TÜRKĠYE CUMHURĠYETĠ ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ

SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

FARKLI ĠRRĠGASYON SOLÜSYONLARININ

SĠTOTOKSĠSĠTELERĠNĠN

HÜCRE KÜLTÜRÜ YÖNTEMĠ ĠLE KARġILAġTIRILMALI

OLARAK ĠNCELENMESĠ

Arzu BAYALAN ALDEMĠR

ENDODONTĠ ANABĠLĠM DALI

DOKTORA TEZĠ

DANIġMAN

Doç. Dr. Semra SEVĠMAY

2009- ANKARA

TÜRKĠYE CUMHURĠYETĠ ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ

SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

FARKLI ĠRRĠGASYON SOLÜSYONLARININ

SĠTOTOKSĠSĠTELERĠNĠN

HÜCRE KÜLTÜRÜ YÖNTEMĠ ĠLE KARġILAġTIRMALI

OLARAK ĠNCELENMESĠ

Arzu BAYALAN ALDEMĠR

ENDODONTĠ ANABĠLĠM DALI

DOKTORA TEZĠ

DANIġMAN

Doç. Dr. Semra SEVĠMAY

2009- ANKARA

ii

KABUL VE ONAY

iii

ĠÇĠNDEKĠLER

KABUL VE ONAY ......................................................................................... ii

ĠÇĠNDEKĠLER ............................................................................................... iii

ÖNSÖZ .......................................................................................................... v

SĠMGELER ve KISALTMALAR .................................................................. vii

ÇĠZELGELER ............................................................................................. viii

ġEKĠLLER .................................................................................................... ix

RESĠMLER .................................................................................................... x

1.GĠRĠġ .......................................................................................................... 1

1.1. Smear Tabakası ..................................................................................... 2

1.2. Kök Kanallarında Ġrrigasyon Solüsyonu Kullanımının Amacı .................. 3

1.3. Ġrrigasyon Solüsyonlarının Sınıflandırılması ........................................... 5

1.3.1. Asitler ve ġelasyon Yapan Ajanlar ....................................................... 6

1.3.2. Proteolitik Enzimler .............................................................................. 9

1.3.3. Okside Edici Ajanlar ........................................................................... 10

1.3.4. Alkalen Solüsyonlar ........................................................................... 10

1.3.5.Serum Fizyolojik .................................................................................. 14

1.3.6. Smear Clear ....................................................................................... 15

1.3.7. Klorheksidin Glukonat ........................................................................ 16

1.3.8. MTAD ................................................................................................. 16

1.3.9. Elektrokimyasal Olarak Aktive EdilmiĢ Su (ECA) ............................... 20

1.4. Biyouyumluluk ....................................................................................... 21

1.4.1. Biyouyumluluk Testleri ....................................................................... 22

1.4.2. Ġn Vitro Test Yöntemleri...................................................................... 24

1.4.2.1. Genotoksisite .................................................................................. 26

1.4.2.2. Östrojenite ....................................................................................... 26

1.4.2.3. Sitotoksisite ..................................................................................... 27

1.4.3. Hücre Kültürü ..................................................................................... 31

1.4.3.1.Agar Overlay Yöntemi ...................................................................... 35

iv

1.4.3.2.-Milipor Filtre Yöntemi ...................................................................... 36

1.4.3.3.-Krom Salınım Test Yöntemi ............................................................ 37

1.4.3.4.Model Kavite Yöntemi ...................................................................... 37

1.4.3.5.DiĢ Kavitesi Yöntemi ........................................................................ 37

1.4.3.6.Dentin Bariyer Testi ......................................................................... 38

1.4.3.7. Hemolizis Testi ................................................................................ 38

1.4.3.8.Ekstraksiyon Testi ............................................................................ 39

1.4.3.9.MTT Yöntemi (Mitokondiriyal Dehidrogenaz Aktivitesi) .................... 39

1.4.4. Protein Miktar Tayini Yöntemi ............................................................ 40

1.4.4.1. Bradford (Coomassie Blue) Yöntemi ............................................... 41

1.4.5. Hücre Yapısında Ortaya Çıkan DeğiĢiklikler ...................................... 41

1.5. Amaç ..................................................................................................... 43

2.1.Örneklerin Hazırlanması ........................................................................ 44

2.2.Hücre Kültürü ......................................................................................... 46

2.3. MTT (Mitokondriyal Toksisite Testi) Yöntemi ile Hücre

Canlılık Tayini ....................................................................................... 47

2.4. Protein Tayin Yöntemi ile Hücre Canlılık Testi ...................................... 47

2.6.Ġstatistiksel Analiz ................................................................................... 50

3. BULGULAR ............................................................................................. 51

3.1. MTT Yöntemi ile Elde Edilen Sonuçların Ġstatistiksel

Değerlendirmesi ................................................................................... 51

3.2. Bradford Yöntemi ile Protein Miktarı Tayini Yapılan

Grupların Sonuçlarının Ġstatistiksel Olarak Değerlendirilmesi ............... 54

4. TARTIġMA .............................................................................................. 61

ÖZET ........................................................................................................... 76

SUMMARY .................................................................................................. 78

KAYNAKLAR .............................................................................................. 80

ÖZGEÇMĠġ .................................................................................................. 91

v

ÖNSÖZ

ÇalıĢmamızda farklı irrigasyon solüsyonlarının sitotoksisitelerini hücre kültürü

yöntemiyle inceledik. ÇalıĢmamızın MTT ve bradford boyası ile protein tayini

yöntemlerinde, ilk 24 saatlik değerlendirmede kullandığımız deney

materyalleri arasında absorbans düzey dağılımı ve protein konsantrasyon

miktarları açısından değerlendirildiğinde en az sitotoksik solüsyon MTAD

iken, en fazla sitotoksik etkiyi gösteren solüsyon EDTA olarak tespit

edilmiĢtir. 48. saatteki değerlendirme sonuçlarında ise her iki yöntemde de

MTAD en düĢük sitotoksisiteyi gösterirken, en yüksek sitotoksisiteyi NaOCl

grubu göstermiĢtir. Sonuç olarak solüsyonlar arasındaki fark istatistiksel

olarak anlamlı bulunmamıĢtır. 24. ve 48. saatler arasında MTT yönteminde

SmearClear grubunda hücre canlılığı anlamlı oranda azalırken, Bradford

boyası ile protein tayini yönteminde SmearClear‘a ek olarak MTAD ve

NaOCl‘ de anlamlı oranda hücre canlılığı azalmıĢtır.

Tüm doktora öğrenim boyunca her türlü desteği veren, yaĢadığım zor

günlerde moral desteğini ve anlayıĢını hep yanımda hissettiğim, Endodonti

A.B.D. BaĢkanı Sayın Prof.Dr. Lale ZAĠMOĞLU‘ na,

Doktora öğrenimi boyunca bana mesleki bilgi ve deneyimlerini aktaran Sayın

Prof.Dr.Lale ZAĠMOĞLU‘na, Sayın Prof.Dr. Aylin KALAYCI‘ya ve tez

çalıĢmamda tecrübe ve birikimini benimle paylaĢan danıĢman hocam Sayın

Doç. Dr. Semra SEVĠMAY ‗a,

Tez çalıĢmamın deney aĢamasında her türlü konuda yardımcı olan Yrd.Doç.

Duygu ÖZEL DEMĠRALP‘ e,

Hayatımın her alanında sınırsız sevgi ve desteklerini benden hiçbir zaman

esirgemeyen, varlık sebeplerim sevgili anneme, babama; ayrıca ablacığıma,

eniĢteme, Seyde anneme, Abdullah babama ve küçük kardeĢim YeĢim‘e,

vi

YetiĢmemde büyük emekleri olan Gülden ve Ġsmail Bayraktar‘a,

Her zaman her konuda dostluklarını hissettiren kardeĢlerim Dr.Dt.Hilal

SONBAY‘a, Dr.Dt. Sami SONBAY‘a, Dr.Dt. Serkan ER‘e,

Desteği ve dostluğu için Dt.Duygu AKKOR‘ a,

Hayatımın her anında yanımda olan, dostluğu ve hayatı benimle paylaĢan,

hayatımda mucizeler yaratan sevgili eĢim Dr.Dt.Korkut ALDEMĠR‘e,

Tüm kalbimle teĢekkürlerimi sunuyorum.

vii

SĠMGELER ve KISALTMALAR

µl Mikro litre

µm Mikrometre

au Absorban unit

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimetilsülfoksit

ECA Elektrokimyasal Olarak Aktive EdilmiĢ Su

EDTA Etilendiamin tetraasetikasit

H2O2 Hidrojen Peroksit

MTT Mitokondiriyal Toksisite Testi

MTAD Mixture of tetracycline isomer, acid, detergent

NaOCl Sodyum Hipoklorit

nm Nanometre

OD Ortalama değer

SEM Scanning Electron Microscope

viii

ÇĠZELGELER

Çizelge 1.3.8.1. MTAD nin bileĢenleri ve etkileri .......................................... 17

Çizelge 3.1.1. Gruplar arasında zamana göre absorbans düzeylerinin

dağılımı................................................................................. 51

Çizelge 3.1.2. 24. ve 48.Saat absorbans düzeyleri yönünden çoklu

karĢılaĢtırma sonuçları ......................................................... 53

Çizelge 3.2.1. Gruplara ait ortalama konsantrasyon düzeylerinin

dağılımı ve istatistiksel analiz sonuçları ................................ 55

Çizelge 3.2.2. 24.ve 48. Saat ortalama konsantrasyon düzeyleri ve

genel konsantrasyon ............................................................ 57

Çizelge 3.2.3. 1:1 Oranda 24. ve 48. Saat konsantrasyon düzeyleri ve

konsantrasyon değiĢimi yönünden çoklu karĢılaĢtırma

sonuçları ............................................................................... 58

Çizelge 3.2.4. 1:5 Oranda 24. ve 48. Saat konsantrasyon düzeyleri ve

konsantrasyon ...................................................................... 59

ix

ġEKĠLLER

ġekil 1.4.1. Biyouyumluluk ve ilgili faktörler ............................................. 22

ġekil 1.4.4.1 Spektrofotometrenin çalıĢma prensibi .................................... 41

ġekil 3.1.1. MTT Yöntemi sonucunda gruplar arasında zamana göre

absorbans düzeylerinin dağılımı ............................................. 54

ġekil 3.2.1. Gruplar arasında zamana göre genel konsantrasyon

düzeylerinin dağılımı .............................................................. 56

ġekil 3.2.2. Gruplar ve oranlar arasında zamana göre konsantrasyon

düzeylerinin dağılımı .............................................................. 60

x

RESĠMLER

Resim 2.1. BioPure™ MTAD™ .............................................................. 44

Resim 2.2. SmearClear .......................................................................... 45

Resim 2.3. NaOCl................................................................................... 45

Resim 2.4.1. 96 kuyucuktaki hücre ve deney solüsyonun karıĢımının

bradford boyası ilave edildikten sonraki görüntüsü ............... 48

1

1.GĠRĠġ

Kök kanal tedavisi; kron ve kök pulpasının anestezi altında çıkarılmasının

ardından kök kanallarının mekanik olarak geniĢletilip, kimyasal olarak

mikroorganizmalardan arındırılması ve kök kanallarının hermetik bir Ģekilde

doldurulması iĢlemidir.

Endodontik tedavinin hedefi; apikal bölgede problem oluĢumunu önlemek ya

da oluĢan problemin tedavisi olup, daha da önemlisi kök kanal sisteminde

gözlenen mikrobiyal bir enfeksiyonu elimine etmek veya enfeksiyondan

korumaktır. Rezorbsiyon ve çeĢitli endodontik komplikasyonlar gibi bazı özel

durumlarda, hedefe ulaĢmada farklılıklar olsa da, nihai baĢarı daima iyi bir

enfeksiyon kontrolüne bağlıdır (Haapasalo ve ark., 2005).

Bugün endodontik baĢarısızlığın ana nedeni, mevcut mikroorganizmalar ve

kanal tedavisi sonrası tekrar kolonize olabilen mikroorganizmalardır. Kök

kanalının preparasyon öncesi ve preparasyon sırasında, sık aralıklarla

nekrotik ve vital materyali çözücü, antimikrobiyal özellikli bir veya daha fazla

irrigasyon solüsyonu ile yıkanması gerekmektedir (Siqueira ve ark., 1999;

Zehnder, 2006).

