natural extraído deuma planta ou de uma substânciadesconhecida.
APLICAÇÕES
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4343
-- NoNo isolamentoisolamento dede produtosprodutos dede reaçãoreação
Esta técnica pode ser aplicada noisolamento de produtos de reação dediversas formas, analisando a eficiência ea precisão de uma destilação ou de umacristalização, podendo até mesmoverificar a pureza das frações obtidas.
APLICAÇÕES
4444
- Especialmente na Química Orgânica temos estasEspecialmente na Química Orgânica temos estasutilidadesutilidades
estabelecer a identidade de dois ou maiscompostos;
determinar o número de componentes de umamistura;
determinar o solvente apropriado para umaseparação por cromatografia em coluna;
APLICAÇÕES
4545
Em todas estasEm todas estasaplicações, a CCD tem aaplicações, a CCD tem a
vantagem de utilizarvantagem de utilizarpequenas quantidades depequenas quantidades deamostrasamostras..
APLICAÇÕES
4646
Na CCD, a fase líquida se move através dafase estacionária.
Como há uma interação preferencial do
composto a ser identificado com uma dasfases, o percurso total percorrido pelo compostoserá diferente do percurso percorrido pela fase
móvel.
PRINCÍPIO DA TÉCNICA
4747
Se o percursopercorrido pelocomposto for
menor do que opercorrido pela
fase móvel, diz-seque há uma maior
adsorsão docomposto na fase
estacionária.
PRINCÍPIO DA TÉCNICA
4848
Preparação das Placas:
Espalhamento
Pré-Fabricadas
Manual
Espalhadores
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4949
Manual:
Solução do adsorvente é aplicadamanualmente sobre a placa de vidro,
com o auxílio de uma bagueta.Pode-se também fazer uma solução
do adsorvente em solvente volátil emergulhar a placa.
Este tipo de espalhamento gerasuperfícies não uniformes. 5050
Preparação das placasPreparação das placas
utilizandoutilizandoEspalhadorEspalhadorUtiliza-se quandohá necessidadede camadas bem
uniformes eespessuras
definidas doadsorvente
5151
PreparaçãoPreparaçãodas placasdas placasutilizandoutilizando
EspalhadorEspalhador
5252
Placas Pré-Fabricadas:
Existem no mercado PlacasPré-Fabricadas, dos
adsorventes mais comuns.
Apesar do custo maiselevado, elas dispensam apreparação e são bem maisuniformes e homogêneas, oque melhora a separação e
torna o Rf mais reprodutível.
5353
•Aplicação: Utilizada para separação de compostoshidrofílicos (açúcares, aminoácidos, íonsinorgânicos, ácidos nucléicos).
PREPARAÇÃO DA SUSPENSÃO DO ADSORVENTE
CeluloseCelulose
•Aplicação: Geralmente empregadas na separação decompostos lipofílicos. (Hidrocarbonetos, vitaminaslipossoluveis, corantes sintéticos)
Alumina ( AlAlumina ( Al22OO33))
Sílica ( SiOSílica ( SiO22))•Aplicação: Utilizada para separação de compostoslipofílicos (fenóis, aminoácidos, esteróides ). 5454
ATIVAÇÃO DAS PLACAS
A ativação consiste em aquecer as placasem temperaturas relativamente elevadas, portempo prolongado. Isto aumenta o seu poderde adsorsão.
Este processo promove a remoção de vapord’água e outros resíduos possivelmenteadsorvidos na placa.
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5555
Adsorventes como sílica, alumina são ativadasa 105-110ºC por 30 a 60 minutos.
A celulose não deve ser aquecida por mais de10 minutos a 105ºC.
ATIVAÇÃO DAS PLACAS
As placas podem ser conservadas, prontas parauso, em ambientes secos como dessecadores ou
caixas tipo estantes fechadas.
5656
ATIVAÇÃO DAS PLACAS
5757
Após estarem asplacas todas
ativadas, costuma-seriscar as placas deformas a fazer com
que uma amostra, na
sua ascensão, nãointerfira na da outra
amostra.
ATIVAÇÃO DAS PLACAS
5858
5959
ESCOLHA DA FASE MÓVEL
Um ensaio cromatográfico eficientesignifica uma separação total dos
componentes de uma amostra, numtempo relativamente curto.
Para isto acontecer, é necessárioempregar um solvente adequado acada sistema cromatográfico, isto é,amostra e adsorvente empregado 6060
ESCOLHA DA FASE MÓVEL
Aplica-se a solução da amostra em pontosdiferentes separados por alguns centímetros.
Depois das manchas secas, aplica-se umsolvente diferente sobre o centro da mancha.
O líquido deverá migrar radialmente se oeluente for apropriado a separação será
eficiente.
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ESCOLHA DA FASE MÓVEL
6262
ESCOLHA DA FASE MÓVEL
6363 6464
APLICAÇÃO DA AMOSTRA
As amostras são aplicadasnas cromatoplacas na formade soluções, em solventes
bem voláteis.
Grandes quantidades deamostras geram manchas
muito grandes, o que não édesejado.
6565
Técnica de aplicação
••PontoPonto -análise qualitativa e quantitativa.
••FaixaFaixa - Análise quantitativa e preparativa.
APLICAÇÃO DA AMOSTRA
• A distância entre as gotas não deve sermenor a 1,0 cm
6666
Forma incorretade aplicação
Forma correta deaplicação
A amostra deve ser aplicada com micropipeta,quando a quantidade da amostra é importante, oucom tubo capilar, quando não, de 1,5 cm a 2,0 cm,
da base da placa.
APLICAÇÃO DA AMOSTRA
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APLICAÇÃO DA AMOSTRA
6868
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
Cromatografia ascendente é o métodomais utilizado e pode ser considerado a
técnica mais básica.
