estudio de la telaraña del champiñón causada por
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Estudio de la telaraña del champiñón causada por Cladobotryum mycophilum
en cultivos españoles
Study of mushroom cobweb caused by Cladobotryum mycophilum in
Spanish crops
Jaime Carrasco Carrasco 2015
“Estudio de la telaraña del champiñón
causada por Cladobotryum mycophilum en
cultivos españoles”
“Study of cobweb disease caused by
Cladobotryum mycophilum in Spanish
mushroom crops”
Tesis Doctoral
Jaime Carrasco Carrasco
2015
UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS
Programa de Ciencia e Ingeniería Agraria
CENTRO DE INVESTIGACIÓN, EXPERIMENTACIÓN Y SERVICIOS DEL
CHAMPIÑÓN
Memoria presentada por
Jaime Carrasco Carrasco
Licenciado en Química
Para optar al grado de Doctor
con la mención de Doctorado Europeo
bajo la dirección de
Dr. Francisco José Gea Alegría
Dra. María Jesús Navarro Lozano
FINANCIACIÓN
La presente Tesis Doctoral ha sido financiada por los siguientes proyectos de investigación: - Proyecto: RTA2010-00011-C02-01. Control integrado de enfermedades del champiñón
mediante el uso de sustratos post-cultivo de hongos comestibles. Financiación: Ministerio de
Economía y Competitividad (INIA) y FEDER. Organismos involucrados: Consejería de
Agricultura de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha y Centro de Investigación,
Experimentación y Servicios del Champiñón (CIES, Quintanar del Rey) (2010-2013). - Proyecto: E-RTA2014-00004-C02-01. Diseño de estrategias de gestión integrada de la
telaraña en cultivos de champiñón: Estudio epidemiológico, detección de resistencias a
fungicidas y valoración de la eficacia de métodos de control biológico. Financiación:
Ministerio de Economía y Competitividad (INIA). Organismos involucrados: Consejería de
Agricultura de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha y Centro de Investigación,
Experimentación y Servicios del Champiñón (CIES, Quintanar del Rey) (2015-2018).
Y las siguientes becas y contratos:
- Beca FPI-INIA otorgada por INIA (Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria
y Alimentaria). Beca predoctoral cofinanciada por ―European Social Fund‖. Proyecto:
Control integrado de enfermedades del champiñón mediante el uso de sustratos post-cultivo
de hongos comestibles (RTA2010-00011-C02-01) (2011-2013).
- Contrato Predoctoral (Personal Investigador Predoctoral en Formación). Consejería de
Agricultura de la Junta de Comunidades de Castilla-La Mancha. Línea de Investigación:
Control integrado de enfermedades del champiñón mediante el uso de sustratos post-cultivo
de hongos comestibles (RTA2010-00011-C02-01) (2014-2016).
- INIA. Beca de movilidad para colaborar en la Universidad de Almería (Almería, España).
Proyecto: Caracterización microbiológica y optimización de los mecanismos de supresividad
de sustratos post-cultivo de hongos comestibles frente a enfermedades del champiñón.
(RTA2010-00011-C02-02). Supervisor: Prof. Dra. Milagrosa Santos Hernández (02/05/2012-
30/06/2012 y 01/03/2013- 29/03/13).
- INIA. Beca de movilidad para colaborar en el Teagasc Food Research Centre. Astown
(Dublín, Irlanda). Proyecto: Mush TV (FP7-SME-2011-286836). Supervisor: Dra. Helen
Grogan. (Septiembre - Diciembre 2013).
- INIA. Beca de movilidad para colaborar en la Universidad de Utrecht. Fungal Biology group.
Facultad de biología. Utrecht (Holanda). Proyecto: Estudio de la interacción entre el hongo
ascomiceto Cladobotryum mycophilum y los basidiomicetos Agaricus bisporus y
Schizophillum commune. Supervisor: Prof. Dr. Han Wösten. (Septiembre - Diciembre 2014).
FUNDING
This PhD document has been financed by the following research projects:
- Project: RTA2010-00011-C02-01. Integrated control of mushroom diseases through the use
of spent mushroom compost from edible mushroom crops. Funding: Ministerio de Economía
y Competitividad (INIA) and FEDER. Entities involved: Department of Agriculture of the
Regional Government of Castilla-La Mancha (Spain) and Centro de Investigación,
Experimentación y Servicios del Champiñón (CIES, Spain) (2010-2013). - Project: E-RTA2014-00004-C02-01. Design of strategies for an integrated management of
cobweb disease in button mushroom crops: epidemiological study, detection of resistance to
fungicides, and efficacy assessment of biological control methods. Funding: Ministerio de
Economía y Competitividad (INIA). Entities involved: Department of Agriculture of the
Regional Government of Castilla-La Mancha (Spain) and Centro de Investigación,
Experimentación y Servicios del Champiñón (CIES, Spain) (2015-2018)
And the following grants and contracts.
- FPI-INIA fellowship from INIA (Spanish National Institute for Agricultural and Food
Research and Technology). Pre-doctoral grant co-financed by the European Social Fund.
Project: ―Integrated control of mushroom diseases through the use of spent mushroom
compost from edible mushroom crops‖ (RTA2010-00011-C02-01) (2011-2013).
- Pre‐doctoral contract. Department of Agriculture of the Regional Government of Castilla-La
Mancha (Spain). Research line: Integrated control of mushroom diseases through the use of
spent mushroom compost from edible mushroom crops. 2010- 2013 (RTA2010-00011-C02-
01) (2014-2016).
- INIA. Mobility grant to collaborate at the Universidad de Almería (Almería, España). Project:
Microbiological characterization and optimization of the mechanisms involved in the
suppressive effect of spent substrates from edible mushroom crops against mushroom
diseases (RTA2010-00011-C02-02). Supervisor: Prof. Dr. Milagrosa Santos Hernández
(02/05/2012- 30/06/2012 and 01/03/2013- 29/03/13). - INIA. Mobility grant to collaborate at the Teagasc Food Research Centre. Astown (Dublin,
Ireland). Project: Mush TV (FP7-SME-2011-286836). Supervisor: Dr. Helen Grogan.
(September - December 2013).
- INIA. Mobility grant to collaborate at the Utrecht University. Fungal Biology group. Faculty
of biology. Utrecht (The Netherlands). Project: Study of the interaction between the
ascomycete fungus Cladobotryum mycophilum and the basidiomycetes Agaricus bisporus and
Schizophillum commune. Supervisor: Prof. Dr. Han Wösten. (September - December 2014).
PUBLICACIONES DERIVADAS DE LA TESIS – PUBLICATIONS
- Gea, F.J.; Navarro, M.J.; Carrasco, J.; González, A.J.; Suz, L.M., 2012: First Report of
Cobweb on White Button Mushroom (Agaricus bisporus) in Spain Caused by Cladobotryum
mycophilum. Plant disease. 96(7). 1067.
- Gea, F.J.; Carrasco, J.; Santos, M; Diánez, F.; Navarro, M.J. (2014). Cladobotryum
mycophilum, causal agent of cobweb disease on commercial Agaricus bisporus and Pleurotus eryngii
crops in Spain. In: Proceedings of the 8th International Conference on Mushroom Biology and
Mushroom Products (ICMBMP8). Vol.: 2. Pag. 523-529. 19-22 Nov 2014 New Delhi (India).
- Carrasco, J.; Navarro, M. J.; Santos, M.; Diánez, F.; Gea, F.J. (2015). Incidence,
identification and pathogenicity of Cladobotryum mycophilum, causal agent of cobweb disease on
Agaricus bisporus mushroom crops in Spain. Annals of Applied Biology. (In press).
doi:10.1111/aab.12257.
- Carrasco, J.; Navarro, M. J.; Santos, M.; Gea, F.J. (2015). Chemical control of Cladobotryum
mycophilum, causal agent of mushroom cobweb disease. (Under revision).
PRESENTACIÓN EN CONGRESOS–SYMPOSIUMS
- Carrasco, J.; Navarro, M.J.; Santos, M.; Gea, F.J. Identificación, incidencia y patogenicidad
de Cladobotryum mycophilum, agente causal de la telaraña en cultivos de champiñón. XVI Congreso
de la Sociedad Española de Fitopatología. Málaga (Spain). 17-21 Sep. 2012. Type: Poster
presentation.
- Gea, F.J.; Carrasco, J.; Navarro, M.J. Presencia de Cladobotryum mycophilum en cultivos de
seta de cardo (Pleurotus eryngii). XVI Congreso de la Sociedad Española de Fitopatología. Málaga
(Spain). 17-21 Sep. 2012. Type: Poster presentation.
- Carrasco, J.; Navarro, M.J.; Martínez-Carrasco, A.; Santos, M.; Gea, F.J. Identificación,
incidencia y patogenicidad de Cladobotryum mycophilum, agente causal de la telaraña, en Castilla-
La Mancha. VI Jornadas técnicas del champiñón y otros hongos cultivados en Castilla-La Mancha.
Casasimarro (Spain). 12-13 Nov. 2013. Type: Oral presentation.
- Gea, F.J.; Carrasco, J.; Santos, M; Diánez, F.; Navarro, M.J. Cladobotryum mycophilum,
causal agent of cobweb disease on commercial Agaricus bisporus and Pleurotus eryngii crops in
Spain. 8th
International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products (ICMBMP8).19-
22 Nov 2014 New Delhi (India). Type: Oral presentation.
- Gea, F.J.; Carrasco, J.; Navarro, M.J. Cladobotryum mycophilum, agente causal de la telaraña en los cultivos de
Agaricus bisporus y Pleurotus eryngii. II Jornadas Argentinas sobre Biología y Cultivo de Hongos Comestibles y
Medicinales. 25-26 Sep. 2015 San Martín (Argentina).Type: Oral presentation.
AGRADECIMIENTOS
Tras este periplo por La Manchuela conquense, que no deja de ser mi tierra aunque el acento sea
diferente, debo recordar a varias personas que han contribuido de forma decisiva al punto y final de esta
memoria.
Agradezco a mis directores de tesis Paco y Mª Jesús la oportunidad para construir junto a ellos
este trabajo.
Al INIA y al programa FPI-INIA por darme de comer durante estos años.
A los compañeros del CIES, a Antonio por su compañía y experiencia en las visitas de campo, y
muy especialmente por muchas de las fotografías que ilustran la tesis.
A Roque y Gabriel por su colaboración indispensable en los cultivos, a Arturo por la revisión del
texto, a Mª Jesús, y a Miguel Ángel por enseñarme los caminos de La Manchuela. También a Paqui, que
es igualmente parte del centro. Gracias por los almuerzos, auténtico pilar de la estructura quintanareña.
A los agricultores que han tenido la paciencia de escuchar un discurso redundante en la higiene y
el control de la telaraña.
Agradecer también a la doctora Milagrosa Santos, y a su equipo, especialmente a los Franes, por
su colaboración en la secuenciación de los aislados y por acogerme en su laboratorio.
A los doctores Helen Grogan y Han Wösten por recibirme durante las estancias, tratarme
estupendamente, y permitirme aprender un poco más fuera de los muros del CIES.
A los compañeros del Departamento de Química Agrícola de la UAM, a Rebe y a mis colegas de
bádminton Virgi y Carlos (champiñonero él también). A los doctores Juan José Lucena y Lourdes
Hernández que confiaron en mi recién salido del horno.
A quienes me soportan, en especial a esas otras tres patas de la silla donde nos sentamos ―los
pavos‖ y a la peña del lugar al que pertenezco, Tinajas, en un lugar de la Alcarria conquense.
A mis hermanas y amigas, Judit y Cristina, y a la chiquitina Irene, motivo de babeo generalizado.
A los abuelos porque a quien tiene mucho cuento le han gustado las buenas historias.
Ana, eres más bonita que un San Luis...
A mis padres, Jesús y Bene, por su lucha, su honestidad y sus esfuerzos, por el ejemplo y por lo
orgulloso que me hacen sentir. A ellos van dedicadas estas páginas.
Gracias.
―Le vent les promène. Ils manquent
de racines, ça les gêne beaucoup.‖
Antoine de Saint-Exupéry
xi
ÍNDICE DE CONTENIDOS
TABLAS/ TABLES ................................................................................................................................................................................................................................................................ XIV
GRÁFICOS/ GRAPHS ....................................................................................................................................................................................................................................................... XVI
FIGURAS/ FIGURES ..................................................................................................................................................................................................................................................... XVIII
PROJECT JUSTIFICATION ......................................................................................................................................................................................................................................... XXI
ABSTRACT ....................................................................................................................................................................................................................................................................................... 1
AIMS ....................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 2
I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................................................................................................................................................... 3
1. EL CULTIVO DEL CHAMPIÑÓN ............................................................................................................................. 4 1.1. PRODUCCIÓN COMERCIAL ....................................................................................................................................................... 4 1.2. INDICADORES DE CALIDAD. PROPIEDADES NUTRICIONALES Y MEDICINALES DEL CHAMPIÑÓN .................. 7 1.3. DESARROLLO DE AGARICUS BISPORUS .............................................................................................................................. 8 1.4. REQUERIMIENTOS DEL CULTIVO DE CHAMPIÑÓN ........................................................................................................... 9
1.4.1. Micelio o ―semilla‖ .......................................................................................................................................................... 9 1.4.2. Sustrato de cultivo. Compostaje ....................................................................................................................................... 9 1.4.3. Cobertura ....................................................................................................................................................................... 10 1.4.4. Etapas del ciclo de cultivo del champiñón ..................................................................................................................... 10
Siembra y compactado ........................................................................................................................................................ 11 Incubación .......................................................................................................................................................................... 11 Cobertura ............................................................................................................................................................................ 11 Prefructificación e inducción .............................................................................................................................................. 11 Fructificación y cosecha ..................................................................................................................................................... 11 Vaciado, limpieza y desinfección del local ......................................................................................................................... 12
1.5. HIGIENE EN LOS CULTIVOS. DESINFECCIÓN .................................................................................................................... 12 1.6. ENFERMEDADES, PLAGAS Y ANOMALÍAS DEL CHAMPIÑÓN ........................................................................................ 14
1.6.1. Generalidades: hongos competidores y parásitos ........................................................................................................... 14 1.6.2. Control de enfermedades fúngicas ................................................................................................................................. 15 1.6.3. Aspectos legislativos ...................................................................................................................................................... 18
2. LA ENFERMEDAD DE LA TELARAÑA ................................................................................................................ 20 2.1. SINTOMATOLOGÍA Y DESARROLLO....................................................................................................................................... 20 2.2. FUENTES DE INFECCIÓN ......................................................................................................................................................... 22 2.3. DISPERSIÓN .................................................................................................................................................................................. 23 2.4. AGENTE CAUSAL ......................................................................................................................................................................... 24
2.4.1. Ecología ......................................................................................................................................................................... 24 En la naturaleza .................................................................................................................................................................. 24 En los cultivos de setas comestibles ................................................................................................................................... 25
2.4.2. Descripción .................................................................................................................................................................... 25
II. INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD DE LA TELARAÑA EN CULTIVOS DE CHAMPIÑÓN DE CASTILLA-LA MANCHA ..... 27
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................................... 28 1.1. INCIDENCIA DE LA TELARAÑA A NIVEL MUNDIAL ........................................................................................................... 28 1.2. LA TELARAÑA EN CASTILLA-LA MANCHA ............................................................................................................................ 30
Modificaciones culturales. Problemática de las coberturas ...................................................................................................... 30 1.3. EXPRESIÓN DE LA ENFERMEDAD ......................................................................................................................................... 31
2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................................... 32 3. RESULTADOS .......................................................................................................................................................... 35
3.1. INCIDENCIA DE TELARAÑA EN FUNCIÓN DE LA ESTACIONALIDAD .......................................................................... 36 3.2. INCIDENCIA DE TELARAÑA EN FUNCIÓN DE LA FLORADA .......................................................................................... 37 3.3. INCIDENCIA DE TELARAÑA EN FUNCIÓN DE LA COBERTURA .................................................................................... 39
4. DISCUSSION ............................................................................................................................................................ 41
III. IDENTIFICACIÓN DEL AGENTE CAUSAL DE LA TELARAÑA EN LOS CULTIVOS DE CHAMPIÑÓN ESPAÑOLES................ 43
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................................... 44 2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................................... 46
2.1. AISLADOS ....................................................................................................................................................................................... 46 2.2. ESTUDIO DEL PATÓGENO IN VITRO .................................................................................................................................... 46
xii
2.3. CARACTERIZACIÓN TAXONÓMICA ........................................................................................................................................ 47 2.4. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR .......................................................................................................................................... 48 2.5. ESTUDIO FILOGENÉTICO ......................................................................................................................................................... 49
3. RESULTADOS .......................................................................................................................................................... 50 3.1. ESTUDIO DEL PATÓGENO IN VITRO .................................................................................................................................... 50 3.2. CARACTERIZACIÓN TAXONÓMICA ........................................................................................................................................ 51 3.3. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FILOGENÉTICA ....................................................................................................... 54
4. DISCUSSION ............................................................................................................................................................ 56
IV. PATOGENICIDAD DE CLADOBOTRYUM MYCOPHILUM SOBRE DIFERENTES MEZCLAS DE COBERTURA .............................. 57
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................................... 58 1.1. MICOPARASITISMO: INTERACCIÓN PATÓGENO/HOSPEDADOR ................................................................................. 58 1.2. DESARROLLO Y SINTOMATOLOGÍA DE LA TELARAÑA .................................................................................................... 59 1.3. COBERTURA ................................................................................................................................................................................. 60
2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................................... 62 3. RESULTADOS .......................................................................................................................................................... 65 4. DISCUSSION ............................................................................................................................................................ 69
V. CONTROL QUÍMICO DE LA TELARAÑA DEL CHAMPIÑÓN .................................................................................................................................................... 72
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................................... 73 1.1. PREVENCIÓN Y CONTROL DE LA TELARAÑA ..................................................................................................................... 73 1.2. CONTROL QUÍMICO ................................................................................................................................................................... 74
1.2.1. Fungicidas empleados contra la telaraña ........................................................................................................................ 74 1.2.2. Sensibilidad y resistencia ............................................................................................................................................... 75 1.2.3. Selectividad de fungicidas .............................................................................................................................................. 77 1.2.4. Legislación y fungicidas autorizados en Europa y España ............................................................................................. 77
1.3. MÉTODOS DE CONTROL ALTERNATIVOS ............................................................................................................................ 78 2. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................................................... 78
2.1. SENSIBILIDAD IN VITRO A FUNGICIDAS DE CLADOBOTRYUM MYCOPHILUM Y AGARICUS BISPORUS . 79 2.2. CONTROL DE TELARAÑA MEDIANTE FUNGICIDAS EN CULTIVOS DE AGARICUS BISPORUS ........................................ 82
3. RESULTADOS .......................................................................................................................................................... 85 3.1. SENSIBILIDAD IN VITRO A FUNGICIDAS DE CLADOBOTRYUM MYCOPHILUM Y AGARICUS BISPORUS . 85 3.2. CONTROL DE TELARAÑA MEDIANTE FUNGICIDAS EN CULTIVOS DE AGARICUS BISPORUS ........................................ 89
4. DISCUSSION ............................................................................................................................................................ 94 4.1. IN VITRO SENSITIVITY OF CLADOBOTRYUM MYCOPHILUM AND AGARICUS BISPORUS TO FUNGICIDES ................94 4.2. COBWEB CONTROL BY FUNGICIDES IN AGARICUS BISPORUS CROPS ................................................................... 95
CONCLUSIONS .......................................................................................................................................................................................................................................................................... 99
ANEXO ............................................................................................................................................................................................................................................................................................ 101
1. TÉCNICAS DE AISLADO Y CONSERVACIÓN .................................................................................................. 102 Medios de cultivo empleados ............................................................................................................................................................... 103
2. INCIDENCIA .......................................................................................................................................................... 104 2.1. Instalaciones visitadas .................................................................................................................................................................. 104 2.2. Registro metereológico durante el muestreo ............................................................................................................................... 106 2.3. Análisis de datos ............................................................................................................................................................................ 107 2.4. Severidad estacional de la infección ............................................................................................................................................ 108
3. IDENTIFICACIÓN .................................................................................................................................................. 109 3.1. Caracterización de las fiálides ..................................................................................................................................................... 109 3.2. Caracterización de los conidios ................................................................................................................................................... 110 3.3. Secuencias de máxima similitud. Búsqueda MegaBlast ............................................................................................................ 111
4. PATOGENICIDAD ................................................................................................................................................. 112 4.1. Colonización de la cobertura ....................................................................................................................................................... 112 4.2. Producción registrada en los ensayos de cabina ........................................................................................................................ 113
5. CONTROL QUÍMICO ............................................................................................................................................. 114 5.1. Valores de dosis media efectiva ................................................................................................................................................... 114 5.2. Inhibición del crecimiento miceliar ............................................................................................................................................. 117 5.3. Colonización de la cobertura ....................................................................................................................................................... 119
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................................................................................................................................................... 120
URLS ............................................................................................................................................................................ 132
xiii
xiv
tablas/ TABLes
Tabla 1. Análisis regional: superficie de champiñón cultivada, rendimiento y producción en 2013......................................... 6
Table 1. Regional analysis: mushroom crop area cultivated, yield and production in Spain during 2013. ............................. 6 Tabla 2. Industria española del champiñón: serie histórica de superficie cultivada, rendimiento, producción, precio
medio y valor total generado. ........................................................................................................................................................................ 6
Table 2. Spanish mushroom industry: historical time series of surface cultivated, crop yield, production, average price
and total value. .................................................................................................................................................................................................. 6
Tabla 3. Etapas del ciclo de cultivo. Duración y condiciones de cultivo necesarias. .................................................................. 11 Table 3. Stages of the crop cycle. Length and environmental requeriments. ................................................................................. 11 Tabla 4. Fungicidas de origen químico aprobados para su uso en champiñón en Europa........................................................ 19 Table 4. Chemical fungicides approved for mushroom use in Europe. .......................................................................................... 19 Table 5. Locales de cultivo de champiñón evaluados......................................................................................................................... 32
Table 5. Mushroom farms analyzed......................................................................................................................................................... 32 Tabla 6. Aislados de Cladobotryum spp. evaluados. Municipio donde se recolectaron, sustrato a partir del que se reaisló,
florada y año. .................................................................................................................................................................................................. 47 Table 6. Isolates of Cladobotryum spp. included in the study, town where they were collected, substrate, flush and year..... 47 Table 7. Aislados de Cladobotryum spp. estudiados. Identificación molecular y número de acceso al GenBank. ............ 54 Table 7. Isolates of Cladobotryum spp. included in the study, molecular identification and GenBank accession numbers. . 54
Tabla 8. Caracterización físico-química del sustrato empleado en los ensayos (al finalizar la fase III).................................. 62 Table 8. Physic and chemical characterization of the compost employed inthe trials (at the end of Phase III). .................. 62
Tabla 9. Caracterización físico-química de las mezclas de cobertura empleadas en los ensayos. ........................................... 63 Table 9. Physic and chemical characterization of the casing materials used in the trials. ......................................................... 63 Tabla 10. Bloques infectados al final del ciclo de cultivo, precocidad de la infección en días tras la aplicación de la
cobertura. ......................................................................................................................................................................................................... 66 Table 10. Infected blocks at the end of the crop cycle, infection earliness in days after casing and final percentage of crop
surface colonized by the disease. ............................................................................................................................................................... 66 Tabla 11. Especificaciones generales de los fungicidas empleados. ............................................................................................... 79
Table 11. Standard specifications of the fungicides used .................................................................................................................... 79 Tabla 12. Concentración de fungicida empleada en los ensayos de sensibilidad in vitro frente a C. mycophilum y A.
bisporus. .......................................................................................................................................................................................................... 80
Table 12. Fungicide concentration used for the in vitro sensitivity tests of C. mycophilum and A. bisporus. ...................... 80 Tabla 13. Caracterización físico-química del sustrato (al finalizar la fase III) y cobertura empleados en los ensayos. ...... 82
Table 13. Physic and chemical characterization of the compost (phase III) and casing material employed in the trials. . 82 Tabla 14. Valores de ED50 calculados para los fungicidas evaluados y factor de resistencia (RF) de los aislados de C.
mycophilum estudiados. .............................................................................................................................................................................. 86
Table 14. ED50 values of selected fungicides and resistance factor (RF) of the C. mycophilum strains studied. ................. 86 Table 15. Valores medios de ED50 comparando los dos clados de C. mycophilum identificados. .......................................... 88 Table 15. ED50 mean values of selected fungicides comparing the two clades of C. mycophilum identified. ...................... 88
Tabla 16. Selectividad in vitro a los fungicidas entre patógeno y hospedador. ............................................................................ 89
Table 16. In vitro pathogen/host selectivity of fungicides. ................................................................................................................... 89 Tabla 17. Producción (kg m
-2) y eficiencia biológica, BE (kg dt
-1), del cultivo en el ensayo A. .............................................. 90
Table 17. Mushroom production (kg m-2) and BE (kg dt
-1) along the trial A. ................................................................................ 90
Tabla 18. Precocidad de la telaraña y número de bloques infectados al final del ciclo de cultivo (%). Ensayo A. ............. 90 Table 18. Earliness of cobweb and number of infected blocks at the end of the crop cycle (%). Trial A. ................................... 90
Table 19. Eficacia (%) de los tratamientos en el control de la telaraña al final de la tercera flor. .............................................. 92 Table 19. Effycacy (%) of treatments to control cobweb disease in A. bisporus crops at the end of 3rd flush. Trial A. ..... 92 Tabla 20. Producción (kg m
-2) y eficiencia biológica, BE (kg dt
-1), del cultivo en el ensayo B. .¡Error! Marcador no
definido.
xv
Table 20. Mushroom production (kg m-2) and BE (kg dt
-1) along the trial B. ....................... ¡Error! Marcador no definido.
Tabla 21. Precocidad de la telaraña y número de bloques infectados al final del ciclo de cultivo (%). Ensayo B. ... ¡Error!
Marcador no definido. Table 21. Earliness of cobweb and number of infected blocks at the end of the crop cycle (%). Trial B.¡Error! Marcador
no definido. Tabla 22. Datos del muestreo. Número de puntos de muestreo registrados atendiendo a cada factor evaluado. .............. 107 Table 22. Sampling data. Number of sampling points regarding each of the factors considered. ......................................... 107 Tabla 23. Dimensiones de las fiálides en los aislados estudiados. ................................................................................................. 109 Table 23. Phyalide measurements of the evaluated strains. ............................................................................................................. 109 Tabla 24. Longitud y anchura de conidios en los aislados evaluados. .......................................................................................... 110
Table 24. Conidia length and width of the evaluated strains. .......................................................................................................... 110 Tabla 25. Porcentaje de septos en los conidios. .................................................................................................................................. 110
Table 25. Percentage of septa in conidia. ............................................................................................................................................. 110 Tabla 26. Secuencias de la región ITS del ADNrn que muestran maxima similitud con los aislados estudiados mediante
búsquedas MegaBlast. ............................................................................................................................................................................... 111 Table 26. Maximum likelihood of the DNArn ITS sequences from the studied strains through MegaBlast searches. .... 111 Tabla 27. Producción (kg m
-2) y eficiencia biológica, BE (kg dt
-1), del cultivo en los ensayos. ............................................. 113
Table 27. Mushroom production and biological efficiency (BE: kg dt-1) of crop obtained in the trials. ............................... 113
Tabla 28. Valores de ED50 de los aislados frente a clortalonil. ....................................................................................................... 114
Table 28. ED50 values of the strains against chlorothalonil. ............................................................................................................ 114 Tabla 29. Valores de ED50 de los aislados frente a metil-tiofanato. ............................................................................................... 114
Table 29. ED50 values of the strains against thiophanate-methyl. .................................................................................................. 114 Tabla 30. Valores de ED50 de los aislados frente a procloraz-Mn. ................................................................................................ 115 Table 30. ED50 values of the strains against prochloraz-Mn. .......................................................................................................... 115
Tabla 31. Valores de ED50 de los aislados frente a tiabendazol...................................................................................................... 115 Table 31. ED50 values of the strains against thiabendazole. ............................................................................................................ 115
Tabla 32. Valores de ED50 de los aislados de A. bisporus frente a los fungicidas. .................................................................... 116
Table 32. ED50 values of A. bisporus strains against selected fungicides. .................................................................................... 116
xvi
gráficos/ graphs
Gráfico 1. Producción mundial estimada (miles de toneladas) de A. bisporus en 2010. .............................................................. 4
Graph 1. Estimated world production (thousands of tons) of A. bisporus in in 2010. ................................................................... 4 Gráfico 2. Producción de champiñón (miles de toneladas) en Europa en 2011. ............................................................................ 4 Graph 2. Button mushroom produced (thousands of tons) in Europe along 2011. ....................................................................... 4 Gráfico 3. Serie histórica de prducción de champiñón (miles de toneladas) en Europa. .............................................................. 5
Graph 3. Historical time series of button mushroom produced (thousands of tons) in Europe. ................................................. 5
Gráfico 4. Porcentaje estacional de cultivos evaluados. ..................................................................................................................... 33 Graph 4. Percentage of crops checked. Seasons in respect to the total. ......................................................................................... 33 Gráfico 5. Porcentaje de cultivos evaluados por florada. ................................................................................................................... 34 Graph 5. Percentage of crops checked. Flushes in respect to the season. ..................................................................................... 34 Gráfico 6. Porcentaje de cultivos evaluados por material de cobertura. ......................................................................................... 34
Graph 6. Percentage of crops checked. Casing layers in respect to the season. .......................................................................... 34
Gráfico 7. Porcentaje de cultivos infectados comparando la estacionalidad. ................................................................................ 36
Graph 7. Percentage of diseased crops comparing the season. a) Year. b) Flush. c) Casing. ................................................. 36 Gráfico 8. Presencia estacional de la enfermedad. ............................................................................................................................... 36 Graph 8. Presence of cobweb disease regarding the season. ........................................................................................................... 36 Gráfico 9. Severidad estacional de la infección en cultivos de champiñón. a) Otoño. b) Invierno. c) Primavera. d) Verano.37
Graph 9. Severity of the infection in mushroom crops through the seasons. a) Autumn. b) Winter. c) Spring. d) Summer. .. 37 Gráfico 10. Porcentaje de cultivos infectados comparando la florada. a) Año. b) Cobertura. c) Estación. ........................... 38
Graph 10. Percentage of diseased crops comparing the flush. a) Year. b) Casing. c) Season. ................................................ 38 Gráfico 11. Presencia de la enfermedad a lo largo del ciclo de cultivo. ......................................................................................... 38 Graph 11. Presence of cobweb disease regarding the flush. ............................................................................................................. 38
Gráfico 12. Severidad de la infección en cultivos de champiñón a lo largo del ciclo. a) Primera flor. b) Segunda flor. c)
Tercera flor. ..................................................................................................................................................................................................... 39
Graph 12. Severity of infection in mushroom crops along the flushes. a) First flush. b) Second flush. c) Third flush. ........ 39 Gráfico 13. Porcentaje de cultivos infectados comparando los materiales de cobertura. a) Año. b) Florada. c) Estación. 39
Graph 13. Percentage of diseased crops comparing the casing material. a) Year. b) Flush. c) Season. ............................... 39 Gráfico 14. Presencia de la enfermedad respecto al material de cobertura. .................................................................................. 40
Graph 14. Presence of cobweb disease regarding the casing material. ......................................................................................... 40
Gráfico 15. Severidad de la infección en cultivos de champiñón comparando coberturas. a) Mineral. b) Turba. .............. 40 Graph 15. Severity of infection in mushroom crops comparing casing material. a) Mineral. b) Peat based. ...................... 40
Gráfico 16. Rendimiento del cultivo (kg m-2). a) Ensayo A. b) Ensayo B. ................................................................................... 67
Graph 16. Mushroom yield (kg m-2) in trials. a) Trial A. b) Trial B. ................................................................................................ 67
Gráfico 17. Superficie de cultivo colonizada por la telaraña. a) Ensayo A. b) Ensayo B. ......................................................... 68
Graph 17. Crop surface colonized by cobweb along the crop cycles. a) Trial A. b) Trial B. .................................................... 68 Gráfico 18. Crecimiento radial in vitro de C. mycophilum (%) frente al control sin fungicida al aplicar concentraciones
crecientes de sustancia activa (µg mL-1). a) Clortalonil. b) Procloraz-Mn. c) Tiabendazol. d) Metil-tiofanato. .................... 85
Graph 18. Percentage of C. mycophilum radial growth in vitro in respect to the control without fungicide, when
applying increasing concentrations of active substance (µg mL-1). a) Chlorothalonil. b) Prochloraz-Mn. c)
Thiabendazole. d) Thiophanate-methyl. .................................................................................................................................................. 85 Gráfico 19. Distribución de frecuencias de los valores de ED50 en los aislados de Cladobotryum mycophilum estudiados.
a) Clortalonil. b) Procloraz-Mn. c) Tiabendazol. d) Metil-tiofanato. ................................................................................................ 87
Graph 19. Frequency distribution of ED50 values of the strains studied. a) Chlorothalonil. b) Prochloraz-Mn. c)
Thiabendazole. d) Thiophanate-methyl. .................................................................................................................................................. 87 Gráfico 20. Superficie de cultivo colonizada por telaraña a lo largo del ciclo. a) Ensayo A. b) Ensayo B. .......................... 91 Graph 20. Crop surface colonized by cobweb along the crop cycles. a) Trial A. b) Trial B. .................................................... 91
xvii
Gráfico 21. Condiciones climáticas registradas en la comarca durante el periodo de muestreo. a) Temperatura media
(ºC). b) Humedad relativa (%). c) Precipitación acumulada (mm). d) Velocidad del viento (m s-1). .................................... 106
Graph 21. Weather conditions recorded in the region during the sampling period. a) Average temperature (ºC). b)
Relative humidity (%). c) Accumulated precipitation (mm). d) Wind speed (m s-1). .................................................................. 106
Gráfico 22. Severidad estacional de la infección en cultivos de champiñón. a) Otoño (2011/12; 2012/13). b) Invierno
(2011/12; 2012/13).c) Primavera (2011/12; 2012/13). d) Verano (2011/12; 2012/13). ........................................................... 108 Graph 22. Severity of disease concerning degree of infection (%) along the study. a) Autumn (2011/12; 2012/13). b)
Winter (2011/12; 2012/13). c) Spring (2011/12; 2012/13). d) Summer (2011/12; 2012/13). ................................................ 108 Gráfico 23. Superficie de cultivo colonizada por telaraña en cada cobertura. a) Ensayo A. b) Ensayo B........................... 112 Graph 23. Crop surface colonized by cobweb in each casing material. a) Trial A. b) Trial B. .............................................. 112
Gráfico 24. Superficie de cultivo colonizada por telaraña en cada tratamiento. a) Ensayo A. b) Ensayo B. ...................... 119 Graph 24. Crop surface colonized by cobweb in each treatment. a) Trial A. b) Trial B. ......................................................... 119
xviii
figuras/ figures Figura 1. Actividades que engloba la explotación commercial del cultivo de champiñón. ......................................................... 5 Figure 1. Areas of work included within the commercial activity of button mushroom. ............................................................... 5 Figura 2. Micelio de A. bisporus germinando en el sustrato de cultivo. ........................................................................................... 8
Figure 2. Mycelium of A. bisporus growing on compost. ..................................................................................................................... 8 Figura 3. Carpóforo de A. bisporus. ........................................................................................................................................................... 8 Figure 3. Fruit body of A. bisporus. ............................................................................................................................................................ 8 Figura 4. a) Micelio parasitario algodonoso creciendo sobre la cobertura y los carpóforos. b) Masa densa de conidios
generada por una abundante esporulación. ............................................................................................................................................. 20
Figure 4. a) Fluffy mycelium growing over the casing layer and carpophores. b) Mass of conidia as a result of a profuse
sporulation. ..................................................................................................................................................................................................... 20
Figure 5. Moteado en carpóforos infectados. a) Decoloraciones o manchas amarillo-grisáceas de borde regular. b)
Mancha marrones con borde irregular. .................................................................................................................................................... 22 Figure 5. Spotting on diseased fruit bodies. a) Regular grey-yellow spots or decoloration. b) Brown spots with an ill
defined edge. ................................................................................................................................................................................................... 22 Figura 6. Moteado de champiñones por la acción de parásitos fúngicos. a) L. fungicola. b) Trichoderma spp. c)
Cladobotryum spp. .............................................................................................................................. ¡Error! Marcador no definido. Figure 6. Cap spotting on A. bisporus caps due to fungal parasites. a) L. fungicola. b) Trichoderma spp. c)
Cladobotryum spp. .............................................................................................................................. ¡Error! Marcador no definido. Figura 7. Sintomatología asociada a la enfermedad de la telaraña en la cobertura y en los carpóforos. a, b) Cultivos
cubiertos con cobertura mineral. c, d) Cultivos cubiertos con cobertura tipo turba. e) Moteado en un carpóforo infectado.
f) Lesiones cóncavas en champiñones infectados. ............................................................................................................................... 41
Figure 7. Symptoms of cobweb disease over the casing layer and carpophores. a, b) Crops cased with mineral casing
layer. c, d) Crops cased with peat based casing layer. e) Spotting over the caps. f) Sunken lesions over the caps. ............. 41 Figura 8. Haz y envés de placas Petri sembradas con el parásito sobre medio PDA. Evolución de la colonia. .................. 50
Figure 8. Front and back side of PDA medium plated with the parasite. Evolution of the colony. ......................................... 50
Figura 9. Micrografía óptica de C. mycophilum. a, b, c) Microesclerocios. d, e, f) Clamidosporas. ...................................... 51 Figure 9. Optical micrographs from C. mycophilum. a, b, c) Microsclerotia. d, e, f) Clamidospores................................... 51 Figura 10. Micrografías de C. mycophilum. a) Masa de conidios envolviendo un carpóforo. b) Micelio. c, d) Conidios.
e) Conidios entre hifas de A. bisporus (*Prot: cicatriz de union a la fiálide, hilum basal). f) Conidios germinando cobre
tejido de A. bisporus. (1: conidios; 2: tubos germinativos). g, h) Fiálides. ............................. ¡Error! Marcador no definido.