Kullanılan irrigasyon solusyonları dentin duvarı ve debrislerle temas halinde

olmalıdır. Bu temasın gerçekleĢmesi, irrigasyon solüsyonunun yüzeyi

ıslatabilme özelliğine bağlıdır. Bu özellik yüzey gerilimi ile ilgilidir.

Endodontide kullanılan irrigasyon solüsyonları çok düĢük yüzey gerilimi

göstermelidir (Giardino ve ark., 2006).

2

1.1. Smear Tabakası

Kemomekanik preparasyon sonrasında kök kanal duvarını çevreleyen

dentinin durumu ile ilgili 1975 yılına kadar detaylı bir çalıĢma yapılmamıĢtır.

Dentin herhangi bir yerden kesildiğinde, dentin duvarlarının yüzeyi üzerinde

sıklıkla çamurumsu bir tabakanın oluĢtuğu SEM (Scanning Electron

Microscope) çalıĢmalarında tespit edilmiĢtir (Torabinejad ve ark., 2002).

Bu konuyla ilgili olarak yapılan çalıĢmada kemomekanik preparasyon

sonrasında kök kanal duvarını SEM ile incelemiĢlerdir. Bu çalıĢmada; yıkama

solusyonu olarak %5‘lik NaOCl (Sodyum hipoklorit) kullanılmıĢtır.

Kemomekanik preparasyon sonrası kanal duvarında düzensiz bir yapı

gözlemiĢlerdir. Kanal duvarını kaplayan bu düzensiz yapı smear tabakası

olarak adlandırılmıĢtır. Smear tabakası amorf, granüler ve irregüler bir tabaka

olarak tanımlanmıĢtır. Bu tabaka, inorganik maddelerin yanı sıra odontoblast

parçacıklarının ve nekrotik debrisin oluĢturduğu organik maddelerden

meydana gelmiĢtir (Zaimoğlu ve ark.,1988; Georgopoulou ve ark., 1994).

Smear tabakasının büyük bölümü inorganik kısım, dentin talaĢları ve bazı

spesifik olmayan partiküllerden meydana gelmiĢtir. Organik kısım ise koagule

olmuĢ proteinler, nekrotik veya canlı pulpa dokusu artıkları, odontoblast

uzantıları kan hücreleri ve mikroorganizmalardan oluĢmuĢtur Kök kanal

preparasyonundan sonra gözlenen smear tabakasının kalınlığının 1–5 µm

arasında olduğu yapılan çalıĢmalarda tespit edilmiĢtir (ġen ve ark.,1995).

Smear tabakasının kanal preparasyonu ve kanal dolgusunun kalitesi üzerine

yaptığı etkiler konusunda görüĢ birliği oluĢmamıĢtır. Ancak smear

tabakasının kendisi enfekte olabilir; ayrıca dentin tübülü içindeki bakterilerin

korunmasına neden olabilir. Bu yüzden smear tabakasının kaldırılması için

çeĢitli yöntemler uygulanmaktadır (ÇalıĢkan, 2006).

3

NaOCl‘nin smear tabakasını kaldırma etkinliğinin SEM ile incelendiği bir

çalıĢmada, NaOCl ve hidrojen peroksitin ne yüzeyel smear tabakasını, ne de

tübüler tıkaçları elimine edemediği bildirilmiĢtir(Zaimoğlu, 1985a).

Zaimoğlu (1985b) yaptığı bir çalıĢmada; klasik yıkama solüsyonlarını yüksek

hacimlerde kullanmıĢlar ve böylece smear tabakasını elimine etmeye

çalıĢmıĢtır. Yıkama solüsyonlarının hacminde yapılan artıĢın ne smear

tabakasının kaldırılmasında ne de tübüler tıkaçların kök kanal duvarından

uzaklaĢtırılmasında etkin olmadığı sonucuna varmıĢtır.

1.2. Kök Kanallarında Ġrrigasyon Solüsyonu Kullanımının Amacı

Çürük ve travma gibi sebeplerle oluĢan pulpa hastalıklarında kök kanalları

nekrotik, enfekte, bazen vital pulpa dokusu, mumifıye doku parçaları ve doku

sıvısı ile dolu olabilir. Bu artık materyallerin; preparasyon sırasında apikal

foramenden itilmeden önce ortamdan uzaklaĢtırılması gerekmektedir. Bu

yüzden kanalın mekanik preparasyonu öncesi ve sırasında, sık aralıklarla

nekrotik materyali çözücü ve antimikrobiyal özellikte bir solüsyonla yıkanması

gerekmektedir (ÇalıĢkan, 2006). Kök kanal tedavisi esnasında irrigasyon

solüsyonu kullanımının belli baĢlı yararları;

1-Enfekte materyal, yumuĢak ve sert doku artıkları; fiziksel ve

kimyasal olarak uzaklaĢtırılır. Ġrrigasyonda kullanılan solüsyonlar organik

debrisleri uzaklaĢtırarak mikroorganizmaların beslenmelerini güçleĢtirmekte

ve böylece sayı ve tipleri azalmaktadır.

2-Kök kanal sistemindeki artık organik materyaller eritilmektedir.

3-Kanal aletlerinin lubrikasyonla çalıĢmaları kolaylaĢmaktadır.

4-Kanalda kullanılan dezenfektanların etkinlikleri artmaktadır.

4

5-Kanal preparasyonunda açığa çıkan dentin talaĢları pulpa

odasına yükselerek aspirasyon veya kâğıt konlarla uzaklaĢtırılabilmektedir.

6- Dentin talaĢlarının apeks yakınlarında birikmesi veya tıkaç

oluĢturması olasılığı azalmaktadır(Sundquist ve Fidgar,1998).

Endodontik tedavide irrigasyon solüsyonu olarak bugüne kadar sayısız

bileĢikler kullanılmıĢtır. Bunlar; salin gibi inert maddelerden, son derece

toksik ve alerjik maddelere kadar çeĢitlilik göstermektedir. Ġrrigasyon

solüsyonları kanal preparasyonu esnasında ve sonrasında preparasyon

etkinliğinin artırılması ve debrislerin uzaklaĢtırılması amacıyla kullanılır.

Günümüzde kullanıma sunulan irrigasyon solüsyonlarında belirli özellikler

aranmaktadır. Bu özellikler Ģunlardır:

1- Doku ve debrisleri eritebilmelidir. Enstrümanların giremediği

yerlerdeki yumuĢak dokuların uzaklaĢtırmasını sağlamalıdır.

2- DüĢük toksisite göstererek periapikal dokulara irritan olmamalıdır.

3- DüĢük yüzey gerilimi göstermelidir. Bu özellik girilemeyen bölgelere

akıĢı arttırmaktadır.

4- Lubrikasyon özelliği göstererek aletlerin kanalda kullanımını

kolaylaĢtırmalıdır.

5- Kullanım sırasında ve sonrasında etkisi devam etmelidir.

6- Smear tabakasını kaldırmalıdır.

7- Etkinliği açısından kanalda kolay nötralize olmamalıdır.

8- Maliyeti düĢük, raf ömrü uzun olmalıdır(Cohen ve Hargreaves, 2006;

Sundquist ve Fidgar, 1998; Alaçam, 2000).

5

Ġrrigasyon solüsyonlarının etkinliği yalnızca solüsyonun kimyasal özelliğine

değil miktarı, ısısı, temas süresi, irrigasyon iğnesinin yerleĢtirme derinliği,

iğnenin tip ve çapı, irrigasyon solüsyonunun yüzey gerilimi ve solüsyonun

tazeliğine bağlıdır. Ġrrigasyon solüsyonları dentin duvarları ve debrisle sıkı

iliĢki kurabilmelidir. Bu iliĢkinin sağlanabilmesi irriganın dentini ıslatabilmesine

bağlıdır ve bu da doğrudan solüsyonun yüzey gerilimi ile iliĢkilidir. Yüzey

gerilim değeri düĢtükçe solüsyonun dentin duvarlarına adaptasyon kabiliyeti

daha da artmaktadır (Zehnder, 2006).

Kök kanallarında bulunabilen tüm artıkların temizlenmesi amacıyla çeĢitli

irrigasyon yöntemleri ve kimyasal maddeler önerilmiĢtir. Günümüzde

endodonti pratiğinde sıklıkla kullanılan irrigasyon solüsyonları; serum

fizyolojik, sodyum hipoklorit, hidrojen peroksit, klorheksidin, asitler ve

Ģelasyon yapan ajanlar, elektrokimyasal olarak aktive edilmiĢ su ve MTAD‘

dir (Cohen ve Hargreaves, 2006; Spangberg ve Haapasalo, 2002).

1.3. Ġrrigasyon Solüsyonlarının Sınıflandırılması

Bugüne kadar endodontide kullanılan irrigasyon solüsyonları Ģunlardır:

1- Asitler ve Ģelasyon yapıcı ajanlar (inorganik doku çözücüler);

hidrojen klorür (HCl), sülfürik asit, laktik asit, poliakrilik asit, EDTA (Etilen di

amin tetraasetikasit), REDTA, RC-Prep ve sitrik asit,

2- Proteolitik enzimler,

3- Okside edici ajanlar (H2O2)

4- Alkalen solüsyonlar (organik doku çözücüler); sodyum dioksit,

sodyum hidroksit, potasyum hidroksit, sodyum hipoklorit

6

5- Serum fizyolojik

1.3.1. Asitler ve ġelasyon Yapan Ajanlar

Asitler ve Ģelasyon yapıcı ajanlar dentini yumuĢatmak amacıyla

kullanılmıĢlardır. ġelasyon yapıcı ajanlar; dentini kostik ajanlardan daha fazla

yumuĢatmakta ve yumuĢak dokulara daha az zarar vermektedir. ġelasyon

ajanları, dentindeki Ca+2 iyonlarıyla birleĢerek Ģelat tuzları oluĢturmaktadır.

Bu etkileĢimin kanal duvarlarının enstrümantasyona daha az direnç

göstermesini sağlayacağı düĢünülmüĢtür (Alaçam, 2000). ġelasyon ajanları

sıvı veya pat formunda uygulanabilir.

Sıvı Ģelatörler;

1. Calsinase (Lege Artis, Dettenhausen, Germany) %17'lik sodyum

edetat, saf su ve stabilizör olarak hidroksit içerir.

2. REDTA (Roth International, Chigaco, II, USA) %17‘lik EDTA‘ya

yüzey gerilimini azaltmak için 0.84 gram setrimit eklenmesiyle oluĢmuĢtur.

Ġçeriğindeki diğer maddeler 9.25ml 5M sodyum hidroksit ve 100 ml distile

sudur.

3. EDTAC ve DTPAC, %15‘lik EDTA ve dietil triamin-penta asetik asit

(DTPA)'ten oluĢmuĢtur ve pH'ı 8‘dir. Bu solüsyonların 100 ml‘sine deterjan

olarak 0.75 gr setritrimetil amonyum bromid ilave edilir.

4. EDTA-T (Formula & Açao Farmaçia, Sao Paulo, Brazil) %17'lik

EDTA‘ya deterjan olarak sodyum lauril eter sülfat tergentol eklenmesiyle

oluĢur.

7

5. EGTA (Sigma, St. Louis, MO,USA)'nın, esas içeriği etilen glikol bis

(β-amino-etil-eter)-N,N,N1, N1-tetra asetik asitten oluĢur.

6. CDTA (deneysel solüsyon) siklohekzan–1,2-diamintetra asetik

asitin %1‘lik solüsyonudur.

7. Largal Ultra (Septodont, Paris, Fransa), disodyum tuzu olarak %15

EDTA, %0,75 Setrimite ve pH 7,4‘e ayarlamak için sodyum hidroksit içerir.

8. Salvizol, (Ravenz, Konstanz, Germany) propilen glikol içerisindeki

%5 aminoquinaldinum di asetattan oluĢur ve pH 6,6‘dır.

9. Decal (Veikko, Auer, Helsinki, Finland). %5.3 oxyl-asetate, %4,6

amonyum oksilasetat ve %0,06 setrimitten oluĢur. pH 3,4‘ dür

10. Tubulucid Plus (Dental Therapeutics, Nacka, Sweden) 1,5gr

Amfoterik- 2 (%38), 0.5 benzal-klonikorit, 3gr EDTA dihidrat, fosfat tampon

solüsyonu (pH'ı 7,3), 100gr distile su ve %50 sitrik asitten oluĢur.

