Estudios genómicos en

parásitos helmintos

Cecilia Fernández

Estudios genómicos en parásitos

Biología básica Identificación/desarrollo de productos

control (drogas, vacunas)diagnóstico (Ag)

Objetivos

Dificultades

Los parásitos no son organismos “modelos” Las especies relevantes son diversas

Análisis del genomaProtozoariosAnálisis del transcriptoma Helmintos

Estrategias “clásicas”

Desarrollos tecnológicos:secuenciación, (bio)informática

Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)

Clonas genómicas vs clonas de ADNc

Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)

• contienen UTRs 5’ y 3’• incluyen información de ARNnc (que no codifican para proteínas)

• no contienen intrones• frecuencia

nivel de transcripción

El transcriptoma permite conocer cómo se procesan los genes

Tomado de: Blumenthal, Briefings in functional genomics and proteomics. vol 3. no 3. 199–211, 2004

Estudios genómicos en parásitos helmintos

Los helmintos son organismos que causan infecciones crónicas, con alta prevalencia en todo el mundo

Importancia

Dificultades

Poseen genomas grandes (108 pb/102

Mb) Las especies relevantes son diversas

Proyectos EST: Secuenciación sistemática

de ADNc seleccionados al azar de genotecas de diferentes estadios

• Nematodos ~ 750,000 ESTs (excl. C. el.) • Trematodos • Algunos cestodos

Datos dbEST (NCBI), 08/11

Estrategia “clásica”

~ 450,000 ESTs

Ensamblaje (‘clustering’) y análisis de ESTsTomado de Parkinson y Blaxter (2004) Methods in Mol Biol 270: 93-126

‘Genoma parcial’ del organismo

Los helmintos…Nematodos y Platelmintos (Cestodos y Trematodos)

integran grupos distintos de metazoarios

Protostomados

Deuterostomados

Lofotrocozoarios

Ecdisozoarios

Tomado de Balavoine G. ‘Evolution and development of protostomes’

Anelids

Genomas de

● Datos acerca de la evolución del parasitismo

● Datos acerca de las interacciones parásito-hospedero

¿Qué tipo de información se busca extraer de los datos genómicos?

Estudios genómicos en “helmintos” de vida libre (organismos modelos)

Genomas de:

● NematodoCaenorhabditis elegans (1997) - http://www.wormbase.org

(Caenorhabditis spp. 4 especies adicionales)

● Platelminto - Turbelario

Schmidtea mediterranea (2008) - http://smedgd.neuro.utah.edu

Estudios genómicos en parásitos helmintos

● NematodosBrugia malayiMeloidogyne spp. (M. incognita y M. hapla)Trichinella spiralisAscaris suumHaemonchus contortus

- 1a versión terminada y publicada (2007, 2008 y 2011 y 2013)

● Platelmintos

Trematodos

Schistosoma spp. (S. mansoni, S. japonicum y S. haematobium)- 1a versión terminada y publicada (2009 y 2012)

Cestodos

Echinococcus spp. (E. multilocularis y E. granulosus) Taenia soliumHymenolepis microstoma

- 1a versión terminada y publicada (2013)

Información genómica y/o

transcriptómica en el phylum nematodos

Filogenia (ARNr 18S) especies con proyecto EST ( ‘genoma parcial’ ) y/o proyecto genoma (*)

Modificado de: Mitreva y col Trends in Genetics 21(10): 573-81, 2005

***

**

**

*

*

*

Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004

Secuencias predichas de “genomas parciales” vs proteoma de C. elegans

C. elegans:20,000 genes (12,000 flías) 22,000 polipéptidos

Otros: 30 especies (28 parásitos)~ 93,000 “genes” (60,000 flías)(> 250,000 ESTs)

“Espacio génico” del phylum Nematodos

• 50% sin homólogos fuera del phylum Nematodos• 15% en todos los grupos de nematodos:

la mayoría (90%) con homólogos fuera del phylum

~ 1,300 específicos de nematodos

Tomado de: Parkinson y col. Nature Genetics 36(12): 1259-67, 2004

C. elegans

Aunque poseen un plano corporal uniforme…

• los nematodos son extraordinariamente diversos

• el genoma de C. elegans representa una porción pequeña del espacio génico del phylum

Algunos genes identificados a partir de ESTs

• poseen ortólogos fuera del phylum

• no están presentes en el genoma de C.

elegans

• genes perdidos en la evolución del linaje de C.

elegans

• genes asociados con el parasitismo (?)