Figure 10. Micrographs from C. mycophilum. a) Conidia clouds engulfing the infected carpophore. b) Mycelium. c, d)
Conidia. e) Conidia in the mycosphere of A. bisporus (*Prot: Scar of union to the phyalide, hilum basal). f) Germinating
conidia in the mycosphere of A. bisporus. (1: conidia; 2: germinative tubes). g, h) Phialides.¡Error! Marcador no
definido. Figura 11. Secuencia micrográfica de la germinación de un conidio de C. mycophilum en PDA a temperatura ambiente.
Capturas cada hora durante las primeras 12 h, y después de 24 h. ................................................................................................... 53
Figure 11. Micrograph sequence of the germination of C. mycophilum on PDA at room temperature. Conidium
captured every hour during the first 12 hours, and after 24h. ........................................................................................................... 53
Figure 12. Árbol filogenético construido conjuntando los vecinos (―neighbor-joining method‖), comparando la region
ITS de las secuencias de veinte aislados de Cladobotryum con otras especies de Cladobotryum depositadas en el
GenBank. La secuencia de Sepedomium sp. se usó como referencia. La barra de escala representa una distancia
filogenética del 1%. ...................................................................................................................................................................................... 55 Figure 12. Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining method, comparing the ITS region sequences of twenty
Cladobotryum isolates with those of other Cladobotryum species from GenBank. Sepedomium sp. was used as the
outgroup. The scale bar represents a phylogenetic distance of 1%. ................................................................................................ 55 Figura 13. a) Fase inicial de la infección. b) Masa de esporulación engullendo un champiñón. c, d) Carpóforos
infectados sufriendo podredumbre. .......................................................................................................................................................... 60
xix
Figure 13. a) Initial phase of infection. Fluffy-cottony mycelium growing radially outwards. b) Mass of sporulation
engulfing fruit bodies. c, d) Decaying carpophores. ............................................................................................................................ 60 Figura 14. Diseño experimental en las salas de cultivo. a, b) Bloques cubiertos sobre estructura metálica. c) Bloques
cubiertos con cobertura tipo turba.. d) Bloques cubiertos con cobertura mineral. ......................................................................... 64 Figure 14. Design of trials in the experimental mushroom units. a, b) Cased blocks over the metal shelf structure. c)
Blocks cased with peat based materials. d) Blocks cased with mineral casing. ............................................................................ 64 Figura 15. Sintomatología asociada a la telaraña observada en los ensayos. a) Micelio fino algodonoso sobre cobertura
tipo turba y champiñones. b) Densa masa de esporas sobre la cobertura mineral y un cuerpo fructífero. .............................. 69
Figure 15. Symptoms of cobweb disease observed in the trials. a) Fluffy mycelium over peat casing and fruit bodies. b)
Dense mass of conidia over mineral casing and fruit body. .............................................................................................................. 69
Figura 16. Brotes puntuales de telaraña tratados mediante un papel húmedo y sal. a) Ensayo al final del ciclo. b) Bloques
cubiertos con turba. c) Bloques cubiertos con cobertura mineral. ..................................................................................................... 69
Figure 16. Outbreaks of cobweb disease treated by damp paper and salt. a) Trial at the end of the crop cycle. b) Blocks
cased with peat based materials. c) Blocks cased with mineral casing. .......................................................................................... 69
Figura 17. Sintomatología de la enfermedad de la telaraña observada en los ensayos. a) Fase inicial de la infección. b)
Masa de conidios. c) Manchas marrones de borde mal definido. d) Manchas regulares de color amarillo-grisáceo. ........ 89 Figure 17. Symptoms of cobweb disease observed in the trials. a) Fluffy mycelium over casing and fruit bodies. b) Dense
mass of pathogenic conidia. c) Brown spots with an ill defined edge. d) Yellow-grey spots with a clear defined edge...... 89 Figura 18. Locales tradicionales para cultivo de champiñón en Castilla-La Mancha. ............................................................. 104
Figure 18. Traditional facilities for mushroom cultivation in Castilla-La Mancha. .................................................................. 104 Figura 19. Invernaderos para cultivo de champiñón. ....................................................................................................................... 104
Figure 19. Plastic tunnels for mushroom cultivation. ........................................................................................................................ 104 Figura 20. Naves industrials para cultivo de champiñón. ................................................................................................................ 105
Figure 20. Industrial buildings for mushroom cultivation. ............................................................................................................... 105
Figure 21. Instalaciones tipo holandés de paneles aislantes tipo sandwich.. ............................................................................... 105 Figure 21. Dutch design, made from isolating panels. ...................................................................................................................... 105
Figura 22. Ensayos in vitro (MEA). Inhibición del crecimiento de C. mycophilum mediante concentraciones crecientes
de fungicidas. ................................................................................................................................................................................................ 117
Figure 22. Assays in vitro (MEA). Inhibition of C. mycophilum growth by chemical fungicides. ......................................... 117
Figura 23. Ensayos in vitro (medio agar-compost). Inhibición del crecimiento de A. bisporus mediante concentraciones
crecientes de fungicidas. ............................................................................................................................................................................ 118
Figure 23. Assays in vitro (agar-compost medium). Inhibition of A. bisporus growth by chemical fungicides. ................ 118
xx
Abreviaturas
A. bisporus: Agaricus bisporus
ACT: té de compost aireado
C. mycophilum: Cladobotryum mycophilum
CTL: clortalonil (chlorothalonil)
EB: eficiencia biológica (BE: biological efficiency)
EC: electrical conductivity (CE: conductividad eléctrica)
ED50: dosis media efectiva
HR: humedad relativa (RH: relative humidity)
MEA: malt extract agar (agar-extracto de malta)
MTF: metiltiofanato (thiophanate-methyl)
NCT: té de compost no aireado
PCL: procloraz-Mn (prochloraz-Mn)
PDA: potato dextrose agar (agar-patata dextrosa)
RF: resistant factor (factor de resistencia)
SMS: spent mushroom compost (sustrato postcultivo de champiñón)
s.m.s: sobre materia seca
sp.: detrás de un nombre de género indica especie concreta perteneciente a ese género cuyo epíteto
específico es desconocido o carece de importancia
spp.: detrás de un nombre de género hace referencia a todas las especies individuales dentro de ese
género
TBD: tiabendazol (thiabendazole)
WHC: water holding capacity (capacidad de retención de agua)
Project Justification
xxi
PROJECT JUSTIFICATION Cladobotryum spp. is a mushroom parasite fungus. Its occurrence in white button
mushroom (Agaricus bisporus (Lange) Imbach) commercial crops generates the pathology known as
cobweb. This name is associated to the white fluffy mycelium that grows over the casing and the
infected mushrooms; in the first stage it resembles a spider web that quickly evolves towards a dense
mass of sporulation. Another disease symptom is the cap spotting on the mushroom which provokes
loss of quality and a significant drop in profitability during the crop cycle.
Historically Cladobotryum dendroides had been the specie associated with this pathology in
Spain. However, various taxa of the same genus are able to cause cobweb in mushroom crops. All of
them belong to the Cladobotryum Nees emend. (syn. Dactylium Nees) genus, hyphomycete, asexual
or conidial state of some species from the Hypomyces (Fries) L. R. genus. Cladobotryum
mycophilum is currently commonly cited as causative agent of cobweb disease. Varieties of this
specie resistant to benzimidazole fungicides (C. mycophilum type II) were responsible for heavy
losses in Great Britain and Ireland during mid-1990s.
Cobweb disease has always been common in Spanish mushroom crops, but has rarelybeen a
cause of major concern, inasmuch as it was heavily dependant on the season, usually emerging in
autumn. However, in the last few years (since 2008) the prevalence of cobweb in Spanish
commercial crops has increased remarkably. This upward trend can lead to yield losses and and is
consequently of great concern for farmers since low farm gate prices demand high production to be
profitable.
Currently, the Spanish mushroom industry is promoting a progressive modification of
traditional culture management, basically due to the replacement of the traditional casing materials
(based on mineral soils) by materials based on black peat moss, which have higher water holding
capacity. However, such casing materials have physical and chemical characteristics that a priori
look favourable to the initiation and spread of the disease. The modifications necessary demand a
gradual ―technification‖ by farms and farm workers in order to recycle knowledge towards cultural
management practices that will enable outbreaks of the diseas to be prevented or, at least, controlled.
To minimize the occurrence of disease and the dispersion of harmful conidia, the most
effective practice consists on preventing cobweb outbreaks, although chemical control can also be
applied to cope with the pathology. In the past, it was effectively controlled by using methyl-
benzimidazole-carbamate (MBC) fungicides, among them benomyl, carbendazim and thiabendazole,
although resistant strains were detected in Great Britain and Ireland. A plausible explanation of these
resistant strains may be the widespread and massive overuse of benzimidazole-type fungicides.
These have been applied through the years to fight with cobweb and several other fungal diseases. In
Spain, carbendazim was commonly used and the key product in the successful control of cobweb
disease; however, European legislation has led to it being banned for use on mushroom crops.
Such increasingly restrictive legislation regarding the chemicals used in agriculture
demands proper management of the available products. But to optimize integrated disease control,
chemicals must be combined with good farming practices and measures towards enhancing the
hygiene in growing facilities.
Abstract
1
ABSTRACT Recent years have seen the widespread occurrence of cobweb disease in Spanish button
mushroom crops [Agaricus bisporus (Lange) Imbach]. Indeed, in the last four years the presence of
the disease has increased notably, resulting in serious economic losses.
To provide a global perspective on the impact of the disease, A. bisporus mushroom crops
were surveyed over a two year period to estimate the incidence and severity of cobweb along the
crop cycle and the season, analyzing the casing material used. Cobweb disease usually appears in
Spanish button mushroom crops when they age. Crops in the third flush are much more likely to be
infected than those of the second and first. An early occurrence can lead to widespread infection by
the end of the crop cycle. The pathology may appear at any time during the year although its
presence and severity is greater in autumn and winter than in spring and summer. Temperature and
humidity during these seasons, as well as the higher density of crops in the production area (since
summer temperatures increase the energy costs of production), can promote the germination of the
pathogen and facilitate its entry into the culture facilities, as well as the dispersion of cobweb among
different rooms and farms. No significant differences were observed concerning disease emergence
through the casing materials analyzed during the field sampling. The physical and chemical
properties of the peat casing, especially its high water holding capacity, appear to enhance the
germination of the pathogen in this kind of casing material. However, this effect may have been
conditioned by the extent to which this new casing material has been introduced within the
production area under study. Initially, peat casing materials were applied by farmers whose technical
preparation and high-tech facilities enabled the optimized management of risks and environmental
growth conditions. In these facilities, disinfection after crop termination is effective and the control
of pathogen irruption is efficient, while the traditional buildings usually show deficiencies. During
the second annual period of the study, the presence of the disease registered in tested farms was
considerably lower than in the first one. This was a direct result of the recommendations about crop
management and cobweb control provided to growers throughout the study. Many of them have
learnt to prevent and manage disease outbreaks.
Twenty-five Cladobotryum spp. colonies were isolated from commercial crops showing
disease symptoms, plated on PDA and preserved. Their evolution and growth in vitro, taxonomic
characters and genetic material were studied. The colonies secrete a pigment that becomes deep red
and lack the characteristic camphor odour associated to C. mycophilum. Their conidia are big,
bacillus in shape and mainly uniseptated while the phyalides are tapered to the tip which is simple
and regular. At room temperature, spores germinated two hours after plating on PDA, and the
germinative tubes showed a high growth rate. BLAST analysis of the sequenced amplicons revealed
the closest degree of similarity to four Cladobotryum mycophilum sequences deposited in the
GenBank database. Phylogenetic analysis showed the highest evolutive proximity to several
sequences of Cladobotryum mycophilum. Therefore, the causal agent of cobweb disease in Spanish
button mushroom crops is Cladobotryum mycophilum (Oudem.) W. Gams&Hoozem.
The pathogenicity of Cladobotryum mycophilum was evaluated by applying a conidial
solution over several casing types of an Agaricus bisporus germinated crop. Three different peat
cased blocks and one mineral cased where checked. The pathology appeared in the inoculated
Abstract
2
blocks, while control blocks remained healthy. As a result, the infection was presumably due to the
primary inoculum spread. Blocks where a peat-lime casing was used were more infected than those
ones with mineral casing. The cultural practices carried out during the crop cycle were those suited
to a peat-lime casing, and so it can be affirmed that mineral casing blocks suffered yield reductions
that were not directly attributable to the disease (but to a wrong hydric balance). Of note is the fact
that all the casing materials used showed infection. Disease-inoculated blocks suffered losses of
between 1% and 13% due to cobweb. The sooner the pathology appeared, the greater the yield losses
registered. The cropping surface colonized by the disease increased as the cycle proceeded, and the
eralier the infection appeared, the larger the crop area colonized. Once an outbreak of cobweb is
located within the facilities, the individual outbreaks must be controlled. Indeed, it is necessary to
treat them prior to sporulation. This can be done covering them with damp paper and applying salt
generously, sealing the edges at first to avoid conidia release, and then the rest of the affected
surface. Control methods, described in this work, should prevent the dissemination of harmful
spores, which are dry and easy to dislodge. When not properly treated, conidia spread within crops
and will disseminate the infection resulting in higher losses. However, to apply salt over the patches
of disease is currently discontinued, since there could be food safety implications. Instead, only a
thick damp paper splaced over the isolated patches is recommended to prevent the spread of the
disease (Pyck and Grogan, 2015).
The response of the colonies to selected fungicides (chlorothalonil, thiophanate-methyl,
prochloraz-Mn and thiabendazole) was analyzed in vitro. As the concentration of active substance
added to the medium increased, the mycelium showed a linear reduction in growth. The pathogen
shows greatest sensitivity to prochloraz-Mn. Mean effective dose (ED50) values for the two
benzimidazole fungicides tested (thiophanate-methyl and thiabendazole) were greater than those
obtained for prochloraz-Mn and chlorothalonil. Two of the analyzed strains showed resistant
symptoms towards the benzimidazole fungicides employed, and were also the most sensitive to
prochloraz-Mn. Due to their resistance to benzimidazole fungicides, these two isolates must be
classified as Cladobotryum mycophilum Type II. In addition, two other isolates exhibited some
tolerance to prochloraz-Mn, while all of them were sensitive to chlorothalonil, which showed
homogeneous ED50 values. Prochloraz-Mn was the active substance with the highest selectivity
between pathogen and host. Thiabendazole also showed an interesting degree of selectivity against
the pathogen. Due to its high persistence in the casing layer and the reduced toxicity to the host,
thiabendazole must be considered to be of interest as a control alternative to sensitive strains. On the
other hand, chlorothalonil showed the worst selectivity among the evaluated substances.
Cobweb control by fungicides was studied in crop trials cased with peat based material,
treated with the selected fungicides and subsequently inoculated with Cladobotyum mycophilum.
Seven treatments per trial were evaluated: control, inoculated contol, prochloraz-Mn (1 application),
prochloraz-Mn (2 applications), chlorothalonil, thiophanate-methyl and thiabendazole. Cobweb
became widespread in all the treatments from the third flush. The crop area affected showed an
exponential growth as the growing cycle proceeded. The earlier the infection appeared the larger the
surface colonized by the pathogen. Those treatments that experienced an earlier infection showed a
higher surface colonized by the pathogen at the end of the crop cycle. An substantial degree of
infection facilitates conidial dispersion through the crop. Uncontrolled outbreaks appeared at the end
of the cycle, perhaps induced by the dispersion of harmful conidia as a result of the widespread
dispersion of the disease in the culture mushroom unit. Cobweb was responsible for yield reductions
Abstract
3
of up to 17%. In general, infected blocks showed levels of productions that were below those that
remained healthy. The crop surface colonized in the non-inoculated control was important due to
conidial dissemination from inoculated blocks. On the other hand, in treatments where fungicides
were applied, the very poor control achieved in both assays by using thiabendazole should be noted.
This aspect could be intrinsically related to the pathogen´s ability to generate resistance to
thiabendazole. Thiophanate-methyl also proved to be ineffective in coping with cobweb disease, as
did chlorothalonil. The prochloraz-Mn treatments showed the most effective response in managing
the disease, with homogeneous results. The biological efficiency (BE) registered in the inoculated
control was the lowest among all the blocks. Meanwhile the chlorothalonil treatment recorded the
lowest BE among the fungicide treatments; it can therefore be concluded that the low specificity of
this product results in a lower production. Prochloraz-Mn (one application) and thiophanate-methyl
provided highest BE values among the treatments.
Prochloraz-Mn was, on the basis of the results, the most effective fungicide among those
evaluated for cobweb control. It showed the lowest ED50, as well as the highest selectivity towards
the pathogen. Remarkably two of the youngest isolates revealed a slightly lower sensitivity to this
fungicide than the rest, although they were still very sensitive to the active substance. Prochloraz-Mn
was likewise the best treatment to prevent the colonization of casing surface by the disease,
providing an accurate BE of the crop.
In summary, mushroom cobweb caused by Cladobotryum mycophilum is a common
pathology within Spanish mushroom crops. Isolates of C. mycophilum Type II, resistant to the
bencimidazole fungicides, have been detected. Cobweb provokes yield losses in the infected crops.
Its presence and severity are more pronounced in autumn and winter, with a higher incidence as the
crop cycle progresses. Although prochloraz-Mn is the most efficient fungicide to cope with this
pathology, evidences concerning a potential threat to the appearance of resistant strains to this
chemical agent will be presented in this thesis.
Aims
2
AIMS
Incidence of cobweb disease in commercial mushroom crops.
- In recent years the presence of cobweb disease has notably increased, resulting in serious
economic losses. We propose to determine the circumstances under which the disease
manifests itself in commercial mushroom crops and to record the degree of severity observed
when different factors are studied:
growing cycle: stage of the fruiting period when the disease appears by visiting farms at
different flushes during the crop cycle.
season: to ascertain the season when cobweb appears most frequently.
casing: to provide an overview of the differences observed when applying the two casing
layers most widely used by the growers.
Identification of the pathogen responsible for the disease.
- Identification of the causal agent responsible for the disease. Based on morphological and
genetic analyses the pathogen was identified by:
studying the development of the pathogen in vitro (growth, colour and odour).
using classical taxonomy to describe the morphological characteristics of the pathogenic
fungus.
using molecular methods to genetically identify the different strains and then studying
the phylogeny of the strains sequenced.
Pathogenicity of the disease in mushroom crops.
- Pathogenicity trials were carried out to determine the virulence of the pathogen in Agaricus
bisporus crops artificially inoculated with the disease. We attempt to clarify issues concerning
changes in cultural techniques, such as the use of different casing materials. The effect of
cobweb on mushroom productivity was evaluated by comparing mushroom production and the
biological efficiency. The crop surface colonized by the disease was also analyzed.
Control of mushroom cobweb by selected fungicides.
- Certain chemical fungicides used in the worldwide mushroom industry have been analyzed in
order to specify the most effective products to cope with cobweb disease by checking:
in vitro sensitivity of C. mycophilum and A. bisporus. Sensitivity tests have been
conducted to determine ED50 values and the selectivity of the fungicides between
pathogen and host.
the ability to control cobweb when the pathogen is artificially inoculated in A. bisporus
mushroom crops.
I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I. Revisión bibliográfica
4
1. EL CULTIVO DEL CHAMPIÑÓN
1.1. PRODUCCIÓN COMERCIAL
Actualmente el champiñón [Agaricus bisporus (Lange) Imbach] es la especie de hongo
comestible más cultivada en el mundo. En 2009 la producción anual se estimaba en
aproximadamente 4 millones de toneladas, una actividad que generaba en torno a 4700 millones de
dólares (Sonnenberg et al., 2011). Los principales productores mundiales de champiñón son China y
Estados Unidos (Gráfico 1).
Gráfico 1. Producción mundial estimada (miles de toneladas) de A. bisporus en 2010.
Graph 1. Estimated world production (thousands of tons) of A. bisporus in in 2010.
Gráfico 2. Producción de champiñón (miles de toneladas) en Europa en 2011.
Graph 2. Button mushroom produced (thousands of tons) in Europe along 2011.
0
500
1000
1500
2000
2500
China USA Netherlands Poland France Spain Other EU
0
50
100
150
200
250
300
350
(Royse, 2014)
(GEPC, The European Mushroom Producers Board)
I. Revisión bibliográfica
5
España ocupa el cuarto lugar como productor europeo tras Holanda, Polonia y Francia, y el
sexto a nivel mundial (Gráficos 1 y 2), con una producción estimada de 134.768 t anuales en 2013
(Royse, 2014; MAGRAMA, 2015). Los gráficos 2 y 3 recopilan la producción de champiñón en la
Unión Europea en 2011 así como la serie histórica de los 15 años anteriores.
Gráfico 3. Serie histórica de prducción de champiñón (miles de toneladas) en Europa.
Graph 3. Historical time series of button mushroom produced (thousands of tons) in Europe.
La importancia de la producción de champiñón radica en el hecho de integrar diversas
actividades que deben estar perfectamente coordinadas entre sí para una adecuada explotación
comercial del producto, y para la gestión apropiada de los residuos generados, como se esquematiza
en la Figura 1 (Pardo, 2008).
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
Figura 1. Actividades que engloba
la explotación commercial del cultivo
de champiñón.
Figure 1. Areas of work included
within the commercial activity of
button mushroom.
(GEPC)
I. Revisión bibliográfica
6
Actualmente en España el champiñón se cultiva principalmente en dos regiones, Castilla-La
Mancha y La Rioja. Las tablas 1 y 2 ofrecen los datos del análisis provincial de la superficie total
cultivada de champiñón, rendimiento medio y producción total en 2013; y de la serie histórica de
superficie total cultivada, rendimiento de cultivo, producción total, precio medio y valor total del
champiñón en España.
Tabla 1. Análisis regional: superficie de champiñón
cultivada, rendimiento y producción en 2013.
Table 1. Regional analysis: mushroom crop area
cultivated, yield and production in Spain during 2013.
Provinces
REGIONS
Surface
(*ha)
Yield
(kg ha-1
)
Production
(t)
NAVARRA 9.0 34.50 3105
LA RIOJA 231.0 30.00 69300
BALEARES 11.8 15.10 1783
Albacete 65.0 28.00 18200
Cuenca 160.0 26.00 41600
CASTILLA-LA MANCHA 225.0 26.58 59800
Valencia 3.0 7.48 224
C. VALENCIANA 3.0 7.48 224
Granada 2.0 25.00 500
ANDALUCÍA 2.0 25.00 500
S.C. de Tenerife 0.8 7.00 56
CANARIAS 0.8 7.00 56
SPAIN 482.6 27.92 134768
*1 ha: 10000 m2 (MAGRAMA, 2015)
Tabla 2. Industria española del champiñón: serie histórica de superficie
cultivada, rendimiento, producción, precio medio y valor total generado.
Table 2. Spanish mushroom industry: historical time series of surface
cultivated, crop yield, production, average price and total value.
Year Surface
(ha)
Yield
(kg ha-1
)
Production
(t)
Average farm price
(€ 100kg-1
)
Value
(thousands of €)
2001 303.84 36.07 109605 98.36 107807 2002 293.08 43.02 126083 88.27 111293
2003 290.48 41.65 120988 89.03 107716
2004 291.89 44.16 128898 105.20 135601
2005 277.47 45.85 127213 117.52 149501
2006 299.28 42.26 126463 113.50 143536
2007 272.53 45.25 123322 114.34 141006
2008 245.67 48.19 118398 116.07 137425
2009 305.09 40.98 125017 91.21 114028
2010 456.97 26.53 121248 97.32 117999
2011 491.73 27.56 135545 103.46 140235
2012 479.70 28.08 134676 113.52 152884
2013 482.61 27.92 134768 117.26 158029
(MAGRAMA, 2015)
I. Revisión bibliográfica
7
Desde 2008 el consumo de champiñón en España, tanto en fresco como en conserva, sigue
una línea ascendente. En 2012, el consumo per cápita, sumando el champiñón fresco más champiñón
en conserva, se situó en 1,77 kg por persona y año, con una ligera recuperación de los precios. En la
balanza comercial del sector es destacable que la exportación de champiñón en fresco experimentó
un importante aumento en 2011, aunque sufrió descensos significativos la exportación de champiñón
en conserva, cocido y en salmuera. También se han incrementado las importaciones de champiñón en
fresco, sobre todo las procedentes de Portugal (MAGRAMA y Base de datos ICEX, 2013).
En Castilla-La Mancha, este cultivo se concentra en la comarca de La Manchuela, un área
muy localizada que cuenta con dieciocho poblaciones productoras en la provincia de Cuenca y ocho
poblaciones en la provincia de Albacete. Existen entre 1.200 y 1.500 explotaciones, con una
producción anual de unas 59.800 t de champiñón (Tabla 1), lo que supone el 44% de la producción
nacional (Peñaranda et al., 2009; MAGRAMA, 2015).
1.2. INDICADORES DE CALIDAD. PROPIEDADES NUTRICIONALES Y MEDICINALES
DEL CHAMPIÑÓN
Los carpóforos normalmente se recolectan en un estadío inmaduro, antes de que las láminas
queden expuestas. Un champiñón ideal para comercialización debe ser blanco, sin manchas, de
textura firme y con el velo cerrado. Si bien un ejemplar maduro, con manchas o deforme es
igualmente apto para consumo, estas deficiencias provocan el rechazo del potencial consumidor. La
calidad del producto puede verse mermada por el deterioro microbiano (moteado por enfermedades
de origen fúngico o bacteriano) y por lesiones durante la recolección o el transporte que provocan
decoloración, o la maduración y senescencia del producto (Eastwood y Burton, 2002).
Los hongos en general contienen aproximadamente un 90% de agua y un 10% de materia
seca. Presentan contenido en proteínas entre 27% y 48% s.m.s, siendo los carbohidratos menos del
60% s.m.s y las grasas inferiores al 8% s.m.s. El valor energético de los sombreros de setas frescas es
1,05-1,50 J kg-1
(Sánchez, 2004).
El champiñón es interesante desde el punto de vista nutricional y posee atractivas
propiedades medicinales. A. bisporus contiene altos niveles de fibras dietéticas y antioxidantes
incluyendo vitamina C, D, y B12, folatos y polifenoles que proporcionan efectos beneficiosos en
enfermedades cardiovasculares y diabetes. Tienen proteínas en gran cantidad y de muy buena calidad
y su contenido graso bruto es relativamente bajo (Chang, 2005). Es un alimento rico en minerales
indispensables para el buen funcionamiento del organismo humano, destacando el contenido en
potasio, fósforo, yodo y magnesio, junto con los micronutrientes: hierro, zinc, cloro, azufre,
manganeso, flúor, cobalto y selenio (http://alimentos.org.es/champinones). El champiñón destaca por
ser una fuente de selenio dietético, un micronutriente esencial para la salud y generalmente deficiente
en las dietas occidentales (Beelman, 2005).
La vitamina B5 o ácido pantoténico, que se encuentra de forma abundante en los
champiñones, hace que este alimento sea útil para combatir el estrés y las migrañas, y recomendable
para reducir el exceso de colesterol. El champiñón manifestó actividad hipoglucémica e hipolipídica
en ensayos con ratas (Jeong et al., 2010). También presentan interesantes propiedades
anticancerígenas. Contienen sustancias fitoquímicas que pueden suprimir la acción de dos enzimas
que intervienen en el desarrollo del cáncer de mama y de próstata; la ingesta de este alimento puede,
I. Revisión bibliográfica
8
por tanto, reducir la incidencia de estos tipos de cáncer (Chen, 2005). El consumo de A. bisporus
enriquecido en selenio puede ser un método efectivo para retardar el crecimiento de tumores
inducidos químicamente (Spolar et al., 1999).
1.3. DESARROLLO DE AGARICUS BISPORUS
Existen dos estados morfológicos por los que el cultivo de A. bisporus debe atravesar desde
el momento de la siembra hasta la etapa final de recolección: fase vegetativa y fase reproductiva
(Bernardo, 2003).
- Fase vegetativa: Las hifas que componen el micelio colonizan el sustrato de cultivo y la
cobertura (Figura 2). El champiñón presenta este estado morfológico en las etapas de siembra
(crecido sobre granos de cereal), incubación (coloniza el sustrato de cultivo) y pre-fructificación
(colonización de la cobertura) (Tabla 3). El desarrollo vegetativo del hongo se favorece a
temperatura en el ambiente de 20-22ºC y en torno a 22-27ºC en el compost, alta humedad relativa
(>95%) y una elevada concentración de CO2 (>0,1% hasta 3%).
- Fase reproductiva: Después de un periodo de crecimiento y una vez que las condiciones
requeridas son proporcionadas (descenso gradual de humedad y temperatura del ambiente, así como
ventilación para reducir la concentración de CO2), el micelio puede producir los cuerpos fructíferos.
Los champiñones son estructuras multicelulares generadas por la diferenciación de las células del
micelio vegetativo (Eastwood y Burton, 2002). Un cuerpo fructífero de A. bisporus posee tres partes
bien diferenciadas: sombrero o píleo; tallo, pie o estípite y el himenio (Figura 3).
Cap (pileus)
Gill (hymenium)
Stem (stipe)
Veil
Figura 2. Micelio de A.
bisporus germinando en el
sustrato de cultivo.
Figure 2. Mycelium of A.
bisporus growing on compost.
Figura 3. Carpóforo de A.
bisporus.
Figure 3. Fruit body of A.
bisporus.
I. Revisión bibliográfica
9
1.4. REQUERIMIENTOS DEL CULTIVO DE CHAMPIÑÓN
1.4.1. Micelio o “semilla”
El micelio o inóculo del cultivo, denominado coloquialmente como ―semilla‖ o ―spawn‖ en
su denominación anglosajona, se produce en laboratorios especializados.
El inóculo se obtiene al potenciar el crecimiento del micelio (procedente de una colección
de cepas seleccionadas) sobre la superficie de granos de cereales (centeno o mijo). El proceso
consiste en hidratar los granos con agua caliente (al 35-45%), y mezclar con una combinación de
yeso y carbonato cálcico para evitar el apelmazamiento y proporcionar un pH adecuado. A
continuación se esteriliza el grano a 121ºC durante 2 horas. Tras enfriar, el grano es inoculado con el
micelio de la cepa seleccionada en condiciones rigurosamente estériles. A continuación, el grano es
trasladado en los formatos comerciales a una sala de incubación (23-25ºC), donde se desarrolla el
micelio invadiendo los granos (2-2,5 semanas). Los granos así crecidos en condiciones de rigurosa
higiene, constituyen la ―semilla‖ con la que se inocula el sustrato de cultivo.