Pat tipi Ģelatörler;

1. Calsinase slide (Lege artis, Dettenhausen, Germany), %15'lik

sodyum EDTA ve %58–64 su içerir. pH'ı 8–9‘ dur.

2. RC-Prep (Premier Dental, Philadelphia, PA, USA) %10 üre

peroksit, %15'lik EDTA ve glikolun kombinasyonudur.

3. Glyde File (DeTrey Dentsply, Konstanz, Germany)sıvı bir solüsyon

içerisindeki %15 EDTA ve %10 üre peroksitten oluĢur. (ÇalıĢkan, 2006)

Ġlk kez 1957'de EDTA‘nın dental dokular üzerindeki demineralize edici

etkisine dair rapor yayınlanmıĢtır. EDTA (%17 disodyum tuzu, pH'ı 7) çok az

antibakteriyel etkinliği olan endodontik preparasyonda sıklıkla kullanılan etkili

8

bir Ģelasyon ajandır. EDTA veya sitrik asitle smear tabakasının

kaldırılmasının lokal olarak kullanılan dezenfeksiyon ajanlarının dentinin derin

tabakalarındaki etkilerini artırdığı ve geliĢtirdiği gösterilmiĢtir. (TaĢman ve

ark.,2000; Haapasalo ve ark., 2005).

EDTA‘ nın saf formunun yüzey gerilimi %1 ve %5‘ lik NaOCl' den, serum

fizyolojikten ve distile sudan daha az olduğu bildirilmiĢtir (TaĢman ve

ark.,2000; Haapasalo ve ark., 2005).

EDTA'nın kullanım Ģekline dair Nygaard ve Ostby‘nin yaptıkları çalıĢmada

%15'lik EDTA'nın (pH'ı 7,3) aĢağıdaki kompozisyonda kullanımı önerdiği

bildirilmiĢtir.

1. EDTA'nın disodyum tuzu (17 gram)

2. Distile su (100ml)

3. 5 mol sodyum hidroksit (9,25 ml) (Zehnder, 2006).

Önemli bir bakıĢ açısı da EDTA ve sitrik asitin NaOCl ile güçlü bir Ģekilde

etkileĢmesidir. Her ikisi de solüsyondaki kullanılabilir kloru indirger ve NaOCl'i

bakteri ve nekrotik dokular üzerinde etkisiz hale getirir. Bu sebepten; sitrik

asit veya EDTA asla NaOCl ile karıĢtırılmamalıdır (Zehnder, 2006).

EDTA ile ilgili yapılan sitotoksisite çalıĢmaları da literatürde önemli yer

tutmaktadır. Malheiros ve arkadaĢlarının (2005) yaptıkları çalıĢmada; %17'lik

EDTA solüsyonu ile üç farklı konsantrasyondaki sitrik asitin sitotoksik

etkilerini in vivo ortamda kültüre edilmiĢ fibroblastlar kullanarak

karĢılaĢtırmıĢlardır. Sonuç olarak; %17'lik EDTA sitrik asit solüsyonundan

daha sitotoksik bulunmuĢtur.

EDTA solüsyonunun içerisine temizleme ve bakterisidal kapasitesini

arttırmak için bir deterjan eklenerek EDTAC adı altında piyasaya sürülmüĢtür.

9

EDTAC (EDTA+Cetavlon), EDTA'nın bir kuaterner bileĢiğinin 0.84gr.'ı ile

karıĢtırılmasıyla üretilmiĢtir. Bu ekleme; yıkama solüsyonunun yüzey

gerilimini düĢürmek, bütün kanal duvarlarının ıslatılmasını sağlamak ve

böylece sektörlerin dentine penetre olabilme yeteneklerini arttırmak amacıyla

yapılmıĢtır. EDTAC ın daha iyi bir antimikrobiyal etkinliğe sahip olması

gerekmesine rağmen yumuĢak dokularda daha fazla enflamatuar

reaksiyonlara sebep olmaktadır (ÇalıĢkan, 2006 ).

Scelza ve arkadaĢları (2001) yaptıkları araĢtırmada kısa dönem ve uzun

dönem değerlendirme sonucunda sitrik asit solüsyonunu, EDTA-T‘ye göre

daha biyouyumlu bulunmuĢtur.

ġelasyon yapıcı ajanlar kadar önemli olan diğer irrigan asit solüsyonlarıdır.

Bu irriganlar smear tabakasının kaldırılmasında, dentin duvarının temizliğinde

ve kök kanal dezenfeksiyonuna katkıda bulunmaktadırlar(Siqueira ve

ark.,1998).

Siqueira ve arkadaĢları (1998) %2.5'lik ve %4‘lük NaOCl; %0.2 ve %2‘lik

klorheksidin, EDTA ve sitrik asitle kombine irrigasyonu da içeren çeĢitli

irrigasyon solüsyonlarının antimikrobiyal etkinliğini incelemiĢlerdir. Sonuçta;

kanal içindeki mikroorganizmalarda önemli oranda azalma saptamıĢlardır.

1.3.2. Proteolitik Enzimler

Proteolitik enzimler; 1930 ve 1940'lı yıllarda yaygın olarak doku eritici olarak

kullanılmıĢtır. Kök kanal sisteminde çok küçük miktarlarda kullanıldıklarından

ve etki edebilmeleri çok uzun süre gerektirdiğinden zamanla kullanımları terk

edilmiĢtir. Endodontide kullanılan enzimler arasında streptokinaz,

streptodornaz, papain, saflaĢtırılmıĢ tripsin ve enzymal sayılabilir (Alaçam,

2000).

10

1.3.3. Okside Edici Ajanlar

Ġlk olarak 1943'de NaOCl ile birlikte oksitleyici ajanların kullanımı önerilmiĢtir;

%3‘lük H2O2 ile %5.25'lik NaOCl 'nin ard arda kullanımının oluĢturduğu

köpürmenin kök kanalındaki debrislerin uzaklaĢtırılmasında yardımcı

olabileceği düĢünülmüĢtür. Okside edici ajan olarak en fazla kullanılan

solüsyon H2O2 'tir (Alaçam, 2000).

Hidrojen peroksit sterilizasyon ve dezenfeksiyon amaçlı geniĢ çaplı kullanıma

sahip bir solüsyondur. DiĢ hekimliğinde %1 ile %30'luk konsantrasyonlar

arasında kullanılabilen renksiz bir sıvıdır. Su ve oksijene ayrıĢtığı için

uygulandığı yüzeyler ve çevre dokular açısından problemsizdir. Virüslere,

bakterilere, mayalara ve hatta bakteri sporlarına karĢı aktiftir. Hidrojen

peroksit serbest hidroksil radikalleri üretir ve bunlar DNA ve protein gibi hücre

elementlerine değiĢik ataklar düzenleyerek biositik etkilerini gösterirler

(Haapasalo ve ark., 2005).

1.3.4. Alkalen Solüsyonlar

Endodontik irrigasyonda kullanılan alkalen solüsyonlar arasında sodyum

dioksit, sodyum hidroksit, potasyum hidroksit, sodyum hipoklorit sayılabilir.

Bunların içinden sadece NaOCl klinikte kullanım alanı bulmuĢtur.

NaOCl, NaOH‘ın dilüe kostik sodada sıvı veya gaz halinde bulunan klorinle

reaksiyona girmesi sonucu oluĢan yeĢilimsi renkte bir sıvıdır.

NaOH+Cl2—> NaOCl +H2O+ ısı

Alkalen solüsyonlarla ilgili olarak, 1915 yılında 202'den fazla bileĢiğin

antibakteriyel yapısı incelenmiĢ ve NaOCl ile kloraminlerin bu solüsyonlar

11

içinde en etkin dezenfektanlar olduğu tespit edilmiĢtir. DiĢhekimliğinde

kullanılan NaOCl solüsyonunun pH'ı konusunda farklı görüĢler vardır. NaOCl

ve hipokloröz asit (HOCl) su içerisinde dengededir.

NaOCl+H2O→HOCl+NaOH

Bu dengedeki değiĢiklikler solüsyonun pH'ına bağlıdır. Solüsyonun aktif

antimikrobiyal maddesi olan hipokloröz asit (HOCl) yüksek pH‘da daha az

aktif bir forma yani hipoklorit ve hipoklorit iyon tuzlarına ayrıĢır. Bu yüzden

antimikrobiyal etkinliği azalır. pH 6 olduğunda HOCl konsantrasyonunun

mükemmel ve ayrıĢması düĢük bir düzeyde olacağı için ideal olduğu

belirtilmiĢtir. Ancak pH düĢtükçe bozulma hızı da artar. Stabilite açısından

pH'ının 9‘dan büyük olması gerekir. Bu pH‘da zaten sitotoksik olan

solüsyonun hipokloröz asit konsantrasyonunun artmasına bağlı olarak

sitotoksisitesinin daha da artacağından pH‘ının 11–12 olması tavsiye

edilir(ÇalıĢkan, 2006).

NaOCl çeĢitli konsantrasyonlarda yıllardır kök kanal tedavisinde

kullanılmaktadır. NaOCl çok geniĢ spektrumlu bir antimikrobiyal ajandır.

NaOCl'nin, bakteriyofajlara, sporlara, funguslara ve viruslara karĢı etkili

olduğu belirtilmiĢtir (Bergenholtz ve Spangberg, 2004).

Bu solüsyonun antimikrobiyal etkinliğini açıklayan iki temel görüĢ vardır.

Birinci görüĢe göre; solüsyonun dezenfektan etkinliği içerisinde tepkimeye

girmemiĢ HOCl miktarına bağlıdır. HOCl bakteri enzimlerinin sülfürhidril

grupları üzerine oksidatif etki yaparak germisidal bir etki gösterir. Böylece

hayati enzimleri bu yolla inhibisyona uğrayan bakteriler ölürler. Ġkinci görüĢe

göre de solüsyonun hücre proteinlerini hidrolize ve okside etmesi yeteneğinin

yanı sıra hipertonikliğinden dolayı bir miktar hücre içi sıvısının, osmotik olarak

hücre dıĢına çıkmasıdır (Pashley ve ark., 1985). YaklaĢık pH'ı 11–12 olan

NaOCl doku proteinleriyle temasa geçtiğinde çok kısa bir süre içinde nitrojen,

formaldehit, asetaldehit oluĢur ve peptit bağlarının yıkımı ile proteinlerin

12

çözünmesi meydana gelir. Bu reaksiyon sırasında amino grubundaki (-HN)

hidrojen, klorin (NCl) ile yer değiĢtirerek kloramin oluĢur ki bu madde de

solüsyonun antimikrobiyal aktivitesinde önemli bir rol oynar (ÇalıĢkan, 2006).

Endodontide en çok kullanılan irrigasyon solüsyonu olan NaOCl'nin

antibakteriyel özellikleriyle ilgili birçok çalıĢma yapılmıĢtır. Klinik ve laboratuar

çalıĢmalarda bu solüsyonun 1 dakika gibi bir sürede bile tüm

mikroorganizmaları tahrip ettiği gösterilmiĢtir. NaOCl, Enterococcus

,Actinomyces ve Candida gibi kök kanalından uzaklaĢtırılması zor olan

endodontik mikroorganizmalara karĢı etkilidir. Endodontik tedavide NaOCl

%0,2'den %5,25'e kadar değiĢen konsantrasyonlarda kullanılmaktadır.

NaOCl‘nin değiĢik konsantrasyonlardaki antimikrobiyal etkinliği ile ilgili

yapılan çalıĢmada test edilen solüsyonlar arasında denenen

mikroorganizmaya karĢı en etkili antibakteriyel ajanın %5,25'lik NaOCl

olduğu tespit edilmiĢ ve %5,25'lik NaOCl‘nin sulandırılmasının bu kimyasal

ajanın antibakteriyel etkinliğini anlamlı Ģekilde azalttığı sonucuna varılmıĢtır

(Harrison ve Hand,1981).

Enfekte kök kanalında bilinen en iyi antibakteriyel özelliğe sahip irrigasyon

solüsyonu olan NaOCl' nin kök kanalında kullanım konsantrasyonunun

yüksek olması önerilir (YeĢilsoy ve ark., 1995). Ancak bu özelliğe rağmen

yüksek konsantrasyon, toksisitenin artmasına sebep olur. Bu Ģekilde

periapikal ve periodontal dokuları irrite edebilir (Gatot ve ark., 1991;

Tanomaru ve ark., 2002).