Tomado de: Aboobaker y Blaxter, Current Biology 13: 37-40, 2003

El complejo de genes Hox en la evolución de los nematodos

Genes asociados con el parasitismo: ‘factores de virulencia’ adquiridos por transferencia

horizontal

Meloidogyne spp. (parásitos de las raíces de plantas) habrían adquirido 12 genes de bacterias del suelo por transferencia horizontal (HGT)

Varios genes habrían sido “donados” por rizobios (bacterias fijadoras de nitrógeno en nódulos en raíces de

leguminosas) con los que estos nematodos comparten

. el nicho. los mecanismos de interacción con la

planta

Tomado de: Mitreva et al. TIG 21(10): 573-81, 2005

NodL: N-acetil transferasa que participa en la síntesis del factor Nod,

glicolípido involucrado en el intercambio de señales entre la bacteria y la planta

Incongruencia entre las filogenias del gen y de la especie

Tomado de: B. Elsworth et al, International Journal for Parasitology 41 (2011) 881–894

NEMBASE: una base de datos de ESTs de nematodos

http://www.nematodes.org

“NEMBASE en acción”

● Relevamiento de genes de Tylenchina potencialmente adquiridos por HGT

Pregunta: ¿Qué genes específicos de Tylenchina (aparte de los de celulasas) habrían sido adquiridos por HGT?

Se trata de identificar tribus de proteínas de Tylenchina, sin contrapartes en otros nematodos y con similtud significativa con genes de fuera del phylum.

Se identificó una tribu con alta homología con proteínas virales

(ARN polimerasas ARN dependientes de Picornavirales)

¿Podría tratarse de proteínas derivadas de virus de nematodos?

“NEMBASE en acción”

● Genes de Strongylida asociados al parasitismo

Pregunta: ¿Qué genes específicos de Strongylida pueden considerarse asociados al parasitismo?

● Genes involucrados con la biosíntesis del hemo en filarias

Pregunta: ¿Existen diferencias en la biosíntesis del hemo entre las filarias que poseen la bacteria endosimbionte Wolbachia y otros nematodos?

Estudios genómicos en nematodos

http://www.nematode.net

Ver también Martin et al (2009) NAR

“Next (second)-generation sequencing” (NGS)

Una revolución en las tecnologías de secuenciación: cambio cualitativo en los costos y el volumen de datos

generados

Transcriptómica (RNASeq) y genómica de “nueva generación”

Tomado de Kumar et al Worm 1: 42-50, 2012

Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)

Secuenciación de ADN vs secuenciación de ADNc

Tomado de: ‘Molecular Biology of the Cell’ Alberts y col, 3a Ed, 1994 (Fig 7.24)

• contienen UTRs 5’ y 3’• incluyen información de ARNnc (que no codifican para proteínas)

• no contienen intrones• frecuencia

nivel de transcripción

Secuenciación sin clonado

Trancriptómica (RNASeq) de nueva generación de nematodos

Tomado de Blaxter et al Parasite Immunology 34: 108-120, 2012

aAccessed on the NCBI SRA interface (http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/); excluding data for Caenorhabditis species. WUGSC is theWashington University of St. Louis Genome Sequencing Center. Data from some published studies are not available on public databases[Heterodea glycines ].Clade: Nematode clades are as defined in Blaxter et al. 1998 . I: Dorylaimia, including Dorylaimida and Trichocephalida; II: Enoplia; III: Spirurina, including Spiruromorpha and Ascaridida; IV: Tylenchina, including Cephalobomorpha, Strongyloidoiea and Tylenchida; V: Rhabditina, including Rhabditida, Strongylida and Diplogasterida.a: Data not available. The data submitters say that their analyses have ‘produced sequences from 16 814 isogroups and 47 252 singletons’.

Caracterización del transcriptoma de Ancylostoma caninum

Transcriptos de Ac con homólogos en Ce y Bm

Tomado de: Wang y col. BMC Genomics 211:307, 2010

La comparación revela que: • el transcriptoma de los nematodos es diverso (tanto A. caninum como C. elegans integran el Clado V)

• existirían genes “relacionados con el parasitismo”(A. caninum (Clado V) y B. malayi (Clado III) integran clados distintos)

Transcriptos de Bm con homólogos en Ce y Ac

48,326 transcriptos de Ac21,000 genes de Ce 11,609 genes de Bm

Genomas de nematodos publicados

Tomado de Kumar et al Worm 1: 42-50, 2012

http://www.nematodegenomes.org

Tomado de Kumar et al Worm 1: 42-50, 2012

“50 Helminth Genomes Iniciative” (WTSI)

http://www.sanger.ac.uk/research/initiatives/globalhealth/research/ helminthgenomes/

Estudios genómicos en parásitos helmintos

● NematodosBrugia malayiMeloidogyne spp. (M. incognita y M. hapla)Trichinella spiralisAscaris suumHaemonchus contortus

- 1a versión terminada y publicada (2007, 2008 y 2011 y 2013)

● Platelmintos

Trematodos

Schistosoma spp. (S. mansoni, S. japonicum y S. haematobium)- 1a versión terminada y publicada (2009 y 2012)