1.4.2. Sustrato de cultivo. Compostaje
Los hongos comestibles se producen a partir de materias primas naturales procedentes de la
agricultura, los bosques, la ganadería, y las industrias manufactureras (Rinker, 2002). El champiñón
es un organismo saprófito que extrae los compuestos orgánicos que requiere como nutrientes de un
medio adecuado en el que estén presentes (Gerrits, 1996). El compost del champiñón es un sustrato
de cultivo lignocelulósico de tipo húmico, rico en nitrógeno, que tiene todos los nutrientes necesarios
para su crecimiento. La selectividad del sustrato limitará el crecimiento de otros organismos
antagonistas o patógenos (Pardo, 1999).
Es deseable que las materias primas empleadas para elaborar el compost y seleccionadas en
razón de su potencial composición nutritiva para el crecimiento y desarrollo del champiñón, posean
una serie de características (Pardo, 1999): uniformidad y homogeneidad del material; disponibilidad
continua o muy regular; características físico-químicas y nutritivas conocidas; facilidad de transporte
y manejo; y precio competitivo en origen. Pardo (1999) establece una clasificación de las materias
primas empleadas en España por el sector champiñonero. Actualmente, los materiales de base
empleados por la industria se resumen en paja de cereal y una serie de residuos agrícolas
aprovechables disponibles en la zona productora: gallinaza y orujo agotado de alcoholería
fundamentalmente.
La elaboración del compost para cultivo de champiñón supone el desarrollo de un proceso
fermentativo, llevado a cabo a gran escala, sobre mezclas calculadas de materiales lignocelulósicos
de base y materiales nitrogenados que se añaden como activadores y enriquecedores, en el que se
producen gradualmente importantes cambios físico-químicos, bioquímicos y microbiológicos sobre
los materiales de partida (Pardo, 1999). La operación de compostaje se subdivide en distintas etapas
(Schisler, 1982; Fletcher y Gaze, 2008):
- Una fase previa de acondicionamiento del material: el objetivo de esta etapa inicial es
mezclar y humedecer el material crudo de partida para dar comienzo al proceso del compostaje. Se
estimula la actividad microbiana para favorecer la iniciación de una fermentación aerobia (al aire
libre, aprox. 7 días).
I. Revisión bibliográfica
10
- Fase I (fermentación libre en pila): el material se coloca en pilas asegurando un continuo
suministro de agua y oxígeno mediante el riego y volteo de los montones. Cada vez que la pila se
voltea la actividad microbiana se estimula y el compost adquiere temperaturas superiores,
produciéndose una sucesión y acción de distintos microorganismos según la banda de temperatura (al
aire libre, aprox. 7 días).
- Fase II (fermentación dirigida y controlada en cámara): tiene como finalidad acondicionar
el sustrato para el crecimiento miceliar del champiñón y eliminar los posibles parásitos y
competidores del hongo. El compost se introduce en cámaras de pasteurización en las que es
necesario controlar las condiciones ambientales. Se obtiene un sustrato selectivo que estimulará el
crecimiento del A. bisporus al tiempo que limita el desarrollo de competidores (cámara de
pasteurización, aprox. 6 días).
Una vez finalizada la fase II se inocula el micelio de Agaricus sobre el sustrato selectivo
(Ferri, 1985). El compost fase II inoculado puede ser distribuido a los cultivadores, que serán los
encargados de incubarlo en sus propias instalaciones. Otra alternativa es la elaboración de compost
fase III.
- Fase III (compost incubado): el compost proveniente de la fase II, inoculado con el micelio
del champiñón, se incuba en cámaras donde se controla la temperatura usando aire frío filtrado que
es canalizado a través del compost. El micelio coloniza uniformemente el sustrato acortando el ciclo
de cultivo sensiblemente (cámara de germinación, aprox. 16-18 días) (Fletcher y Gaze, 2008).
1.4.3. Cobertura
Un compost totalmente invadido con el micelio de A. bisporus apenas produce cuerpos
fructíferos. Se entiende por capa de cobertura el material empleado como recubrimiento superior del
compost, de un espesor variable entre tres y cuatro centímetros, que será invadido por el micelio del
champiñón. En ella se produce la modificación ecológica que supone el cambio de la fase de
desarrollo vegetativo al reproductivo (Pardo et al., 2004). La función de la capa de cobertura se
define como ―inducir la producción de esporóforos en cantidad‖ (Flegg, 1956). La necesidad de la
cobertura surge por tanto de la ausencia de otra vía para producir champiñones en cantidades que
resulten rentables para su cultivo (Pardo et al., 1999).
La capa de cobertura tiene diversas funciones que exigen una serie de condicionantes a la
hora de su elección. Tanto las funciones como las propiedades que deben tener los materiales
elegidos quedan resumidas en la introducción del capítulo III.
1.4.4. Etapas del ciclo de cultivo del champiñón
El champiñón es un cultivo forzado que se realiza bajo techo. El ciclo de cultivo consta de
diferentes etapas; cada una de ellas exige un manejo de cultivo concreto definido por las condiciones
ambientales requeridas que deben ser proporcionadas por el cultivador (Peñaranda et al., 2009). A
continuación se resume cada una de las fases de cultivo (Tabla 3):
I. Revisión bibliográfica
11
Tabla 3. Etapas del ciclo de cultivo. Duración y condiciones de cultivo necesarias.
Table 3. Stages of the crop cycle. Length and environmental requeriments.
Stages Length Facility Environmental conditions
Spawning <1 day Compost facility T: 25-30ºC
Incubation 12-20 days,
usually16-18 Compost facility/ Farm
T: air= 20-22ºC; compost= 22-27ºC//
RH>95%// CO2> 0.1%, until 3%
Casing <1 day Farm T: 20-25ºC
Casing incubation 7-9 days Farm T: air= 20-22ºC; compost= 22-27ºC//
RH>95%// CO2> 0.1%, until 3%
Induction of pinning 11-12 days Farm T: 16-18ºC// RH: 85-90%// CO2< 0.08%
Cropping and harvest 21-28 days Farm T: 15-20ºC// RH: 85%// CO2< 0.08%
Crop termination 1-3 days Farm Cooking out (65-70ºC for 12h)//
Disinfectants// High ventilation
Siembra y compactado
El compost selectivo es inoculado con el micelio del champiñón crecido sobre un soporte
biológico (granos de cereal). La tasa de siembra suele ser de 5-10g de micelio kg-1
de compost en
peso seco. Posteriormente el compost sembrado se compacta para aumentar su densidad.
Incubación
Fase vegetativa de colonización del sustrato por el micelio del hongo. Durante esta etapa se
requiere una temperatura del compost alta (22-27ºC) y una humedad elevada (>95%) para evitar la
desecación de la superficie del compost (Van Gils, 1988). Se mantiene una escasa ventilación para
aumentar el nivel de CO2 ambiental (>0,1% hasta el 3%) ya que esta elevada concentración de CO2
estimula el crecimiento miceliar. Esta etapa tiene lugar en la cámara de incubación en el caso del
sustrato Fase III.
Cobertura
Según diversos autores el espesor de la cobertura variará entre 2 y 7cm (Pardo et al., 1999).
Debe aplicarse con un nivel alto de humedad para evitar la posible adsorción de agua del compost, y
lo más uniforme posible, evitando que se creen zonas de un menor espesor.
Prefructificación e inducción
Inicialmente se facilita la colonización de la capa de cobertura por parte del micelio. Se
deben mantener las condiciones de incubación durante 7-9 días. Para inducir la fructificación se
forzará un descenso gradual de la temperatura (hasta 16-18ºC) con fuerte aireación, reduciendo la
concentración de CO2 ambiental (<0,08%). También debe reducirse la humedad relativa (hasta 85-
90%). Con todos estos cambios en las condiciones medioambientales tiene lugar el inicio del
desarrollo de los carpóforos.
Fructificación y cosecha
A los 35-40 días desde el inicio del ciclo se recolectan los primeros champiñones. La etapa
de fructificación y recolección se divide en sucesivas floradas u oleadas, con un periodo entre
floradas que puede oscilar de 2 a 4 días. Habitualmente se cosechan tres floradas. Durante esta fase
I. Revisión bibliográfica
12
interesa mantener una humedad próxima al 85%, disminuyendo hacia el final del cultivo, y
ventilando para evitar una concentración de CO2 elevada (CO2<0,08).
Vaciado, limpieza y desinfección del local
Una vez terminado el ciclo de cultivo, se retira el sustrato post-cultivo del local y se procede
a la desinfección del mismo (Fletcher y Gaze, 2008).
1.5. HIGIENE EN LOS CULTIVOS. DESINFECCIÓN
En general, la higiene se puede definir como un conjunto de medidas preventivas dirigidas a
salvaguardar la salud y prevenir enfermedades en los humanos, animales u otro organismo de interés.
En el caso que nos compete la finalidad de la higiene consistirá en mantener los cultivos de
champiñón sanos.
Se considera que la principal causa de enfermedades en el cultivo es una higiene deficiente
(Staunton y Dunne, 2001). Para implementar mejoras hay que implantar una serie de mecanismos
que si bien son generales, pueden hacerse extensibles para el caso concreto de la telaraña (Staunton
et al., 1999; Fletcher y Gaze, 2008):
- Los equipos cosechadores deben realizar su trabajo comenzando de las floradas más
jóvenes (cultivos más limpios) a las más viejas. Iniciando la jornada con una indumentaria libre de
esporas patógenas (la ropa de trabajo debe lavarse diariamente).
- Se deben emplear guantes desechables que serán reemplazados para cada cultivo.
- Todas las herramientas empleadas como cuchillos o carros deben ser limpiadas y
desinfectadas antes de entrar en otro cultivo.
- Los cajones de plástico no deben introducirse en los locales de cultivo sin limpiarlos
debidamente.
- Se recomienda el empleo de alfombras o fosos con desinfectante para limpiar los pies
a la entrada de las salas de cultivo, así como para las ruedas de los camiones que llegan a la
instalación.
- Uno o varios trabajadores deben encargarse fundamentalmente de identificar
patógenos en los cultivos y aplicar tratamientos puntuales para evitar su dispersión (eliminar bolas,
tapar con sal manchas de telaraña, etc.).
- La superficie de cultivo debe sanearse, evitando dejar tallos y champiñones viejos tras
la recolección.
- Los residuos biológicos procedentes de la recolección o limpieza del cultivo deben
retirarse diariamente.
- Sellar las cámaras de compostaje (Fase II y III) y las naves de cultivo.Se recomienda
la utilización de filtros ―HEPA‖ de alta eficiencia para evitar la dispersión de las esporas y
fragmentos de micelio (2µm Ø).
- Implementar medidas preventivas contra las plagas del champiñón: colocación de
mallas antitrips en las aberturas de ventilación; instalación de luces negras sobre una superficie
impermeable tratada con insecticida en el interior de la explotación.
- Impedir la circulación de polvo en la instalación: evitar barrer los pasillos secos
humedeciéndolos previamente para no liberar esporas patógenas al ambiente, y mantener las puertas
de las naves cerradas el mayor tiempo posible.
I. Revisión bibliográfica
13
- Evitar transferir compost o cobertura entre sacos vecinos de un mismo cultivo.
- Proteger la cobertura, ya que puede contaminarse fácilmente. Almacenarla en un lugar
limpio y cubierta con plástico si no va a emplearse inmediatamente.
La desinfección es la medida de higiene más importante. Lelley y Straetman (1986) la
definen como la destrucción de agentes que provocan una enfermedad y la descontaminación del
local. Si bien la aplicación de productos fungicidas suele tener un carácter específico, la desinfección
tiene una finalidad más general eliminando todos los elementos potencialmente peligrosos.
Es necesario someter a desinfección los locales de cultivo una vez finalizado el ciclo y
previamente al inicio de un nuevo ciclo, respetando los plazos de seguridad correspondientes al
desinfectante empleado; puesto que al igual que elimina los agentes dañinos, la cosecha podría verse
afectada. Debe realizarse también una adecuada desinfección de las herramientas empleadas en el
cultivo, así como de las estanterías y soportes donde se disponen los sacos o bandejas.
Una desinfección con vapor (―cooking-out‖) in situ (previa a la retirada del sustrato post-
cultivo de la nave de cultivo) es el tratamiento más efectivo. Se aconseja una desinfección con vapor
a 65-70ºC durante 9-12 horas para destruir las estructuras de resistencia de los hongos patógenos
(Fletcher y Gaze, 2008). El cooking-out es una técnica empleada en los modernos locales de cultivo
climatizados, pero no es posible utilizarla en los locales tradicionales por carecer de la infraestructura
y tecnología necesarias. En el caso de no disponer de esta tecnología es recomendable aplicar un
potente desinfectante a la superficie de la bolsa previamente a la retirada del sustrato post-cultivo
para eliminar las esporas patógenas en superficie (Staunton et al., 1999).
En caso de emplear desinfectantes, es necesario un lavado previo con agua del grifo para
eliminar la posible suciedad bajo la cual puede encontrarse el vector de la enfermedad, puesto que el
desinfectante actúa más eficazmente en contacto con el patógeno. La elección de un desinfectante
adecuado para un local de cultivo de champiñón requiere una serie de estudios previos encaminados
a dilucidar el efecto fungistático y bacteriostático, consistente en establecer en qué condiciones el
producto limita el crecimiento del organismo dañino sin llegar a eliminarlo, así como el efecto
fungicida y bactericida, basado en establecer las condiciones en las que el desinfectante es capaz de
matar los organismos diana evaluados.
En la comarca de La Manchuela tradicionalmente se ha empleado el formol como
desinfectante, una disolución al 40% de formaldehido. Es un producto que cumple con todos los
requisitos necesarios para ser empleado en la industria productora de champiñón, además por su
volatilidad no deja residuos (Gea y Tello, 1997). Sin embargo, este desinfectante es muy nocivo para
la persona que lo aplica. Hay evidencias de su efecto carcinogénico, además de irritar las vías
respiratorias y provocar problemas dermatológicos, lo que desaconseja su uso. También han sido
empleados desinfectantes clorados. Actualmente se ha generalizado el empleo como desinfectantes
de ciertos compuestos de amonio cuaternario. Contienen cadenas alquílicas largas cuyos cationes
actúan como disruptores de la membrana celular de un amplio rango de hongos y bacterias. Los
agentes químicos pueden complementarse con el encalado de los locales de cultivo que consiste en
aplicar cal viva a techos, suelos y paredes del local. Esta es una práctica tradicional en la comarca
aunque en la actualidad está casi totalmente en desuso.
Se han publicado algunos estudios evaluando la eficacia de distintos desinfectantes a la hora
de controlar o prevenir la enfermedad de la telaraña. En Irlanda, se evaluó el efecto in vitro e in vivo
de tres desinfectantes, Environ (sales de fenilfenol y clorofenol al 22,9%), Purogene (dióxido de
I. Revisión bibliográfica
14
cloro al 2%+activador) y Sudol (fracción de xilenol refinado al 50%), en aislados de C. dendroides.
Los tres productos fueron más efectivos al aplicarlos 12 horas después de la inoculación artificial
sobre tres tipos de materiales: cemento, madera y vidrio. Se observó mayor persistencia de la
contaminación en superficies rugosas, cemento y madera, que en vidrio. En los ensayos in vitro,
Environ y Purogene fueron los más efectivos al inhibir el crecimiento de C. dendroides a dosis de 50
mg L-1
(Abosriwil y Clancy, 2002). En Serbia, se estudió el potencial de Ecoute (30 mg de plata
coloidal en 1 L de H2O2) y Peral-S (oxígeno activo al 0,9%), dos desinfectantes de la cobertura
respetuosos con el medio ambiente. Aunque ambos resultaron eficientes, el desinfectante a base de
oxígeno activo fue más eficaz a la hora de controlar la enfermedad aunque manifestó un efecto
adverso sobre el rendimiento del cultivo. Los resultados indican que el tratamiento con oxígeno
activo para desinfectar la superficie de cobertura, combinado con procloraz-Mn obtuvo la más alta
eficiencia en el control de la telaraña y una productividad de A. bisporus satisfactoria (Potočnik et
al., 2011). Por otra parte, el ácido peracético, que se desintegra en agua generando peróxido de
oxígeno y ácido acético, finalmente generando agua, oxígeno activo y dióxido de carbono, puede
recomendarse como un desinfectante eficaz de la capa de cobertura del cultivo de A. bisporus contra
la telaraña provocada por Cladobotryum dendroides. En ensayos in vivo, el ácido peracético controló
mejor la enfermedad que la plata coloidal, mostrando un efecto positivo en la fisiología de A.
bisporus y un efecto sinérgico al emplearlo junto con procloraz-Mn (Potočnik et al., 2014).
La desinfección mediante irradiación UV cercano ha sido también descrita como un método
eficaz para la reducción de los hongos patógenos y bacterias en las instalaciones destinadas al cultivo
de hongos (Sawada et al., 2005).
1.6. ENFERMEDADES, PLAGAS Y ANOMALÍAS DEL CHAMPIÑÓN
El champiñón es un cultivo que puede sufrir diversas enfermedades provocadas por hongos,
bacterias y virus patógenos. Existen además un buen número de hongos competidores del micelio
que pueden aparecer en el compost o en la cobertura, y normalmente son indicadores de una menor
calidad del sustrato o cobertura empleados (Gea y Tello, 1997; Sharma et al., 2007). Junto a los
citados, el cupo de factores bióticos se completa con las consideradas como plagas del champiñón:
nematodos, ácaros y dípteros (Ferragutet al., 1997; Navarro et al., 2000; Navarro et al., 2003a;
Navarro et al., 2003b; Navarro et al., 2004).
Además de las patologías y desórdenes de origen biótico citados anteriormente, existen una
serie de factores de tipo abiótico que pueden condicionar el desarrollo del cultivo, su rendimiento y
calidad (Fletcher y Gaze, 2008). Aunque las causas abióticas son frecuentemente difíciles de
identificar, normalmente se asocian a un deficiente régimen hídrico, condiciones climáticas poco
apropiadas en el local de cultivo, un compost de pobre calidad, una cobertura inadecuada o la
presencia de elementos tóxicos.
1.6.1. Generalidades: hongos competidores y parásitos
Varias son las anomalías de origen fúngico que afectan de forma directa al cultivo del
champiñón. Con la intención de clarificar la amplia variedad de flora fúngica que puede aparecer en
los cultivos se puede establecer una clasificación en dos grupos: hongos competidores y hongos
parásitos (Geels et al., 1988; Gea y Tello, 1997). Hongos competidores son aquellos que pugnan con
I. Revisión bibliográfica
15
el champiñón por los nutrientes, el agua, el CO2 y el espacio, pudiendo intervenir adversamente
sobre el crecimiento del micelio del champiñón durante la colonización del compost o de la
cobertura. Por otro lado, los hongos parásitos se diferencian de los primeros en que infectan el
micelio y/o los cuerpos fructíferos provocando daños, independientemente de que estos puedan
llegar a ser letales.
Gea y Tello (1997) recopilan un inventario de las patologías de origen fúngico que afectan
al cultivo del champiñón en España. En este contexto, la telaraña es una enfermedad que afecta al
cultivo provocada por un hongo patógeno (Fletcher y Gaze, 2008). Las enfermedades de origen
fúngico más comunes son la mole seca (Lecanicillium fungicola), telaraña (Cladobotryum spp.),
moho verde (Trichoderma aggressivum) y la mole húmeda (Mycogone perniciosa).
1.6.2. Control de enfermedades fúngicas
El manejo de las condiciones ambientales en la instalación junto con los sistemas de
circulación de aire, la sobrepresión en las naves de cultivo y la posibilidad de aplicar ―cooking-out‖
al final del ciclo, facilitan un entorno adecuado para desarrollar un programa de control integrado de
plagas y enfermedades (Geösel, 2011a).
Wuest y Moore (1972) analizaron el grado de muerte térmica de diversos patógenos del
champiñón, concluyendo que al tratar suelo contaminado por Cladobotryum dendroides, Mycogone
perniciosa, Trichoderma viride y Lecanicillium fungicola con vapor, los organismos diana eran
eliminados al aplicar temperaturas de 54,4ºC durante 30 minutos. Las esporas húmedas de
Cladobotryum spp. se eliminan mediante tratamiento a 45ºC durante 30 minutos, pero cuando están
secas pueden resistir temperaturas muy superiores, incluso de 100ºC. Algo similar ocurre con el
micelio del patógeno, el cual puede ser eliminado a 40ºC durante 15 minutos si presenta humedad,
aunque en seco es necesario aplicar 70ºC durante 15 minutos (Fletcher y Gaze, 2008). Se requiere
una Tª de 45ºC durante 30 minutos para destruir la mayoría de las esporas de C. dendroides
(Desrumaux, 2005). La desinfección térmica con vapor (―cook-out‖) in situ es el tratamiento más
efectivo para eliminar los patógenos fúngicos presentes tras el ciclo de cultivo. En caso de no poder
emplearse esta técnica es recomendable hacer un tratamiento con algún fungicida antes de sacar las
bolsas afectadas tras el cultivo, y de esta forma minimizar la densidad de inóculo en el exterior. Una
vez retirado el cultivo se procederá a aplicar una desinfección muy concienzuda del local que haya
experimentado algún brote de la enfermedad.
En las instalaciones con menor tecnología (donde no es posible aplicar cooking-out y los
materiales de construcción empleados dificultan la desinfección post-cultivo), el nivel de infección
tiende gradualmente a crecer, y puede derivar en graves epidemias que ocasionarán pérdidas
significativas si no se actúa adecuadamente (Staunton y Dunne, 2001). En cultivos con severas
infecciones por telaraña es recomendable adelantar el final del ciclo de cultivo, puesto que la nave
afectada puede ser un vector de contaminación para las adyacentes debido a la facilidad de
dispersión del patógeno.
La industria del champiñón emplea distintos productos fitosanitarios autorizados como
insecticidas, bactericidas, fungicidas y desinfectantes. También es posible utilizar mecanismos de
control biológico: organismos depredadores, parásitos o/y patógenos, como los nematodos, bacterias
y ácaros empleados para controlar las poblaciones de dípteros (Navarro et al., 2004), aunque en la
actualidad el grado de introducción de estos agentes es muy limitado.
I. Revisión bibliográfica
16
A través de los fungicidas comerciales puede ejercerse un control químico de las
enfermedades de origen fúngico del cultivo. El control de los hongos mediante productos químicos
es un problema que entraña gran dificultad debido a que los micelios fúngicos, de una manera
general, presentan propiedades ilimitadas para regenerarse a partir de un simple fragmento de hifa
superviviente después de cualquier tratamiento químico inhibitorio (García et al., 2004). Es de vital
importancia aplicar el producto de acuerdo a las recomendaciones del etiquetado. No sobrepasar las
dosis por riesgo a dañar el cultivo ni emplear dosis inferiores que pueden resultar en un pobre control
de la enfermedad y favorecer el desarrollo de resistencias al fungicida (Fletcher y Jaffe, 1993).
Los fungicidas disponibles para combatir enfermedades del champiñón no sólo se ven
limitados por las regulaciones gubernamentales sino también por las similitudes entre patógeno y
hospedador (Bonnen y Hopkins, 1997), puesto que ambos organismos son hongos. El uso de
cualquier agente fungicida puede suponer por tanto una merma en el rendimiento del cultivo, luego
es necesario emplear productos de especificidad contrastada. Aquellos fungicidas tóxicos para el
crecimiento del micelio pueden ser empleados siempre que su presencia se limite a la zona
superficial de la cobertura, donde generalmente hay poca densidad de micelio hospedador (Fletcher
et al., 1983).
El fungicida debe encontrarse sobre la cobertura, en la zona de iniciación de los carpóforos.
Este es un punto muy importante porque uno de los problemas a la hora de controlar un
micopatógeno mediante fungicidas resulta del hecho de que este último pueda desaparecer de la
cobertura debido a su degradación por acción de la microbiota presente en la cobertura u otras causas
(Fletcher et al., 1980). Así, se evaluó el comportamiento del fungicida carbendazima incorporado en
la cobertura o aplicado por aspersión sobre la misma. Al mezclarlo con la cobertura se obtuvo una
buena distribución del fungicida mientras que por aspersión permanecía en la zona superficial. El
producto sufrió una mayor y más rápida degradación al aplicarlo por aspersión (Grogan et al., 1996).
Fue evaluada también la persistencia de los fungicidas tiabendazol, carbendazima y procloraz-Mn en
la cobertura empleada en el cultivo de champiñón. Después de aplicar los fungicidas por aspersión la
concentración de todos los ingredientes activos era mayor en la zona media superficial que en la zona
media inferior. La concentración de carbendazima y procloraz se redujo progresivamente tras su
aplicación, resultando en concentraciones muy inferiores al final de la segunda flor. Tiabendazol, sin
embargo, permaneció en una concentración elevada durante todo el ciclo. Los fungicidas que no
persisten en concentraciones elevadas en la cobertura durante el ciclo de cultivo pueden manifestar
problemas para controlar los patógenos conforme avanza el ciclo de cultivo (Grogan y Jukes, 2003).
Resumiendo, para que un fungicida sea válido para su uso en la industria del champiñón
debe garantizar toxicidad al patógeno y no dañar el cultivo. Los fungicidas del grupo de los
bencimidazoles y procloraz-Mn muestran esta especifidad toxicológica (Fletcher y Jaffe, 1993). Es
destacable que no se ha aprobado el uso en champiñón de nuevos agentes fungicidas en ningún país
productor desde el inicio de la década de los años ochenta (Shamshad et al., 2009), tras la
introducción en 1983 de procloraz-Mn para tratar variedades resistentes de Lecanicillium fungicola a
los bencimidazoles, mole húmeda y telaraña (Fletcher et al., 1983). Aunque en el año 2012, imazalil,
un fungicida del grupo de los imidazoles ha sido autorizado en Australia para el control de
Trichoderma en semilla (https://portal.apvma.gov.au/es/permits).
El uso continuado de un mismo producto puede conducir a la aparición de variedades
resistentes en el patógeno (Van Zaayen y Van Adrichem, 1982; Grogan y Gaze, 2000). Resulta por
tanto preciso disponer de fungicidas alternativos. Sin embargo, es complicado esperar que aparezcan
I. Revisión bibliográfica
17
nuevos agentes fungicidas sintéticos para su uso en el cultivo del champiñón debido a que desarrollar
sustancias activas requiere una elevada inversión y el volumen de actividad de esta industria es
reducido en comparación con otras actividades agrícolas (Geösel, 2011a). Por este motivo se están
desarrollando estudios cuyo objetivo es solicitar la inclusión de nuevas formulaciones en la lista de
fungicidas autorizados para su uso en champiñón, muchas de ellas autorizadas en otros cultivos, y
sustituir progresivamente los agentes químicos tradicionales por productos respetuosos con el medio
ambiente. Complementariamente, un aumento de la higiene antes del desarrollo de la enfermedad, así
como un mejor conocimiento del patógeno puede prolongar la vida útil de los fungicidas disponibles,
al racionalizarse las dosis y limitarse la aparición de resistencias (Schwinn y Morton, 1990).
En la búsqueda de nuevas alternativas, diez fungicidas no autorizados en el cultivo del
champiñón, tres de los cuales eran comercializados como agentes de biocontrol, fueron analizados in
vitro para comprobar su efecto sobre la geminación de las esporas y el crecimiento miceliar de
Lecanicillium, Mycogone, Cladobotryum y Trichoderma aggressivum Th2, comparándolos con
procloraz-Mn y carbendazima. El estudio concluye que ninguno de los analizados presenta mejores
resultados que procloraz-Mn, aunque los autores postulan uno de ellos, ―Chemical F‖, como
potencial candidato (Grogan y Keeling, 1999).
En dos experimentos inoculados artificialmente, el fungicida imazalil (no aprobado para uso
en champiñón) y la biopreparación Serenade® (Bacillussubtilis QST 713) fueron analizados para
evaluar el nivel de protección contra Tichoderma aggressivum Th2 y Cladobotryum dendroides.
Serenade® fue ineficaz para ambos patógenos, e imazalil resultó también ineficaz para controlar
Trichoderma. (Ślusarski et al., 2012b).
Por otro lado, los aceites esenciales, compuestos naturales complejos caracterizados por su
fuerte olor y generados por las plantas aromáticas como metabolitos secundarios, han sido empleados
desde la edad media por sus propiedades antisépticas, bactericidas, fungicidas y viricidas (Bakkali et
al., 2008). Algunos aceites esenciales y sus componentes no sólo actúan como agentes fungicidas
sino que también inhiben la esporulación de los hongos patógenos (Glamočlija, 2006; Glamočlija et
al., 2007; Soković y Van Griensven, 2006). Los aceites esenciales de distintas plantas aromáticas y
sus componentes fueron analizados para caracterizar la actividad inhibidora contra dos hongos
patógenos de A. bisporus: Lecanicillium fungicola y Trichoderma harzianum. Se determinó que el
carvacrol (componente del aceite esencial de orégano entre otros) tenía la mayor actividad
antifúngica de entre los componentes analizados, y el aceite de Origanum vulgare mayor actividad y
amplio espectro (Soković y Van Griensven, 2006). La actividad antifúngica de 18 aceites esenciales
fue también evaluada in vitro para caracterizar la eficacia contra los patógenos Lecanicillium
fungicola, Mycogone perniciosa y Cladobotryum sp.; canela, clavo, tomillo y ―tea tree‖ (Melaleuca
alternifolia) mostraron mayor actividad antifúngica (Tanović et al., 2006). El aceite esencial de
Crithmum maritimum y sus componentes (α-pineno y limoneno) poseen actividad antifúngica contra
el micopatógeno M. perniciosa por la metodología de la microatmósfera; el limoneno muestra mayor
actividad (Glamočlija et al., 2009). La fracción volátil de los aceites esenciales de distintas plantas
aromáticas ha sido evaluada para determinar su eficacia contra los patógenos Lecanicillium
fungicola, Mycogone perniciosa y Cladobotryum sp.; los aceites de orégano (carvacrol y timol) y
geranio (citranelol y geraniol) mostraron mayor toxicidad (Tanović et al., 2009). Los aceites
esenciales de Lippia citriodora, Cymbopogon citratus y Thymus vulgaris inhiben sustancialmente el
crecimiento del patógeno M. perniciosa, mostrando la toxicidad más baja hacia A. bisporus de entre
I. Revisión bibliográfica
18
los ensayados. En ensayos in vivo demuestran su eficacia para controlar la enfermedad sin resultar
perjudiciales para el cultivo (Regnier y Combrinck, 2010).
Una línea de investigación actual y en crecimiento como alternativa a los productos
químicos consiste en el uso de extractos acuosos conocidos como ―tes de compost‖. Una infusión
obtenida al fermentar compost de residuos agrícolas para tratar diversas patologías vegetales. Existen
dos variantes, te de compost no aireado (NCT) y te de compost aireado (ACT) (Scheuerell y
Mahaffee, 2002). Los resultados obtenidos en ensayos in vitro con NCT de cuatro extractos acuosos
a partir de distintos compost agrícolas para controlar la mole seca sugieren que estos subproductos
podrían incorporarse a la industria como alternativa de control (Gea et al., 2009). Se obtuvieron
buenos resultados en el control de nueve agentes patógenos, entre ellos el micopatógeno L.
fungicola, utilizando varios tes de compost de orujo de uva aireados (ACT) (Diánez et al., 2006). Se
analizó el efecto in vitro de ACT y NCT extraídos a partir de cuatro compost diferentes sobre ocho
fitopatógenos de origen fúngico, entre ellos L. fungicola. Los resultados mostraron que ambos
filtrados inhibieron el crecimiento in vitro de todos los patógenos ensayados, mientras que los tes de
compost esterilizados en autoclave perdieron completamente su efecto inhibidor, y los esterilizados
por microfiltración no tuvieron efecto sobre el crecimiento de los patógenos (Marín et al., 2013).
El sustrato post-cultivo de champiñón (SMS) es un subproducto del cultivo comercial de A.
bisporus después de retirar el material de la instalación tras la cosecha (Yohalem et al., 1996). Este
subproducto abundante, puesto que se producen millones de toneladas al año, puede emplearse para
fines variados: en agricultura o paisajismo como enmienda y abono, en horticultura como
componente de la mezcla del sustrato, como cobertura de cultivo de A. bisporus, en vermicultura
como medio de cultivo, para descontaminación de aguas en zonas de humedales, como material para
camas y alimento de animales, y para controlar enfermedades de plantas (Rinker, 2002).
Investigaciones tanto in vitro como in vivo demuestran que al emplear el te de compost de SMS
mediante aplicaciones por aspersión no existe efecto fungitóxico sobre el hospedador A. bisporus,
postulando su uso alternativo a los fungicidas clásicos (Gea et al., 2012b). Al evaluar la eficacia de
dos tes de compost a partir SMS con cobertura mineral y tipo turba en un cultivo artificialmente
inoculado con L. fungicola, el de cobertura de turba resultó más eficaz. Se obtuvieron mejores
resultados cuando se aplicaron cerca del inicio de la cosecha (Gea et al., 2011). Recientemente ha
sido publicado un estudio que sugiere que mediante el uso de te de compost de SMS puede
controlarse la mole seca (Gea et al., 2014). En este estudio se emplearon SMS a partir de cultivos
con coberturas minerales y tipo turba. Todos los tes de SMS empleados inhibieron el crecimiento del
patógeno in vitro al 100%, mientras que en ensayos in vivo se obtuvieron reducciones de enfermedad
de hasta el 73% respecto al control inoculado al aplicar SMS proveniente de cultivos que emplearon
turba como cobertura.
La revisión bibliográfica respecto al control de la enfermedad de la telaraña se aborda en
mayor profundidad en la introducción del capítulo IV.