Son yıllarda yapılan çalıĢmalarda NaOCl‘nin yumuĢak dokudaki enflamatuar

potansiyelinden bahsedilmiĢtir. NaOCl‘nin bu özelliğinden dolayı araĢtırıcılar

düĢük konsantrasyonda kullanılması ya da klorheksidin ve ECA gibi alternatif

solüsyonların tercih edilmesini önermiĢlerdir(Gernhart ve ark., 2004).

NaOCl' nin antibakteriyel etkinliğinde konsantrasyonun önemi bilinen bir

gerçektir. Ancak irrigasyon zamanı arttırılarak düĢük konsantrasyondaki

13

NaOCl‘nin antibakteriyel etkinliği çevre dokulara zarar vermeden arttırılabilir.

Yapılan baĢka bir çalıĢmada 30 dakika uygulanan %0.5' lik NaOCl'nin ve

%5'lik NaOCl‘nin antibakteriyel, etkinliğinin benzer olduğunu gözlemiĢtir

(Gomes ve ark.,2001).

NaOCl'nin konsantrasyon değiĢikliklerindeki etkinliği ile ilgili yapılan baĢka bir

invitro çalıĢmada %0.12'lik, %0.5'lik NaOCl ve %1'lik klorheksidin glukonatın

bakteriyel özellikleri karĢılaĢtırılmıĢtır. Sonuç olarak klorheksidin glukonat'ın

%1'lik konsantrasyonlarının Enteroccoccus faecalis üzerindeki antibakteriyel

etkisi NaOCl'nin her iki konsantrasyonundan daha etkili bulunmuĢtur

(Sassone ve ark., 2003).

NaOCl'nin mikroorganizmalar üzerindeki detoksifikan etkisinin incelendiği bir

çalıĢmada; değiĢik konsantrasyonlardaki NaOCl'in küçük miktardaki

endotoksinler üzerinde detoksifikan etki gösterdiği belirtilmiĢtir (Buttler ve

Crawford, 1982).

NaOCl'nin bir baĢka önemli özelliği organik dokuları çözme yeteneğidir. Bu

özellik mekanik olarak temizlenemeyen yan kanallar ve anatomik sapmaların

temizliğinde büyük önem taĢır. Organik artıkların kimyasal olarak

temizlenmesi bakteri geliĢmesinin önlenmesi açısından önemlidir (ÇalıĢkan,

2006).

NaOCl'nin nekrotik doku çözme yeteneği solüsyonun konsantrasyonuna,

pH'ına, hacmine, ısısına, sürekli yenilenmesine solüsyona ultrasonik

titreĢimler uygulanmasına, organik doku miktarına, yüzey alanına, doku tipine

ve uygulanma süresine bağlıdır. NaOCl, doku çözücülüğünün ve

antibakteriyel özelliğinin araĢtırıldığı bir çalıĢmada klorheksidin glukonat ile

karĢılaĢtırılmıĢ, klorheksidin glukonatın antimikrobiyal aktivitesi en az NaOCl

kadar iyi bulunmuĢtur. Buna rağmen NaOCl kadar iyi doku çözücü olmadığı

belirtilmiĢtir (Ohara ve ark., 1993).

14

NaOCl, %0,2‘lik setrimid (Cetrexidin®; Vebas, San Giuliano, Milan, Italy),

%2'lik ve %0,2‘lik klorheksidin glukonatın antibakteriyel ve toksik özelliklerinin

incelendiği bir çalıĢmada, 2 haftalık süre sonunda %5,25 NaOCl'nin toksik

etkisinin farklı konsantrasyonlardaki klorheksidin glukonat ve setrimidden

daha fazla olduğu sonucuna varılmıĢtır, %2'lik kloheksidin glukonat

Enterococcus faecalis'e, %5,25'lik NaOCl'e göre daha güçlü bir antibakteriyel

etki göstermiĢtir (Önçağ ve ark., 2003).

NaOCl'in en önemli özelliklerinden birisi de periapikal dokulardaki toksik

özelliğidir. Klinik kullanımı %2.6 ile %5.25 arasında değiĢen NaOCl çevre

dokular üzerinde son derece irrite edicidir. Bazı araĢtırıcılar %5.25'lik

NaOCl'in endodontik irrigan olarak kullanımı sonrasında periradiküler

dokularda irritasyon ve ağrı olduğunu bildirmiĢlerdir. Sitotoksisite testleri,

konjuktival iltihap testleri, deney hayvanlarındaki subkutan doku

implantasyon testleri ve laboratuar testleri de bu bulguyu desteklemiĢtir

(Alaçam, 2000 ).

1.3.5.Serum Fizyolojik

Kök kanalının biyomekanik preparasyonunda kanal irrigasyon solüsyonu

olarak serum fizyolojik kullanıldığında orta dereceli bir antibakteriyal etki -

sağlanır. Serum fizyolojik kullanımı ile kök kanal sistemindeki bakteri

sayısının önemli oranda azaltılabileceği fakat genelde ilk randevunun

sonunda negatif kültür elde edilebilecek kadar azaltılamayacağı gösterilmiĢtir

(ÇalıĢkan, 2006).

Byström ve Sundquist (1983) yaptıkları çalıĢmada, % 0,5‗lik NaOCl ile serum

fizyolojiğin (%0,9‘luk sodyum klorit) antibakteriyel etkinliğini

karĢılaĢtırmıĢlardır. ÇalıĢmanın sonucunda, %0,5‘lik NaOCl‘nin serum

fizyolojiğe göre daha fazla antibakteriyel etkiye sahip olduğu gözlenmiĢtir.

15

1.3.6. Smear Clear

Son zamanlarda yeni bir ürün olarak SmearClear (SybronEndo, USA)

piyasaya sürülmüĢtür. Smear tabakasını kaldırmak için tasarlanmıĢ olan

SmearClear, %17 EDTA solusyonuna setrimid ve sülfaktanların eklenmesiyle

hazırlanmıĢtır. Bu kombinasyon kanal içi enstrümantasyon sırasında

inorganik oluĢumları kaldırmayı amaçlar. Smear tabakasını kaldırmada ve

dentin kanallarını inorganik içerikten temizlemede oldukça etkilidir.

SmearClear‘ in kullanımı boyunca ve kök kanal preparasyonunun sonunda,

öncelikli olarak son yıkamanın hipokloritle yapılmasının en iyi sonuçları

verdiği gözlenmiĢtir (Koch ve Brave, 2003).

Lui ve arkadaĢları da (2007) yaptıkları çalıĢmada EDTA ve SmearClear'in

smear tabakasını kaldırmadaki etkinliğini incelemiĢlerdir. Sonuçta

SmearClear'in, smear tabakasını kaldırmadaki etkinliğinin EDTA'dan

istatistiksel olarak daha üstün olmadığını tespit etmiĢlerdir.

Silva ve arkadaĢları (2008) yaptıkları çalıĢmada SmearClear ve%14,3‘lük

EDTA‘nın kök kanal enstrumantasyonundan sonra oluĢan smear tabakasını

kaldırmadaki etkinliğini SEM‘ de incelemiĢlerdir. Bu çalıĢmanın sonucunda

her ikisinin de smear tabakasını kaldırmada etkili olduğu ve ikisi arasında

istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamadığını rapor etmiĢlerdir.

Giardino ve arkadaĢlarının (2006) yaptıkları çalıĢmada MTAD, SmearClear,

NaOCl ve %17‘ lik EDTA‘nın yüzey gerilimleri karĢılaĢtırılmıĢtır. ÇalıĢmanın

sonucunda en düĢük yüzey gerilimini SmearClear göstermiĢtir.

Khalil ve arkadaĢları (2004) yaptıkları çalıĢmada SmearClear‘ın sitotoksik

etkisini değerlendirmiĢlerdir. Bu çalıĢmanın sonucunda; %2.5‘luk NaOCl ve

SmearClear‘ın sitotoksik etki gösterdiği; fakat %2,5‘luk NaOCl‘nin

SmearClear‘dan daha fazla hücre yıkımına neden olduğunu yani daha toksik

olduğunu gözlemiĢlerdir.

16

1.3.7. Klorheksidin Glukonat

Klorheksidin glukonat etkili bir oral antimikrobiyal ajan olduğundan

periodontal hastalıklarda, çürük önlenmesinde ve genel oral enfeksiyonlarda

tedavi edici ajan olarak kullanılmaktadır Antimikrobiyal aktivitenin

değerlendirildiği bir çalıĢmada, klorheksidin glukonat (%2) solüsyonunun

%5,25'lik NaOCl'ye eĢdeğer antimikrobiyal aktivite gösterdiği ileri sürülmüĢtür

(Jeansonne ve White, 1994).

Vianna ve arkadaĢları %0,2, %1 ve%2'lik klorheksidin glukonat (jel ve likid

formları) ve %0,5, %1, %2,5, %4 ve %5,25‘lik NaOCl‘ın antibakteriyel

özelliklerini inceledikleri bir çalıĢmada, %2‘lik klorheksidin glukonatın her iki

formununda 15 saniyede staphylococcus aereus ve candida albicansı

öldürmede etkin olduğunu gözlemiĢlerdir. Jel formunun ise 15 dakikada

porphyromonas endotalis, porphyromonas gingivalis ve prevotella

intermedia‘yı öldürmede etkin olduğunu belirtmiĢlerdir. %5,25‘lik NaOCl‘ nin

ise tüm mikrororganizmaları elimine ettiği sonucuna varmıĢlardır.

1.3.8. MTAD

Son yıllarda, tetrasiklin izomer (doksisiklin), sitrik asit ve deterjan (tween 80)

karıĢımından oluĢan yeni bir irrigasyon ajanı olarak MTAD geliĢtirilmiĢtir

(Torabinejad ve ark.,2003a) (Çizelge 1.3.8.1.).

Doksisiklin geniĢ spektrumlu ve yaygın aralıktaki mikroorganizmaya etkili

olan bir antibiyotiktir. Bakteriyostatik ve salınabilme özelliği gösterir; çünkü

sement dentin gibi diĢ yüzeylerince absorbe edilir ve salınır. Uzun dönem

kullanımında tetrasikline direnç sıklığı düĢüktür ve antikolajenaz aktiviteye

sahiptir. DüĢük pH konsantrasyonuyla kalsiyum Ģelatör gibi rol oynar.

Böylece mine ve kök yüzeyinin demineralizasyonunu sağlar. Sitrik asitle

17

karĢılaĢtırıldığında dentin yüzey demineralizasyonu daha fazladır

(Barkhordar ve ark.,1997).

MTAD' nin ikinci bileĢeni olan sitrik asit, su ve alkolde çözünen kristalin bir

organik asittir. Antibakteriyeldir ve %10.25 ve %50 konsantrasyonlardaki

sitrik asitin smear tabakasını kaldırdığı gösterilmiĢtir (Baumgartner ve

ark.,1984).

Tween-80 düĢük yüzey gerilimi olan bir deterjandır. Bu da irrigasyonun

penetrasyonunu arttırır ve kanal içi uygulamalarda antibakteriyel etkinliğini

geliĢtirir (Barbosa ve ark.,1994).

Çizelge 1.3.8.1. MTAD nin bileĢenleri ve etkileri

BileĢenler Etken madde Etkisi

Tetrasiklin izomer Doksisiklin Ġnternal ve eksternal kök

yüzeyinde dezenfeksiyon

Asit Sitrik asit Organik ve inorganik

materyallerin kök

yüzeyinden

uzaklaĢtırılması

Deterjan Tween 80 Dentin tubulleri ve kök

kanal düzensizliklerine

diffüze olmasının

sağlanması

MTAD‘ nin klinik kullanımıyla ilgili yapılan çalıĢmalarda; 20 dakika boyunca

%1,3‘lük NaOCl uygulamasının ardından, 5 dakika boyunca MTAD

uygulanması önerilmiĢtir (Machnick ve ark., 2003; Beltz ve

Torabinejad,2003).

18

ÇeĢitli araĢtırmalarda MTAD‘nin bonding ajanlara etkisi, doku çözücü özelliği,

antibakteriyel etkinliği ve smear tabakası üzerine etkinliği değerlendirilmiĢtir.