Cestodos

Echinococcus spp. (E. multilocularis y E. granulosus) Taenia soliumHymenolepis microstoma

- 1a versión terminada y publicada (2013)

Evolución del parasitismo de cestodosEvolución del parasitismo de cestodos

Tomado de Tsai et al Nature 2013

“Heatmap” de vías metabólicas de platelmintos: versatilidad metabólica reducida

Tomado de Tsai et al Nature 2013

Metabolismo reducido y dependiente del hospedero

Metabolismo de lípidos reducido: no sintetizan ácidos grasos ni colesterol; no obtienen energía de los ácidos grasos

Posible ausencia de peroxisomas

Metabolismo de aminoácidos reducido: No sintetizan Phe, Trp, Tyr ni Lys como los trematodos, además la biosíntesis de Pro y Ser se habría perdido en el linaje de los

cestodos

Ausencia de síntesis de molibdopterina y de molibdoenzimas

Detoxificación reducida y dependiente del hospedero

Citocromo P450: tan sólo 1 gen (mamíferos del orden de 80 genes, Schmidtea mediterranea del orden de 50)

Ausencia de tiorredoxina y glutatión reductasas convencionales (aunque expansión de tiorredoxinas)

Familias multigénicas de GSTs de clase µ, no así de otras clases de GSTs

Desafíos de la era ‘post-genómica’...

• interpretar el genoma (ADN) y el transcriptoma (ADNc derivados de genes expresados en distintos estadios) junto con estudios de las proteínas expresadas (proteoma) y vías metabólicas (metaboloma) de los organismos

• comparar estos procesos fisiológicos con los de los hospederos para contribuir al desarrollo de nuevas estrategias de control de las parasitosis

Bibliografía

• Brindley et al (2009) Helminth genomics: the implications for human health. PLoS NTD 3(10):e538 Una revisión actualizada a 2009 de los proyectos genoma y transcriptoma de helmintos patógenos del hombre.

Genómica y transcriptómica de nematodos:• Parkinson & Blaxter (2004) Expressed sequence tags: analysis and annotation. Methods Mol Biol 270: 93Capítulo de un volumen de protocolos experimentales que describe una plataforma de herramientas para el análisis de ESTs. • Parkinson et al (2004) A transcriptomic analysis of the phylum Nematoda. Nat Genet 36(12):1259Una estudio global del transcriptoma de 30 especies de nematodos, incluyendo 28 parásitos.

• Mitreva et al (2005) Comparative genomics of nematodes. Trends in genetics 21(10): 573Otra revisión que enfatiza la idea de diversidad molecular del Phylum; incluye las evidencias de adquisición de genes de bacterias fijadoras de nitrógeno por transferencia horizontal por parte de los nematodos de plantas.

• Wang et al (2010) Characterizing Ancylostoma caninum transcriptome and nematode diversity. BMC Genomics 11:307Caracterización muy completa del transcriptoma de un helminto, utilizando tanto estrategias de generación de ESTs “clásicas” como con las nuevas herramientas de secuenciación.

• Blaxter et al (2012) Genomics and transcriptomics across the diversity of the Nematoda. Parasite Immunology 34: 108Revisión de las estrategias usadas para generar información molecular del Phylum y de las herramientas disponibles para el análisis de los datos. • Kumar et al (2012) Toward 959 nematode genomes. Worm 1: 42Artículo que revisa algunas de las ideas discutidas en la revisión anterior y presenta el proyecto de secuenciar 100 (959) genomas de nematodos.

Bibliografía

Genómica y transcriptómica de platelmintos:

• Verjovski-Almeida et al (2003) Transcriptome analysis of the acoelomate human parasite Schistosoma mansoni. Nat Genet 35(2):148• Hu et al (2003) Evolutionary and biomedical implications of a Schistosoma japonicum complementary DNA resource. Nat Genet 35(2):139Artículos que describen análisis exhaustivos del transcriptoma (ESTs) de dos especies de Schistosoma patógenas del hombre.

• Protasio, Tsai et al (2012) A systematically improved high quality genome and transcriptome of the human blood fluke Schistosoma mansoni. PLoS Negl Trop Dis 6(1): e1455Artículo que describe el análisis más completo disponible hasta el momento del genoma de S. mansoni integrando datos de un relevamiento exhaustivo del transcriptoma, utilizando RNASeq.

• Tsai, Zarowiecki, Holroyd et al (2013) The genomes of four tapeworm species reveal adaptations to parasitism. Nature 270: 93Artículo que describe la 1a versión del genoma de cuatro especies de cestodos (una secuencia de alta calidad de Echinococcus multilocularis y “borradores” de los genomas de E. granulosus, Taenia solium e Hymenolepis microstoma).

• Los datos de genómica de platelmintos están disponibles en:GeneDB http://www.genedb.org/HomepageSchistoDB http://SchistoDB.net