1.6.3. Aspectos legislativos
Atendiendo a la legislación vigente de las principales sustancias activas con efecto fungicida
empleadas para combatir la telaraña es importante mencionar que la carbendazima, fungicida del
grupo de los bencimidazoles históricamente empleado para combatir el patógeno (Grogan y Gaze,
2000), fue incluida en el Anexo I de la Directiva 91/414/CEE como biocida por el Parlamento
I. Revisión bibliográfica
19
Europeo, si bien su uso en cultivos de champiñón no está autorizado (Reglamento (CE) nº
1107/2009, Directiva 2011/58/UE).
Tabla 4. Fungicidas de origen químico aprobados para su uso en
champiñón en Europa.
Table 4. Chemical fungicides approved for mushroom use in
Europe.
Active Product 2B F H Ir. It. P S U
Chlorothalonil x
x *
Metrafenone x
*
Prochloraz-Mn x x x x x x x x 2B: Belgium; F: France; H: Holland; Ir.: Ireland; It.: Italy; P: Poland;S: Spain;
U: United Kingdom. *Chlorthalonil and metrafenone obtained a temporary
approval for mushroom use in Spain [Regulation (EC) No 1107/2009. Article
53].
La Tabla 4 recoge los agentes químicos autorizados en Europa para su uso en el cultivo del
champiñón según datos del Grupo Europeo de Productores de Champiñón, GEPC, (European
Mushroom Growers Group, 2010). El límite máximo de residuos para los fungicidas autorizados en
la Unión Europea para su uso en cultivos de champiñón es: clortalonil: 2 mg kg-1
; metrafenona: 1 mL
m-2
; procloraz-Mn: 3 mg kg-1
(Reglamento (CE) nº 396/2005).
I. Revisión bibliográfica
20
2. LA ENFERMEDAD DE LA TELARAÑA
La enfermedad de la telaraña es una patología común del cultivo de champiñón en todos los
países productores. Está catalogada entre las cuatro enfermedades de origen fúngico más frecuentes y
dañinas para el cultivo. Su aparición en cultivos comerciales de champiñón genera pérdidas
cuantitativas y cualitativas. Cuantitativamente, la telaraña coloniza la cobertura reduciendo la
superficie de cultivo y provoca una podredumbre húmeda de los carpóforos que encuentra en su
camino al desarrollarse el micelio parasitario. Genera también un moteado en el sombrero de los
champiñones afectando a la calidad del producto, lo que imposibilita su comercialización (Adie,
2000). Si la infección se generaliza puede ser necesario acortar el ciclo de cultivo reduciéndose el
número de floradas a cosechar (Fletcher y Gaze, 2008).
2.1. SINTOMATOLOGÍA Y DESARROLLO
La germinación de la espora de Cladobotryum spp. depende básicamente de las condiciones
ambientales. Con altos valores de humedad relativa (HR=97-100%) las esporas germinan muy
fácilmente. Con una HR<85% pocas esporas germinan. Por tanto, una mayor humedad sobre la
cobertura o sobre los cuerpos fructíferos favorece la germinación y desarrollo del patógeno. La
temperatura óptima para el desarrollo de la espora es 25ºC y un pH 5-6 (Desrumaux, 2005; Fletcher
y Gaze, 2008). Si bien la infección puede producirse inicialmente por la germinación de una espora
patógena en la cobertura, también es posible una infección producida por restos de micelio patógeno.
Según Rinker y Wuest (1994), una infección por micelio provocará una aparición más temprana de la
enfermedad y, por tanto, mayores daños.
Figura 4. a) Micelio parasitario algodonoso creciendo sobre la cobertura y los carpóforos. b) Masa
densa de conidios generada por una abundante esporulación.
Figure 4. a) Fluffy mycelium growing over the casing layer and carpophores. b) Mass of conidia as a
result of a profuse sporulation.
Los primeros síntomas de la enfermedad suelen aparecer entre la 2ª y 3ª florada, aunque
puntualmente se pueden también detectar en la 1ª (Desrumaux, 2005). Los problemas comienzan con
pequeñas colonias circulares de micelio, más o menos regulares, sobre la capa de cobertura o los
I. Revisión bibliográfica
21
cuerpos fructíferos (Figura 4). Conforme el micelio se extiende hacia el exterior envuelve los
champiñones adyacentes y coloniza mayor superficie de cultivo.
Independientemente del microorganismo responsable de la enfermedad, los carpóforos
parasitados suelen mostrar tejidos marrones o decolorados (Largeteau and Savoie, 2010). Las
manchas de color marrón que provoca la telaraña pueden ser confundidas con las producidas por
otros parásitos fúngicos como Trichoderma spp. o Lecanicillium fungicola (Figura 6).
La telaraña puede también manifestarse en forma de manchas sobre los sombreros. Se
pueden observar dos tipos de moteado diferentes (Figura 5): manchas marrones oscuras con un borde
mal definido y manchas entre amarillo y grisáceo (Grogan y Gaze, 2000; Grogan, 2006). La
pigmentación de estas manchas es causada por la formación de melaninas en el tejido infectado
como resultado de la oxidación enzimática de sustratos fenólicos (catalizada por polifenol oxidasas)
en quinonas que autopolimerizan en melaninas (Soler-Rivas et al., 1999; Berendsen et al., 2010).
Las manchas de color marrón oscuro y borde irregular se generan cuando una espora de
Cladobotryum spp. transportada por el aire u otra vía se deposita sobre un carpóforo y germina
generando un pequeño micelio parasitario que provoca el escurecimiento del tejido hospedador y una
pequeña depresión en la superficie. Este moteado es un síntoma inicial de infección, si se deja que se
desarrolle, el micelio patógeno terminará envolviendo el carpóforo completo (Adie, 2000). Las
manchas de color gris-amarillento que decoloran gradualmente el tejido del champiñón infectado son
debidas a la interacción con el micelio parasitario en la que, como ya se ha citado, el tejido del
carpóforo parasitado sufre una podredumbre húmeda progresiva (Adie, 2000). El moteado de los
sombreros no sólo aparece durante la cosecha sino que también pueden surgir posteriormente
alterando el producto en post-cosecha, durante el almacenamiento o el transporte (Adie, 2000).
Figura 5. Moteado de champiñones por
la acción de parásitos fúngicos. a) L.
fungicola. b) Trichoderma spp. c)
Cladobotryum spp.
Figure 6. Cap spotting on A. bisporus
caps due to fungal parasites. a) L.
fungicola. b) Trichoderma spp. c)
Cladobotryum spp.
I. Revisión bibliográfica
22
Figura 6. Moteado en carpóforos infectados. a) Decoloraciones o manchas amarillo-
grisáceas de borde regular. b) Mancha marrones con borde irregular.
Figure 5. Spotting on diseased fruit bodies. a) Regular grey-yellow spots or decoloration.
b) Brown spots with an ill defined edge.
2.2. FUENTES DE INFECCIÓN
Las esporas de Cladobotryum spp. que dan lugar a la infección pueden provenir de los
mismos cultivos o de otras fuentes. Los brotes de enfermedad se asocian principalmente con
sustratos contaminados o con deficiencias en la higiene de los cultivos.
Las especies de Cladobotryum son comunes en la naturaleza. Aunque se desconoce cómo
han podido llegar a las naves de cultivo, parece acertado pensar que la fuente inicial de infección
puede provenir de hongos silvestres o suelos contaminados con esporas. Sin embargo, la teoría de
que las esporas han sido transportadas por el aire partiendo originariamente de especies silvestres
infectadas ha sido cuestionada (Adie, 2000). Diversos autores asocian la entrada del hongo en las
champiñoneras con tierra de cobertura contaminada, pudiendo considerarse la cobertura contaminada
como una de las fuentes de infección primaria (Atkins y Atkins, 1971; Swatton, 1993; Fletcher y
Gaze, 2008).
Tamm y Poldmaa (2013) han caracterizado la diversidad genética de Hypomyces rosellus y
otras especies de Hypomyces/Cladobotryum cercanas que producen el pigmento aurofusarina,
correlacionando su afinidad con las especies responsables de la enfermedad de la telaraña en
champiñón. Concluyen que la diversidad de especímenes locales del género determina el agente
causal de la telaraña en los cultivos de la misma región. Esto parece indicar que una fuente primaria
de infección puede provenir de los especímenes naturales circundantes a las explotaciones afectadas.
Una vez introducida la enfermedad en el sector productivo, las esporas pueden ser
transportadas por las corrientes de aire generando la infección primaria. Los resultados obtenidos al
evaluar la germinación de los conidios indican que el hongo tiene un periodo de incubación corto y
que los conidios pueden resultar una fuente importante de inóculo provocando una rápida infección
(Dar y Seth, 1992b). Puede existir también un foco de infección externa: embalaje y contenedores
infectados, visitas, vehículos infectados, etc.
Puesto que la supervivencia de los microesclerocios es considerablemente mayor que la de
las esporas, es posible que los microesclerocios contribuyan a la supervivencia del hongo en
condiciones adversas (Desrumaux, 2005), y puedan ser más difíciles de eliminar mediante la
a b
I. Revisión bibliográfica
23
desinfección. Estos reservorios de alimento se asocian con estructuras de latencia del hongo por lo
que podrían resultar una fuente de infección.
El agua sucia también puede suponer un foco de infección, ya que las esporas de algunos
hongos patógenos, como Lecanicillium y Mycogone, pueden sobrevivir en agua durante muchos
meses (Staunton y Dunne, 2001).
El compost no se considera fuente de infección primaria. Durante la fase II el compost sufre
un proceso de pasteurización en el que la masa de compost se somete a temperaturas cercanas a 58ºC
durante 10-15 horas para eliminar patógenos y competidores (Pardo, 1999). Las empresas
compostadoras deben ser cuidadosas al inocular el compost para impedir contaminaciones.
La semilla o micelio tampoco es un foco de infección primaria. El inóculo es preparado por
empresas especializadas en instalaciones con elevados niveles de higiene. En un estudio realizado
analizando la microflora asociada a las ―semillas‖ empleadas en la comarca de La Manchuela, se
demostró que no parece común la transmisión de ésta y otras micosis por el material de siembra
(Gea, 1990). Esto coincide por lo expresado por Desrumaux (2005), quien maniesta que la presencia
de Cladobotryum en el micelio del hospedador es improbable.
2.3. DISPERSIÓN
El factor clave atendiendo a la incidencia de la patología en cultivos comerciales de
champiñón es la propagación de los conidios dentro de las naves de cultivo (Adie et al., 2006;
Desrumaux, 2005; Fletcher, 2002; Grogan, 2005a).
El papel de los microesclerocios en las naves de cultivo todavía no está claro, pero algunos
investigadores consideran posible que estas estructuras de reserva estén presentes en el material
usado como cobertura (Desrumaux, 2005), facilitando la dispersión de la enfermedad.
Las esporas del patógeno son numerosas, secas y fácilmente dispersables por contacto
físico. Para poder diseminarse, los conidios deben ser previamente liberados de la fuente de
esporulación. En un estudio sobre la liberación de esporas de Cladobotryum mycophilum, se
determinó que se requiere una perturbación física de la colonia para liberar los conidios. Los autores
sugieren que las mayores causas de esta liberación son salpicaduras y escorrentía durante el riego y
la aplicación de sal para eliminar infecciones puntuales (Adie y Grogan, 2000). Si una colonia de
esporulación es manipulada o alterada las esporas generadas asexualmente pasan al aire y se
distribuyen por toda la nave de cultivo para formar colonias secundarias con la misma genética
(Adie, 2000).
La mayoría de las esporas se movilizan por las corrientes de aire. Adie et al., (2006)
establecieron que una fuerza del viento de 0,1 m s-1
es suficiente para movilizar las esporas de
telaraña y trasladarlas a grandes distancias, comprobando la hipótesis de que el sistema de
circulación de aire en las cámaras de cultivo facilita la distribución rápida y uniforme de los
conidios. En su experimento, la liberación de los conidios de colonias esporulantes tuvo lugar de
manera consistente en momentos en que las colonias sufrieron una perturbación física, ya fuera al
aplicar sal para tratar las manchas de telaraña sobre la cobertura o al regar. Otras operaciones como
la recolección diaria no se han asociado con una liberación significativa de conidios. Una vez en el
aire, los conidios fueron transportados a través de las salas de cultivo por la constante corriente de
aire de los sistemas de circulación (Adie et al., 2006), ya que dentro y alrededor de los cultivos
I. Revisión bibliográfica
24
normalmente hay corrientes de aire de velocidad superior a la necesaria para su trasposición (>0,1 m
s-1
) (Desrumaux, 2005). Dar (1997) también demostró que la propagación de la enfermedad a
distancias cortas se ve favorecida por salpicaduras de agua durante el riego y por el agua de
escorrentía.
Un vector de menor importancia en la dispersión de los conidios es la presencia de moscas
(fóridos y esciáridos) en las naves de cultivo (Fletcher, 2002); a diferencia de Lecanicillium
fungicola, que secreta un mucílago facilitando la adherencia de las esporas a las patas de los dípteros
(Berendsen et al., 2010), Cladobotryum spp. genera una espora seca.
Staunton et al. (1999) propusieron varias medidas preventivas para evitar la dispersión de
las esporas al retirar el compost post-cultivo de una instalación:
- Procurar no dispersar las esporas patógenas al cargar las bolsas de compost en el
camión, manipulándolas lo mínimo posible.
- La bañera del camión que transporta el residuo hasta su lugar de reciclaje o procesado
debe cubrirse con una lona de plástico.
- Mientras se vacía una instalación conviene apagar la ventilación y cerrar los cultivos
adyacentes.
2.4. AGENTE CAUSAL
Distintos taxones de un mismo género pueden generar la enfermedad de la telaraña en
cultivos de setas comestibles, todos ellos pertenecientes al género Cladobotryum Nees emend.,
sinónimo Dactylium Nees (Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Sordariomycetes; Hypocreales,
Hypocreomycetidae; Hypocreaceae; Cladobotryum), que es el anamorfo o forma asexual de algunas
especies pertenecientes al género Hypomyces (Fries) L.-R.Tulasne (Ascomycota, Hypocreales,
Hypocreaceae), teleomorfo o forma sexual. Todos ellos son citados y descritos en la introducción del
capítulo II.
2.4.1. Ecología
En la naturaleza
Las especies de Cladobotryum son hongos microscópicos que pueden actuar como
micoparásitos (Hawksworth, 1981; Pérez-Silva y Bárcenas, 2000). En la naturaleza estas especies
parasitan hongos del grupo de los basidiomicetos, sobre todo afiloforales y agaricales (Gams y
Hoozeman, 1970; Pérez-Silva y Bárcenas, 2000). Es más raro encontrarlos parasitando
heterobasidiomicetos y ascomicetos. Algunas especies pueden encontrarse sobre otros sustratos,
como corteza de árboles, madera u hojarasca. En general, los anamorfos de las especies de
Hypomyces se encuentran en una variedad de hospedadores mayor que los teleomorfos.
Varias de las especies de Cladobotryum spp. que han sido catalogadas como agentes
causales de la enfermedad de la telaraña en cultivos de setas comestibles se han encontrado en la
naturaleza parasitando polyporales y agaricales (Gams y Hoozemans, 1970; Helfer, 1991; Rogerson
y Samuels, 1993; Rogerson y Samuels, 1994; Kirschner et al., 2007; Põldmaa, 2011). Dactylium
dendroides (Bull.) Fr. (sin. Cladobotrym dendroides (Bull.) W. Gams & Hooz.) es un epiparásito de
I. Revisión bibliográfica
25
Polyporus circinatus, ha sido reaislado a partir del esporóforo del hospedador (Nobles y
Madhosinsh, 1963); también ha sido encontrado en suelo y en un agaricoide en descomposición, en
Mycena sp. y en el estroma inmaduro de Xylaria sp. (Arnold y Yurchenko, 2007). Cladobotryum
mycophilum (Oudem.) W. Gams & Hooz. ha sido identificado en el himenio en descomposición de
Tricholoma fracticum. (Torrejón, 2005); también en Hebeloma sp., y en un agaricoide en
descomposición (Arnold y Yurchenko, 2007). Cladobotryum varium ha sido aislado en el himenio de
Trametes versicolor y en Stereum sp. (Arnold y Yurchenko, 2007). Por su parte, Cladobotryum
verticillatum (Link) S. Hughes ha sido identificado en Russula sp., en Lactarius helvus (Fr.) Fr., en
madera en descomposición sobre el suelo y en Lactarius sp. (Arnold y Yurchenko, 2007).
El hecho de que especies del género Cladobotryum parasiten agaricales en la naturaleza,
como en el caso de Crinipellis perniciosa, agente causal de la enfermedad ―escoba de bruja‖ del
cacao, ha motivado una vía de investigación en biocontrol para ciertas enfermedades de origen
fúngico en cultivos de interés (Bastos et al., 1981). Así por ejemplo, el compuesto antifúngico
―hifomicetina‖, aislada del hongo Hypomyces aurantius, teleomorfo de Cladobotryum varium, ha
sido evaluada in vitro frente a distintos hongos fitopatógenos, obteniéndose resultados inhibitorios
muy interesantes frente a dos especies de Phythium (Breinholt et al., 1997).
En los cultivos de setas comestibles
Cladobotryum spp. ha sido descrito causando daños en distintas especies de setas
comestibles cultivadas. Entra ellas podemos citar Agaricus bisporus, Agaricus bitorquis, Agaricus
blazei, Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus y Pleurotus pulmonarius, Ganoderma tsugae,
Flammulina velutipes, Auricularia polytricha, Auricularia mesenterica, Hypsizygus marmoreus e
Hypsizygus tessellatus (Goltapeh et al., 1989; Eicker et al., 1990; Sharma et al., 1992; Kim et al.,
1998, 1999; Arima y Suyama, 2000; Mignucci et al., 2000; Kirschner et al., 2007; Potočnik et al.,
2008a; Geösel, 2011b; Kim et al., 2012; Back et al., 2012a, 2012b, 2013; Kim et al., 2014). En
España ha sido referenciada la enfermedad en cultivos de Agaricus bisporus y Pleurotus eryngii
(Gea et al., 2011, 2012).
2.4.2. Descripción
Los conidióforos y las esporas se generan en las colonias masivas de aspecto harinoso que
la telaraña desarrolla. Presenta hifas con ramificaciones verticiladas, conidióforos, en el extremo de
las cuáles se generan una serie de células especializadas conidiogénicas llamadas fiálides (3 o 4). En
estas células se forman los conidios a través de una ontogenia holoblástica (la pared del ápice de la
célula conidiogénica se incorpora como una parte de la pared celular del propágulo) por sucesión
basipetal, provocando un acortamiento progresivo de las fiálides (Cole y Kendrick, 1971; Grogan y
Gaze, 2000). Los conidios son inicialmente unicelulares, después presentan de 1 a 3 septos (entre dos
y cuatro células), y miden aproximadamente 21x9 µm (Desrumaux, 2005; Adie et al., 2006). Son
hialinos, globosos a subglobosos, baciloformes, entre cilíndricos y levemente cónicos, ligeramente
curvos en algunos casos. En uno de los extremos presentan un hilio basal conspicuo, correspondiente
al lugar de unión a la fiálide. Las fiálides son hialinas y subuladas (estrechadas hacia el ápice), el
ápice puede presentar irregularidades o no dependiendo de las especies, variando también las
dimensiones entre especies. En algunas de estas species, tras la formación del conidio el extremo de
la fiálide sigue creciendo formando una extensión o raquis irregular (Grogan, 2005a).
I. Revisión bibliográfica
26
En ciertos casos el hongo produce microesclerocios (masa compacta de micelio endurecido
que contiene reservas alimenticias) (Hughes, 1978). Estos microesclerocios son oscuros, con una
pared celular adelgazada. Por el momento, sólo se han visto en el laboratorio y no en cultivos, pero
es importante considerarlos dentro del ciclo de vida del hongo, puesto que la supervivencia de los
microesclerocios es considerablemente mayor que la de las esporas (Potočnik et al., 2008a). Esto
indica que es posible que los microesclerocios contribuyan a la supervivencia del hongo en
condiciones adversas (Desrumaux, 2005). Asociadas a los microesclerocios suelen aparecer
clamidosporas multicelulares, estructuras globosas en cadena de cuatro a cinco células, conectadas
entre ellas a través de poros. Presentan una pared celular engrosada y generalmente se asocian a la
etapa del ciclo vital del hongo que sobrevive en condiciones desfavorables (Rogerson y Samuels,
1993).
II. INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD DE
LA TELARAÑA EN CULTIVOS DE
CHAMPIÑÓN de castilla-la mancha
II. Incidencia
28
1. INTRODUCCIÓN
1.1. INCIDENCIA DE LA TELARAÑA A NIVEL MUNDIAL
La telaraña es una enfermedad de los cultivos de champiñón extendida en todos los países
productores del mundo (Harvey et al., 1982; Eicker, 1984; Fletcher et al., 1989; Howard et al., 1994;
McKay et al., 1999; Jandaik et al., 2004a; Desrumaux, 2005; Erler y Polat, 2008; Fletcher y Gaze,
2008; Potočnik et al., 2008a; Back et al., 2010, Largeteau y Savoie, 2010). Desde la década de los
noventa del siglo pasado, tanto en Europa como en Australia, esta patología provoca serios
problemas en cultivos de champiñón. Algo más tarde también comenzó a golpear con fuerza en
Estados Unidos (Fletcher, 2002).
A continuación se resume la información disponible sobre la enfermedad de la telaraña en
distintos países productores de champiñón y setas comestibles:
En Australia, la enfermedad ocasionada por Cladobotryum dendroides no había causado
problemas de importancia hasta que en 1999 se convirtió en una epidemia (Fletcher et
al., 2004). Actualmente, la telaraña es considerada como una de las cuatro enfermedades
de origen fúngico más importantes en los cultivos de champiñón (Shamshad, 2009).
En Bélgica, después de Lecanicillium fungicola, la telaraña ha llegado a ser la
enfermedad más importante en la industria productora de champiñón (Desrumaux, 2005).
En Canadá, la enfermedad de la telaraña es producida por el hongo patógeno
Cladobotryum dendroides, un hongo parásito cuyas esporas pueden ser dispersadas
fácilmente por distintos medios (Howard et al., 1994).
En las zonas templadas de Asia, principalmente Corea y Japón, la enfermedad de la
telaraña es históricamente endémica en la mayoría de explotaciones (Kim, 1978). Sin
embargo, un repunte de la enfermedad ha motivado recientes estudios en Corea. El
agente causal de la enfermedad en cultivos de A. bisporus ha sido identificado como C.
mycophilum (Back et al., 2010). También se identificó C. mycophilum en cinco aislados
recogidos de sombreros de champiñón infectados (Oh y Kong, 2011).
En Estados Unidos, a mediados del siglo pasado, ―Dactylium‖ era un parásito raramente
común en los cultivos de champiñón (Kligman, 1950). Sin embargo, en los últimos años
la enfermedad de la telaraña se ha convertido en una patología común, y una seria causa
de pérdida de rendimiento en los cultivos (Fletcher y Gaze, 2008). Actualmente,
Cladobotryum spp. se considera uno de los patógenos fúngicos más frecuentes en
cultivos de champiñón estadounidenses (Beyer y Kremser, 2004). El impacto de la mole
seca, mole húmeda y telaraña en los cultivos de champiñón de Pensilvania se
cuantificaron hace cuarenta años como responsables de pérdidas de $9.1 millones en un
solo año (Forer et al., 1974).
En Francia, la telaraña (Cladobotryum dendroides) es común, pero raramente epidémica
(Largeteau y Savoie, 2010).
II. Incidencia
29
En Hungría, la enfermedad de la telaraña provoca pérdidas de producción. El hongo
causante (C. dendroides) es uno de los cinco más comunes que crecen sobre el sustrato
de cultivo o la superficie de los champiñones (Györfi, 2010; Parrag et al., 2014).
En India, la enfermedad de la telaraña provocada por Cladobotryum dendroides es una
seria amenaza para el cultivo de Agaricus bisporus (Dar y Seth, 1992a). Visitas a
explotaciones durante 1982-1983 registraron una incidencia entre 6.8-28% (Seth y Dar,
1989). Un nuevo muestreo entre 1999 y 2000 registró una incidencia de Hypomyces
rosellus de hasta un 17.85% (Bhatt y Singh, 2002).
En Inglaterra, hasta la década de los noventa del siglo pasado era considerada por los
investigadores en tercer lugar de importancia, tras Lecanicillium y Mycogone. Hasta
dicha fecha esta enfermedad se consideraba raramente responsable de grandes pérdidas
en el cultivo (Fletcher et al., 1986). A mediados de la citada década, la enfermedad fue
considerada como la más problemática del cultivo de champiñón en el Reino Unido e
Irlanda, con pérdidas de producción registradas de hasta un 40% debido a los graves
síntomas de manchas y a la necesidad de acortar los ciclos en el momento de mayor
incidencia de la epidemia (Gaze, 1995, 1996).
En Japón, Cladobotryum varium es un patógeno del champiñón común en locales de
cultivo (Sawada et al., 2005).
En Nigeria, Cladobotryum dendroides ha sido catalogado como patógeno en cultivos de
Pleurotus sp. y Agaricus sp. (Fasidi et al., 2008).
En Polonia, Cladobotryum dendroides ha sido evaluado en ensayos de patogenicidad,
puesto que esta enfermedad causa mermas en el rendimiento (Ślusarski et al., 2012a).
En la República de Sudáfrica, Dactylium dendroides se ha catalogado entre los cuatro
patógenos fúngicos de mayor importancia en el cultivo comercial de champiñones
(Eicker, 1984).
En Rusia, se han estudiado los caracteres morfológicos y culturales, así como algunas de
las características biológicas de C. dendroides y C.mycophilum, causantes de la telaraña
en cultivos de Agaricus bisporus y Pleurotus ostreatus. Alekseeva (2013) describió los
síntomas de la enfermedad y la distribución de la infección en los cultivos, además de
aspectos relativos a la prevención y medidas de control.
En Serbia, la telaraña solía aparecer de forma puntual antes de la tercera o cuarta florada
en cultivos de champiñón, pero actualmente es considerada una enfermedad problemática
con un considerable impacto en el rendimiento y calidad del cultivo de A. bisporus,
siendo el tercer patógeno en importancia tras Lecanicillium y Mycogone (Potočnik et al.,
2007).
En Turquía, la telaraña, causada por Cladobotryum dendroides, ha sido considerada
como la tercera enfermedad más común en cultivos de champiñón, con una prevalencia
del 33% en los locales de cultivo (Bora y Özaktan, 2000). Actualmente se califica como
una enfermedad devastadora, catalogada entre las cuatro enfermedades fúngicas más
comunes del cultivo (Cengiz et al., 2014).
Queda patente que la enfermedad se manifiesta en todos los países productores. Es motivo
de preocupación para los agricultores debido a las pérdidas de producción y calidad derivadas de su
II. Incidencia
30
aparición y, consecuentemente, objeto de estudio para investigadores internacionales.
1.2. LA TELARAÑA EN CASTILLA-LA MANCHA
La telaraña es una enfermedad común en los cultivos de champiñón de Castilla-La Mancha.
Gea y Tello (1997) afirmaban que esta micosis, aunque común, no solía provocar graves pérdidas en
las cosechas. Los autores asociaban su presencia a cultivos en las últimas fases del ciclo,
considerándola como la tercera en importancia entre las ocasionadas por hongos parásitos asociados
al champiñón, tras Lecanicillium fungicola (mole seca) y Mycogone perniciosa (mole húmeda).
Estos autores señalaban que los cambios culturales y las restricciones en el uso de fungicidas tendían
a aumentar su importancia.
Entre los años 2008-2011, se ha registrado un aumento de la presencia de telaraña en
cultivos comerciales de champiñón españoles (Gea et al., 2012). La telaraña también ha sido
detectada en cultivos de Pleurotus eryngii españoles (Gea et al., 2011).
Modificaciones culturales. Problemática de las coberturas
A finales del siglo pasado, el sistema cultural extendido en la comarca castellano-manchega
productora de champiñón consistía en alargar el periodo de fructificación hasta 60 días, recogiéndose
un promedio de 5 floradas por ciclo de cultivo (Gea y Tello, 1997). Sin embargo, entre el 50-60% de
la producción se recoge en las dos primeras floradas (Martínez Carrasco et al., 1994), por lo que
prolongar demasiado un cultivo puede ocasionar mayor daño que beneficio al convertirse las naves
de cultivo en focos de contaminación para otros cultivos de la explotación. Conscientes de esta
realidad, en los últimos años los agricultores tienden a evitar prolongar sus cultivos más allá de la
tercera florada. Las floradas posteriores a la tercera generalmente son consideradas económicamente
deficientes (Fletcher y Gaze, 2008).
El repunte de la enfermedad anteriormente mencionado puede estar motivado por
modificaciones en las técnicas culturales (Fletcher, 2002). Los cultivadores deben tratar de
identificar las causas que puedan originar un brote de la enfermedad con el objetivo de mitigar en lo
posible la incidencia de la misma:
1. Modificaciones en los sistemas de ventilación que puedan afectar a la distribución del aire en
la nave de cultivo, y también en el entorno de la granja (dispersión de conidios).
2. Cambios en el tipo de cobertura, al sustituir las coberturas tradicionales por coberturas tipo
turba, lo que supone una modificación en el calendario de riegos y en los parámetros de control
ambiental.
3. Uso de fungicidas, pudiendo generarse resistencias en el patógeno.
4. Deficiencias en la higiene de los cultivos.
Existen distintos materiales que pueden ser utilizados como coberturas para el cultivo de
champiñón, siendo la turba el más ampliamente empleado en todo el mundo. La cobertura
tradicionalmente empleada en La Manchuela se fundamenta en la utilización de suelo mineral (capa
superficial, subsuelo), tierra caliza (la presencia de Ca en abundancia evita la caída del pH) de
textura franco-arcillo-arenosa como base, a la que se adicionan materiales diversos para mejorar la
II. Incidencia
31
estructura y la retención de agua. Los materiales correctores son fundamentalmente turbas rubias tipo
Sphagnum importadas o turbas negras de origen nacional (Pardo et al., 1999). Las características
físicas del suelo mineral no son las óptimas para el cultivo del champiñón, y provoca problemas para
comercializar el sustrato post-cultivo. Actualmente se está produciendo una sustitución progresiva de
la cobertura tradicional. Su lugar está siendo ocupado por coberturas a base de turba negra (con
algunos aditivos como lodos de azucarera o carbonato cálcico), nacionales, fundamentalmente
provenientes de la turbera de Torreblanca, en Castellón, y suministradas por la empresa Infertosa
S.A. o importadas (Euroveen B.V., Topterra Holland, Mcdon Peat, RHP Mushrooms y Harte peat).
Su elevada capacidad de retención de agua y su estructura porosa hacen que este material sea ideal
para emplearlo como cobertura. Sin embargo, es un producto natural cuya tasa de renovación es baja,
por tanto el agotamiento de las reservas es un factor limitante para su uso continuado. Además, la
explotación de este recurso supone un fuerte impacto sobre los ecosistemas. Atendiendo a esta
problemática un buen número de materiales han sido evaluados como coberturas alternativas (Pardo
et al., 1999).
Como medida preventiva, es recomendable ocasionalmente realizar una desinfección de la
cobertura antes de su aplicación mediante el uso de desinfectantes sintéticos o vapor de agua. La
colonización de la cobertura por organismos patógenos o competidores del champiñón es retardada
aplicando tratamientos de vapor a 60ºC durante 30 minutos (Moore, 1972).
1.3. EXPRESIÓN DE LA ENFERMEDAD
Varios factores condicionan en mayor o menor medida la expresión de la enfermedad en los
cultivos de champiñón, al influir decisivamente en el ciclo vital del hongo parásito favoreciendo o
dificultando la germinación de las esporas y el desarrollo del micelio parasitario. A continuación se
resumen una serie de generalidades descritas por la bibliografía que afectan decisivamente a la
expresión de la telaraña.
Considerando la importancia de la HR y de la temperatura, el otoño es la época de mayor
riesgo (Desrumaux, 2005; Fletcher y Gaze, 2008).
La incidencia y severidad de la enfermedad puede estar condicionada por la precocidad de
infección, así como por la estructura y las condiciones nutritivas y físico-químicas del material
empleado como cobertura (Dar y Seth, 1992a). Según Gray y Morgan-Jones (1981), el micoparásito
infecta de forma efectiva los carpóforos del hospedador aunque parece no afectar al micelio
vegetativo del hospedador, pudiendo aparecer tanto en cuerpos fructíferos como sobre la cobertura.
Si la infección es temprana suele provocar importantes pérdidas de producción y limitar el número
de floradas recolectadas.
Cuando una colonia de telaraña sufre una perturbación física se pueden liberar los conidios
(Adie et al., 2000) que pueden ser dispersados provocando focos secundarios de infección. La
dispersión de los conidios se ve favorecida por las salpicaduras de agua durante el riego, también por
el viento y las corrientes de aire en los locales de cultivo (Ingold, 1971; Meredith, 1973; Pedersen et
al., 1994; Holb et al., 2004). Por tanto, es necesario implementar medidas de higiene y control
encaminadas a minimizar la dispersión de los conidios, ya que son secos y fácilmente dispersables
por las corrientes de aire presentes en la instalación. En caso contrario, una fuente primaria de
II. Incidencia
32
esporas inadecuadamente manipulada puede distribuirse rápidamente causando daños importantes
(Grogan, 2005a).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Se ha monitorizado la incidencia de telaraña en la comarca de La Manchuela. La comarca se
lozaliza entre el sureste de la provincia de Cuenca y noreste de la provincia de Albacete. Se visitaron
periódicamente, con un intervalo de 2-3 semanas entre visitas, trece instalaciones de cultivo de
champiñón localizadas en cinco poblaciones (cuatro en la provincia de Cuenca y una en Albacete)
(Tabla 5).
Tabla 5. Locales de cultivo de champiñón evaluados.
Table 5. Mushroom farms analyzed.
Town (Province) n *Facilities Substrate Casing
Casasimarro (Cu)
1 Industrial building Phase II/ Phase III Mineral/ Peat
Iniesta (Cu)
2 Traditional Phase II Mineral
3 Traditional Phase II Mineral
4 Traditional Phase II Mineral
5 Traditional Phase II Mineral
6 Plastic tunnel Phase II Mineral
7 Industrial building Phase II Mineral/ Peat
Quintanar del Rey (Cu)
8 Traditional Phase II Mineral
9 Industrial building Phase II Mineral/ Peat
10 Industrial building Phase II Mineral/ Peat
Villanueva de la Jara (Cu) 11 Traditional Phase II Mineral/ Peat
12 Traditional/ Industrial building Phase II Minearal/ Peat
Villamalea (Ab) 13 Dutch desing Phase III Peat *Pictures compiled in the Annex (Figure 18-21).