Torabinejad ve arkadaĢları (2003a) yeni ve etkili bir kök kanal irriganı olarak

MTAD'yi incelemiĢlerdir. Bu ajanın, prepare edilmiĢ kök-kanal duvarlarından

smear tabakasını kaldırdığını bildirmiĢlerdir. Bu araĢtırmanın ıĢığında,

MTAD'nin dentin yüzeyinde minimal erozyonla smear tabakasını kaldırmada

etkili bir son yıkama ajanı olduğu düĢünülmektedir

MTAD‘nin smear tabakası üzerine etkinliğinin incelendiği bir çalıĢmada;

irrigan olarak %5.25'lik NaOCl ile temizlenen ve enstrümante edilen kanal

yüzeylerinde final irrigan olarak %17'lik EDTA, %5.25 NaOCl, steril su ve

MTAD birbirleriyle karĢılaĢtırılmıĢtır. Final olarak, her bir kanal irriganlardan

biriyle 5 dakika boyunca yıkanmıĢ ve örnekler smear tabakası, debris ve

erozyon varlığı açısından SEM'de incelenmiĢtir. Smear tabakasını

kaldırmada %17'lik EDTA ve MTAD arasında anlamlı farklılık gözlenmemiĢtir.

Bununla beraber, debris uzaklaĢtırma açısından apikal üçlüde MTAD anlamlı

oranda etkin bulunmuĢtur. Erozyona bakıldığında %17 EDTA koronal ve orta

üçlüde MTAD'den anlamlı oranda daha fazla erozyona neden olmuĢtur. Bu

çalıĢma göstermiĢtir ki; MTAD smear tabakasının inorganik ve bazı organik

komponentlerini çözmektedir. Bununla beraber smear tabakasının tamamen

kaldırılması için MTAD'ye yardımcı irrigan olarak NaOCl'ye ihtiyaç vardır

(Torabinejad ve ark., 2003b).

MTAD'nin doku çözücü özelliği sığır pulpa dokusunda NaOCl ve EDTA ile

karĢılaĢtırılarak değerlendirilmiĢtir. Sonuçlar incelendiğinde, %5,25‘lik ve

%2,6‘lık NaOCl, %90'dan fazla doku çözerek en etkili doku çözücü olarak

bulunmuĢtur. MTAD ve %17‘lik EDTA‘nın ise pulpanın yaklaĢık %49'unu

çözdüğü gözlenmiĢtir. Bu solüsyonlar arasında, etkileri açısından ana farklılık

MTAD‘nin dentine yüksek bağlanma kapasitesini doksisiklinin sağladığı

bildirilmiĢtir (Beltz ve Torabinejad, 2003).

19

MTAD'nin antibakteriyel etkinliği, endodontik baĢarısızlıklarla iliĢkili bir

mikroorganizma olan E.faecalis'e karĢı değerlendirilmiĢtir. Agar difüzyon

testlerinde MTAD ve %5,25'lik NaOCĠ arasında istatistiksel olarak farklılık

bulunmamıĢtır. SulandırılmamıĢ ve 1:2 sulandırılmıĢ NaOCl

mikroorganizmaları tamamen öldüremezken, sulandırılmamıĢ ve 1:2

sulandırılmıĢ MTAD tamamen negatif kültür göstermiĢtir (Shabahang ve

Torabinejad, 2003).

BaĢka bir çalıĢmada, Shabahang ve arkadaĢları (2003), tükrükle kontamine

olmuĢ kök kanalının dezenfeksiyonunda MTAD'nin etkinliğini incelemiĢler ve

NaOCl'nin etkinliğiyle karĢılaĢtırmıĢlardır. Sonuçlar; MTAD'nin enfekte kök

kanallarından bakterileri uzaklaĢtırmada %5,25'lik NaOCĠ‘den anlamlı oranda

daha etkin olduğunu göstermiĢlerdir.

Torabinejad‘ın (2003) yaptığı bir çalıĢmada; MTAD‘nin E.faecalis üzerine

antibakteriyel etkinliğini, NaOCl ve EDTA ile karĢılaĢtırmıĢtır. Bu çalıĢmanın

sonuçlarına göre MTAD; E.faecalis'i öldürmede %5.25'lik NaOCl kadar etkili

olup, EDTA'dan ise anlamlı oranda daha yüksek etki göstermiĢtir.

Royal ve arkadaĢları (2007) yaptıkları bir çalıĢmada; Guta-perka konların

sterilizasyonu için sodyum hipoklorit, klorheksidin, gluteraldehit, alkol,

hidrojen peroksit, polivinilpirolidon iyodin ve MTAD gibi dezenfektanlar

kullanılmıĢtır.%5.25‘lik sodyum hipoklorit, %2‘lik klorheksidin ve MTAD hem

guta-perka hem de Resilon konlar üzerinde E. faecalis‘in eliminasyonunda

etkili olmuĢtur.

MTAD‘nin sitotoksisitesiyle ilgili yapılan bir çalıĢmada antibiyotik-asit-deterjan

karısım olan ticari preparat BioPure (MTAD) ile bu preparata benzer olarak

hazırlanan Deneysel Solüsyon I (% 1‘lik Doxycycline Hyclate, % 10‘luk Citric

asit, % 0,5‘lik TWEEN–80) ve Deneysel Solüsyon I‘e fluconazole ilavesiyle

hazırlanan Deneysel Solüsyon II (% 1‘likDoxycycline Hyclate, % 10‘luk

Citricasit, % 0,5‘ lik TWEEN–80,% 1‘lik Fluconazole)‘u karĢılaĢtırılmıĢ. Sonuç

olarak olusan doku reaksiyonları birbirine benzer bulunmuĢtur. Kısa

20

dönemde (48 saat) ortaya çıkan histopatolojik reaksiyonlar her üç madde için

eĢ değerdedir. Ancak MTAD ve Deneysel Solüsyon I ile ortaya çıkan

reaksiyonlar daha kısa sürede (1 hafta) iyilesirken, Deneysel Solüsyon II

karsısında olusan reaksiyonların iyilesmesi için daha uzun zaman

gerekmektedir (Köylü, 2007).

Zhang ve arkadaĢları (2003) baĢka bir araĢtırmada MTAD'nin öjenol, %3'lük

H2O2, Ca(OH)2 patı, %5.25'lik NaOCl, Peridex ve EDTA'dan daha az toksik

olduğunu tespit etmiĢlerdir.

1.3.9. Elektrokimyasal Olarak Aktive EdilmiĢ Su (ECA)

Rus bilim adamları tarafından geliĢtirilmiĢ yeni ve özel bir anot-katot

sisteminden üretilir. ECA 300'den fazla Rus ve uluslararası patente sahiptir.

Rusya‘daki hastanelerde 20.000'den fazla ECA üreten ünite bulunmaktadır.

ECA' nın insan vücuduna zararsız olduğu açık yaraları yıkamada kullanıldığı

bildirilmiĢtir. ECA‘nın fiziksel ve kimyasal yapısı henüz tam olarak

anlaĢılamamıĢtır. Solüsyonun üretimden sonra 48 saat süre ile yarı stabil

durumda bulunduğu ve birçok serbest radikal ve çeĢitli moleküller içerdiği

söylenmektedir. Üretimden 48 saat sonra solüsyon stabil hale döner ve tekrar

inaktif olur. Yarı stabil halde solüsyon çok yüksek bir oksidasyon-redüksiyon

potansiyeline sahiptir (Marais, 2000, Gulabivala ve ark., 2004).

Ġki tip ECA solüsyonu üretilmektedir. Bunlar anolit ve katolit solüsyonlardır.

Anolit, yüksek oksidasyon potansiyeline sahiptir (400-1200mV). Asidik, nötral

veya alkalen anolit solüsyonu üretebilmek mümkündür. Anolitin yüksek

derecede antimikrobiyal olduğu iddia edilmektedir. Katolit, yüksek redüksiyon

potansiyeline sahip (-80 -900mV) alkalen bir solüsyondur. Katolit

solüsyonunun güçlü bir temizleyici ve deterjan etkisi olduğu kabul edilir. Bu iki

solüsyon, içinde FEM (flow-through electrolytic module) adı verilen bir

21

yapının yerleĢik olduğu bir ünitede musluk suyu ve salin solüsyonu

kullanılarak üretilir (Marais, 2000).

Marais‘in (2000) yapmıĢ olduğu bir çalıĢmada bir grupta ultrasonik sistem ile

birlikte solüsyon olarak NaOCl, diğer grupta ise ECA solüsyonlarından ilk

önce anolit, final yıkamasında da katolit kullanılmıĢtır. Kontrol grubunda ise

hiçbir iĢlem yapılmamıĢtır. Kontrol grubunda kök kanal yüzeyinin tamamının

debris ve bakteri ürünleriyle kaplı olduğu görülmüĢtür. NaOCl kullanılan

grupta debrisin büyük bir miktarının uzaklaĢtırıldığı. kanal yüzeyinde frezler

ve kanal eğeleri ile oluĢan smear tabakasının varlığı ve bazı dentin

tübüllerinin açık, bazı dentin tübüllerinin smear tabakası ile kaplı olduğu

görülmüĢtür. ECA kullanılan grupta ise tüm kanal yüzeylerinin tamamen

temiz, debris ve bakteriden yoksun olduğu smear tabakasının olmadığı açık

dentin tübüllerinin bulunduğu ve kollajen fıbrillerin olduğu geniĢ alanlar

gözlenmiĢtir.

1.4. Biyouyumluluk

Biyouyumluluk canlı dokularla temasta olan herhangi bir maddenin, sistemik

ve lokal toksisite, alerjik, mutajenik ve karsinojenik etki yapmayan inert

özelliklere sahip olması ve vücudun yumuĢak ya da sert dokularında doku

reaksiyonu oluĢturmamasını ifade eder (Kansu, 1992; Wataha, 2000).

Biyouyumluluğun bir baĢka tanımı ise bir materyalin kendine özgü

uygulamaları sonrası, uygun konakçı doku cevabı oluĢturabilme yeteneğidir

(Schmalz,1994).

Biyouyumlulukda konakçı, materyal ve materyalin fonksiyonu arasında bir

kesiĢme olduğu görülür. Bir materyalin biyouyumlu olarak düĢünülebilmesi

için bu üç faktörün uyum içinde olması gerekmektedir. Biyouyumluluk

dinamik bir olaydır, çünkü bu üç faktörden herhangi birinde değiĢiklik

22

meydana gelirse biyouyum bozulur (ġekil 1.4.1.) (Schmalz, 1994; Wataha,

2001).

ġekil 1.4.1. Biyouyumluluk ve ilgili faktörler (Wataha,2001)

Bir materyalin ağız ortamında kullanılabilmesi için biyouyumlu olması

gerekmektedir. Biyolojik uyum için malzemenin kimyasal yapısı,

restorasyonun tasarımı, mekanik özellikleri, doku ile temasının Ģekli, yeri ve

dokunun özellikleri gibi pek çok faktörün bir arada uyum içinde olması

gerekmektedir. Biyolojik uyumu olmayan malzemeler değiĢik doku

reaksiyonlarına neden olurlar (Hanks ve ark., 1996).

1.4.1. Biyouyumluluk Testleri

DiĢ hekimliğinde kullanılan maddelerin biyolojik değerlendirmelerinde çok

sayıda tekniği kullanma imkanı vardır. Ancak test yöntemlerinden uygulaması

kolay, kısa sürede sonuç veren ve standart bir yöntem tercih edilmelidir.

Konakçı

Materyal Materyalin fonksiyonu

BİYOUYUMLULUK

23

Dental materyallerin biyouyumluluk değerlendirmelerinde üç basamak

tanımlanmıĢtır. Bunlar:

a- Birincil testler,

b- Ġkincil testler,

c-Klinik koĢullarda kullanıma dayanan testlerdir (Hensten-Pettersen,

1988; Schmalz, 1994)

a-Birincil testler; materyalin toksik profilini veren testlerdir. Bu testler,

sitotoksisite, hemolizis, ağız veya damar yolu ile kullanım sonucu sistemik

toksisite, inhalasyon toksisitesi, teratojenite, karsinojenite tahmin testleri,

Ames mutojenite testi, Styles hücre transformasyon testi gibi, bir seri yöntemi

kapsamaktadır (Hensten-Pettersen, 1988; ISO 1999,10993-5.).

b-Ġkincil testler; kullanım testleri ve birincil testler arasında yer alır. Bağ

dokusu veya kemik dokuya implantasyon, oral mukoz membran irritasyon

testleri ve sensitizasyon testlerini içermektedir (ISO 1999, 10993-5)

c-Kullanım testleri; herhangi bir materyalin insanlarda veya hayvanlarda klinik

olarak kullanılması hedeflenen alana yerleĢtirilmesi sonrasında, materyale

verilen cevapların gözlenmesi esasına dayanmaktadır (ISO 1999, 10993-5;

Hensten-Pettersen, 1988).

