dna’nın İzolasyonu ve analizi - molekulce.com · dna İzolasyon yÖntemlerİnde bİrbİrİnİ...
TRANSCRIPT
DNA İzolasyonu
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
DNA’nın Özellikleri,
Negatif yüklüdür,
Suda çözünebilir,
Alkolde çözünmez.
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
DNA İZOLASYON YÖNTEMLERİNDE BİRBİRİNİ
İZLEYEN ÜÇ TEMEL AŞAMA BULUNMAKTADIR:
1-Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması,
2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi,
3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması,
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
cell growth cell harvest
and lysis
DNA purification
DNA purification: overview
DNA concentration
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
Bacterial genomic DNA prep: cell extract
Lysis:
• Detergents
• Organic solvent
• Proteases
(lysozyme)
• Heat
“cell extract”
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
Genomic DNA prep: removing proteins and RNA
Add the enzyme RNase to degrade RNA in the aqueous
layer
Need to mix gently! (to avoid shearing breakage of the
genomic DNA)
chloroform
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
2 ways to concentrate the genomic DNA
70% final conc.
“spooling” Ethanol precipitation molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
*Enzimler (RNase) RNA’yı yok etmek için,
*Enzimler (Proteases) DNA molekülüne bağlı olarak
bulunan proteinleri yok etmek için,
*İzopropanol ve etanol: Nükleik asitlerin
çöktürülmesinde,
*Amonyum sülfat ve sodyum sülfat:Proteinlerin
çöktürülmesinde,
*Etil asetat, Toluen, SDS membran yapısını
bozmada,
***İzole edilen DNA +4°C’da uzun süre saklanabilir.
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
Plasmids: vehicles of recombinant DNA
Bacterial cell
genomic DNA plasmids
Non-chromosomal DNA
Replication: independent of the chromosome
Many copies per cell
Easy to isolate
Easy to manipulate molekulce.com/Tuba ERTÜRK
Plazmidler;
F Plazmidleri: Kromozom dışında veya bakteri
kromozomuyla birleşmiş halde bulunabilen genetik
elementlerdir. Kendilerinde bulunan genetik mteryali veya
bakteri kromozomunun bir kısmını oluşturdukları seks
pilusları ile alıcı bakterilere aktarırlar.
R plazmidleri: antibiyotiklere karşı direnç sağlarlar.
Kolisin plazmidleri: kolisinleri kodlayan genleri taşırlar.
Virulans plazmidleri
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
Plasmid purification: alkaline lysis
Alkaline
conditions
denature
DNA
Neutralize:
genomic DNA
can’t renature
(plasmids
CAN because
they never
fully
separate)
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
DNA purification: silica binding
Binding occurs in presence of high
salt concentration, and is disrupted
by elution with water
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
DNA purification: phenol/chloroform extraction
1:1 phenol : chloroform
or
25:24:1 phenol : chloroform : isoamyl alcohol
Phenol: denatures proteins, precipitates form at
interface between aqueous and organic layer
Chloroform: increases density of organic layer
Isoamyl alcohol: prevents foaming
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
1. Aqueous volume (at least 200 microliters)
2. Add 2 volumes of phenol:chloroform, mix well
3. Spin in centrifuge, move aqueous phase to a new tube
4. Repeat steps 2 and 3 until there is no precipitate at
phase interface
5. (extract aqueous layer with 2 volumes of chloroform)
Phenol extraction
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
DNA’nın Analizi
Nükleik asitlerin nanogram veya mikrogram
düzeyindeki miktarlarının belirlenmesinde absorbsiyon
temeline dayanan spektrofotometrik yöntemler
kullanılır
Ayrıca nükleik asitlerin doğrudan görüntülenmesinde
özgün dizilerde kesim yapan restriksiyon endonükleaz
enzimlerinin etkisi sonucu oluşan farklı boyutlardaki
DNA parçalarının saptanmasında elektroforetik
yöntemler kullanılır.
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK
molekulce.com/Tuba ERTÜRK