En cada explotación se han visitado varias locales de cultivo, y dentro de cada local se ha
realizado una inspección ocular de la cobertura y carpóforos con el fin de detectar sintomatología
asociada a la presencia de la telaraña. Los carpóforos que presentaban manchas sospechosas fueron
analizados en el laboratorio, mediante aislamiento y siembra en medio de cultivo PDA según la
metodología descrita en el Anexo, con la finalidad de confirmar si padecían la enfermedad.
En Castilla-La Mancha se pueden encontrar distintos tipos de locales destinados al cultivo
de champiñón: unos más tradicionales, denominados naves y ―sótanos‖, algunas construcciones tipo
invernadero, y otros más modernos que cuentan con instalaciones climatizadas y paredes de panel
tipo sandwich. Los locales visitados representan un esquema general de la tecnología disponible en
el sector productivo de champiñón en la comarca (Anexo, Figura 18-21). Entre las explotaciones
seleccionadas, sólo una de ellas es una instalación totalmente climatizada con paredes de panel
sándwich, situada en Villamalea. Esta instalación emplea compost Fase III, germinado (procedente
de la planta de compostaje de Champinter Soc. Coop. en Villamalea) que se dispone en bandejas de
grandes dimensiones (a granel) con la cobertura tipo turba ya aplicada. La explotación visitada en
II. Incidencia
33
Casasimarro emplea compost Fase II y Fase III dispuesto en sacos o ―compoblocks‖. Las once
instalaciones restantes emplean compost Fase II dispuesto en ―compoblocks‖ de 60x40x20 cm en
hileras, sobre estanterías o líneas de alambre tensado a distintas alturas (Tabla 5). En estos casos, el
compost es incubado en las propias instalaciones y el agricultor es el encargado de aplicar la
cobertura. El compost empleado en las instalaciones no ha sido considerado como factor en la
aparición de la enfermedad. El área de cultivo muestreada ha sido delimitada comprendiendo las tres
primeras alturas del cultivo, que en algunas instalaciones llegan hasta cinco alturas, con una
separación de 60 cm aproximadamente entre ellas. El estudio se ha prolongado durante 24 meses,
entre 2011 y 2013. Un total de 507 datos correspondientes a distintos puntos de muestreo han sido
considerados.
A lo largo del estudio se han evaluado varios factores, considerando como variable
dependiente dicotómica la ausencia o presencia de la enfermedad. Los factores estudiados y las
categorías en que se subdividen son:
- Estacionalidad: El estudio se ha realizado a lo largo de todo el año, considerando los
siguientes periodos: otoño2011; invierno2012; primavera2012; verano2012; otoño2012;
invierno2013; primavera2013; verano2013.
- Periodo de fructificación: Se ha valorado la aparición de la enfermedad a lo largo de las
tres primeras floradas de la etapa de fructificación: 1ª Florada; 2ª Florada; 3ª Florada.
- Cobertura empleada: Las explotaciones visitadas emplean coberturas basadas en suelo
mineral o tipo turba (Tabla 5). Se ha muestreado un mayor número de cultivos con
coberturas minerales atendiendo a la realidad del cultivo en la comarca. Sin embargo, a
lo largo del estudio hemos asistido a una progresiva sustitución de la cobertura mineral
tradicional por cobertura tipo turba en varias de las explotaciones analizadas.
De los 507 puntos o datos de muestreo registrados, 254 (50%) corresponden al periodo
anual 2011/2012, y 253 (50%) al 2012/2013. El Gráfico 4 recopila el porcentaje de datos evaluados
en cada estación respecto del total.
*66
73
81
5655
64
52
60 AUTUMN11/12
AUTUMN12/13
WINTER11/12
WINTER12/13
SPRING11/12
SPRING12/13
SUMMER11/12
SUMMER12/13
Gráfico 4. Porcentaje estacional de
cultivos evaluados. *No de visitas por estación.
Graph 4. Percentage of crops
checked. Seasons in respect to the
total. *No of visits made every season.
II. Incidencia
34
Atendiendo a la etapa de fructificación, el Gráfico 5 recoge el porcentaje de datos
recopilados a lo largo de las floradas estudiadas respecto al total muestreado en cada una de las
estaciones.
El número de datos recopilado en cultivos de tierra ha sido superior al de cultivos de turba,
suponiendo el 64% y el 36% del total respectivamente, si bien, como refleja el Gráfico 6, el
porcentaje ha variado en los distintos periodos estacionales. A lo largo del estudio, debido a la
progresiva sustitución de la cobertura tradicional, el porcentaje de cultivos con cobertura tipo turba
examinados ha experimentado un aumento: si en la primera anualidad supusieron el 21% del total
evaluado, ya en la segunda se incrementó el porcentaje suponiendo el 51% del total.
Para aportar una visión general acerca de la severidad de la infección se establece una escala
de valoración artificial: 0-No hay infección; 1-Focos puntuales, no más de 5; 2-Focos puntuales, más
de 5, hasta un 10% de sacos afectados; 3-Entre un 10-50% de sacos afectados; 4-Más del 50% de
sacos afectados.
*1426 19 14 16 14
23 19
2023
1815 27 19
17 19
3232 18
23 30 23 24 22
0
20
40
60
80
100
AU
TU
MN
WIN
TE
R
SP
RIN
G
SU
MM
ER
AU
TU
MN
WIN
TE
R
SP
RIN
G
SU
MM
ER
2011/2012 2012/2013
1ª FLUSH (%) 2ª FLUSH (%) 3ª FLUSH (%)
56*77
43
2446 38
23 17
104
12
2827 8
41 43
0
20
40
60
80
100
AU
TU
MN
WIN
TE
R
SP
RIN
G
SU
MM
ER
AU
TU
MN
WIN
TE
R
SP
RIN
G
SU
MM
ER
2011/2012 2012/2013
MINERAL (%) PEAT (%)
Gráfico 5. Porcentaje de cultivos
evaluados por florada. *No de visitas por florada.
Graph 5. Percentage of crops
checked. Flushes in respect
to the season. * No of visits made in every flush.
Gráfico 6. Porcentaje de
cultivos evaluados por material
de cobertura. *No de visitas por material de cobertura.
Graph 6. Percentage of crops
checked. Casing layers in
respect to the season. *No of visits made in every casing
material.
II. Incidencia
35
El Gráfico 21 (Anexo) recopila las condiciones meteorológicas de temperatura, humedad,
pluviometría y velocidad del viento registradas en la zona del muestreo durante el mismo. Los datos
han sido recogidos en la estación metereológica situada en el CIES (Quintanar del Rey).
Análisis estadístico
Las variables independientes o factores considerados al analizar estadísticamente los datos
recopilados de presencia o ausencia de enfermedad en los cultivos (variable dependiente dicotómica)
son: estacionalidad, florada y cobertura.
Se ha realizado un estudio estadístico de los datos basado fundamentalmente en el análisis
de correspondencia simple y múltiple que permite relacionar la aparición de la enfermedad con los
factores estudiados (Vega y Fleites, 2002; Linares y Sistachs, 1996).
Para determinar qué subdivisión dentro de cada factor tiene mayor importancia respecto a la
variable dependiente dicotómica se expresan los datos recopilados en tablas de frecuencia
bidimensionales, donde las columnas corresponden a cada una de las subdivisiones de los factores
estudiados:
- Estacionalidad: Otoño; Invierno; Primavera; Verano.
- Florada: Primera; Segunda; Tercera.
- Cobertura: Tierra; Turba.
Por su parte, las filas corresponden a la variable dependiente dicotómica: presencia o
ausencia de enfermedad.
Una vez realizada la prueba de Chi-cuadrado que contrasta la independencia entre filas y
columnas en las tablas de contingencia, estableciendo cierto grado de asociación entre las mismas
(valor P<0,01) (Pérez, 1998), para cada una de los factores respecto a las variables dependientes se
han construido gráficos de mosaico (Hartigan y Kleiner, 1981; Friendly, 1994). En los gráficos las
frecuencias relativas correspondientes a las subdivisiones de cada uno de los factores estudiados son
proporcionales a las áreas delimitadas por las líneas verticales; mientras que las líneas horizontales
de los gráficos definen las frecuencias relativas de la variable dependiente dicotómica. El análisis
estadístico ha sido ejecutado empleando el software Statgraphics–Centurion XVI (Statpoint, Herdon,
Virginia, USA).
3. RESULTADOS
El Anexo recopila en la tabla 22 los datos recogidos a lo largo del seguimiento realizado,
distribuyendo el número de datos recopilados en cada una de las variables estudiadas (Gráfico 4, 5 y
6). El estudio demuestra que la telaraña es una patología de origen fúngico común en cultivos de
champiñón españoles. Se ha detectado la presencia de la enfermedad en el 32% de las visitas.
II. Incidencia
36
3.1. INCIDENCIA DE TELARAÑA EN FUNCIÓN DE LA ESTACIONALIDAD
El gráfico 7 muestra el procentaje de cultivos infectados por estación respecto del total de
visitas realizadas en cada una de las estaciones. El gráfico 7a muestra la distribución de los cultivos
afectados en los periodos anuales, el gráfico 7b en las floradas y el 7c en las coberturas analizadas.
Se observa un patrón de comportamiento común en los tres gráficos, con una mayor infección
registrada en las estaciones de otoño (fundamentalmente) e invierno, y menor incidencia durante la
primavera y el verano.
Evaluando el estudio completo, la mayor incidencia se registró en otoño (44% de los
cultivos estaban infectados) e invierno (37%), mientras que la primavera (18%) y el verano (28%)
fueron las estaciones con la menor incidencia (Gráfico 8 y 9).
Gráfico 8. Presencia estacional de la enfermedad.
Graph 8. Presence of cobweb disease regarding the season.
0 10 20 30 40 50 60
SUMMERSPRINGWINTERAUTUMN
a
0 10 20 30 40 50 60 70
1st F
2nd F
3rd Fb
0 10 20 30 40 50
PEAT
MINERAL
c
Disease vs Season
Presence
Absence
Autumn
Winter
S pring
S ummer
Gráfico 7. Porcentaje de cultivos
infectados comparando la estacionalidad.
a) Año. b) Florada. c) Cobertura.
Graph 7. Percentage of diseased crops
comparing the season. a) Year. b) Flush.
c) Casing.
2012/2013
2011/2012
II. Incidencia
37
Conforme al análisis categórico de la tabla de contingencia construida para el factor
estacional, puesto que el valor de P<0.01 puede rechazarse la hipótesis de que las filas y columnas de
la tabla de contingencia son independientes con un nivel de confianza del 99% [Prueba χ² de
Pearson= 22,81 con 3 grados de libertad (df), P= 0,0], por lo que existe una relación estadística entre
cada una de las variables estudiadas:―estacionalidad‖ y la variable dependiente ―presencia de la
enfermedad‖ (Gráfico 8).
Con respecto a cada uno de los períodos, otoño 2011 fue el más afectado a lo largo del
estudio, un 50% de los cultivos visitados mostraron síntomas de la enfermedad, seguido del invierno
de 2012 con el 43% de los cultivos afectados. La prevalencia de la enfermedad durante la primavera
y el verano de 2012 fue menor, ya que el 24% de los cultivos evaluados en cada uno de estos dos
períodos sufrieron la enfermedad. Es destacable que la incidencia de telaraña experimentó un repunte
durante el otoño de 2012 (38%) e invierno 2013 (29%), mientras que la primavera y el verano de
2013, con el 13% y el 22% de los cultivos afectados respectivamente, fueron los dos períodos que
registraron los niveles más bajos de presencia de telaraña a lo largo del estudio (Anexo. Gráfico 22).
El otoño y el invierno han sido las estaciones donde se han registrado brotes más severos de
telaraña (grados 2, 3 y 4). En otoño, el 24% de los cultivos mostró un grado de infección entre
moderado y severo, y el 22% en invierno. Por el contrario, únicamente el 7% de los muestreados en
la primavera y el 8% de los cultivos de verano sufrieron este mismo nivel de infección (Gráfico 9).
3.2. INCIDENCIA DE TELARAÑA EN FUNCIÓN DE LA FLORADA
El muestreo realizado en diferentes etapas del ciclo indica que la telaraña se detecta en cada
una de las floradas evaluadas. Se observó una presencia considerablemente mayor durante la tercera
flor, puesto que el porcentaje de cultivos enfermos registrado aumenta conforme envejece el cultivo
63%
15%
12%
6%4%
n= 137
0 1 2 3 4
82%
11%
3%2% 2%
n= 119
0 1 2 3 4
72%
20%
4%3% 1%
n= 112
0 1 2 3 4
56%
20%
10%
9%5%
n= 139
0 1 2 3 4
a b
c d
Gráfico 9. Severidad estacional de la
infección en cultivos de champiñón. a)
Otoño. b) Invierno. c) Primavera. d)
Verano. *Escala subjetiva de severidad: 0-No hay
infección; 1-Focos puntuales, no más de 5; 2-
Focos puntuales, más de 5, hasta un 10% de
sacos afectados; 3-Entre un 10-50% de sacos
afectados; 4-Más del 50% de sacos afectados..
n= Nº de visitas por estación. Graph 9. Severity of the infection in
mushroom crops through the seasons.
a) Autumn. b) Winter. c) Spring. d)
Summer. *Scale of infection severity: 0 = no infection; 1 =
isolated outbreaks, no more than 5 patches; 2 =
isolated outbreaks, more than 5, up to 10% of
blocks affected; 3 = 10-50% of blocks affected; 4
= more than 50% of blocks affected. n = No of
sampled crops per season.
II. Incidencia
38
(Gráfico 10, 11). El Gráfico 10 muestra la distribución de cultivos infectados por florada respecto del
total de visitas realizadas en cada una de las floradas. El gráfico 10a muestra la dispersión de los
cultivos afectados en los periodos anuales, el gráfico 10b en las coberturas y el 10c en las estaciones
evaluadas. En todos los casos el patrón es comparable, observándose mayor infección en cultivos de
tercera flor y menor incidencia en los cultivos de primera florada.
Gráfico 10. Porcentaje de cultivos infectados comparando la florada. a) Año. b) Cobertura. c) Estación.
Graph 10. Percentage of diseased crops comparing the flush. a) Year. b) Casing. c) Season.
Evaluando el estudio completo, la infección más extendida fue registrada en tercera florada
(56% de los cultivos estaban infectados), disminuyendo progresivamente la presencia en las florada
más tempranas: en la segunda florada se registró el 24% de afectados, mientras que la primera
resultó la florada con menor incidencia, en únicamente el 8% de los cultivos visitados (Gráfico 11 y
12).
Gráfico 11. Presencia de la enfermedad a lo largo del ciclo de cultivo.
Graph 11. Presence of cobweb disease regarding the flush.
En la tabla de contingencia construida para las floradas, cada fila se relaciona con su
columna con un nivel de confianza del 99% (χ2=99,40; df=2; P=0,0), por lo que existe una relación
estadística entre cada una de las variables estudiadas: el factor florada y la variable dependiente.
Los brotes registrados en la primera florada fueron aislados y de poca importancia (grados 1
y 2). A medida que el ciclo de cultivo avanza la infección adquiere mayor severidad, siendo más
0 10 20 30 40 50 60 70 80
MIN
ER
AL
PE
AT
b
0 10 20 30 40 50 60 70 80
AUTUMN
WINTER
SPRING
SUMMER
AUTUMN
WINTER
SPRING
SUMMER
20
11
-20
12
20
12
-20
13
3rd F
2nd F
1st F
c
0 10 20 30 40 50 60 70 80
20
11
/12
20
12
/13
a
Disease vs Flush
First
S econd
Third
Presence
Absence
II. Incidencia
39
preocupante durante la tercera flor, cuando el 19% de los cultivos visitados presentó una infección
grave de grado 3 y 4 (Gráfico 12).
Gráfico 12. Severidad de la infección en cultivos de champiñón a lo largo del ciclo. a) Primera flor. b) Segunda flor.
c) Tercera flor. *Escala subjetiva de severidad. n= Nº de visitas por estación.
Graph 12. Severity of infection in mushroom crops along the flushes. a) First flush. b) Second flush. c) Third flush. *Scale of infection severity. n = Number of sampled crops per season.
3.3. INCIDENCIA DE TELARAÑA EN FUNCIÓN DE LA COBERTURA
Atendiendo al factor de la cobertura aplicada, se registraron síntomas de enfermedad en las
dos mezclas de cobertura evaluadas durante el estudio (Gráfico 13 y 14). El Gráfico 13 muestra el
porcentaje de cultivos infectados por cobertura respecto del total de visitas realizadas en cada una de
las coberturas. El gráfico 13a muestra la distribución de los cultivos afectados en los periodos
anuales, el gráfico 13b en las floradas y el 13c en las estaciones evaluadas. Atendiendo a los
parámetros representados, no existe un patrón común respecto a la incidencia de la enfermedad en
cada una de las coberturas.
Gráfico 13. Porcentaje de cultivos infectados comparando los materiales de cobertura. a) Año. b) Florada. c)
Estación.
Graph 13. Percentage of diseased crops comparing the casing material. a) Year. b) Flush.
c) Season.
76%
17%
6% 1%n=158
0 1 2 3
44%
23%
14%
12%
7%n=204
0 1 2 3 4
92%
7%
1%n=145
0 1 2
a b c
0 10 20 30 40 50 60
20
11
/12
20
12
/13
0 10 20 30 40 50 60
AUTUMN
WINTER
SPRING
SUMMER
AUTUMN
WINTER
SPRING
SUMMER
20
11
-20
12
20
12
-20
13
PEAT
MINERAL
0 10 20 30 40 50 60 70 80
1st
F2
nd
F3
rd
F
a
b
c
II. Incidencia
40
El porcentaje de cultivos afectados por telaraña es comparable en ambas coberturas (Gráfico
14). Al evaluar el estudio general se ha observado un porcentaje de cultivos afectados por telaraña
ligeramente superior en cultivos que aplicaron cobertura mineral (34%) que en los cubiertos con
cobertura tipo turba (29%) (Gráfico 14 y 15).
Gráfico 14. Presencia de la enfermedad respecto al material de cobertura.
Graph 14. Presence of cobweb disease regarding the casing material.
El análisis categórico no especifica una correlación entre las filas y columnas de la tabla de
contingencia con un nivel de confianza del 99%. Para el factor cobertura, el valor de P>0.01 para la
prueba de Chi cuadrado (χ2=1,5;df=1; P=0,22). Por lo tanto los datos obtenidos para el factor
cobertura no están estadísticamente correlacionados con la variable dependiente (Gráfico 14).
En cuanto a la severidad de los brotes localizados, es comparable en ambas coberturas,
registrándose mayoritariamente afecciones leves de enfermedad (grados 1 y 2) en el 25% de cultivos
muestreados en tierra y en el 23% de los cubiertos con turba. Respecto a los cultivos con brotes
severos, la cobertura mineral registró una infección de grado 3 en el 6% y de grado 4 en el 3% de los
muestreados; por su parte los cubiertos con turba presentaron infecciones importantes de grados 3 y
4 en el 4% y 2% respectivamente (Gráfico 15).
Disease vs Casing
Presencia
Ausencia
TierraTurba
66%
16%
9%
6%3%
0 1 2 3 4
a
71%
18%
5%
4%
2%
0 1 2 3 4
n=183 bn=324
Gráfico 15. Severidad de la
infección en cultivos de champiñón
comparando coberturas. a) Mineral.
b) Turba. * Escala subjetiva de severidad. n = Nº de
visitas por material de cobertura.
Graph 15. Severity of infection in
mushroom crops comparing casing
material. a) Mineral. b) Peat based. *Scale of infection severity. n= No of
sampled crops per casing material.
II. Incidencia
41
4. DISCUSSION
In Spain, the data collected demonstrate that cobweb disease is a common pathology in
commercial mushroom facilities since it was detected in 32% of mushroom crops checked. In
contrast, lower incidence of disease was detected in India where 13% of the Indian mushroom farms
during 1982 and 9% in 1983 showed symptoms of cobweb, while Bora and Özaktan (2000) showed
similar results; they stablished a cobweb prevalence of 33% in Turkish mushroom houses. Our
results have nothing to do with the epidemic dimension that cobweb disease reached in Ireland in
1992 (McKay et al., 1999).
During the survey all the cobweb symptoms previously described were detected (Figure 7).
Cobweb is a dangerous pathology since both quantitative and qualitative losses of
production must be conditioned by its occurrence and widespread within mushroom crops. In the
mid-1990s, outbreaks of cobweb disease associated with the occurrence of benzimidazole-resistant
C. mycophilum isolates reached epidemic proportions on British mushroom farms, with crop losses
up to 40% (Mckay et al., 1999; Grogan y Gaze, 2000; Adie et al., 2006).
In Spanish mushroom crops, it is possible to find the disease at any time of the year
although its incidence and severity is higher in autumn and winter than in those cycles cultured
during spring and summer, being especially common in autumn. This is in line with Desrumaux
(2005), who maintains that the autumn seems the high-risk period for the infection, considering the
Figura 7. Sintomatología asociada a
la enfermedad de la telaraña en la
cobertura y en los carpóforos. a, b)
Cultivos cubiertos con cobertura
mineral. c, d) Cultivos cubiertos con
cobertura tipo turba. e) Moteado en un
carpóforo infectado. f) Lesiones
cóncavas en champiñones infectados.
Figure 7. Symptoms of cobweb
disease over the casing layer and
carpophores. a, b) Crops cased with
mineral casing layer. c, d) Crops cased
with peat based casing layer. e) Spotting
over the caps. f) Sunken lesions over the
caps.
II. Incidencia
42
importance of high relative humidity and high temperature for cobweb development. It is remarkable
that after the spring and summer, the presence of the disease increased again during the autumn and
winter of the second annual period. This could be related to the high humidity registered through this
two periods (autumn and winter) during the two years of the study (Annex, Graph 21). According to
Desrumaux (2005), the germination of pathogenic spores is definitely conditioned by high relative
humidity (RH) and high temperature.
Under unfavorable conditions: mainly conditions of low RH, the majority of the spores do
not survive for a long period, however, the fungus produces microsclerotia (a compact mass of
hardened mycelium containing food reserves) which are structures of resistance that can germinate
even when they are stored at 0% RH (Lane et al., 1991). It is plausible to consider that under the dry
seasons, spring and summer, the fungus structures lay dormant. With the increase of relative
humidity experienced in the autumn this fungus could have found an environment propitious for the
germination. Subsequently the density of conidia in the air would raise. Conditions of high humidity
out of the cropping rooms will facilitate the survival of the pathogenic conidia and its dispersion
through the productive area. Attending to the weather conditions recorded in the region during the
study, it seems a priori that RH is the limiting factor, while temperature (lower in autumn and winter)
has less influence over disease manifestation (Annex, Graph 21). Nevertheless, it is also notable that
there has been a general decline in cobweb occurrence during the second annual period of the study.
This downward trend may have arisen partially due to the hygiene improvements implemented in
mushroom farms as a result of the recommendations provided to the growers during the study to
cope with the disease. These recommendations include: correct disinfection of spent mushroom
substrate after the crop cycle, control of conidia release from punctual outbreaks (by covering
patches of cobweb with thick-damp paper) and prevention of conidial dispersion by avoiding to
water over or near patches of disease, switching off fans when removing the spent mushroom
compost (when applying ―cooking out‖ in situ is not possible), and maintaining the doors of growing
rooms hermetically closed, in adition to the use of air filters, etc. (Fletcher y Gaze, 2008).
Our findings are consistent with those of McKay et al. (1999): along the crop cycle the
presence and severity of infection significantly rises. The infection grew exponentially from 1st to 3
rd
flush, and the severity of the outbreaks considerably increased as well. Thus the third flush crops are
much more likely to express the infection than those of second and first.
During the survey no significant differences were found between the casing materials used
by growers as regards the incidence of cobweb. The pathology appeared regardless the casing used
during the cultivation (mineral or peat based). Even though when physic and chemical properties of
peat based materials seem, a priori, more susceptible for disease development, mainly due to its
higher water holding capacity. It is remarkable that the number of peat cased crops sampled during
the second year of the study significantly increased. Along the transitional period from traditional to
peat based casing, the farms were advised on the peat casing management to deal with cobweb
disease. So, as Grogan (2006) suggests, the data gathered could be attributed to the high standards of
hygiene achieved in those farms where peat based materials have been employed, anyhow, a more in
deep study would be necessary to clarify this point.
III. IDENTIFICACIÓN DEL agente
causal de la telaraña en los
cultivos DE CHAMPIÑÓN españoles
III. Identificación
44
1. INTRODUCCIÓN
Como ya ha sido comentado anteriormente en la memoria, distintos taxones del género
Cladobotryum Nees emend. pueden generar la enfermedad de la telaraña en cultivos de setas
comestibles. Entre las especies causantes de la telaraña del champiñón, C. dendroides y C.
mycophilum se consideran las más comunes e importantes debido a los graves daños que ocasionan
en los cultivos (Grogan, 2006). Sembrados in vitro estos hongos desarrollan un micelio blanco-
grisáceo con el reverso de la placa tornando a amarillo en pocos días. Normalmente en 2-4 semanas,
dependiendo del medio de cultivo y de las condiciones, las colonias adquieren un intenso color rojo.
Este pigmento, identificado como aurofusarina, es secretado más abundantemente por las hifas
sumergidas en el medio que por el micelio aéreo. Al microscopio, el color es entre rojo y amarillo
rosáceo (Põldmaa, 2011). Sin embargo, no todas las especies de Cladobotryum presentan esta
pigmentación (Potočnik et al., 2008a). A continuación se describen las especies recogidas en la
literatura como responsables de la enfermedad en cultivos de setas.
El patógeno más citado en la literatura como agente causal de la telaraña en cultivos de
champiñón es Cladobotryum dendroides (Bull.: Fr.) W. Gams & Hoozem. (también conocido por su
sinónimo, Dactylium dendroides) cuyo teleomorfo es Hypomyces rosellus (Alb. & Schwein.:Fr.) Tul.
(Flachs, 1939/1940; Fletcher et al., 1989). Hasta mediados de la década de los noventa, esta especie
ha sido siempre referenciada como la principal responsable de la enfermedad en cultivos de A.
bisporus (Kligman, 1950; Forer et al., 1974; Eicker, 1984; Fletcher et al., 1983; Seth y Dar, 1989;
Lane et al., 1991; Dar y Seth, 1992a; Howard et al., 1994; Rinker y Wuest, 1994), sin embargo
también actualmente sigue siendo responsable de pérdidas en los cultivos y considerada por algunos
autores como el agente causal más importante (Largeteau y Savoie, 2010; Ślusarskiet al., 2012;
Cengiz et al., 2014; Parrag et al., 2014; Potočnik et al., 2014). Distintos aislados de C. dendroides
asociados a la enfermedad de la telaraña en cultivos de A. bisporus han sido recolectados en la
mayoría países productores, como Australia, Bélgica, Canadá, Estados Unidos, Gran Bretaña, Irlanda
o Luxemburgo, algunos de ellos referenciados en el GenBank (McKay et al., 1999). In vitro este
espécimen presenta colonias de micelio inicialmente blanco que adquieren tonalidades rojizas al
envejecer el aislado (Grogan, 2005a). La especie se caracteriza por la presencia de una extensión
secundaria muy irregular en el ápice (raquis) (McKay et al., 1999). Las fiálides generan los conidios
a través del ápice que continúa creciendo después de la formación de cada espora haciéndose más
irregular con el tiempo. Las esporas son grandes (20-30 μm de longitud) y normalmente tienen de
tres a cuatro células (dos y tres septos por espora). Presentan en uno de los extremos un hilio basal
conspicuo que es la cicatriz de unión a la fiálide. Esta especie también genera clamidosporas y
microesclerocios (McKay et al., 1999). Al estudiar las condiciones más favorables para la
germinación de los conidios de C. dendroides, Dar y Seth (1992b) determinaron que la máxima
germinación tiene lugar a 25ºC, aunque observaron tubos germinativos más largos a 20ºC; el pH
óptimo de germinación fue 6,5, si bien la máxima longitud se alcanzó a pH=6.
La enfermedad también se asocia frecuentemente con Cladobotryum mycophilum (Oudem.)
W. Gams & Hoozem., Dactylium mycophilum Oudem., cuyo teleomorfo es Hypomyces odoratus
G.R.W. Arnold (Gea et al., 2012). Desde mediadiados de los noventa se han encontrado especímenes
de C. mycophilum parasitando cultivos de champiñón en distintos países productores como
III. Identificación
45
Alemania, Gran Bretaña y Holanda (McKay et al., 1999). Recientemente también se ha detectado la
presencia de C. mycophilum en cultivos de A. bisporus coreanos (Back et al., 2010, 2012a). Al igual
que el anterior, en el laboratorio las colonias no esporulan abundantemente, excretando un pigmento
semejante al generado por C. dendroides conforme envejece la cepa (Grogan, 2005a). Las colonias
producen un olor a alcanfor detectable al levantar la tapa de la placa Petri (Grogan 2005a, Põldmaa,
2011). La producción e intensidad del olor depende del medio y de la edad de la cepa (Põldmaa,
2011). Las fiálides de esta especie no tienen raquis, siendo el ápice donde se generan las esporas
simple y regular, además no sigue creciendo tras la formación del conidio como en el caso de C.
dendroides (Grogan, 2005a). En las esporas de esta variedad suele haber mayoritariamente sólo dos
células disociadas por un septo, al contrario de las 3 o 4 que pesentan mayoritariamente las esporas
de C. dendroides (Grogan, 2005a). Además las colonias producen un olor característico a trementina
y alcanfor (Grogan, 2005a; Fletcher y Gaze, 2008).
A mediados de los noventa, durante la epidemia de telaraña que golpeó Gran Bretaña e
Irlanda con serias consecuencias se identificó una cepa de C. mycophilum distinta a las descritas
anteriormente (McKay et al., 1999). La mayoría de los aislados recolectados (80%) eran resistentes a
los bencimidazoles (Grogan y Gaze, 2000). Inicialmente los aislados fueron identificados como C.
dendroides porque las esporas presentaban 3 y 4 células, aunque el ápice de las fiálides no
mostrataba irregularidades y exhibían un crecimiento más rápido y mayor esporulación que C.
dendroides. Resultó ser una variedad genéticamente más próxima a C. mycophilum, aunque
morfológicamente difería del descrito hasta la fecha. Las colonias carecían del distintivo olor a
alcanfor de C. mycophilum, y las esporas presentaban dos, tres y cuatro células (uno, dos y tres
septos), a diferencia de las dos células características en este patógeno (Adie, 2000; Grogan y Gaze,
2000). Estos aislados también crecían y esporulaban con mayor intensidad que los previamente
descritos como C. mycophilum. Se denominó Cladobotyum mycophilum tipo II. La mayoría de estos
aislados muestran resistencias a los fungicidas tipo bencimidazoles (Grogan, 2005a). Se han
identificado aislados de Cladobotryum mycophilum Tipo II en Australia, Estados Unidos, Francia,
Gran Bretaña e Irlanda (Grogan y Gaze, 2000).
Grogan (2005a) concluye que existen tres tipos de especies causantes de telaraña:
Cladobotryum dendroides, Cladobotryum mycophilum y Cladobotryum mycophilum tipo II. Para ello
se analizaron microscópicamente aislados de Cladobotryum spp. procedentes de naves de cultivo de
champiñón con problemas de telaraña. Se evaluaron especímenes recolectados en distintos países
productores del mundo y recopilados durante aproximadamente una década, desde 1995.
Sin embargo, otras especies han sido también registradas por diversos autores como
responsables de la enfermedad de la telaraña en cultivos de setas comestibles, entre ellas C.
multiseptatum, C. semicirculare, C. varium (sin. C. variospermum) y C. verticillatum (Sinden, 1971;
De Hoog, 1978; Sharma et al., 1992 Kirschner, et al., 2007; Back, 2012a).
Los aislados de Cladobotryum varium Nees ex Steud. desarrollan un micelio blanco al
crecer en medio PDA a 22ºC, tornando el medio a coloraciones crema a los 10 días. Presenta
conidióforos con ramificaciones sencillas, conidios ovoides con dos células (un septo) cuyas
dimensiones oscilan entre 8,6-15,8 μm de longitud y 6,4-8,6 μm de anchura, y fiálides con un ápice
muy irregular (raquis). Esta especie ha sido recientemente descrita como agente causal de la telaraña
en cultivos coreanos de setas comestibles (F. velutipes y H. marmoreus), mostrando capacidad
infecciosa frente a carpóforos de A. bisporus en laboratorio (Back, 2012a).
III. Identificación
46
Cladobotryum verticillatum (Link ex. S. F. Gray) Hughes fue aislado e identificado a partir
de cuerpos fructíferos de Agaricus bitorquis infectados en la India. Se describe un micelio blanco
grisáceo del hongo que crece rápidamente sobre la cobertura envolviendo los champiñones. El
micelio se torna rojizo a los 5-6 días (Sharma, 1992).
Cladobotryum multiseptatum (de Hoog) fue aislado por A. W. Smith como agente causal de
la enfermedad de la telaraña en Agaricus brunnescens Peck (variedad de A. bisporus), en Nueva
Zelanda. Presenta conidios con 2-4 células (1 y 3 septos) (De Hoog, 1978).
Cladobotryum semicirculare sp. nov. se diferencia de otras especies del mismo género por
presentar conidios muy curvados, con 0-3 septos. Esta especie fue aislada en cultivos comerciales de
Ganoderma tsugae en Taiwan (Kirschner et al., 2007).