Bu testlerin yapılmasıyla tüm materyaller için zaman alıcı ve pahalı test

metotlarının uygulanmasına gerek kalmamaktadır (Schmalz, 1997). Ayrıca,

böyle bir sıranın takip edilmesi, hayvan çalıĢmalarına duyulan gereksinimleri

azaltacağı gibi, yetersiz materyallerin insanlarda kullanılması olasılığını da

azaltmaktadır (Torabinejad ve ark., 1995).

Ġn vivo hayvan deneyleri; test materyalinin klinik kullanımını deneyen

Ģartlarda, deney hayvanları üzerinde test edilmesi prensibine dayanır. Birincil

24

ve ikincil testlerde ve hayvan deneylerinde güvenli bulunan maddeler,

insanlara uygulanarak klinik kullanım ve reaksiyonlar bakımından

değerlendirilir (Browne, 1988; Hensten-Petersen, 1988; Browne, 1994;

Schmalz, 1994; Schmalz, 1997; Wataha, 2001).

1.4.2. Ġn Vitro Test Yöntemleri

Dental materyallerin olası toksik etkilerinin, geleneksel in vivo metotlarla

değerlendirilmesindeki kısıtlamalar, in vitro test metotlarının geliĢtirilmesini

zorunlu kılmıĢtır (Browne, 1988).

Ġn vivo metodların doğasından kaynaklanan problemleri içermeyen, kontrollü

deneysel koĢullarda yürütülen, tekrarlanabilen, hızlı ve ucuz Ģekilde sonuç

alınmasını sağlayan in vitro test metodları (Browne, 1988; Schmalz, 1994),

aynı zamanda dental materyallerin ağız içine yerleĢtirildikleri kısa dönemde

sergiledikleri toksik etkilerinin gösterilmesine de yardımcı olurlar. Çünkü, pek

çok dental materyalin özellikle bu aĢamada daha fazla toksisite sergilediği ve

bu anlamda en uygun değerlendirme yönteminin in vitro test metotları olduğu

bildirilmektedir (Browne, 1988). Ġn vitro araĢtırmalar, hücre ve dokuda oluĢan

yaralanmaların dejeneratif (reversible) ve nekrotik (irreversible) aĢamalarında

ortaya çıkan spesifik olayları inceler. Ġn vitro biyouyumluluk testlerinde vücut

dokularının üzerine veya içerisine yerleĢtirilen malzemelere karĢı oluĢacak

olan biyolojik reaksiyonların test ortamında oluĢturulması amaçlanır (Hanks

ve ark., 1996).

Biyolojik uyumla ilgili olarak diĢ hekimliğinde kullanılan malzemeler beĢ ayrı

grupta incelenirler:

1. Ağız dıĢında bulunan ancak vücudun diğer bölümleri ile yutma,

soluma veya dokunma yoluyla temasta olan malzemeler,

25

2. Ağız içinde bulunan ve yumuĢak dokularla temas halindeki

malzemeler,

3. Pulpanın sağlığını etkileyebilecek malzemeler,

4. Kanal dolgu malzemeleri,

5. DiĢ sert dokularının sağlığını etkileyebilecek malzemeler (Ergün,

1998).

Bir materyalin biyouyumluluğunu belirlemedeki en önemli aĢama materyale

uygun özellikteki en ideal test yönteminin seçilmesidir. Çünkü biyolojik

uyumun belirlenmesinde kullanılacak olan testler hem malzemenin

uygulandığı bölgeye hem de beklenen zararlı etkilere göre farklılık

göstermektedir (Hensten-Pettersen, 1988).

Ġn vitro biyouyumluluk testlerinin uygulanması esnasında karĢılaĢılan

sorunlar;

1. Biyolojik reaksiyonların in vitro testlerle Ģekillendiği koĢullarda, elde

edilen sonuçlar in vivo sistem içerisinde mevcut olan koruyucu

mekanizmalardan etkilenmediklerinden, sadece test edilen ölçütle ilgili olarak

Ģekillenir (Kawahara ve ark., 1968).

2. Uygulanan test yöntemlerinin tekrarlanılabilir özellikte olabilmeleri

için standart test yöntemlerinin geliĢtirilmesi gerekmektedir (Hanks ve ark.,

1996).

Ġn vitro test yöntemleri arasında genotoksisite, östrojenite ve sitotoksisite

testleri yer alır (Browne, 1988; Schmalz, 1994; Schmalz, 1997).

26

1.4.2.1. Genotoksisite

Kimyasal maddelerin DNA üzerinde direk etkileri olabilir ve bu duruma

genotoksisite adı verilir. Bu etkinin belirli durumlarda sonraki nesillere

aktarılmasına ise mutajenite denir. Bu etkiler subtoksik konsantrasyonlarda

da meydana gelebilir. Özel bakteriler veya memeli hücreleri bu etkiyi

incelemek için kullanılmaktadır. Mutajenite aynı zamanda karsinojenitiyle de

iliĢkilidir. Karsinojen olduğu bilinen 301 kimyasal maddenin %90'nı, en sık

kullanılan mutajenite testi olan AMES testinde pozitif sonuç vermiĢtir

(Schmalz, 1994; Geurtsen ve Leyhausen, 1997; Schmalz, 1998).

1.4.2.2. Östrojenite

Belirli kimyasal maddeler, subtoksik konsantrasyonlarda vücuttaki östrojen

reseptörlerine bağlanarak, östrojenlere benzer bir biyolojik reaksiyon ortaya

koyarlar. Bu kimyasal maddelerden biri de bisfenol A'dır. Bis-GMA, bisfenol

A‘nın sentezinden açığa çıktığından pek çok rezin içerikli maddenin

içeriğinde bulunmaktadır (Schmalz, 1998).

Son zamanlarda rezin içerikli maddelerin östrojeniteleri daha büyük önem

kazanmıĢtır. Bu kimyasal maddelerin insan sağlığı üzerindeki etki

mekanizmaları tam olarak anlaĢılmamıĢtır. Ancak doğada bu tip maddelere

bağlı olarak üreme organlarında bozukluklar, deformitelerin görüldüğü pek

çok çalıĢmada belirtilmiĢtir (Söderholm ve Mariotti, 1999; Tarumi ve ark.,

2000).

27

1.4.2.3. Sitotoksisite

Sitotoksisite, in vitro biyouyumluluk değerlendirmelerinde en yaygın kullanılan

test yöntemidir (Hanks ve ark., 1996). Farklı metotlara sahip çeĢitli

sitotoksisite testleri bulunmakla birlikte, her bir test baĢlıca üç bileĢenden

oluĢmaktadır;

a-biyolojik sistem,

b-hücre/materyal teması,

c-değerlendirme metodu (Schmalz, 1994).

a-Biyolojik Sistem: Ġn vitro sitotoksisite değerlendirme testlerinde, biyolojik

sistem olarak; organ kültürleri, hücre kültürleri ve hücre

organellerinden yararlanılmaktadır (Schmalz,1994). Dental materyallerin

sitotoksisite değerlendirmelerinde, en yaygın kullanılan biyolojik sistem,

kültür ortamındaki hücrelerdir. Nadir olmakla birlikte,

biyolojik sistem olarak diĢ jermi gibi organ kültürlerininde kullanıldığı

görülmektedir(Thonemann ve Schmalz, 1992).

Hücre kültürlerinin kullanıldığı test sistemlerinde, hücre tipleri;

Mortal hücre kültürleri (primer, diploid),

Ġmmortal hücre kültürleri (devamlı) olarak sınıflandırılmaktadır

(Hensten-Pettersen, 1988; Schmalz, 1994).

Hücre kültür koleksiyonlarından veya ticari kaynaklardan elde edilebilen

devamlı hücreler anöploid kromozom biçimi gösterirler ve uygun

pasajlandıkları sürece sınırsız yaĢam sürelerine sahiptirler (Schmalz,1994;

Koh ve ark. 1998). Transforme olan veya tumoral orijin gösteren bu hücreler

28

(Feigal ve ark, 1985), primer hücrelere göre daha basit sistemleri sergilerler.

Oysa, herhangi bir laboratuarda, doku eksplantlardan elde edilen diploid

kromozom Ģekline sahip primer hücreler, yavaĢ büyümeleri ve yaĢam

sürelerinin kısıtlı olması ile karakterizedirler (Schmalz, 1994; Koh ve ark.,

1998). Ancak, spesifik metabolik potansiyele sahip primer hücreler, hedef

hücrelere benzerlikleri nedeni ile in vivo Ģartlara daha yakın deneysel koĢullar

oluĢturulmasını sağlarlar (Arenholt-Bindslev ve Blegg, 1990).

b-Hücre/Materyal Teması: Direkt veya indirekt Ģekilde materyalin kendisinin

veya materyal yapısından salınan bileĢenlerin kullanılması ile

sağlanmaktadır. Direkt temas testlerinde, hücreler materyalin yanında veya -

üzerinde büyürlerken, indirekt temas testlerinde, materyal ve hücreler bir

bariyer ile ayrılmıĢlardır (Wennberg ve ark., 1979; Schmalz, 1988). Hücre

materyal temasını sağlamanın üçüncü yolu ise dental materyallerin belirli bir

zaman periyodu boyunca, besi ortamı gibi sıvı bir ortamda bekletilmesi ve

sitotoksisite testlerinde materyalin kendisi yerine bu sıvıların kullanılmasıdır

(Keiser ve ark., 2000).

Direkt hücre/materyal temasına dayanan test sistemleri, klinik koĢullarda

diĢeti, pulpa, periapikal dokular gibi canlı dokularla iliĢkide bulunan dental

materyallerin sergilediği davranıĢları taklit edebilmek amacı ile düzenlenir

(Schmalz, 1994). Ancak, bu tür uygulamalarda, hem materyal özelliklerinde

değiĢiklikler oluĢabileceği, hem de hücrelerde mekanik hasar meydana

gelebileceği gerekçesiyle, deney örneklerinin sterilizasyonu yapılmadığı için,

kültür ortamı kontamine olabilmektedir (Keiser ve ark., 2000).

Ġndirekt hücre materyal temasına dayanan test sistemleri ise dolgu

maddelerinin canlı dokulardan dentin veya smear tabakası gibi bir bariyer ile

ayrıldığı durumları taklit edebilmek amacı ile düzenlenir (Schmalz, 1994).

Hücre materyal temasının sağlanmasında bir diğer alternatif, materyallerden

salınan bileĢenlerin kullanımıdır. Kolayca iĢlenebilen ve filtreler yardımı ile

steril edilebilen bu sıvılar, sitotoksisite değerlendirme testlerinde materyalin

29

kendisi yerine kullanılabilir (Schmalz, 1994; Keiser ve ark, 2000). Bu

yaklaĢımla, materyalin hem direkt temasında, hem de hücrelerden uzakta

meydana getireceği etkiler belirlenebilmektedir (Keiser ve ark, 2000).

Basit bariyer sistemi olan agar/agaroz ve selüloz asetat filtrelerin dental

materyallerin sitotoksisite değerlendirmelerinde birinci adım olduğu, ikinci

adımda daha iyi değerlendirme amacı ile yapıdan salınan bileĢenlerin

kullanılması gerektiği bildirilmektedir (Schmalz, 1994).

c-Değerlendirme Metotları: Sitotoksisite testlerinde, hücre morfolojisinde,

hücre membranında ve hücre aktivitesindeki değiĢikliklere göre

değerlendirme yapılabileceği gibi, hücre proliferasyon oranlarındaki

değiĢikliklere göre de değerlendirme yapılabilmektedir (Schmalz, 1994).

Morfolojik değerlendirmeler agar difüzyon testindeki hücre lizis indeksi gibi

indekslerle yapılabilmektedir. Ancak, bu yaklaĢımlarla nicel bir değerlendirme

yapılabileceği gerçeği unutulmamalıdır. Ayrıca, morfolojik değerlendirmelerin

formaldehit gibi fiksatif içeren dental materyallerin sitotoksisite sonuçlarında

yanıltıcı olabileceği bildirilmektedir (Schmalz, 1994).

Membran değiĢiklikleri canlı hücrelerde depolanan nötral kırmızı veya canlı

hücrelerden salınan tyripan mavisi gibi boyalarla belirlenebilmektedir

(Schmalz, 1994).