As cubas cromatográficas, em geral de vidrocom fundo plano, devem ter junto às paredesum pedaço de papel de filtro que permita a
subida da fase móvel, saturando rapidamenteo interior das mesmas.
6969
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
7070
As placas são colocadas numa cubacromatográfica quase na posição vertical,
apoiadas no fundo da cuba e inclinadas paraas paredes laterais.
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
Quando a fase móvel atinge umadeterminada posição nas placas (2/3), estasdevem ser retiradas e é importante marcar a
distância percorrida pela fase móvel,possibilitando o cálculo dos valores de Rf.
7171
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
7272
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIACuba saturada Cuba não saturadaCuba não saturada
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7373
D E S E N V O L V I M E N T O D
A C R O M A T O
G R A F I A
7474
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
7575
D E S E N V
O L V I M E N T O D
A C R O M A T O G R A F I A
7676
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
7777
DESENVOLVIMENTODA CROMATOGRAFIA
7878
DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA
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Após a eluição, as cromatoplacas sãosecas e reveladas, tornando visível assubstâncias incolores existentes na
amostra. Os métodos podem ser:
FísicosQuímicosBiológicos
REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
8080
FísicosMuitos compostos se tornam fluorescentes quando
excitados por luz UV, ou utiliza-se o adsorventecontendo uma substância fluorescente
REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
8181
FísicosREVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
8282
Físicos
8383 8484
Químicos
Utiliza-se agentes cromogênicos(vanilina, tricloreto de Antimômio) que,
em contato com as substâncias daamostra, tornam-nas coloridas e,
portanto, visíveis.
O mais utilizado é o iodo, que torna asmanchas marrons.
REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
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8585
BiológicosUtiliza-se reações enzimáticas
ou bacterianas para tornara mancha visível.
Placa de sílica, eluída comPlaca de sílica, eluída comdiclorometano:metanol (97:3). Adiclorometano:metanol (97:3). Aplaca foi borrifada com soluçãoplaca foi borrifada com solução
esporos de fungosesporos de fungos e, ondee, ondeapareceram manchas brancasapareceram manchas brancas
porque houve inibição dos fungosporque houve inibição dos fungospelas substâncias contidas nospelas substâncias contidas nos
extratos de uma planta.extratos de uma planta.
REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
8686
• Aplicadores de vidro
REVELAÇÃO PELO MÉTODO QUÍMICOREVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
8787
REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
8888
REVELAÇÃO COM APLICADOR COMERCIAL
Revelando o cromatograma Modo de dirigir o jatoao longo da placa
cromatográfica
8989
O objetivo do desenvolvimento ésempre a melhor separação das
substâncias da amostra.A técnica básica mais utilizada é o
desenvolvimento ascendente(unidimensional).
Existem também desenvolvimentobidimensional.
FORMAS DE DESENVOLVIMENTO
9090
Os resultados obtidos após a revelação dascromatoplacas, podem ser documentados:
DOCUMENTAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS
Desenhando as cromatoplacasDelineando as cromatoplacas sobre papel de seda
Fotografando as cromatoplacasXerocando as cromatoplacas
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9191
Comparações feitas do Rf obtidocom a amostra e o Rf de padrões é
considerado como o método qualitativo.
O método quantitativo serácitado posteriormente.
FatorFator de Retenção (R.f.)de Retenção (R.f.)
9292
d r 1
d m
d r 2
Linha de chegada da FM
Profundidade da FM
Ponto de partida da amostra
Ws1
Ws2
ANÁLISE QUALITATIVA
Leva em consideração a Cor e o Fator de Retenção :
onde dr é aonde dr é adistânciadistância
percorrida pelapercorrida pelaamostra e dmamostra e dmé a distânciaé a distânciapercorridapercorridapela fasepela fase
móvelmóvel
R.f.=dr/dmR.f.=dr/dm
9393
ResoluçãoResolução
Uma outra medida de separação de doisUma outra medida de separação de doiscomponentes consecutivos é a resolução;componentes consecutivos é a resolução;
Usada em cromatografia é calculada a partir daUsada em cromatografia é calculada a partir dadistância que separa as manchas dividido peladistância que separa as manchas dividido pelamédia das larguras de suas respectivas bases:média das larguras de suas respectivas bases:
RRss = 2(d= 2(dr1r1 –– ddr2r2) / (W) / (Ws1s1 + W+ Ws2s2))
9494
CÁLCULO DA RESOLUÇÃOCÁLCULO DA RESOLUÇÃO
RRss == 2(d2(dr1r1 –– ddr2r2))(W(Ws1s1 + W+ Ws2s2))
9595
•• Fator de Retenção (RFator de Retenção (Rff):):• Rf = dr / dm
•• Resolução (RResolução (Rss):):• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2)
PARÂMETROS UTILIZADOS NA CCD
9696
A CCD pode ser utilizada para quantificação.
Retira-se da cromatoplaca a área quecontenha a substância desejada que é extraída
e quantificada posteriormente.
Frequentemente, utiliza-se a densitometria, emedidas de fluorescência.
ANÁLISE QUANTITATIVA
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Analise Instrumental -
9797
Densitometria ANÁLISE QUANTITATIVA
9898
Densitometria ANÁLISE QUANTITATIVA
9999
Densitometria ANÁLISE QUANTITATIVA
100100
8cm
10cm
Linha de chegada da FM
Profundidade da FM
Ponto de partida da amostra
1cm
0,5cm
Exercícios
Calcule o Rf de cada substância e a Resolução
101101
12cm
15cm
Linha de chegada da FM
Profundidade da FM
Ponto de partida da amostra
0,6cm
0,3cm
Exercícios
Calcule o Rf de cada substância e a Resolução
0,7cm
9cm
0,5cm