Sin embargo, como sugiere Grogan (2005a), podría ser que alguna o varias de estas especies
descritas como causantes de la enfermedad hayan sido identificadas erróneamente, puesto que para
asegurar una correcta identificación es muy recomendable que la descripción taxonómica se apoye
en la correspondiente caracterización genética de los aislados. Así por ejemplo, C. verticillatum ha
sido descrito por los autores como agente causal de la enfermedad únicamente en base a caracteres
morfológicos (Sharma, 1992).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. AISLADOS
Se estudiaron veinticinco aislados de Cladobotryum sp. procedentes de cultivos comerciales
de A. bisporus situados en Castilla-La Mancha y La Rioja. Los aislados se obtuvieron a partir de
cuerpos fructíferos que presentaban síntomas de telaraña o de manchas sobre la superficie de la
mezcla de cobertura. 23 de los aislados estudiados furon recogidos en explotaciones situadas en
distintas localidades de Castilla-La Mancha (CLM), 2 de ellos se recolectaron en la comarca
productora de La Rioja. Los aislados fueron recolectados en distintos años (2008-2013), floradas (1ª-
3ª) y sustratos (carpóforos afectados o manchas sobre la cobertura) (Tabla 6). La metodología
utilizada para aislar y conservar los especímenes se describe en el Anexo.
Con el objetivo de identificar el patógeno se ha realizado un estudio del crecimiento y
evolución del patógeno in vitro, y los distintos aislados estudiados han sido caracterizados
taxonómica y molecularmente.
2.2. ESTUDIO DEL PATÓGENO IN VITRO
Se ha empleado medio PDA para evaluar el crecimiento medio de cada uno de los aislados,
el nivel de esporulación, así como las variaciones en la coloración del patógeno y la presencia o
ausencia de olores. A partir de cultivos madre crecidos durante cinco días, con un sacabocados estéril
se tomó un disco de 5 mm de diámetro de la parte más externa de la colonia, ya que ésta es una zona
metabólicamente activa (la banda de crecimiento activo del micelio). Con los fragmentos
III. Identificación
47
procedentes de los cultivos madre se sembraron placas en medio PDA. De cada aislado, se
sembraron 5 placas con un disco cada una en el centro de la placa, enfrentando la superficie donde ha
crecido el hongo en la placa madre con la superficie de cultivo de la nueva placa.
Se observó y registró la evolución de los aislados durante 21 días en cámara de cultivo a
22ºC y en oscuridad. Con un calibre digital se tomaron dos medidas perpendiculares por aislado,
correspondientes al diámetro del crecimiento miceliar del hongo en milímetros, para evaluar la tasa
diaria de crecimiento del micelio. También se ha registrado el nivel de esporulación de los aislados,
así como los cambios de color registrados en la placa. Se registró también la presencia/ ausencia de
olor a alcanfor, característico de C. mycophilum (Grogan, 2005a), al levantar la tapa de la placa de
cultivo. Por último, la presencia de clamidosporas y microesclerocios en aislados envejecidos ha sido
también evaluada.
Tabla 6. Aislados de Cladobotryum spp. evaluados. Municipio donde
se recolectaron, sustrato a partir del que se reaisló, florada y año.
Table 6. Isolates of Cladobotryum spp. included in the study, town
where they were collected, substrate, flush and year.
Strain Town/ Region Substrate Flush Year
CM1 Quintanar del Rey (*CLM) Peat casing 2
nd 2008
CM2 Quintanar del Rey (CLM) Fruitbody 3rd
2008 CM3 Quintanar del Rey (CLM) Mineral
casing
3rd
2009 CM4 Quintanar del Rey (CLM) Fruit body 2
nd 2009
CM5 Quintanar del Rey (CLM) Frui body 3rd
2009 CM6 Quintanar del Rey (CLM) Mineral
casing
3rd
2010 CM7 Quintanar del Rey (CLM) Fruit body 3
rd 2010
CM8 Villalgordo del Júcar (CLM) Fruit body 3rd
2010 CM9 Villarta (CLM) Fruit body 3
rd 2011
CM10 Iniesta (CLM) Fruit body 3rd
2011 CM11 Iniesta (CLM) Fruit body 2
nd 2011
CM12 Iniesta (CLM) Fruit body 3rd
2011 CM13 Quintanar del Rey (CLM) Fruit body 2
nd 2011
CM14 Quintanar del Rey (CLM) Fruit body 2nd
2011 CM15 Iniesta (CLM) Fruit body 2
nd 2011
CM16 Villanueva de la Jara (CLM) Fruit body 3rd
2012 CM17 Quintanar del Rey (CLM) Fruit body 2
nd 2012
CM18 Villanueva de la Jara (CLM) Fruit body 3rd
2012 CM19 Quintanar del Rey (CLM) Fruit body 3
rd 2012
CM20 Iniesta (CLM) Fruit body 3rd
2012 CM21 Villanueva de la Jara (CLM) Fruit body 3
rd 2012
CM22 Quintanar del Rey (CLM) Fruit body 1st 2012
CM23 Iniesta (CLM) Fruit body 3rd
2013 CM24 La Rioja Fruit body 3
rd 2012
CM25 La Rioja Fruit body 3rd
2012 *CLM: Castilla-La Mancha.
2.3. CARACTERIZACIÓN TAXONÓMICA
Para caracterizar los distintos aislados estudiados, las estructuras fúngicas se montaron en
portaobjetos y se observaron al microscopio. Se han empleado distintas técnicas de tinción para
colorear las estructuras fúngicas estudiadas: tinción mediante colorantes artificiales (azul algodón en
lactofenol y lactofucsina) y tinción mediante colorantes vegetales solubles en agua empleados por la
industria alimentaria, rojo allura (E124) y azul brillante (E133) (Coralim Aditivos, Ribarroja del
III. Identificación
48
Turia, Valencia) preparados a razón de 0,05 g de colorante alimentario + 0,5 mL de ácido acético
glacial + 2 mL de glicerina + 2,5 mL de agua destilada estéril (González et al., 2011).
Las peculiaridades taxonómicas de los aislados evaluados han sido caracterizadas: longitud,
anchura y número de septos de los conidios; longitud de las fiálides (células conidiogénicas),
anchura de la base y del ápice de las fiálides, y presencia o ausencia de ápice irregular en el extremo.
Doscientos conidios y cien células conidiogénicas fueron evaluados en cada uno de los aislados. Para
el registro de las estructuras fúngicas se ha utilizado una cámara Nikon DS-Fi1 (Tokio, Japón) para
microscopía óptica acoplada a un microscopio Nikon Eclipse E600 (Tokio, Japón) donde
fundamentalmente se han empleado los objetivos 20x (apertura numérica 0,40) y 40x (apertura
numérica 0,65). La cámara se acopló a un ordenador y las medidas correspondientes se realizaron
empleando el software Nikon NIS-Elements Advanced Research (Nikon, Japón). Para el análisis
estadístico de las medidas registradas se ha empleado el paquete software Excel 2007 (Microsoft,
Redmont, Washington, US). Tomando en consideración los resultados obtenidos, los aislados fueron
identificados morfológicamente conforme a las descripciones proporcionadas por Gams y
Hoozemans (1970) y Rogerson y Samuels (1994). Se ha estudiado también la tasa de germinación de
los conidios de una de las cepas empleadas en el estudio a temperatura ambiente. Para ello se
seleccionó el aislado CM23 con cinco días de crecimiento sobre medio PDA. Se preparó una
solución conidial a partir del cultivo, lavando el aislado con agua destilada estéril y liberando los
conidios del micelio mediante un pincel esterilizado. Se eliminaron los restos de micelio mediante
filtro de red de polipropileno [25 µm de diámetro de poro, Millipore® (Merck KGaA, Darmstadt,
Alemania)]. La concentración conidial de la disolución madre se determinó empleando un
hemocitómetro y posteriormente se reajustó la disolución a la concentración requerida adicionando
agua destilada estéril, de tal manera que se pueda aislar los conidios y estudiar su crecimiento. Se
tomaron 50 µl de la solución conidial y se depositaron en una placa Petri sobre medio PDA. El
crecimiento y evolución de los tubos germinativos a partir de una espora fue registrado
fotográficamente (cada hora durante las 12 primeras horas tras la siembra y a las 24h). Para ello se
empleó la cámara Nikon DS-Fi1 (Tokio, Japón) para microscopía óptica acoplada a un microscopio
óptico inverso Nikon Eclipse TS100 [objetivos 20x (apertura numérica 0,40) y 40x (apertura
numérica 0,65)]. La cámara se acopló a un ordenador y las medidas correspondientes se realizaron
empleando el software Nikon NIS-Elements Advanced Research (Nikon, Japón).
2.4. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR
Los aislados caracterizados taxonómicamente también se han identificado molecularmente.
De cada placa se seleccionó a partir de la zona de crecimiento activo del micelio una sección
cuadrada de unos 5 mm de lado y se almacenó a -20ºC hasta su análisis molecular.
Para la extracción y secuenciación del material genético de los aislados se han seguido dos
protocolos diferentes:
1) Para caracterizar los aislados CM1, CM2, CM3, CM4, CM5 y CM6 se siguió el
protocolo descrito a continuación: el ADN de las muestras se extrajo mediante el kit comercial
E.Z.N.A. Fungal DNA (Omega Bio-Tek, Doraville, USA) sin mercaptoetanol. La región ITS del
ADN ribosómico nuclear de los extractos de ADN se amplificó por PCR mediante el iniciador
específico para hongos ITS1F (Gardes y Bruns, 1993) y el iniciador eucariótico ITS4 (White et al.,
III. Identificación
49
1990), siguiendo las condiciones descritas por Martín y Winka (2000). Para ello, se utilizó el kit de
PCR puReTaq Ready-To-Go PCR beads (GE-Healthcare, Buckinghamshire, UK). En cada batería de
amplificaciones se incluyó un control positivo y un control negativo (sin ADN). Los amplímeros se
visualizaron en geles de agarosa al 2%, teñidos con SYBR® Safe (Invitrogen, OR, USA) bajo luz
UV. Los amplímeros se purificaron mediante el kit comercial QIAquick PCR purification kit
(Qiagen, CA, USA) y se enviaron a secuenciar en una dirección con el iniciador ITS1F al Servicio de
Biología Molecular de la Universidad de Murcia. El software de análisis de secuencias Sequencher®
(Gene Codes Corporation, Michigan, USA) se utilizó para editar la secuencia de cada muestra.
2) Para caracterizar los aislados CM7-CM14, CM16, CM18-CM21 y CM23 se siguió el
protocolo descrito a continuación: los aislados fueron cultivados en matraces Erlenmeyer (250 mL)
con 50 mL de caldo de patata-dextrosa (PDB) a 25°C durante siete días. Posteriormente, los micelios
fueron cosechados por filtración a través de dos capas de tela de muselina. Las muestras fueron
congeladas en nitrógeno líquido y molidas a polvo fino utilizando un mortero y una maja de
porcelana. El ADN de las muestras se extrajo mediante el kit comercial E.Z.N.A. Fungal DNA
Miniprep Kit (Omega Bio-tek, Doraville, GA) conforme a las indicaciones del fabricante. El ADN
extraído se analizó en geles de agarosa al 1% con tampón tris-borato-EDTA para determinar la
calidad y cantidad del ADN obtenida. Las amplificaciones por PCR fueron realizadas en un volumen
total de 50μl. 1μl del ADN extraído (1 ng cuantificado con espectrofotómetro) se añadió a 49-μl de la
mezcla maestra de reacción que contiene 5 μl de tampón PCR 10x, 36,6 μl de H2O destilada estéril, 1
μl de MgCl2 10 mM, 2 μl de dNTPs 2 mM, 2U de Taqpolimerasa (EuroTaq, Euroclone, Lugano,
Switzerland), y 0,2 mM de cada cebador. Las secuencias de los cebadores ITS1 e ITS4 empleadas
fueron respectivamente 5 -̀TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ̀y 5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′ (White et
al., 1990). Estas reacciones fueron sometidas a una desnaturalización inicial de 4 min a 95°C,
seguido de 35 ciclos de 1,5 min a 94°C, 2 min a 55°C y 3 min a 72°C, con una extensión final de 10
min a 72°C. La secuenciación de la región del ADNr, incluyendo los separadores ITS1, ITS2 y
ADNr 5.8S, se llevó a cabo por el servicio técnico de Universidad de Almería mediante
secuenciación automatizada del ADN con terminadores fluorescentes, utilizando el secuenciador
ABI 377 prisma (Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). El software de análisis
ChromasPro® (Technelysium PTY, Tewantin, Australia) fue utilizado para editar cada muestra de las
secuencias.
Se compararon las secuencias obtenidas con las registradas por otros autores en la base de
datos del GenBank [NCBI] (Altschul et al., 1997) mediante búsquedas MegaBlast (secuencias
altamente similares) (Zang et al., 2000; Morgulis et al., 2008). Las secuencias caracterizadas en este
estudio han sido depositadas en la citada base de datos.
2.5. ESTUDIO FILOGENÉTICO
El análisis evolutivo y filogenético de las secuencias obtenidas se ejecutó con el programa
MEGA6 (molecular evolutionary genetics analysis) (Tamura et al., 2013). La alineación múltiple de
las secuencias de máxima similitud obtenidas del GenBank se realizó mediante CLUSTAL W
(Thompson et al., 1994). El árbol filogenético se construyó utilizando el método Neighbor-Joining
(Saituo y Nei, 1987). El porcentaje de árboles en los que los taxones asociados se agrupan en la
prueba ―bootstrap‖ (1000 repeticiones) aparecen junto a las ramas (Felsenstein, 1985); este es un
III. Identificación
50
método estadístico de muestreo con reposición al azar a través de 1000 pseudoréplicas. El árbol se
dibuja a escala, las ramas presentan longitudes proporcionales a las distancias evolutivas utilizadas
para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas se computaron mediante el método de
Kimura 2-parámetros (Kimura, 1980), el cual asume tasas diferenciales de ocurrencia de transiciones
y transversiones de bases. Como grupo externo se ha empleado la secuencia correspondiente a
Sepedonium sp. (HQ604857).
3. RESULTADOS
3.1. ESTUDIO DEL PATÓGENO IN VITRO
Los aislados manifiestan la mayor tasa de crecimiento en PDA entre los días 3 y 4 tras la
siembra, llegando a cubrir totalmente la placa. Desarrollan un crecimiento radial a partir del
fragmento de agar con el que se inocularon las placas. Desde el cuarto día puede apreciarse una
incipiente esporulación en la zona de crecimiento activo del micelio (la más externa). El nivel de
esporulación de los aislados una vez invadida toda la placa (a los 4-5 días) es semejante en todas
ellas, presentando una zona radial de alta esporulación en la parte más externa de la placa (Figura 8).
Inicialmente los aislados presentan una tonalidad blanco-grisácea, posteriormente a partir
del tercer día adquieren cierto tono amarillento que se intensifica, tornando anaranjado a los 7 días. A
partir del día 14 el aislado adquiere tono rosáceo-rojizo, que va tornando rojo muy intenso conforme
envejece el aislado. El cambio de tonalidad se aprecia mejor en el envés de las placas por lo que
podemos concluir que el pigmento aurofusarina (Põldmaa, 2011), es secretado en mayor proporción
por las hifas sumergidas en el medio, mientras que el micelio aéreo conserva la coloración blanca
inicial (Figura 8).
En aislados de cierta edad (a partir de la tercera o cuarta semana) se detectan estructuras
compactas y redondeadas de color oscuro que se extienden por el medio de cultivo. Estas estructuras
Figura 8. Haz y envés de placas
Petri sembradas con el parásito
sobre medio PDA. Evolución de
la colonia. *1, 2, 4, 7, 14, 21: Edad de la placa en días
al fotografiarla. Figure 8. Front and back side of
PDA medium plated with the
parasite. Evolution of the colony. *1, 2, 4, 7, 14, 21: Age in days of the strain
when shooted.
III. Identificación
51
son los microesclerocios que se asocian con estructuras de reserva de nutrientes y latencia. Ligadas a
los microesclerocios suelen detectarse clamidosporas, estructuras multiseptadas en cadena, que
presentan células redondeadas de pared gruesa y constricciones en los septos que las dividen (Lane et
al., 1991; Mckay et al., 1999) (Figura9).
Los aislados sembrados en PDA no presentan el olor a alcanfor carácterístico de C.
mycophilum (Grogan, 2005a).
3.2. CARACTERIZACIÓN TAXONÓMICA
El patógeno presenta hifas verticiladas multiseptadas que se ramifican en varios
conidióforos. Los conidióforos dan lugar a las células conidiogénicas, fiálides. Estas son hialinas,
presentan una forma alargada y subulada (ligeramente afiladas, una base más gruesa y un ápice más
agudo). El ápice, de morfología truncada, da lugar a los conidios (uno o varios), es simple y no tiene
irregularidades (Figura10b, 10g, 10h). Las dimensiones medias de las fiálides en las cepas
estudiadas, considerando el 90% de datos registrados, son: 30,3 µm de largo con un rango entre 18,3-
44,3 µm; 5,6 µm de ancho de base oscilando entre 3,9-7,4 µm; y 2,8 µm de ancho de ápice oscilando
entre 1,6-4,0 µm. La Tabla 23 (Anexo) resume los datos registrados concernientes a las fiálides para
cada una de las cepas estudiadas.
Los conidios son hialinos, baciliformes (cilíndricos a cónicos), globosos a subglobosos,
algunos ligeramente curvos. Uno de los extremos es entre obtuso y redondeado, mientras que la base
a
c
b
d
e f
Figura 9. Micrografía óptica de C.
mycophilum. a, b, c) Microesclerocios. d, e,
f) Clamidosporas. Barras de escala: a= 500µm; b= 127µm; c= 30µm; d=
10µm; e, f= 20µm. Figure 9. Optical micrographs from C.
mycophilum. a, b, c) Microsclerotia. d, e, f)
Clamidospores. Scale bars: a= 500µm; b= 127µm; c=30 µm; d=10
µm; e, f=20 µm.
III. Identificación
52
presenta una cicatriz en forma de protuberancia correspondiente al punto de unión con la fiálide,
hilio basal conspicuo y truncado (Figura10c, 10d, 10e).
Los conidios presentan dos células predominantemente, separadas por una pared celular, el
septo. El 77% de los conidios evaluados en todos los aislados eran uniseptados. Todos los aislados
presentan mayoritariamente 1 septo en al menos el 50% de conidios evaluados. La cepa CM1
presenta el 100% de sus esporas monoseptadas. En la gran mayoría de aislados el rango de septos de
los conidios varía entre 0-3, siendo el porcentaje medio entre los evaluados del 7% en ausencia de
septos, 10% en biseptados y 6% en triseptados. Aunque la superficie de los conidios suele ser recta y
homogénea, en ocasiones pueden presentar ligeras constricciones en la zona del septo que se
Figura 10. Micrografías de C.
mycophilum. a) Masa de conidios
envolviendo un carpóforo. b) Micelio. c,
d) Conidios. e) Conidios entre hifas de
A. bisporus (*Prot: cicatriz de union a la
fiálide, hilum basal). f) Conidios
germinando cobre tejido de A. bisporus.
(1: conidios; 2: tubos germinativos). g,
h) Fiálides. Barras de escala: a= 1cm; b,c,g= 20µm; d,e,f=
10µm; h= 30µm.
Figure 10. Micrographs from C.
mycophilum. a) Conidia clouds
engulfing the infected carpophore. b)
Mycelium. c, d) Conidia. e) Conidia in
the mycosphere of A. bisporus (*Prot:
Scar of union to the phyalide, hilum
basal). f) Germinating conidia in the
mycosphere of A. bisporus. (1: conidia;
2: germinative tubes). g, h) Phialides. Scale bars: a= 1cm; b,c,g= 20µm; d,e,f=
10µm; h= 30µm.
III. Identificación
53
agudizan drásticamente al germinar (Figura10f). La longitud media de los conidios en los aislados
evaluados es de 19,5 µm, oscilando en un rango de 14,3-25,2 µm. La anchura media es 8,4 µm, en un
rango de 6.2-10.6 µm. Las Tablas 24 y 25 (Anexo), resumen los datos registrados relativos a los
conidios estudiados para cada aislado.
Las dimensiones y el número de células presentes en los conidios, así como el tamaño de las
fiálides y la regularidad de los ápices concuerdan con las descripciones aportadas por otros autores
para C. mycophilum (Grogan, 2005a; Back et al., 2010, 2012a; Gea et al., 2012).
El hecho de que las esporas puedan presentar 1, 2, 3 o 4 células, aunque mayoritariamente
sean monoseptadas, así como la ausencia del característico olor a alcanfor in vitro y una esporulación
abundante, están en consonancia con la descripción de C. mycophilum tipo II (Grogan, 2005a).
Al investigar la germinación de los conidios se ha constatado que la espora comienza a
germinar a las dos horas tras su aislamiento en PDA (Figura 11).
En primer lugar sufrió un estrechamiento en la zona del septo (―septa constricta‖), cada una
de las células aumentó su tamaño adquiriendo una morfología globosa redondeada, comenzando a
desarrollarse un tubo germinativo por el extremo opuesto al lugar de unión a la fiálide.
Posteriormente la espora generó sucesivos tubos germinativos, concretamente cuatro, el segundo a
las 3h, el tercero a las 7h y el cuarto a las 8h (Figura10f; Figura 11). La tasa media de crecimiento de
dichos tubos germinativos fue de 11,6 µm h-1
(Figura11).
1h 2h 3h
5h
4h
7h6h 8h
10h9h 12h11h
24h Figure 11. Micrograph sequence of
the germination of C. mycophilum on
PDA at room temperature. Conidium
captured every hour during the first 12
hours, and after 24h. Scale bars= 20 µm.
Figura 11. Secuencia micrográfica de
la germinación de un conidio de C.
mycophilum en PDA a temperatura
ambiente. Capturas cada hora durante
las primeras 12 h, y después de 24 h. Scale bars= 20 µm.
III. Identificación
54
A temperatura ambiente las esporas del aislado estudiado germinan rápidamente y los tubos
germinativos también muestran una elevada tasa de crecimiento. En consecuencia, los resultados
obtenidos indican que puede producirse un rápido desarrollo de la enfermedad en los cultivos a partir
de una espora aislada. Transcurridas 24 h tras la siembra la espora había desarrollado una densa red
de hifas verticiladas que constituyen un nuevo micelio (Figura 11).
3.3. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FILOGENÉTICA
La Tabla 7 recopila los números de acceso del GenBank, y la especie identificada tanto
taxonómica como molecularmente.
Tabla 7. Aislados de Cladobotryum spp. estudiados.
Identificación molecular y número de acceso al GenBank.
Table 7. Isolates of Cladobotryum spp. included in the study,
molecular identification and GenBank accession numbers.
Strain Taxonomic
identification Ac. numbers
Molecular
identification
CM1 C. mycophilum JQ004734 C. mycophilum CM2 C. mycophilum JQ004737 C. mycophilum CM3 C. mycophilum JQ004735 C. mycophilum CM4 C. mycophilum JQ004733 C. mycophilum CM5 C. mycophilum JQ004736 C. mycophilum CM6 C. mycophilum JQ004732 C. mycophilum CM7 C. mycophilum KP698960 C. mycophilum CM8 C. mycophilum KP698961 C. mycophilum CM9 C. mycophilum KP698962 C. mycophilum CM10 C. mycophilum KP698963 C. mycophilum CM11 C. mycophilum KP698964 C. mycophilum CM12 C. mycophilum KP698965 C. mycophilum CM13 C. mycophilum KP698966 C. mycophilum CM14 C. mycophilum KP698967 C. mycophilum CM15 C. mycophilum * * CM16 C. mycophilum KP698968 C. mycophilum CM17 C. mycophilum * * CM18 C. mycophilum KP698969 C. mycophilum CM19 C. mycophilum KP698970 C. mycophilum CM20 C. mycophilum KP698971 C. mycophilum CM21 C. mycophilum KP698972 C. mycophilum CM22 C. mycophilum * * CM23 C. mycophilum KP698973 C. mycophilum CM24 C. mycophilum * * CM25 C. mycophilum * *
*Data not available.
La extracción y secuenciación del material genético de los aislados de Cladobotryum obtuvo
buenos resultados en veinte de los evaluados en esta memoria. El estudio genético de las secuencias
confirma los resultados previamente obtenidos mediante las descripciones morfológicas. Tras la
secuenciación de los amplicones, el análisis Blast de las secuencias mediante búsquedas MegaBlast
arrojó la máxima similitud de bases (>97%; principalmente 99-100%) con varias de las secuencias
ITS de Cladobotryum mycophilum (teleomorph Hypomyces odoratus) registradas en el GenBank
(Anexo, Tabla 26). Algunos de las secuencias de C. mycophilum estrechamente relacionadas con los
III. Identificación
55
evaluados en esta memoria provienen de especímenes aislados en cultivos internacionales de
champiñón y setas comestibles: Y17095 y Y17096 (Mckay et al., 1999); AB527074 (Back et al.,
2010, 2012); JF693809 (Kim et al., 2012); JF505112 (Gea et al., 2011). Las secuencias obtenidas de
la región ITS de los aislados empleados en la investigación fueron depositadas en la base de datos
del GenBank (Tabla 7).
Figure 12. Árbol filogenético construido conjuntando los vecinos (―neighbor-joining method‖), comparando la
region ITS de las secuencias de veinte aislados de Cladobotryum con otras especies de Cladobotryum
depositadas en el GenBank. La secuencia de Sepedomium sp. se usó como referencia. La barra de
escala representa una distancia filogenética del 1%. *Grupo I: JQ004734 (CM1), JQ004735 (CM3), JQ004733 (CM4), JQ004736 (CM5), JQ004732 (CM6), KP698966
(CM13), KP698967 (CM14), KP698970 (CM19).
**Grupo II: JQ004737 (CM2), KP698960 (CM7), KP698961 (CM8), KP698962 (CM9), KP698963 (CM10), KP698964
(CM11), KP698965 (CM12), KP698968 (CM16), KP698969 (CM18), KP698971 (CM20), KP698972 (CM21),
KP698973 (CM23).
Figure 12. Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining method, comparing the ITS region
sequences of twenty Cladobotryum isolates with those of other Cladobotryum species from GenBank.
Sepedomium sp. was used as the outgroup. The scale bar represents a phylogenetic distance of 1%.
El análisis filogenético de las veinte secuencias obtenidas fue analizado en base a las
similitudes con otras secuencias de Cladobotryum registradas en el GenBank (Anexo, Tabla 26;
Figura 12). Los aislados empleados en el estudio se agrupan en dos clados definidos por la especie C.
mycophilum. Ocho de las regiones ITS de los aislados de C. mycophilum [Grupo 1: JQ004734
(CM1), JQ004732 (CM6), JQ004733 (CM4), JQ004735 (CM3), JQ004736 (CM5), KP698966
(CM13), KP698967 (CM14), KP698970 (CM19)] se agrupan junto a las secuencias del GenBank:
C. mycophilum Y17096
C. mycophilum Group I *
C. mycophilum JF505112
C. mycophilum Y17095
C. mycophilum JF693809
C. mycophilum AB527074
C. mycophilum Group II**
C. dendroides Y17090
C. dendroides Y17091
C. dendroides Y17092
C. varium AB591044
C. varium Y17088
C. varium Y17087
Sepedonium sp. HQ604857
*Group I
**Group II
III. Identificación
56
Y17095, Y17096 (Mckay et al., 1999) y JF505112 (Gea et al., 2011). De manera similar, doce de los
aislados de C. mycophilum [Grupo 2: JQ004737 (CM2); KP698960 (CM7); KP698961 (CM8);
KP698962 (CM9); KP698963 (CM10); KP698964 (CM11); KP698965 (CM12); KP698968
(CM16); KP698969 (CM18); KP698971 (CM20); KP698972 (CM21); KP698973 (CM23)] se
agrupan con las secuencias del GenBank: AB527074 (Back et al., 2010, 2012) y JF693809 (Kim et
al., 2012) (Figura 12).
4. DISCUSSION
On the basis of taxonomic and genetic analysis from the selected isolates, the causal agent
of cobweb disease in A. bisporus Spanish crops is Cladobotyum mycophilum (Oudem.) W. Gams &
Hoozem. The symptoms of cobweb disease observed are similar to those described by Fletcher and
Gaze (2008) and Back et al. (2010). Potočnick et al. (2008) also described similar symptoms for
cobweb disease in Serbian mushroom farms in 2003-2007, although the causal agent was identified
as C. dendroides.
C. mycophilum colonies growing in vitro generate a pigment that stains the medium with a
deep red colour, mainly secreted by those hyphae submerged in the medium (Back et al., 2012a;
Põldmaa, 2011). Cladobotryum isolates studied were morphologically identified as C. mycophilum
by the presence of a simple phialide tip, the absence of a short thin-walled rachis, which is a
characteristic of C. dendroides, and conidia 0- to 3-septate, with a predominance of 2-celled (77%)
(Gams and Hoozemans, 1970; Cole and Kendrick, 1971; Rogerson and Samuels, 1993; 1994;
Grogan, 2006). However, although morphologically similar to C. mycophilum, these isolates lack the
distinctive odour of C. mycophilum. Isolates lacking the camphour odour were classified as C.
mycophilum Type II by Grogan (2006). The correct classification of the causal agent of cobweb is of
great importance and may have serious implications for disease control since several studies have
shown most C. mycophilum Type II isolates to be benzimidazole-resistant (McKay et al., 1999;
Grogan and Gaze, 2000; Grogan, 2006).
BLAST analysis of the sequenced amplicons revealed highest similarity (99 and 100%) to
the ITS sequence of four Cladobotryum mycophilum (teleomorph Hypomyces odoratus).
Phylogenetic analyses of ITS1/4 amplicons confirmed the identification made with taxonomy. The
studied isolates clustered in two clades: one clade of eight C. mycophilum isolates (Group I)
clustered with the isolates Y17095 and Y17096 collected from A. bisporus in Great Britain and The
Netherlands (Mckay et al., 1999), and with the isolate JF505112 collected from Pleurotus eryngii in
Spain (Gea et al., 2011); the other clade comprised twelve C. mycophilum isolates (Group II)
clustered with the isolates AB527074 collected from A. bisporus (Back et al., 2010) and JF693809
collected from P. eryngii, both in Korea (Kim et al., 2012). Identification of the Spanish isolates as
C. mycophilum, together with the identification of the above mentioned isolates, underline the
worldwide distribution of this specie and firmly situate it, rather than C. dendroides, as the leading
causative agent of cobweb disease in A. bisporus and P. eryngii crops.
IV. PATOGENICIDAD de Cladobotryum
mycophilum sobre diferentes
mezclas de cobertura
IV. Patogenicidad
58
1. INTRODUCCIÓN
1.1. MICOPARASITISMO: INTERACCIÓN PATÓGENO/HOSPEDADOR
La interacción de un hongo parásito sobre otro hospedador, denominadada como
micoparasitismo, es reconocida por la comunidad científica desde el siglo XIX (Barnett, 1964). Sin
embargo el conocimiento acerca del mecanismo parasitario y los efectos del micoparásito en los
hongos hospedadores es escaso (Flegg et al., 1985). El parasitismo en general es una forma de
interacción entre organismos que implica relaciones nutricionales favorables para la existencia del
parásito (Barnett, 1963).
Los hifomicetos que causan interrupción en el desarrollo de los carpóforos de A. bisporus o
su podredumbre actúan como micoparásitos (Cladobotryum spp., Mycogone perniciosa,
Lecanicillium fungicola y Trichoderma spp. entre ellos). Se conocen dos tipos de hifomicetos
micoparásitos (Gray y Morgan-Jones, 1981):
a) Micoparásitos biotróficos: Generan unas hifas laterales especializadas que contactan con
el hospedador. No producen daños generalizados aunque algunas células del hospedador pueden
morir (Barnett y Lilly, 1958).
b) Micoparásitos necrotróficos: Normalmente causan la muerte del hospedador y extraen
los nutrientes. Pueden actuar como parásitos o saprófitos (Barnett, 1963).
Todos los hifomicetos que se han encontrado creciendo en setas causan un daño en los
tejidos del hospedador. Esto es debido a su habilidad para competir con las especies hospedadoras
por el sustrato, o bien a que una notable actividad antibiótica conduce a la ruptura de células del
hospedador (Rudakov, 1978).
El hongo Cladobotryum spp. es un micoparásito del champiñón cultivado (Lane et al.,
1991). Muy poco se conoce acerca del mecanismo de interacción patógeno/hospedador para los
hongos anamorfos del género Cladobotryum, sin embargo, el antagonismo de ciertos teleomorfos
pertenecientes al género Hypomyces ha sido estudiado. Diversos miembros del géreno Hypomyces
(algunos de ellos teleomorfos de Cladobotryum spp.) producen sustancias biológicas activas que
tienen una probada actividad antifúngica (Sidorova et al., 1977). Hypomyces aurantius (teleomorfo
de Cladobotryum varium) es un parásito necrotrófico que inhibe el crecimiento de distintos
basidiomicetos hospedadores. En ensayos in vitro se ha observado la vacuolización y explosión de
las hifas hospedadoras en zonas de interacción miceliar, el estrangulamiento de las hifas era
excepcional no registrándose penetración en las hifas del hospedador. H. aurantius produce una
toxina, más fungicida que fungistática, difusible y no específica que puede actuar a cierta distancia
del micelio diana. Esta sustancia parece dañar las membranas de las hifas del hospedador rápida e
irreversiblemente al alterar su permeabilidad (Kellock y Dix, 1984). La toxina podría ser la molécula
tetracíclica, aislada años después a partir de este mismo hongo, denominada ―hypomycetina‖, y que
posee contrastado carácter antifúngico (Breinholt, 1997).
Cladobotryum dendroides secreta galactosa oxidasa (Nobles y Madhosinsh, 1963). Una
enzima extracelular que cataliza la oxidación de alcoholes primarios a sus correspondientes
aldehídos, con la reducción acoplada de oxígeno a agua oxigenada. Esta enzima podría actuar en la
IV. Patogenicidad
59
degradación del tejido de los carpóforos afectados. Aunque el aislado investigado en el citado
estudio, identificado como C. dendroides, fue posteriormente reidentificado como una especie de
Fusarium. (Ögel et al., 1994).
Las especies micoparásitas pertenecientes al género Cladobotryum han sido referenciadas
como fuente de metabolitos bioactivos, puesto que este género produce una amplia variedad de
metabolitos secundarios de marcado carácter antibacteriano, antifúngico y represor de células
cancerígenas (Feng et al., 2003; Sakemi et al., 2002; Mitova et al., 2006). Es posible que algunos de
estos compuestos intervengan de alguna forma en el mecanismo parasitario ejercido sobre A.
bisporus.