Hücre aktivitesini belirlemeye yönelik test sistemlerinde belirli bir enzim,

enzim grubu veya maddenin ölçülmesi ile değerlendirme yapılmaktadır

(Schmalz, 1994). Son yıllarda dental materyallerin sitotoksisite

değerlendirmelerinde sıkça kullanılan mitokondri dehidrojenaz aktivitesini

ölçmeye yönelik MTT değerlendirmeleri (Keiser ve ark., 2000) ve fluoresein

diasetat ile non spesifik hidrolazların ölçülmesine yönelik değerlendirmeler

hücre aktivitesini belirleyen testlere örnek olarak verilebilir (Schmalz, 1994).

30

Hücresel hasarın belirlenmesinde kullanılan en eski ve en yaygın metot

hücre proliferasyon oranlarının ölçülmesidir (Schmalz, 1994).

Bu tür geleneksel yaklaĢımların dıĢında son yıllarda, materyallere karĢı

geliĢen inflamatuar veya immün reaksiyonların da, sitotoksisite

değerlendirmelerinde belirleyici olarak kullanılmaya baĢlandığı görülmektedir

(Koh ve ark., 1998; Haglund ve ark., 2003; Pistorius ve ark., 2003).

Değerlendirme amacı ile inflamatuar ve immün reaksiyonlar sırasında yüksek

konsantrasyonlarda salınan ve bu tür reaksiyonlara aracılık eden sitokinlerin

kullanımı ile umut verici sonuçlara ulaĢıldığı bildirilmektedir.

Dental materyallerin sitotoksisitesinin değerlendirildiği testlerde, uygulanan

materyalin;

1. Hücre sayısı ve büyümesi,

2. Hücrelerin membran bütünlüğü,

3. Biyosentez veya enzim aktivitesi ile,

4. Hücrenin genetik yapısı üzerindeki etkileri, ölçülür (Hensten-

Pettersen, 1988; Hanks ve ark., 1996).

Sitotoksisitenin değerlendirilmesinde kullanılan Ġn vitro testlerin avantajları

Ģunlardır:

1. Testi yapılacak malzemenin, diğer metabolik olaylardan bağımsız

olarak, hücre metabolizmasındaki spesifik bir fonksiyon üzerindeki etkisi

değerlendirilir,

2. Aynı anda çok sayıda örnek kısa zamanda test edilebilir ve diğer

testlere oranla daha ekonomiktir,

31

3. Deneyler sonucunda kantitatif sonuçlara ulaĢılır,

4. Materyallerin toksisitesi kullanım testlerine oranla daha hassas

olarak değerlendirilir,

5. Deneyler esnasında test koĢulları standardize edilebilmektedir

(Browne, 1988; Schmalz, 1994).

Ġn vitro sitotoksisite testlerinin dezavantajları;

1. Her test için bir tür hücre kullanılması gerekmektedir,

2. Kültür hücreleri konak hücrelerinden farklıdır,

3. Kültür ortamında in vivo koĢullarda mevcut olan enflamatuar

reaksiyonların ve diğer doku koruyucu mekanizmaların bulunmaması önemli

bir eksikliktir (Schmalz, 1994; Schmalz, 1997).

Ġn vitro sitotoksisite testlerinde kullanılan biyolojik sistemler organ kültürleri,

hücre kültürleri ve hücre organelleridir. Dental materyallerin sitotoksisitelerini

değerlendirmek için çoğunlukla biyolojik sistem olarak hücre kültürleri

kullanılmaktadır (Browne, 1988; Schmalz, 1994; Geurtsen ve Leyhausen,

1997).

1.4.3. Hücre Kültürü

Hücre kültürü tanımı canlı dokuların vücut dıĢında yaĢatılmasını, sürekli

üretimini ve geliĢimini ifade etmektedir. Canlı yapılardan elde edilen dokular,

vücut ısısında kültüre edilmekte ve vücudun özgün fizyolojik konumunu taklit

eden besleyici sıvılarda beslenerek çoğaltılmaktadır. Besleyici sıvılar, hayvan

32

embriyo ekstratları, plazma ve serum, aminoasit, mineraller, Ģeker, tuz,

vitamin ve antibiyotikleri içerir (Gerstner, 1971).

Hücre kültürleri;

• Bireysel faktörlerden etkilenmemeleri,

• Materyaller arasında parametrik karĢılaĢtırmalara olanak

tanımaları,

• Tekrarlanabilme özellikleri,

• ÇalıĢma koĢullarında standardizasyonun sağlanabilmesi,

• Deneylerde kullanılacak hayvanların öldürülmemesi gibi etik

nedenlerden dolayı tercih edilmektedirler (Browne, 1988; Schmalz, 1994;

Schmalz, 1997). Ancak hücre kültür testleri ile sadece maddelerin ilk toksisite

reaksiyonları konusunda bilgi edinilebilmektedir. Malzemenin uzun süre doku

ile temasta olduğu durumlarda oluĢturacağı toksisitenin düzeyi konusunda

bilgi vermemektedir (Schmalz, 1994).

Hücre kültürleri genel olarak üç grupta toplanır:

1. Primer hücre kültürleri: Orijinal dokudan ayrılan ve ilk olarak kültür

Ģartlarında bulunan hücreleri içerir. Bu hücreler genotipik ve fenotipik yönden

orijinal doku hücresi ile aynı özellikleri taĢır. Ancak bu hücrelerin deneysel

çoğalmaları sınırlıdır.

2. Devamlı hücre kültürleri: Subkültürleri sonsuz olarak yapılabilen ve

karyotipleri alındıkları dokulardan farklı olarak geliĢtirilmiĢ kültürlerdir.

Standardize edilerek ve kodlanarak kullanıma sunulmuĢtur.

33

3. Diploid hücre kültürleri: Primer kültürlerin subkültürlerinden elde

edilir. Tekrarlanan pasajlar sonucu orijinal dokunun karyotipini kaybetmemiĢ

olan hücre dizileri olarak tanımlanır (Browne, 1988; Schmalz, 1994; Wyk ve

ark., 2001; Hauman ve Love, 2003).

DiĢ hekimliğinde kullanılan maddelerin in vitro hücre kültür testlerinde

kullanılmak üzere ISO 10993-5:1999 (E)"de tavsiye edilen devamlı hücre

kültürleri Ģunlardır: Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu CCL 1 (NTCC clone

929, fare fıbroblast hücresi), CCL 163 (Balb/3T3 clone A31, fare embriyo

fibroblast hücresi), CCL 171 (MRC-5, insan embriyo akciğer fibroblast

hücresi), CCL 81 (VERO, Afrika yeĢil maymunu böbrek epitel hücresi), CCL

10 [ (BHK-21) C-13, hamster böbrek fibroblast hücresi] ve V-79 (379A, Çin

fare akciğer fibroblast hücresi)‘dur (ISO 1999, 10993-5)

Kültür ortamında hücrelerin yaĢaması, beslenmesi ve çoğalması için bazı

Ģartların yerine getirilmesi gerekmektedir. Ġn vitro hücre kültürü deneylerinde,

hücrelerin yaĢatılması için açık sistem ya da kapalı sistem inkübatörleri

kullanılmaktadır. Açık sistemde, kültür ortamı ile inkübatör içindeki hava

iliĢkidedir. Bu tür inkübatörlerde ortama, sisteme bağlı olan bir tüpten CO2

gelir, hücre ve dokuların yaĢatılması için, genellikle, 37°C, %5 CO2‘li ve %95

nemli ortam sağlanır. Uzun süreli kültürlerde, mutlaka açık sistem kullanılmalı

ve birkaç gün ara ile kültür vasatı yenilenmelidir. Bu iĢlem metabolizma

artıklarının uzaklaĢtırılıp yeni geliĢim ve besleyici faktörlerin sağlanması için

yapılmaktadır (Erkoçak, 1983; Davis, 1996).

Hücrelerin yaĢaması için gerekli Ģartların oluĢturulması gerekmektedir. Bu

Ģartlar aĢağıda sıralanmıĢtır.

Beslenme: Hücre veya dokular kültür kaplarına aseptik koĢullar altında

ekildikten sonra, kültür vasatı ilave edilir. Kültür vasatının besleyici madde

karıĢımını proteinler, vitaminler, tuzlar ve büyüme faktörleri; enerji kaynağını

ise glukoz, metabolitler, mineraller, polipeptidler, organik maddeler,

34

inhibitörler oluĢturur. Mikrobiyal geliĢimi engellemek için ortama antibiyotikler

ve antifungal ilaçlar katılır. Bu amaçla pek çok hücre kültürü çalıĢmasında

hücre çoğalma periyodu sırasında fetal ya da yeni doğan buzağı serumu

kullanılmaktadır (Erkoçak, 1983 ; Hensten-Pettersen, 1988).

Isı: Ġnsan doku ve hücreleri 37°C'de kültüre edilir. Buna karĢın canlı

vücudunda deri gibi daha düĢük ısılarda varlığını sürdüren hücre veya doku

kültürleri için 1-2°C daha düĢük ısılar kullanılabilir. Isı artıĢı ile beraber hücre

çoğalması artar ancak ısı belirli bir düzeyi geçerse bu kez çoğalma üzerine

inhibitor etki yapar (Jacoby ve Pastan, 1979; Spier ve Griffıths, 1985; Davis,

1996).

pH, CO2 basıncı ve tamponlama: Hücrelerin büyümesi için gerekli olan ortam

pH'ı dar sınırlar içerisindedir ve üretilen hücreye göre değiĢiklikler gösterir.

Optimum pH koĢulları 7.2-7.4 arasındadır. Hücre kültürü ortamları çok sayıda

organik ve inorganik madde içerdiği halde, ortamın pH'ının fizyolojik sınırlar

içerisinde tutulması dengeli tuz solüsyonları ile sağlanır. Ancak bu

solüsyonların sağladığı denge çok duyarlı olup, kısa zamanda ya da dıĢ

ortam koĢulları değiĢtiğinde aniden bozulabilmektedir. Bu nedenle ortam

pH‘ının tamponlanması gereklidir. ÇeĢitli tamponlama yollarından en önemlisi

bikarbonat iyonları ile yapılan tamponlama olup; HCO3 + H2+CO3 H2O +

CO2 kimyasal reaksiyonu ile gösterilebilir. Ortamın asite kaydığı koĢullarda

karbonik asit bikarbonata dönüĢerek ortamın asidini nötralize eder. Ortam

bazikleĢirse karbonik asite dönüĢerek ortam pH'ı yine dengelenir. Bu arada

ısı etkisi ile karbonik asitin su ve karbondioksite dönüĢümü nedeniyle sürekli

karbondioksit kaybı olmaktadır. Bunun yerine inkübatöre dıĢarıdan CO2

verilir. 37°C'lik ısı etkisiyle CO2 gaz haline dönüĢür. Bikarbonat- CO2

tamponlu ortam, inkübatörde bulunduğu sürece ideal bir pH ortamı sağlanır

(Jacoby ve Pastan, 1979; Spier ve Griffıths, 1985).

Osmolarite: Hücre büyümesi için gerekli osmotik basınç aralığı oldukça

dardır; hücreden hücreye, türden türe farklılıklar gösterir (Davis, 1996).

35

Nem: Kültür ortamlarının zamanla buharlaĢarak pH, osmolarite ve besleyici

faktörlerini kaybetmelerini engellemek için ortamın nemlendirilmesi gereklidir.

Bunun için açık sistemli inkübatörler de kullanılır. Genellikle istenen nem

oranı %97'dir. En basit iĢlem ortama, içine mantar üremesini önlemek için

sodyum benzoat ilave edilmiĢ steril su koymaktır. Nemlenmenin yeterli olup

olmadığını test etmenin en güvenli yolu osmolaliteyi ölçmektir (Jacoby ve

Pastan, 1979).

Oksijen basıncı: Birçok hücrenin büyümesi için gerekli olan O2 miktarı bir

hayli azdır. Hücre kültürü çalıĢmalarındaki; O2 miktarı %1-10 arasında

tutulduğu koĢullarda, hücre büyümesi belirgin olarak artmaktadır (Jacoby ve

Pastan, 1979).

Toksisitenin engellenmesi: Ortamdaki herhangi bir eleman gereğinden fazla

olduğunda toksik olabilir. Toksisite bazen ortamda bulunan ve toksik olmayan

maddelerin bir araya gelmesi ile oluĢabilir. Toksisiteyi oluĢturan etkene göre

çeĢitli çözüm yolları uygulanır. Tüm sitotoksisite testlerinde, test sisteminin

non-toksik, steril ve tekrarlanabilir olması önemlidir (Davis, 1996).