Gray y Morgan-Jonnes (1981) observaron, tras enfrentar in vitro los micoparásitos
Cladobotryum varians, Cladobotryum verticillatum, Mycogone perniciosa y Lecanicillium fungicola
frente al micelio del hospedador, Agaricus bisporus, que los micoparásitos podían parasitar de forma
efectiva los carpóforos del hospedador pero no el micelio vegetativo. Definen el hecho como una
ventaja evolutiva porque la habilidad de parasitar sólo ciertos tejidos permite la supervivencia del
micelio hospedador en presencia del parásito, y de esta forma ambos, parásito y hospedador, pueden
sobrevivir.
A nivel molecular el conocimiento de los mecanismos que intervienen en la infección de A.
bisporus por micopatógenos es reducido. Aprovechando la reciente secuenciación del genoma de A.
bisporus, se están realizando investigaciones para clarificar el mecanismo de interacción parásita
hongo-hongo. Así ha podido observarse (al estudiar las lesiones producidas por el patógeno en los
sombreros, similares a las provocadas por Cladobotryum spp.) cómo ambos, patógeno y hospedador,
sufren modificaciones en la expresión de sus genes al producirse la infección por L. fungicola
(Bailey et al., 2013). Sin embargo existen muchas incógnitas e hipótesis que deben aclararse.
1.2. DESARROLLO Y SINTOMATOLOGÍA DE LA TELARAÑA
Inicialmente la infección se manifiesta como un fino micelio blanco grisáceo, semejante a
una tela de araña, que rápidamente se desarrolla. El micelio fino algodonoso se densifica y adquiere
una textura harinosa, parecido a un polvo blanco-grisáceo, debido a una abundante esporulación de
conidios secos. El foco inicial de enfermedad tiende a crecer sobre la cobertura, pudiendo atrapar
rápidamente primordios muertos, estípites postcosecha y cuerpos fructíferos; colonizando
radialmente una mayor superficie de cultivo. Los carpóforos infectados con el paso del tiempo se
tornan marrones grisáceos (o negros en algunos casos), y finalmente se pudren. El color blanco
grisáceo del micelio patógeno va adquiriendo tonalidades amarillentas y rosáceas en colonias de
cierta edad (Figura 13) (Desrumaux, 2005; Back et al., 2010).
Como ya se ha descrito con anterioridad, si las esporas transportadas por las corrientes de
aire de la instalación se depositan sobre la superficie de un champiñón en lugar de sobre la cobertura,
y germinan, producirán manchas de color marrón y borde mal definido en unos días (―cap spotting‖),
con la consecuente reducción de la calidad y valor de la cosecha. Se pueden observar además
manchas de color marrón claro o grisáceas y borde regular, provocadas por la decoloración del tejido
del hospedador debido a una infección vía micelio (Adie, 2000).
IV. Patogenicidad
60
1.3. COBERTURA
La capa de cobertura, cuyo cometido fundamental es facilitar la extracción del mayor
potencial productivo del compost, con la máxima calidad y en el menor tiempo posible, tiene
diversas funciones:
- Protege la superficie del compost de la desecación al reducir las pérdidas de humedad.
- Ejerce una protección del compost frente a la microbiota antagonista (Gillmann et al.,
1994).
- Proporciona un sustrato adecuado para el desarrollo de las bacterias estimuladoras,
identificadas como o relacionadas con Pseudomonas putida, las cuáles favorecen el
desarrollo del micelio y estimulan la fructificación (Rainey, 1991).
- Proporciona al micelio un ambiente aireado, facilitando el intercambio de gases a través
de su estructura porosa.
Esta funcionalidad exige unas propiedades físico-químicas y microbiológicas adecuadas
(Pardo, 1999):
- Debe tener un pH ligeramente alcalino.
- Es importante que se encuentre libre de plagas y enfermedades.
- Debe tener un bajo contenido en magnesio u otros elementos tóxicos para el desarrollo
del cultivo o su posterior consumo.
- Es indispensable que posea una buena capacidad para retener/liberar agua. Debe pues
soportar riegos frecuentes sin perder su estructura y porosidad.
- La estructura de la capa de cobertura, y en especial la porosidad, resultan determinantes
sobre la producción del cultivo (Pardo et al., 2002).
- La cobertura debe presentar un bajo aporte nutritivo y una concentración en sales
solubles reducida (baja conductividad eléctrica).
- Debe tener una elevada capacidad de intercambio catiónico (Rainey et al., 1987;
Kurtzman, 1996).
Figura 13. a) Fase inicial de la
infección. b) Masa de esporulación
engullendo un champiñón. c, d)
Carpóforos infectados sufriendo
podredumbre.
Figure 13. a) Initial phase of
infection. Fluffy-cottony mycelium
growing radially outwards. b) Mass
of sporulation engulfing fruit bodies.
c, d) Decaying carpophores.
IV. Patogenicidad
61
Existen diversos tipos de coberturas usadas en los cultivos de Castilla-La Mancha. Los
cultivos tradicionales suelen emplear mezclas elaboradas a base de suelos minerales con baja o nula
proporción de turbas, principalmente turbas rubias importadas tipo Sphagnum o turba negra de
origen nacional (Gea y Tello, 1997). Sin embargo, los cultivos más tecnificados, y cada vez más
algunos cultivos tradicionales, están usando coberturas a base de turbas negras con diferentes
aditivos como yeso y carbonato cálcico de azucarera fundamentalmente (Daniels y Eddy, 1990).
Estos aditivos incrementan el pH y también modifican las condiciones físicas de las mezclas de
cobertura. (Noble et al., 1999). El carbonato cálcico de azucarera es un subproducto de la industria
azucarera compuesto principalmente por CaCO3, tiene una textura arcillosa que confiere densidad a
la estructura de la mezcla de cobertura (Visscher, 1988). Noble et al. (1999) observaron, al analizar
distintas mezclas de cobertura a base de turba negra, que a un determinado potencial mátrico el
contenido en humedad era mayor en aquellas mezclas que contenían menor proporción de carbonato
cálcico de azucarera (fracción inorgánica). Los autores también estudiaron las curvas de liberación
de agua de estos materiales, y constataron que al aumentar el contenido en carbonato cálcico de
azucarera desciende el contenido en humedad aunque las curvas de liberación de agua se mantienen
uniformes. Las propiedades físico-químicas de las mezclas de cobertura tienen, por tanto, una
influencia decisiva en el comportamiento agronómico de los materiales. Pardo-Giménez et al. (2011)
consideran que la conductividad eléctrica de las coberturas puede ser uno de los factores
determinantes que condicione la productividad del cultivo.
Las características físico-químicas de los materiales de cobertura condicionan también el
desarrollo de la telaraña en los cultivos. En este sentido se manifiestan Lane et al. (1991), quienes
observaron que tanto el crecimiento miceliar como la tasa de germinación de las esporas de C.
dendroides disminuía al descender el potencial osmótico (más negativo) del sustrato de cultivo.
Concluyen también que un entorno con una humedad alta contribuirá definitivamente al desarrollo y
esporulación de C. dendroides. Al evaluar el tipo de material de cobertura empleado en cultivos de
A. bisporus como factor que influye en la expresión de la enfermedad de la telaraña, Dar y Seth
(1992) observaron una mayor incidencia de la enfermedad y descenso de rendimiento provocado por
la telaraña en los materiales que contenían mayor proporción de materia orgánica.
La cobertura tradicionalmente empleada en La Manchuela se fundamenta en la utilización
de suelo mineral de tierra caliza con textura franco-arcillo-arenosa como base, a la que se adicionan
materiales diversos para mejorar la estructura y la retención de agua. Los materiales correctores son
fundamentalmente turbas rubias tipo Sphagnum o turbas negras (Pardo et al., 1999). Las
características físicas del suelo mineral no son las óptimas para el cultivo del champiñón
(fundamentalmente por la escasa capacidad de retención de agua), y provoca problemas para
comercializar el sustrato postcultivo.
Los materiales de cobertura tipo turba empleados en España son mezclas comerciales de
origen nacional (IMCA, Torreblanca, Castellón) o importadas, con elevado porcentaje de turba en su
composición. Estas coberturas tienen una capacidad de retención de agua mucho mayor que las
tradicionales, y permiten que no sea necesario el riego mientras haya champiñón sobre la cobertura,
con lo que se evitan pardeamientos y se previenen posibles enfermedades como la mancha
bacteriana, que proliferan cuando la superficie de los carpóforos está húmeda. Sin embargo, la
elevada capacidad de retención de agua en estas coberturas podría a priori proporcionar un ambiente
adecuado y propenso al desarrollo de distintas patologías de origen fúngico como la telaraña.
IV. Patogenicidad
62
Así, aunque no existen muchas investigaciones acerca del comportamiento de la telaraña
atendiendo al material de cobertura, se ha demostrado que una inoculación artificial de la
enfermedad en la superficie de la cobertura resulta en un rápido desarrollo de la enfermedad (10-14
días después) (Staunton et al., 1999). La incidencia y severidad de la telaraña puede estar
condicionada por el momento de aparición de la enfermedad, así como por la textura y las
condiciones nutritivas y físico-químicas del material empleado como cobertura (Dar y Seth, 1992a).
Hay que tener en cuenta que la turba es relativamente estéril en los pantanos donde se
extrae, excepto la franja externa. Por tanto, si existe contaminación será posterior a su recolección.
La misma situación ocurre con los aditivos empleados en los materiales de cobertura, los lodos
carbonatados de azucarera se someten a altas temperaturas, y la fracción mineral no parece implicada
en la contaminación (Staunton y Dunne, 2001). Es crucial un adecuado almacenaje en un lugar lo
más aséptico posible para evitar contaminaciones. En ocasiones, también se recomienda realizar una
desinfección de la cobertura previamente a su aplicación mediante el uso de desinfectantes sintéticos
o vapor de agua. La colonización de la cobertura por organismos patógenos o competidores del
champiñón se puede retrasar aplicando un tratamiento de vapor a 60ºC durante 30 minutos (Moore,
1972).
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Se han realizado dos ensayos de patogenicidad siguiendo las prácticas habituales utilizadas
en los cultivos comerciales de champiñón de Castilla-La Mancha (Gea et al., 2010). Para los ensayos
se ha utilizado un diseño de bloques al azar en estantes a tres alturas, con una distancia entre alturas
de aproximadamente 60 cm, elevándose la primera altura unos 20 cm sobre el suelo. Se ha utilizado
compost incubado fase III, sembrado con una densidad de inóculo del 1% (variedad Gurelan 45,
Gurelan S. Coop., Huarte, Pamplona, España) (Tabla 8).
Tabla 8. Caracterización físico-química del
sustrato empleado en los ensayos (al finalizar la
fase III).
Table 8. Physic and chemical characterization
of the compost employed inthe trials (at the end
of Phase III). Parameter Trial A Trial B
pH (1:5, v/v) 6.27 6.76
Moisture (g kg-1) 622 598
Total nitrogen (g kg-1) 26.4 27.0
Ash (g kg-1) 256 272
Fiber, g kg-1 273 273
Fat, g kg-1 3.1 3.3
Cellulose, g kg-1 211 194
Hemicellulose (g kg-1) 79 113
Lignin (g kg-1) 186 194
IV. Patogenicidad
63
Los ciclos de cultivo se llevaron a cabo en cámaras de cultivo experimental de 20 m3
ubicadas en el Centro de Investigación, Experimentación y Servicios del Champiñón (CIES,
Quintanar del Rey, Cuenca), equipadas con un sistema de humidificación, de
calefacción/refrigeración, y de recirculación interna de aire y ventilación externa. En cada uno de los
ensayos se emplearon dos cámaras de cultivo gemelas, una de las cuales se utilizó como testigo,
mientras que la otra fue inoculada artificialmente con el patógeno (Cabina 2).
El cultivo se realizó en bloques o cajas que se rellenaron con 10 kg de compost, presentando
una superficie de cultivo de 0,15 m2. Los bloques se cubrieron con una capa de cobertura de
aproximadamente 30 mm de espesor (5,5 litros por bloque). Se emplearon tres coberturas tipo turba
(Euroveen B.V., BVB Substrates, Grubbenvorst, Limburg, Holanda; Tmix, una mezcla de varias
coberturas comerciales; Infertosa S.A., Torreblanca, Castellón, España) y una cobertura mineral, de
las que habitualmente se emplean en la comarca de La Manchuela (suelo mineral+turba rubia tipo
Sphagnum 4:1 v/v) (Tabla 9). Las prácticas culturales empleadas fueron las propias de un ciclo de
cultivo con cobertura tipo turba.
Tabla 9. Caracterización físico-química de las mezclas de cobertura empleadas en los ensayos.
Table 9. Physic and chemical characterization of the casing materials used in the trials.
Parameter Euroveen Tmix Infertosa Mineral
A B
A B
A B
A B
Moisture (g kg-1) 771 822
790 827
804 827
181 258
pH (1:5, v/v) 7.9 7.8
8.0 8.0
8.2 8.2
8.2 8.2
EC (1:5, w/v, µS cm-1) 795 1677
2600 7720
3380 9950
685 2130
Bulk density (dry) (g cm-3) 0.12 0.15
0.12 0.11
0.11 0.13
0.84 0.7
Water-holding capacity (kg 100
kg-1)
504 513
583 540
493 594
56 60
Porosity (%) 93.1 91.7
93.5 94.0
94.1 93.2
* 72
Total nitrogen (g kg-1) 9.1 8.1
10.7 11.4
12.2 12.0
* 1.6
Ash (g kg-1) 268 349 397 373 402 460 * 918
*Data not shown.
Las cámaras de cultivo disponen de puertas herméticas, y únicamente entra en ellas el
personal autorizado que desarrolla el ensayo para prevenir una posible contaminación externa. En el
día 0 del ciclo de cultivo se aplicó la cobertura, con un grado alto de humedad en el caso de las
turbas, manteniendo condiciones de incubación, 26ºC de temperatura en el compost, con una
humedad relativa (HR) del 85-90% y concentración de CO2>2000 µg mL-1
(sin ventilación). Nueve
días después se ventilaron las naves de cultivo con aire fresco filtrado para inducir la fructificación, a
través de una reducción gradual en 3 días de temperatura y humedad hasta 17,5-18ºC y 85-90% de
HR, parámetros que se mantuvieron hasta el final del ciclo de cultivo. Nueve días después de cubrir
se inoculó una de las cabinas (Cabina 2) con C. mycophilum, aplicando 20 mL por bloque de una
suspensión conidial (7.5×103 spores mL
-1). La suspensión conidial se preparó el día de la
inoculación, y consiste en realizar una suspensión madre a partir de un cultivo de C. mycophilum en
PDA con cinco días de edad, lavado con agua destilada estéril y filtrado con filtro de red de
polipropileno [25 µm de diámetro de poro, Millipore® (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)] para
retirar cualquier fragmento de micelio de la suspensión. La concentración conidial de la disolución
madre se determinó empleando un hemocitómetro y posteriormente se ajustó la suspensión a la
concentración requerida adicionando agua destilada estéril. En el ensayo A, se inocularon 8 bloques
IV. Patogenicidad
64
por tipo de cobertura con una concentración de 106 conidios m
-2 (24 bloques, Cabina 2). Mientras
que en el ensayo B, fueron inoculados 12 bloques por tipo de cobertura con 106 conidios m
-2 (36
bloques, Cabina 2). En ambos ensayos, 36 bloques experimentales se dispusieron en la cabina 1, los
cuales fueron rociados con 20 mL de agua destilada estéril y usados como control. Las estructuras
metálicas donde se emplazaron los distintos bloques se cubrieron con plásticos para evitar que las
corrientes de aire afectaran la superficie de los bloques, y prevenir así la dispersión de los conidios,
responsables de posibles focos de contaminación cruzada (Figura 14).
A lo largo del periodo de cosecha (tres floradas) se anotó, diariamente y de manera
independiente para cada bloque, el peso y número de champiñones recolectados. Así mismo, también
se realizó un examen exhaustivo de la superficie de cobertura, anotando el día en que se detectó la
enfermedad, la superficie afectada y número de champiñones afectados en cada uno de los bloques.
Una vez detectada una mancha de telaraña, se valoraba la evolución de la superficie afectada durante
24 h, y a continuación se tapaba con un trozo de papel húmedo y se aplicaba sal sobre ella (Fletcher
y Gaze, 2008), toda la superficie afectada se cubrió de sal para evitar que sirviera de inóculo
secundario en la propagación de la enfermedad.
Se ha valorado la producción cosechada en el cultivo (kg m-2
), y la eficiencia biológica del
sustrato (EB) empleado (kg de champiñón recolectados por cada 100 kg en peso seco de compost
empleado: kg dt-1
), comparando los datos de la cabina 1 (control) con los de la cabina 2 (inoculada).
Para calcular la EB se determinó la humedad de cada uno de los sustratos de cultivo empleados en
los ensayos, desecando una muestra de sustrato fresco en estufa a 60ºC.
Figura 14. Diseño experimental en las
salas de cultivo. a, b) Bloques cubiertos
sobre estructura metálica. c) Bloques
cubiertos con cobertura tipo turba.. d)
Bloques cubiertos con cobertura mineral.
Figure 14. Design of trials in the
experimental mushroom units. a, b) Cased
blocks over the metal shelf structure. c)
Blocks cased with peat based materials. d)
Blocks cased with mineral casing.
IV. Patogenicidad
65
El impacto de la telaraña en los cultivos también ha sido evaluado en base a las manchas
de enfermedad detectadas sobre la cobertura o los carpóforos afectados. La superficie de cultivo fue
examinada diariamente durante los ensayos buscando sintomatología asociada a brotes de
enfermedad aislados. Al localizarse un brote se ha medido la superficie afectada por la enfermedad
en el momento de su detección y a las 24 horas (antes de cubrir la mancha). Después, fueron tratados
cubriendo el área afectada y los champiñones infectados con un papel húmedo para prevenir la
liberación de conidios antes de aplicar sal sobre las manchas (Grogan, 2006). Los bloques afectados,
la precocidad de la infección y la superficie de cultivo colonizada por el patógeno a lo largo del ciclo
de cultivo han sido analizados.
Las producciones obtenidas se evaluaron mediante el paquete informático Statgraphics–
Centurion XVI (Statpoint, Herdon, Virginia, USA). Los datos se han expresado como las
medias±EMMs (errores estándar de medida). Las producciones de los distintos bloques se han
comparado mediante ANOVA de acuerdo a la prueba LSD de Fisher, se ha calculado el estadístico
F-test con un nivel de confianza del 95% (P<0,05).
3. RESULTADOS
En los dos ensayos realizados no se ha registrado infección en las cabinas control. Se ha
constatado una mayor patogenicidad en aquellos bloques que emplean coberturas tipo turba. En
ambos ensayos la superficie afectada por la enfermedad aumenta conforme avanza el ciclo de cultivo
(Anexo, Gráfico 23). Todos los bloques de la cabina inoculada artificialmente registraron menor
producción que los bloques de la cabina control, independientemente del material de cobertura
empleado (excepto Infertosa en el ensayo B). La producción registrada fue mayor en el A que en el B
en todas las coberturas empleadas (Anexo, Tabla 27), tanto en la cabina 1 (control) [en el ensayo A
(25,8-37,4 kg m-2
) y el ensayo B (24,6-33,1 kg m-2
)] como en la cabina 2 (inoculada) [en el ensayo A
(12,2-26,2 kg m-2
) y el ensayo B (7,8-24,5 kg m-2
)]. Esta diferencia de rendimiento en los dos
ensayos puede ser parcialmente explicada por las características físico-químicas de los materiales
usados en cada uno de los ensayos (Table 8). La conductividad eléctrica (EC) analizada en el
material de cobertura fue sensiblemente superior en el ensayo B, que resultó el menos productivo.
Tanto Euroveen como Infertosa presentaron también un mayor contenido en cenizas en el ensayo B
que en el A, un 30% en el caso de Euroveen y un 14% en Infertosa. Un mayor contenido en cenizas
indica mayor proporción de la fracción inorgánica (yeso y carbonato cálcico de azucarera
fundamentalmente) en la composición de las coberturas y menor capacidad de retención de agua, por
lo que este factor podría también haber condicionado de forma negativa la productividad de los
bloques cubiertos con las citadas coberturas.
Aunque las condiciones ambientales proporcionadas durante el ciclo de cultivo fueron las
mismas durante los dos ensayos, es importante subrayar que en el ensayo A las temperaturas
registradas en el compost durante la fase de inducción y a lo largo de la primera florada fluctuaron
entre 21 y 16ºC, mientras que en el ensayo B fueron de 3 a 4ºC superiores, lo que se tradujo en un
menor periodo de incubación del micelio y una primera florada más temprana.
IV. Patogenicidad
66
Al igual que la producción, tanto la EC como el contenido en ceniza de las coberturas
empleadas y la distinta temperatura registrada en los sustratos durante los ciclos de cultivo podrían
también haber condicionado la expresión de la enfermedad.
La Tabla 10 recopila el número de bloques afectados al final del ciclo de cultivo, la
precocidad de la infección (días tras aplicar la cobertura en que se detecta el primer síntoma de
enfermedad) y la superficie colonizada al final del ciclo de cultivo para cada uno de los ensayos
realizados.
Tabla 10. Bloques infectados al final del ciclo de cultivo, precocidad de la infección en días tras la
aplicación de la cobertura.
Table 10. Infected blocks at the end of the crop cycle, infection earliness in days after
casing and final percentage of crop surface colonized by the disease.
Casing *Infected blocks No (%)
$Earliness (days) Colonized surface (%)
Trial A Trial B
Trial A Trial B
Trial A Trial B
Euroveen 5 (62.5%) 11 (91.7%)
35 21 30 13
Tmix 7 (87.5%) 5 (41.7%)
34 27 32.5 2
Infertosa 6 (75%) 4 (33.3%)
30 31 36 3
Mineral 3 (37.5%) 0 (0%) 29 - 10 -
*Number of blocks inoculated per casing material (Total: Trial A: 8; Trial B: 12). $Earliness: Days after
casing when the first symptoms of disease were detected.
El importante descenso de producción experimentado en los cultivos de cobertura mineral,
no es atribuible al empleo de esta cobertura. Durante el ciclo de cultivo se aplicaron tratamientos
culturales indicados para cultivos tipo turba, lo que ha repercutido negativamente en la producción
registrada en los bloques con cobertura mineral. Estas prácticas culturales también han repercutido
negativamente en la expresión de la telaraña en los bloques con cobertura mineral, limitando su
incidencia. En consecuencia, los resultados obtenidos en los bloques con cobertura mineral se
recogen en la presente memoria, pero no han sido utilizados a efectos de discusión de la incidencia
de la telaraña. Atendiendo únicamente a los bloques con turba, los bloques cubiertos con la mezcla
Euroveen obtuvieron la mayor producción en ambos ensayos, mientras que los cubiertos con
Infertosa resultaron ser los menos productivos (Gráfico 16).
1) En el ensayo A, se observaron diferencias significativas en el rendimiento total de
champiñones cosechados entre la cabina control y la inoculada (R1 y R2 respectivamente) en
aquellos bloques cubiertos con Euroveen (F1/18=15,64; P=0,0009) y en los cubiertos con Tmix
(F1/18=9,7; P=0,006). Los descensos de producción que pueden ser atribuidos a la enfermedad de la
telaraña alcanzaron el 11,5% en Euroveen y el 12,9% en Tmix. En la tercera florada se registraron
las mayores caídas de producción, que resultaron estadísticamente significativas en aquellos bloques
cubiertos con Euroveen (F1/18=29,39; P=0,00) y Tmix (F1/18=14,52; P=0,0013). En el caso de los
cubiertos con Infertosa, aunque la producción fue lifgeramente inferior en la cabina infectada, no se
registraron diferencias estadísticamente significativas en la producción final (F1/18=0,84; P=0,3712)
(Gráfico 16a; Anexo, Tabla 27).
En este primer ensayo, la enfermedad de la telaraña fue detectada en los bloques de la
cabina inoculada en primera flor (día 29 tras la cobertura): un bloque de cobertura mineral infectado.
También en primera flor se manifestó en uno de los bloques de Infertosa, el día 30. Mientras que en
IV. Patogenicidad
67
aquellos bloques cubiertos con Tmix y Euroveen, la telaraña se detectó respectivamente los días 34 y
35 (2ª florada) (Tabla 10).
La superficie de cultivo colonizada por el patógeno aumentó a lo largo del ciclo de cultivo.
Al final del ciclo de cultivo, la enfermedad había colonizado el 36% de la superficie de cultivo
cubierta con Infertosa (con 6 de los bloques infectados), el 33% de la cubierta con Tmix (7 bloques
afectados) y el 30% de la de Euroveen (5 bloques afectados). Hay que destacar que la incidencia en
los bloques de cobertura mineral fue significativamente inferior, colonizándose sólo el 10% de la
superficie (con 3 bloques infectados) (Gráfico 17a).
2) En el ensayo B también se observaron diferencias significativas entre la cabina control y
la inoculada (R1 y R2 respectivamente) en el rendimiento total de champiñones cosechados, entre los
bloques cubiertos con Euroveen (F1/23=4,46; P=0,0462) y Tmix (F1/23=4,81; P=0,0391). Los
descensos de producción que pueden ser atribuidos a la enfermedad de la telaraña alcanzaron el 6,9%
en Euroveen y el 6,1% en Tmix. En la tercera florada se registraron las mayores caídas de
producción, que resultaron estadísticamente significativas en aquellos bloques cubiertos con
Euroveen (F1/18=29,39; P=0,0000) y Tmix (F1/18=14,52; P=0,0013). En el caso de los cubiertos con
Infertosa, no se registraron diferencias estadísticamente significativas comparando la producción de
ambas cabinas (F1/23=0,68; P=0,4177) (Anexo, Tabla 27).
0
10
20
30
40
R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
Euroveen Tmix Infertosa Mineral
Mu
shro
om
yie
ld (
kg
m-2
)
F3
F2
F1
aAaB
AabbB
c
0
10
20
30
40
R1 R2 R1 R2 R1 R2 R1 R2
Euroveen Tmix Infertosa Mineral
Mu
shro
om
yie
ld (
kg
m-2
)
F3
F2
F1
b
AaAb
c
BB
d
Gráfico 16. Rendimiento del cultivo (kg
m-2). a) Ensayo A. b) Ensayo B.
R1: Cabina control. R2: Cabina inoculada. F1:
primera flor; F2: segunda flor; F3: tercera flor.
Las letras diferentes sobre las barras,
minúsculas entre materials de cobertura
y mayúculas entre cabinas, indicant
diferencias significativas de acuerdo con
el test LSD de Fisher. Graph 16. Mushroom yield (kg m
-2) in
trials. a) Trial A. b) Trial B. R1: Control room. R2: Inoculated room. F1: first
flush; F2: second flush; F3: third flush.
Different letters over the bars,
lowercase between casing materials and
upper case between rooms, show
significant differences by Fisher´s LSD.
IV. Patogenicidad
68
En este segundo ensayo, la enfermedad de la telaraña fue detectada en los bloques de la
cabina inoculada antes de la primera flor (día 21 tras la cobertura): un bloque de cobertura Euroveen
infectado. En la segunda flor del ciclo la enfermedad apareció el día 27 en Tmix (un bloque afectado)
y el día 31 en Infertosa (dos bloques afectados) (Tabla 10). Al final del ciclo de cultivo, los bloques
cultivados con cobertura mineral permanecían sanos, no habiéndose registrado ningún síntoma de
infección, en cuanto a las coberturas tipo turba la infección se manifestó en todas ellas, aumentando
la superficie colonizada y el número de bloques afectados.
La superficie de cultivo colonizada al final del ciclo supuso el 13% de la disponible en
Euroveen (con 7 bloques afectados), 2% en Tmix (1 bloque afectado) y 3% en Infertosa (3 bloques
afectados (Gráfico 17b). El descenso de rendimiento registrado en los bloques de cobertura mineral
respecto al control, correspondiente al 14% de la EB, no es atribuíble a la superficie afectada puesto
que esta cobertura no registró infección. El descenso de producción observado en la cobertura
mineral es resultado de la aplicación de prácticas de cultivo que favorecían a las coberturas tipo
turba, como ya ha quedado expuesto anteriormente. Los datos de incidencia de la telaraña en este
segundo ensayo resultaron claramente inferiores a los obtenidos en el ensayo A, sin embargo la
tendencia a incrementarse a lo largo del ciclo de cultivo se mantiene.
0
10
20
30
40
50
Euroveen Tmix Infertosa Mineral
Su
rface
colo
niz
ed b
y c
ob
web
(%
)
F1
F2
F3
0
10
20
30
40
50
Euroveen Tmix Infertosa
Su
rface
colo
niz
ed b
y c
ob
web
(%
)
F1
F2
F3
b
a
Gráfico 17. Superficie de cultivo
colonizada por la telaraña. a) Ensayo A. b)
Ensayo B. F1: primera flor; F2: segunda flor; F3: tercera flor.
Graph 17. Crop surface colonized by
cobweb along the crop cycles. a) Trial A.
b) Trial B. F1: end of the first flush; F2: end of second flush; F3:
end of third flush.
IV. Patogenicidad
69
Comparando la producción total de cultivo y la eficiencia biológica del sustrato de los
cultivos infectados en los ensayos A y B, no es posible interrelacionar la presencia e incidencia de la
enfermedad en las distintas coberturas junto con un descenso proporcional de la producción. En
ambos ensayos la producción y EB registrada en Euroveen ha sido mayor, independientemente de
que en el primer ensayo fuese la cobertura tipo turba menos afectada por la telaraña y que en el
segundo fuese la más afectada. Los resultados parecen indicar que las propiedades físico-químicas de
cada una de las coberturas influyen de una forma más notable en la producción que el impacto de la
enfermedad.
4. DISCUSSION
Those blocks where peat casing materials were used suffered higher infection than those
ones mineral cased. It is important to remark that cultural practices employed during the crop cycle
were those proper of peat cased crops. As a result, mineral cased blocks got yield reduction not
directly attributable to the disease but to the wrong hydric balance of the casing material. Together
with the production, an inadequate management of the crop in these blocks could have conditioned
the disease occurrence. However, it is remarkable that the water holding capacity (WHC) of those
peat based materials used was ten times higher than the WHC measured for the mineral casing
(Table 8). Both growth and sporulation of Cladobotryum spp. are favored under conditions of high
RH (Lane et al., 1991; Fletcher and Gaze, 2008; Desrumaux, 2005), logically provided by these peat-
based materials. So, cobweb incidence registered in the blocks cased with peat based materials is in
agreement with the largestWHC values of these kind of casings comparing to the lowest WHC
values measured for the mineral ones.
Figura 15. Sintomatología asociada a la telaraña observada en los ensayos. a) Micelio fino
algodonoso sobre cobertura tipo turba y champiñones. b) Densa masa de esporas sobre la
cobertura mineral y un cuerpo fructífero.
Figure 15. Symptoms of cobweb disease observed in the trials. a) Fluffy mycelium over peat
casing and fruit bodies. b) Dense mass of conidia over mineral casing and fruit body.
The symptoms of cobweb disease observed during the trials only included the appearance of
a fluffy white mycelium over the casing layer or carpophores, and no spotted mushrooms (brown
spots with ill-defined edge) were observed in either of the two trials (Figure 15). This result could be
achieved due to the tissue-salting technique applied over the punctual outbreaks to prevent spore
IV. Patogenicidad
70
dispersal within the room, which is normally the cause of cap spotting (Figure 3 (Adie et al., 2006;
Grogan, 2006; Fletcher & Gaze, 2008). The punctual outbreaks of disease grew radially outwards
and, as a result, unless properly controlled, they can colonize bigger area of crop surface and the
surrounding carpophores. Since the evolution of the cobweb patches detected over the casing layer
and carpophores were analyzed for 24h after detection (some of them had already sporulated when
treated), it is not possible to ensure that there is not cross contamination among the blocks from the
inoculated room.
Several aspects have been considered to limit the dispersion of the pathogenic conidia:
a) The metallic structures, where the blocks were disposed, have been covered with plastic
foil to restrict the air currents over the mushroom beds.
b) The absence of spotting in mushroom caps indicates a low density of pathogenic conidia
in the air (the main vector for the dispersion of the disease and cross contamination).
c) Although the evolution of disease patches was studied for 24h, they were subsequently
treated according to the literature to prevent conidial dispersion (by covering them with damp paper
and salt) (Figure 16).
The results obtained in the two cropping trials indicate that cobweb successfully established
in the four types of casing materials used in the inoculated rooms when a conidial suspension of C.
mycophilum was spread over the casing, once the mycelium has reached the surface. None symptoms
of disease were detected in the control rooms. Only those blocks mineral cased in the second trial
remained symptomless. The experimental design showed that both compost and casing materials
employed were free of disease previously to the artificial inoculation (control blocks did not show
cobweb disease), so the disease achieved was a result of the inoculum artificially applied.
Figura 16. Brotes puntuales de telaraña
tratados mediante un papel húmedo y sal.
a) Ensayo al final del ciclo. b) Bloques
cubiertos con turba. c) Bloques cubiertos
con cobertura mineral.
Figure 16. Outbreaks of cobweb
disease treated by damp paper and salt. a)
Trial at the end of the crop cycle. b) Blocks
cased with peat based materials. c) Blocks
cased with mineral casing.
IV. Patogenicidad
71
Both number of outbreaks and crop surface colonized substantially increased along the crop
cycle in both trials. Since the punctual outbreaks were conveniently treated, the earliness of disease
in the different types of casing materials should not be related to its incidence. However, it is
remarkable that in trial B, when Euroveen cased blocks showed significant disease earliness, 92% of
these inoculated blocks showed infection.
In the two trials, the blocks cased with peat based materials provided the highest mushroom
production, while blocks cased with mineral one were the least productive. As cited above the large
productivity differences can be attributed to the management applied in the mineral one. Among the
peat based materials, Euroveen was the most productive; while Infertosa was the least productive.
This difference in mushroom yield may be partially explained by the different physic and chemical
characteristics of the peat casing materials used in the trials. According to Pardo et al. (2011), the
very high electrical conductivity (EC) values of the casing materials used in the trial B could have
condition mushroom productivity.