Dental materyallerin sitotoksisitesinin in vitro koĢullarda incelenmesinde

hücre nekrozu, membran geçirgenliğindeki değiĢiklikler, metabolik

değiĢiklikler veya sitopatojenik değiĢiklerden faydalanılır (Browne, 1988;

Murphy, 1988; Schmalz, 1994). Dental materyallerin sitotoksisite testleri için

çeĢitli yöntemler geliĢtirilmiĢtir Bu yöntemler Ģunlardır:

1.4.3.1.Agar Overlay Yöntemi

Bu test yönteminde katı materyallerin ve katı materyallerden açığa çıkan

maddelerin akut sitotoksisitesi saptanır. L929 hücreleri kültür kaplarında

üretildikten sonra üzerleri agarla örtülür ve hücreler nötral kırmızıyla boyanır.

Agar üstüne test edilecek madde yerleĢtirilir. 24 saat inkübasyondan sonra

36

örneklerden çıkan toksik maddelerin yayıldıkları bölgelerdeki hücrelerde

gözlenen boya kaybıyla sitotoksisite ölçülür. Eğer difüze olan toksik

maddelerin konsantrasyonu yüksek ise hücre erimesi görülür. Sitotoksisite;

renk değiĢtiren difüzyon bölgesinin geniĢliğine göre "zone indeksi" ve bu

bölgede hücre erimesi gösteren "hücrelerin yüzdesi" hesaplanarak belirlenir

(Hensten-Petersen, 1988; Murphy, 1988; Schmalz, 1988; Schmalz, 1994;

Hanks ve ark., 1996).

1973 yılında Wilsnack ve arkadaĢları agarozdaki difüzyon özelliğinin agara

göre daha fazla olduğunu bulmuĢlardır. Agar overlay yönteminin

hassasiyetinin artması için agaroz kullanımını önermiĢlerdir (Hensten-

Petersen, 1988; Schmalz, 1994; Hanks ve ark., 1996).

1.4.3.2.-Milipor Filtre Yöntemi

Hücre kültürü test yöntemlerinde uygulanan materyal ve hücre arasındaki

direk temas klinikte çok sık karĢılaĢılan bir durum değildir. Milipor filtre

yönteminde hücreler filtrenin bir tarafında ve materyal filtrenin diğer tarafında

bulunur. Böylece hücreler üzerinde toksik etki gösterecek olan maddelerin

0,45 µm filtre porlarının içinden yayılması gerekmektedir. Milipor test

yönteminde insan epitel hücreleri veya fare fibroblast hücreleri (L929)

kullanılmaktadır. Bu test yönteminde değerlendirme hücre ve materyalin

temas bölgesinde, boyanan alanın boyanma yoğunluğuna, çapı ve

geniĢliğine göre yapılır (Hensten-Petersen, 1988; Murphy, 1988; Wennberg,

1988; Schmalz, 1994; Hanks ve ark., 1996).

37

1.4.3.3.-Krom Salınım Test Yöntemi

Likit ve katı materyallerin sitotoksisitesinin değerlendirilmesinde kullanılır.

Radyoaktivitenin ölçülmesi için spektrometre kullanılır. Sodyum kromat

(Na2Cr04) içerisindeki hekzavalent, 51Cr hücrelerinin içerisine girer ve

proteinlere tutunarak trivalent forma dönüĢür. ĠĢaretlenmiĢ hücreler ile test

materyalleri direk temasta olduğunda hücrelerde hasar oluĢur ve trivalent

51Cr hücre dıĢına çıkar. Hücre dıĢına çıkan 51Cr'un radyoaktivitesinin ölçümü

hücre ölümü hakkında bilgi verir (Hensten-Petersen, 1988; Schmalz, 1994;

Hanks ve ark., 1996).

1.4.3.4.Model Kavite Yöntemi

Materyal, polimetil metakrilattan hazırlanmıĢ kaviteye yerleĢtirilir. Kavite

tabanına milipor filtresi veya dentin tabakası yerleĢtirilir. Kavitenin altına

hücre kültürleri eklenir. Hücre hasarı, sırasıyla lizozomlar ve mitokondri için

enzim iĢaretleyicisi olan asit fosfataz ve süksinat dehidrogenazın

belirlenmesiyle yapılmaktadır (Hensten-Petersen, 1988; Meryon, 1988;

Hanks ve ark., 1996).

1.4.3.5.DiĢ Kavitesi Yöntemi

Restoratif materyallerin kimyasal toksisitesini belirlemek için Hume tarafından

1985 yılında geliĢtirilmiĢtir. Üçüncü molar diĢler çekildikten sonra fosfatla

tamponlanmıĢ salinde 3–4 saat bekletilir. Normal kavite veya kron

preparasyonundan sonra sistem dentin duvarlarından penetre olabilen

maddelerin solüsyonunu elde etmek için kullanılır. Bu yöntemin in vivo

38

verilerle uyumlu sonuçlar verdiği belirtilmiĢtir (Hume, 1985; Hensten-

Petersen, 1988; Hanks ve ark., 1996; Schmalz, 1997).

1.4.3.6.Dentin Bariyer Testi

Restoratif materyallerin pulpa üzerine sitotoksik etkilerini belirlemede, model

kavite ve diĢ kavite metotlarından sonra varılan nokta dentin bariyer

testleridir. Dentin bariyer testlerinin geliĢtirilmesinin temelinde, toksik

hadiselere karĢı dentinin koruyucu etkilerinin gösterilmesi yatmaktadır. Henüz

geliĢim aĢamasında bulunan dentin bariyer testlerinin en önemli

dezavantajları test sistemlerinin oturmamıĢ olması ve dentin kesitlerinin

standardizasyonundaki güçlüklerdir (Hanks ve ark., 1996). Bu problemleri

aĢabilmek ve testin uygulanabilirliğini arttırmak amacı ile dentin bariyer

testleri için geliĢtirilen düzeneklerin piyasaya sürüldüğü görülmektedir

(Schmalz, 1997). Dentin bariyer testlerinde sitotoksisite değerlendirmeleri;

belirlenen inkübasyon süreleri sonrasında, canlı hücre sayımı (Schmalz,

1997) veya MTT ile enzim aktivitesindeki değiĢikliklere göre yapılabilmektedir

(Schmalz ve ark., 2002).

1.4.3.7. Hemolizis Testi

Bu yöntemin amacı kemikle veya yumuĢak dokuyla uzun süre temasta

olacak materyallerin akut hemolitik aktivitesini incelemektir. Hemolizis

testinde tavĢan kanı kullanılarak, materyalin hemolitik aktivitesi

belirlenmektedir. Materyalin hem yüzeyi hem de materyalden çözünen

maddeler akut hemolitik aktiviteyi oluĢturur (Hensten-Petersen, 1988).

39

1.4.3.8.Ekstraksiyon Testi

Ekstraksiyon testinde, test edilecek örnekler üzerine hücre vasatı ilave

edilerek 37°C' lik, %5 CO2 içeren etüvde deney süresi boyunca bırakılır. Süre

sonlandığında tüplerin içeriğindeki vasat, daha önceden hazırlanarak kültüre

edilen hücrelerdeki vasat ile değiĢtirilip en az 24 saat süre ile 37°C' lik %5

CO2 içeren etüvde bekletilir. Sonra, nitel ya da nicel değerlendirme

hücrelerdeki değiĢikliklere ya da hücre erimesine göre yapılır (Huang ve

Chang, 2002; Schwarze ve ark., 2002).

Ekstraksiyon testinde ekstratların filtrasyonla steril edilebilmeleri, direk temas

testlerine göre avantaj sağlamaktadır; çünkü direk kontak testinde test

materyallerinin sterilizasyonu materyalin özelliklerinde değiĢikliklere neden

olabilmektedir (Keiser ve ark., 2000)

1.4.3.9.MTT Yöntemi (Mitokondiriyal Dehidrogenaz Aktivitesi)

Sitotoksisitenin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılan enzimatik test

yöntemlerinden birisi MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphentyltetrazolium bromide] testidir. Bu test, MTT'yi mavi, çözünmeyen

formazan bileĢiğine dönüĢtürebilen dehidrogenaz enzim aktivitesini ölçer.

Hücrelerde uygulanan maddenin sitotoksik etkisi nedeniyle dehidrogenaz

enzim aktivitesinin etkilendiği koĢullarda mavi renkli formazan

oluĢmamaktadır. Formazan formasyonu ya optik yoğunluğun ölçülmesi veya

test örneğinin çevresindeki formazan ıĢığın elektron mikroskobuyla

belirlenmesiyle değerlendirilir (Freshney,1987; Jenkins,1999).

Hücre kültürü test yöntemleri laboratuar koĢullarında standart koĢullar

içerisinde gerçekleĢtirilebilmektedir. Bu nedenle kontrol edilebilme ve

tekrarlanabilme özellikleri vardır. Ayrıca sonuçlar kısa sürede

40

alınabilmektedir. Ancak sitotoksisite testleri ile toksik madde ile temasa bağlı

olarak oluĢan, sınırlı etkiler belirlenebilir (Koulaouzidou ve ark., 1999; Huang

ve ark., 2002a; Quinlan ve ark., 2002; Szep ve ark., 2003). Buna karĢın in

vivo koĢullarda gerçekleĢen biyolojik reaksiyonların çoğu basit bir

sitotoksisite olmayıp, enflamatuar ve immun reaksiyonlarla kombine olarak

geliĢir. Bu nedenle in vitro testlerle malzemeye karĢı oluĢan öncül tepkiler

belirlendikten sonra, malzemenin uzun dönem kullanımı sonrasında oluĢacak

enflamasyon, immun cevaplar, mutagenez ve karsinogenez gibi subakut

toksisite reaksiyonlarını yansıtan ikincil testler kullanılmalıdır (Schmalz, 1994;

Schmalz, 1997; Chang ve ark., 1998; Chang ve ark., 2000).

1.4.4. Protein Miktar Tayini Yöntemi

Bu alanda yapılan çalısmalarda en çok kullanılan metotlardan biri protein

miktarının ölçümüdür. Protein miktarı tayinindeki kullanılacak metodun seçimi

çok önemlidir. Çünkü tüm protein miktarı tayin metotları, proteini olusturan

amino asitler arasındaki peptit bağlarının parçalanması prensibine dayanır.

Amino asitler arasındaki peptit bağların ayrılmasında kullanılan kimyasal

maddelerin özellikleri metotlar arasındaki farklılıkları olusturmaktadır. Protein

miktarı tayin metotları Biüret yöntemi, Warburg-Christian yöntemi,

Bradford(boya bağlama) yöntemi, Lowry yöntemidir. Boya bağlama yöntemi,

Bradford‘un asitlendirilmis Coomassie Brillant Mavisi G-250 çözeltisi ile

absorbsiyonun maksimumunun degerlendirilmesine dayanan ve berrak

olarak elde edilmis süpernatantın UV Spektrofotometrede 280 nm dalga

boyunda direkt absorbansının okunması ile degerlendirilir (Toker, 2000).

Protein tayin yöntemlerinde tanımlanan tüm metotlar spektrofotometrik

yöntemlere dayanmaktadır. Fotometrik tayinler bir numuneye giren ıĢıkla,

çıkan ıĢığın Ģiddeti arasındaki oranın ölçülmesine dayanır. Bir kaynaktan

çıkan ıĢık paralel bir demet haline getirilir, bir monokromatörden (prizma)

geçirilir ve absorbsiyonun meydana geldiği küvete girer. Küvetten çıkan ıĢık

demeti, gelen ıĢık demetinin Ģiddeti ile orantılı bir elektrik sinyal oluĢturan

41

fotoelektrik dedektöre çarpar. Her atom, molekül veya kimyasal bağın

kendine özel spesifik bir ıĢık dalga boyu absorbsiyonu vardır.

Spektrofotometre, çözeltiye bilinen spesifik bir dalga boyu ıĢığını gönderip,

bu ıĢığın ne kadarının absorbe olduğunu ve ne kadarının yayıldığını ölçen bir

alettir. Bu ölçümle de bir kimyasalın ne miktarda bulunduğu hesaplanabilir

(ġekil1.4.4.1)(Ġmamoğlu, 2007).

ġekil 1.4.4.1 Spektrofotometrenin çalıĢma prensibi

1.4.4.1. Bradford (Coomassie Blue) Yöntemi

O