As regards to the disease incidence, the crop area colonized by cobweb was higher in trial A
than in trial B, even though the same inoculation rates and hygiene measures applied were identical.
It is possible to conclude that the inoculum pressure applied was not directly correlated with the
disease expression. For each casing material used, the EC reached in trial B might have also
contributed to condition the disease occurrence and development. These findings are consistent with
that expressed by Lane et al. (1991) in respect to the reduction of germination rate and mycelium
development under conditions of high salinity pressure.
Disease colonization of crop surface was sensitively lower in the second trial in Euroveen
and Infertosa, where higher ash contents were detected in both materials. On the contrary, although
the ash content of Tmix in trial B was a 10% lower, the disease also showed lower incidence in this
second trial. So the ash content in relation to the organic matter content of casing materials was not
directly related with the disease expression at all the peat based casing materials employed. This is in
contrast with Dar y Seth (1992) who reported greater disease incidence when using casing materials
of higher organic matter content.
Anyway, physic and chemical characteristics of the casing materials cannot be understood
as a general rule for the disease expression and incidence since certain other factors could have
conditioned the trials. Inasmuch as higher temperatures conduct to increase the evaporation rate in
the casing layer, the disease expression in the second trial might be also conditioned by the highest
temperatures registered in the compost along this trial. The higher evaporation rate could conduct to
water deficit in the casing layer and to hinder the conidia germination and the mycelium growth.
V. CONTROL QUÍMICO DE LA TELARAÑA
DEL CHAMPIÑÓN
V. Control químico
73
1. INTRODUCCIÓN
La aplicación de estrictas medidas de higiene y el control químico son las dos estrategias
más importantes a utilizar por el cultivador para combatir la telaraña. Si bien es difícil cuantificar el
orden de importancia entre ambas, debemos reseñar que el uso de fungicidas autorizados es cada día
más reducido, con lo cual la prevención de la enfermedad implementada a través de la higiene puede
limitar su demanda y optimizar su efectividad. Ambas medidas se deberán complementar para lograr
la eficiencia, integrando una higiene rigurosa junto con el uso adecuado de fungicidas (Grogan,
2008).
1.1. PREVENCIÓN Y CONTROL DE LA TELARAÑA
La infección por telaraña suele ocurrir predominantemente en floradas tardías, pero si
aparece en las primeras floradas y no se controla adecuadamente puede convertirse rápidamente en
un serio problema (Lane et al., 1991). La principal medida para evitar la aparición de la telaraña y
limitar su impacto es la prevención. Los métodos de control deben tener como objetivo evitar la
dispersión de los conidios que son el medio transmisor de la enfermedad (Grogan, 2005b). Una
respuesta rápida tan pronto como se detecta la enfermedad es la mejor manera de combatirla y
controlarla (Grogan, 2005a).
La mejora específica de la higiene en los cultivos antes del desarrollo de la enfermedad
puede minimizar los riesgos. Así, por ejemplo, se debe evitar dejar cuerpos fructíferos en
descomposición en la superficie de los cultivos; procurar eliminar los estípites que quedan tras la
recolección; barrer y limpiar las naves con frecuencia (procurando que el suelo esté húmedo para
evitar partículas en suspensión); evitar dejar fuentes de contaminación cerca de los cultivos
(champiñones desechados, moles, etc.) eliminando los residuos tan pronto como sea posible;
desinfectar maquinaria, equipos, etc.; asegurar que los empleados usen ropas limpias; tratamientos
con vapor del sustrato post-cultivo; uso de cancelas que delimiten el exterior y los cultivos; también
es recomendable desinfectar las botas antes de entrar a las salas de cultivo y usar filtros de aire para
evitar la dispersión de plagas y enfermedades (Gaze, 1997; Adie, 2000; Fletcher, 2002; Grogan,
2005b; Potočnik et al., 2007; Grogan, 2008).
Se han evaluado distintos parámetros culturales para controlar la enfermedad atendiendo al
nivel de esporulación y crecimiento registrado por Cladobotryum al variar el potencial hídrico, pH,
temperatura y HR. Lane et al. (1991) concluyen que el patógeno experimenta mayor crecimiento y
esporulación cuando el potencial hídrico en el interior de la hifas es menor que el del entorno.
Jandaik et al. (2004b) observaron que C. dendroides crecía y esporulaba mejor a pH= 6, temperatura
entre 20-25ºC y 95% HR. Es posible prevenir la aparición del patógeno controlando la temperatura y
la humedad relativa de los cultivos. De acuerdo con Desrumaux (2005), muy pocas esporas de C.
dendroides pueden germinar con HR inferior al 85%, por lo tanto, mantener una HR durante el
cultivo ligeramente inferior (-1% o -2%) respecto a los niveles normales puede ser una herramienta
importante para prevenir la dispersión de la enfermedad. Al proporcionar condiciones de bajas
temperaturas en el cultivo, 17ºC en lugar de 18ºC, es posible también limitar la germinación de las
esporas y el desarrollo de la enfermedad (Desrumaux, 2005).
V. Control químico
74
Una vez que la infección se ha producido se debe actuar para controlar el patógeno y evitar
que se disperse en nuestros cultivos:
- Evitar el riego sobre las colonias de telaraña (Grogan, 2008).
- Cubrir con sal las colonias, ya que se elimina el patógeno impidiendo su desarrollo y
crecimiento (Back et al., 2010; Fletcher, 2002). La aplicación de sal sólo es efectiva
cuando se aplica previamente un papel húmedo sobre la mancha (Adie, 2000). El papel
húmedo evita que se liberen esporas al aire, después se aplica la sal comenzando por
sellar los bordes del papel para evitar posibles liberaciones de conidios, a continuación
se cubre con sal el resto de la superficie afectada. Es recomendable cubrir un área de 2-3
cm mayor que el borde de la mancha detectada, así como romper la conexión entre el
compost y los carpóforos afectados antes de cubrirlos, para evitar que sigan creciendo.
Sin embargo esta medida, históricamente recomendada como método de control, puede
tener contraindicaciones de salud alimentaria al aplicarse sal a los cultivos, por lo que
actualmente se recomienda cubrir la mancha con un papel o paño grueso y húmedo para
evitar la dispersión de los conidios y evitar la aplicación de sal (Pyck y Grogan, 2015).
- Apagar los ventiladores de la nave de cultivo, ya que se limitará la dispersión de las
esporas en caso de infección importante (Grogan, 2008).
- Filtrar todo el aire que penetra en la nave de cultivo (un filtro de 5 µm es suficiente para
este patógeno). Debería considerarse también filtrar el aire que sale al exterior para
limitar el número de esporas patógenas en el entorno de la explotación (Fletcher, 2002).
Estos métodos de control y prevención pueden complementarse también con un control
químico de la enfermedad a través del uso de fungicidas comerciales autorizados. Diversos
fungicidas, con numerosos modos de acción, han sido empleados para controlar la telaraña. Un buen
número de investigadores han publicado ensayos de toxicidad de fungicidas sobre Cladobotryum
spp.
1.2. CONTROL QUÍMICO
1.2.1. Fungicidas empleados contra la telaraña
Distintos agentes fungicidas han sido históricamente empleados para combatir la telaraña en
cultivos comerciales. A continuación se enumeran los recopilados por la bibliografía.
El pentacloronitrobenceno es el primer compuesto citado en la literatura como agente de
control de la enfermedad. Fue aplicado como polvo al 20% sobre la cobertura en una explotación de
Yorkshire (Inglaterra) con problemas de telaraña. Los bloques tratados no presentaron síntomas de
infección mientras que aquellos no tratados manifestaron la patología (Cleary, 1958).
La enfermedad de la telaraña ha sido controlada históricamente de forma efectiva por
fungicidas del grupo de los metil-bencimidazol-carbamatos. De este grupo de fungicidas se han
empleado benomilo, carbendazima, metiltiofanato y tiabendazol, aunque en Gran Bretaña e Irlanda
se detectaron aislados resistentes a esta familia de fungicidas (Fletcher y Yarham, 1976; Gaze, 1995;
McKayet al.., 1998; Grogan y Gaze, 2000; Grogan, 2006). Tiabendazol, cuya acción fungistática es
V. Control químico
75
más relevante que su acción fungicida, se mostró efectivo para prevenir la aparición de la
enfermedad en ensayos en planta piloto realizados en Sudáfrica (Eicker, 1984).
A principios de la década del 2000, los fungicidas registrados para su uso en champiñón en
Estados Unidos eran benomilo, metiltiofanato, clortalonil y tiabendazol (Beyer y Kremser, 2004).
Clortalonil, fungicida aromático policlorado derivado del ácido cloroisoftálico, es empleado
actualmente para combatir la infección en Estados Unidos en combinación con los bencimidazoles.
Se puede alcanzar un nivel aceptable de control de la telaraña con este fungicida (Fletcher, 2002;
Beyer y Kremser, 2004).
Actualmente procloraz-Mn (imidazol, inhibidor de la desmetilación del C-14, grupo DMI)
es el fungicida recomendado en los países cultivadores de champiñón de la Unión Europea para
tratar enfermedades de origen fúngico del champiñón, y la telaraña en particular. Aunque parece ser
ineficaz para prevenir el moteado de los sombreros (Grogan, 2006).
1.2.2. Sensibilidad y resistencia
La resistencia a los fungicidas es un factor crucial a considerar en el control de la
enfermedad. La sensibilidad entre los aislados frente a distintos fungicidas presenta variaciones. Sin
duda existen también aislados altamente resistentes a algunos de los fungicidas empleados por la
industria productora de champiñón.
La primera evidencia de cepas resistentes a los fungicidas en la industria se detectó a
mediados de la década de 1980 en Inglaterra. Se demostró la rápida habilidad de Cladobotryum spp.
para desarrollar resistencia a los bencimidazoles cuando se expone continuamente a estos fungicidas
(Gaze, 1995). En 1992, se informó de las primeras resistencias a los metil-bencimidazol-carbamatos
(MBC) registradas en Irlanda después del uso indiscriminado y muy extendido de la carbendazima
(Doyle y Morris, 1993). La mayoría de aislados de Cladobotryum recolectados en cultivos de
champiñón y analizados en Irlanda a mediados de la década de los 90 eran resistentes a los
bencimidazoles (McKay et al., 1998). La resistencia a estos fungicidas se asocia con una mutación
en un gen de la proteína fúngica β-tubulina que altera la unión de la molécula fungicida con la
proteína para inhibir la función de los microtúbulos (Davidse y Flach, 1977; Osmani y Oakley,
1991). A mediados de la década de los noventa Gran Bretaña e Irlanda sufrieron una seria epidemia
de telaraña causada por aislados de C. mycophilum resistente a los bencimidazoles (benomilo,
carbendazima, metiltiofanato y tiabendazol). El uso general de fungicidas tipo bencimidazoles para
controlar telaraña y otras enfermedades habría podido provocar la aparición de estas cepas resistentes
(McKay et al., 1999). En un estudio in vitro en laboratorio realizado con 57 aislados de
Cladobotryum spp., la mayoría de cepas resultaron resistentes a tiabendazol y parcialmente
resistentes a carbendazima. También reflejaron cierta tolerancia a procloraz-Mn. Los autores apuntan
además que hay indicios que permiten deducir que unos especímenes de Cladobotryum son más
resistentes a procloraz-Mn en la cobertura del cultivo que otros (Grogan et al., 1996). Se realizó un
estudio de resistencia a fungicidas entre aislados de C. mycophilum y C. dendroides respecto a las
sustancias activas: tiabendazol, carbendazima y procloraz-Mn después de la epidemia de telaraña de
Gran Bretaña e Irlanda de 1994/1995. El 72% de los aislados fueron altamente resistentes a
tiabendazol y sólo débilmente a carbendazima; todos ellos fueron inicialmente descritos como C.
dendroides tipo II, sin embargo los análisis genéticos determinaron que se trataba de una variedad de
C. mycophilum, tipo II (Grogan, 2005a). Los otros aislados resultaron débilmente resistentes a
V. Control químico
76
tiabendazol pero sensibles a carbendazima. Algunos de los aislados ensayados mostraron una cierta
tolerancia al procloraz-Mn. Este estudio demostró la ausencia de resistencias cruzadas entre ambos
bencimidazoles. (Grogan y Gaze, 2000; Fletcher y Gaze, 2008). Por el contrario, en un estudio
posterior se evaluó la eficacia de los bencimidazoles tiabendazol y carbendazima, y el imidazol
procloraz-Mn para controlar la telaraña frente a dos aislados de Cladobotryum. Uno de los aislados
resultó resistente a tiabendazol y carbendazima, constatándose que este aislado presentaba resistencia
cruzada a los fungicidas tipo bencimidazoles empleados. Los aislados evaluados resultaron sensibles
a procloraz-Mn (Grogan et al., 2008).
En Estados Unidos se demostró que el patógeno puede desarrollar resistencias a tiabendazol
muy rápidamente, pero este fungicida es muy efectivo con cepas sensibles (Beyer y Kremser, 2001).
Beyer y Kremser (2001) han investigado también la creciente resistencia a los fungicidas empleados
para controlar la telaraña. Los resultados indicaron que los aislados más jóvenes evaluados
mostraban una resistencia creciente a benomilo respecto a los más antiguos, lo que indica una
tendencia de tipo regresivo en la respuesta del patógeno al agente fungicida. Los autores sugieren
que los procedimientos de control de la enfermedad deben variar puesto que los fungicidas aplicados
en la cobertura podrían tener una mínima influencia en su prevención (Beyer y Kremser, 2001).
Respecto al clortalonil, empleado por la industria americana, hasta el momento no se han encontrado
cepas resistentes (Beyer y Kremser, 2004). La sensibilidad de aislados de Cladobotryum mycophilum
recopilados en diversos años fue evaluada frente a varios fungicidas en Estados Unidos. Los aislados
más antiguos mostraron elevada sensibilidad a tiabendazol y metiltiofanato mientras que el aislado
más antiguo presentó una tolerancia a clortalonil mayor que el resto. Los aislados más recientes
tuvieron reducida sensibilidad a los fungicidas tipo benzimidazoles, mientras que clortalonil fue la
única sustancia activa a la que resultaron sensibles. Los autores postulan un cambio en la sensibilidad
del patógeno respecto a la acción de los agentes fungicidas, entendiendo esta variabilidad como una
de las causas del repunte de la enfermedad en los cultivos de champiñón (Beyer y Kremser, 2004).
En Serbia se han realizado diversos estudios evaluando la respuesta de Cladobotryum spp. a
diversos agentes químicos. La sensibilidad de C. dendroides fue evaluada frente a diferentes
fungicidas, tales como carbendazima, benomilo, metiltiofanato, cyproconazol+carbendazima,
flusilazol+carbendazima, procloraz-Mn o iprodiona (dicarboximida) (Potočnik et al., 2007, 2008,
2008b, 2009a, 2009c). Al comparar la sensibilidad de una serie de aislados de Cladobotryum spp.
con diferentes fungicidas, todos ellos resultaron altamente sensibles a iprodiona, benomilo y
procloraz-Mn. De entre los tres investigados, procloraz-Mn resultó el más tóxico para todos ellos, no
encontrándose ningún aislado resistente ni a benomilo ni a iprodiona (Potočnik et al., 2007, 2008b).
La sensibilidad de Cladobotryum spp. a otros agentes químicos fue también evaluada in vitro. Todos
los aislados fueron altamente sensibles a carbendazima, cyproconazol+carbendazima y
especialmente a flusilazol+carbendazima; sin embargo resultaron ligeramente resistentes a
metiltiofanato (Potočnik et al., 2008). La toxicidad in vitro de C. dendroides frente a distintos
fungicidas fue también contrastada. En un primer estudio se determinó que los aislados ensayados
eran más sensibles a procloraz-Mn (Potočnik et al., 2009a). Un estudio posterior evaluó la toxicidad
del patógeno frente a otros fungicidas, comprobando que clortalonil era el fungicida más tóxico de
entre los evaluados frente a C. dendroides (Potočnik et al., 2009c).
Al realizar pruebas de sensibilidad a diversos fungicidas en Corea, cinco aislados
identificados como C. mycophilum mostraron una elevada resistencia a mancozeb y metiltiofanato,
V. Control químico
77
moderada sensibilidad a iprodiona y alta sensibilidad a benomilo, prochloraz-Mn y carbendazima
(Oh y Kong, 2011).
En España, hasta la fecha no se han publicado evidencias de aparición de resistencias en el
patógeno (C. mycophilum), sin embargo sí se ha publicado un trabajo que confirma mayor tolerancia
al procloraz-Mn en aislados más recientes de L. fungicola (Gea et al., 2005).
Es evidente por los estudios publicados, que la aparición de resistencias al agente químico
empleado es ciertamente un aspecto crucial respecto a la eficiencia del fungicida empleado. Para
prevenir la aparición de resistencias deben diseñarse buenos programas de higiene en los cultivos e
instalaciones, así como desarrollar métodos de control complementarios (Potočnik., 2009).
1.2.3. Selectividad de fungicidas
Puesto que tanto el patógeno como el hospedador son hongos, un fungicida adecuado para
tratar la telaraña debe presentar selectividad al organismo diana sin provocar mermas de producción
en el cultivo. Por tanto, es importante conocer cuál es el índice de selectividad al patógeno de un
determinado agente fungicida frente al hospedador, entendido como como el cociente entre la ED50
calculada para cada uno de los patógeno/fungicida entre la ED50 media calculada de
hospedador/fungicida (Chrysayi-Tokousbalides et al., 2007).
En Serbia se ha analizado la selectividad in vitro patógeno/hospedador (C. dendroides/A.
bisporus) frente a distintos fungicidas. Un primer estudio determinó que los índices de selectividad
calculados indicaban una mayor selectividad para carbendazima, benomilo y procloraz-Mn que para
otros compuestos como metiltiofanato (Potočnik et al., 2009a). Un estudio posterior evaluó la
selectividad de distintos aislados de C. dendroides y A. bisporus frente a otros fungicidas empleados
en la industria, comprobando que iprodiona presentaba la mejor selectividad patógeno/hospedador,
siendo ligeramente inferior a la obtenida para procloraz-Mn y carbendazima (Potočnik et al., 2009c).
En ensayos in vitro frente a Agaricus bisporus, cyproconazol+carbendazima y
flusilazol+carbendazima fueron más tóxicos que carbendazima (Potočnik et al., 2009b).
Beyer y Kremser (2004) postulan que debido a la reducida selectividad de clortalonil, este
producto puede retardar la colonización del compost por A. bisporus y reducir ligeramente el
rendimiento del cultivo en ausencia de la enfermedad. Fletcher (2002) también se ha manisfestado en
este sentido.
1.2.4. Legislación y fungicidas autorizados en Europa y España
Clortalonil es un fungicida autorizado para su uso en champiñón en España mediante
―Resolución de autorización excepcional para la comercialización de productos fitosanitarios con
clortalonil como fungicida en champiñón‖, para champiñón con destino de exportación al mercado
estadounidense. Vigente desde el 7 de diciembre de 2012, esta autorización excepcional se ha ido
prorrogando en sucesivas resoluciones hasta la actualidad (Reglamento (CE) nº 1107/2009. Artículo
53). Metiltiofanato y tiabendazol, a pesar de no estar autorizados en Europa para su uso en este
cultivo, son usados en países productores como Estados Unidos. Uno de los productos de
descomposición de metiltiofanato es la carbendazima, producto prohibido en Europa para su uso en
el cultivo del champiñón, como ya ha sido recogido con anterioridad en esta memoria. A principios
de año 2015 ha sido también autorizado en España el fungicida metrafenona (fungicida del grupo de
V. Control químico
78
las benzofenonas) mediante ―Resolución de autorización excepcional para la comercialización de
productos fitosanitarios a base de metrafenona 50% [SC] como fungicida en champiñón para el
control de Dactylium dendroides‖ (Reglamento (CE) nº 1107/2009. Artículo 53). Esta autorización
excepcional ha sido motivada por la elevada presencia de la enfermedad en los cultivos y la
preocupación generada entre los productores.
Procloraz-Mn, citado anteriormente, es el fungicida recomendado en los países cultivadores
de champiñón de la Unión Europea para tratar enfermedades de origen fúngico del champiñón, y el
tratamiento más común empleado por los productores españoles.
1.3. MÉTODOS DE CONTROL ALTERNATIVOS
El uso de agentes de origen químico para combatir la enfermedad tiende a restringirse. El
abanico de productos disponibles es escaso y existe una potencial amenaza de aparición de
resistencias a los agentes fungicidas por la continua exposición al fitosanitario. Como alternativa, se
están desarrollando y estudiando métodos de biocontrol de la enfermedad:
En Turquía se realizó un estudio para determinar el efecto antagonista de Pseudomonas para
el control biológico de Cladobotryum dendroides, lográndose mediante las aplicaciones de P.
fluorescent y P. putida aumentos de producción respecto al control inoculado (Bora y Özaktan,
2000).
En Serbia 20 aislados de C. dendroides fueron estudiados para evaluar la sensibilidad in
vitro frente a los biofungicidas Timorex 66 ED [66% ―tea tree oil‖, aceite esencial obtenido por
destilación a vapor de la planta australiana Melaleuca alternifolia (Maiden. &Betche.)Cheel.] y
Sonata (1.38% Bacillus pumilus). Timorex mostró una actividad antifúngica frente al patógeno más
fuerte que Sonata (Potočnik et al., 2009). Los autores sugieren que podría ser recomendado como
suplemento de los fungicidas comerciales. Posteriormente se ha comparado el biofungicida Timorex
66 EC frente a la acción de plocloraz-Mn (Potočnik et al., 2010), obteniendo una eficacia mucho
menor al usar el biofungicida que al emplear procloraz-Mn.
Sánchez et al. (2011), tras evaluar la capacidad antagonista in vitro de los microorganismos
aislados del té de compost de champiñón frente a Cladobotryum mycophilum concluyen que 3
aislados bacterianos y 1 aislado fúngico resultaron una buena estrategia de control biológico del
patógeno, mostrando un porcentaje de inhibición mayor del 80%.
Savic et al. (2012) evaluaron la actividad antifúngica del selenio orgánico contra hongos
patógenos de A. bisporus, entre ellos Cladobotryum dendroides. Una concentración de 70-100 µg g-1
de selenio adicionado al sustrato inhibe el crecimiento de los micopatógenos y proporciona cuerpos
fructíferos enriquecidos en selenio.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
V. Control químico
79
2.1. SENSIBILIDAD IN VITRO A FUNGICIDAS DE CLADOBOTRYUM MYCOPHILUM Y
AGARICUS BISPORUS
Se ha analizado la sensibilidad de los 25 aislados identificados como Cladobotryum
mycophilum (Tabla7) frente a distintos fungicidas empleados por la industria productora de
champiñón. La Tabla 11 resume las principales características así como el modo de acción de cada
una de las sustancias activas evaluadas.
Tabla 11. Especificaciones generales de los fungicidas empleados.
Table 11. Standard specifications of the fungicides used Active substance Spanish regulation* Formulation Action point
Thiophanate-
methyl (MTF)
Registration No.: 22044.
Unauthorized for mushroom
crops in Spain
Water-dispersible granule
(WDG) MTF: 70% w/w
(700 g kg-1)
TBD and MTF: they belong to the
benzimidazole group. Systemic fungicides
with preventive and curative activity, broad
spectrum and a very specific action. It
blocks cell division at the level of the
microtubules.
Thiabendazole
(TBD)
Reg. No.: 21089.
Unauthorized for mushroom
crops in Spain
Concentrated suspension (CS)
TTBD: 60% w/v (600 g/kg)
Chlorothalonil
(CTL)
Reg. No.: 24121
Unauthorized for mushroom
crops in Spain
Concentrated suspension (CS)
CTL: 72% w/v (720 g kg-1)
Polychlorinated aromatic chloro-isophthalic
acid derivative. Broad spectrum fungicide.
It inhibits fungal cells breathing. Reg. No.: 21795
Temporary authorized for export
destination.
Doses: 1L ha-1. Withdrawal
period: 14 days
Concentrated suspension (CS)
CTL: 50% w/v (500 g l-1)
Prochloraz-Mn
(PCL)
Reg. No.: 17597. Authorized for
mushroom crops in Spain.
Doses: 0.03-0.05%. Withdrawal
period: 2 days
Wettable powder (WP)
PCL(Mn complex): 46% w/w
(460 g kg-1)
It belongs to the imidazole group. Inhibits
the synthesis of ergosterol (a key
component of cell membranes) by
inhibition of the 14-demethylase enzyme. *Phytosanitary products registration.
Cinco formulaciones comerciales fueron utilizadas: metil-tiofanato (Topsin® 70WG, Bayer
CropScience, Alcácer, Valencia, España), tiabendazol (Textar®
60SC, Tecnidex, Paterna, Valencia,
España), clortalonil (Bravo® 720SC, Syngenta Agro S.A., Madrid, España; Daconil
® 50SC,
Comercial Química Massó, S.A., Barcelona, España) y procloraz-Mn (Sporgon®, BASF Española
S.L., Barcelona, España). Los cuatro principios activos están incluidos en la Lista Comunitaria de
Sustancias Activas [Anexo I de la Directiva 91/414/CEE trasladadas al anexo I del Reglamento (CE)
Nº 1107/2009]. De todos ellos, sólo procloraz-Mn está autorizado en el cultivo de champiñón en
España (nº de registro: 17597); mientras que clortalonil en champiñón ha sido temporalmente
autorizado para producción de champiñón destinada a la exportación, en su formulado 50% p/V SC
[nº de registro 21795 (Reglamento (CE) nº 1107/2009. Artículo 53)].
También fue evaluada la selectividad in vitro patógeno/hospedador de estos mismos
compuestos. Para ello se han realizado ensayos de sensibilidad de distintas variedades de Agaricus
bisporus. Los aislados de A. bisporus se obtuvieron a partir de variedades comerciales, tomando
semilla de una bolsa comercial y sembrándolas en medio agar-compost: Amycel® XXX (Amycel®-
Spawn Mate®, Watsonville, CA), Gurelan 45 y Gurelan 90 (Gurelan S. Coop., Huarte, Pamplona,
España).
V. Control químico
80
El medio de cultivo empleado para los ensayos de sensibilidad in vitrode las sustancias
activas evaluadas frente a C. mycophilum ha sido extracto de malta agar (MEA:ME + Agar Technical
(Agar No3); Oxoid, Basingstoke, England). Para los ensayos con A. bisporus el medio empleado ha
sido el denominado ―agar-compost‖. Los medios de cultivo fueron preparados de acuerdo a la
metodología descrita en el Anexo.
Los medios fueron esterilizados en autoclave, a 121ºC y 1 atmósfera de presión, durante 20
min., y una vez enfriados en torno a 40-50ºC se añadió la concentración de fungicida calculada para
obtener las concentraciones finales requeridas. Se parte de disoluciones madre preparadas a partir de
las formulaciones comerciales de los fungicidas, disolviendo los productos en agua destilada estéril.
Las disoluciones madre de fungicidas fueron elaboradas justo antes de ser utilizadas. Tras
homogeneizar el medio más el fungicida mediante agitación se dispensa en placas Petri de 90 mm de
diámetro.
Las concentraciones empleadas en los ensayos para cada uno de los fungicidas son
diferentes, ya que varían en función de los resultados obtenidos en ensayos previos. Los fungicidas
se disolvieron en agua destilada estéril y se añadieron al medio de cultivo esterilizado y enfriado con
el fin de conseguir concentraciones crecientes de materia activa: 0,001-0,01-0,1-1-10-100-1000 µg
mL-1
.
Estas concentraciones de fungicida se usaron con varios aislados de C. mycophilum, y de
acuerdo con la sensibilidad previa de cada aislado (ED50 aproximada) se selecciona un rango de
concentraciones de sustancia activa (Sombardier et al., 2010). En ocasiones ha sido necesario usar
concentraciones mayores en el caso de cepas resistentes para poder utilizar el software y calcular el
valor de ED50 (dosis media efectiva, concentración de fungicida que inhibe al 50% el crecimiento del
patógeno) de cada aislado. Particularmente para algunos aislados que mostraron tolerancia a
metiltiofanato y tiabendazol. Las concentraciones seleccionadas para el análisis de la sensibilidad de
los aislados frente a los fungicidas son las expresadas en la Tabla 12.
Tabla 12. Concentración de fungicida empleada en los ensayos de
sensibilidad in vitro frente a C. mycophilum y A. bisporus.
Table 12. Fungicide concentration used for the in vitro sensitivity tests of C.
mycophilum and A. bisporus.
Fungicide Concentration employed (µg mL
-1)
C. mycophilum
A. bisporus
Chlorothalonil
0.09-0.19-0.37-0.74-1.48
0.07-0.14-0.28-0.56-1.12-2.24
Thiophanate-methyl
0.29-0.57-1.15-2.3-4.6-9.2
3.75-7.5-15-30-60
Prochloraz-Mn
0.006-0.013-0.025-0.05-0.1
2-4-8-16-32-64
Thiabendazole
0.48-0.96-1.92-3.84-7.68
30-60-120-240-480-920
Para el cálculo de ED50 media en cada bloque de aislados/fungicida se han considerado los
valores obtenidos dentro del rango de concentraciones evaluadas. De acuerdo con Delp y Dekker
(1985), una vez calculados los valores de ED50 medios para cada uno de los fungicidas se ha
determinado un factor de resistencia (RF), definido como la relación entre el valor más elevado de
ED50 de los aislados estudiados frente al valor medio de ED50 para cada combinación de aislados-
fungicida. Sólo aquellos aislados que mostraron sensibilidad al fungicida han sido considerados para
calcular la ED50 media, los aislados que muestran reducida sensibilidad o síntomas de resistencia no
se han empleado para el cálculo del factor de resistencia.
V. Control químico
81
Las placas fueron inoculadas en cabina de flujo laminar (Telstar SAH-100; Telstar,
Terrassa, España) con discos de 5 mm de diámetro obtenidos mediante un sacabocados estéril y
procedentes de cultivos puros del aislado en placas crecidas en PDA y agar-compost, durante 5 días
en el caso de Cladobotryum y 18 días en el caso de Agaricus. Los fragmentos de micelio se
obtuvieron de la zona de crecimiento activo del micelio, la zona más externa de la colonia. Las
placas fueron sembradas enfrentando la superficie del fragmento de medio donde ha crecido el hongo
con el medio que contiene el producto fungicida. Se realizaron cuatro repeticiones por tratamiento
(aislado/concentración de fungicida) y el experimento se realizó por duplicado.
Los aislados inoculados se incubaron en oscuridad a 22ºC en el caso de Cladobotryum y a
25ºC en el caso de Agaricus. Se realizó la medida del crecimiento de las cepas a distintos días
dependiendo de la tasa de crecimiento de cada uno de los organismos estudiados, 3 días para C.
mycophilum y 18 días para A. bisporus. Con un calibre digital se tomaron dos medidas
perpendiculares por aislado, correspondientes al crecimiento radial del micelio en milímetros. Cada
una de las medidas se ha corregido en 5 mm correspondientes al diámetro del fragmento de agar
inoculado.
Se valoró la tasa de crecimiento miceliar para cada aislado, utilizando las placas control a
las que no se añadió fungicida. A continuación, se calculó el porcentaje de inhibición (PI) del
crecimiento miceliar mediante la ecuación de Vincent (1947): PI = 100(C-T)/C (C= tasa de
crecimiento del control; T= tasa de crecimiento en las placas tratadas con fungicida). La sensibilidad
de los aislados de C. mycophilum y de A. bisporus se estimó mediante el cálculo de la dosis media
efectiva, ED50 (µg mL-1
de materia activa necesarios para inhibir el crecimiento radial del micelio al
50%).
Para el cálculo de los valores de ED50 se utilizó el análisis probit interpolando la
concentración de fungicida empleada y el porcentaje de inhibición del crecimiento miceliar. Para esta
finalidad se utilizó el software de análisis de datos PoloPlus, Probit and Logit Analysis (LeOra
Software Company®, Petaluma, USA). (Finney, 1971; Robertson et al., 2002; Gea et al., 2010). Los
valores medios de ED50 obtenidos, correspondientes a los diferentes fungicidas, fueron comparados
por análisis de varianza (ANOVA), después de efectuar las transformaciones angulares
correspondientes para conseguir homogeneidad de varianza. Al aplicar los test de Cochran y Barlett
para cotrastar la normalidad y homocedasticidad de los datos, se constató que la distribución de la
mayoría de datos no era normal (P<0,05). Por tanto, para establecer diferencias significativas entre
los valores correspondientes a cada uno de los fungicidas se han empleado métodos no paramétricos.
Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para determinar si existían diferencias significativas entre los
fungicidas estudiados. La prueba Mann-Whitney (Wilcoxon) W fue ejecutada para comparar las
medianas entre los grupos y comprobar los resultados del Kruskal-Wallis (Gea et al., 2005). Los
datos (ED50) han sido analizados mediante el software Statsgraphics Versión 5.1 (Statpoint
technologies, inc., Warrenton, Virginia).
También se ha calculado el índice de selectividad al patógeno frente al hospedador de cada
una de las sustancias activas ensayadas. Este valor se entiende como el cociente entre la ED50
calculada para cada uno de los aislados de C. mycophilum/fungicida entre la ED50 media calculada
para A. bisporus/fungicida (Chrysayi-Tokousbalides et al., 2007; Potočnik, et al., 2009a, 2009b,
2010). Valores de índice de selectividad por debajo de 0,1 indican una toxicidad selectiva adecuada
entre patógeno y hospedador (Chrysayi-Tokousbalides et al., 2007). Los índices de selectividad
calculados para cada fungicida han sido comparados mediante análisis de varianza (ANOVA). De
V. Control químico
82
nuevo se ha constatado una distribución de los datos no nomal (P<0,05) por lo que se volvieron a
aplicar los métodos no paramétrico descritos para establecer diferencias significativas entre los
valores de índice de selectividad calculados para los fungicidas. Se utilizó el programa Statsgraphics
Versión 5.1 (Statpoint technologies, inc., Warrenton, Virginia) para el análisis estadístico.
2.2. CONTROL DE TELARAÑA MEDIANTE FUNGICIDAS EN CULTIVOS DE AGARICUS BISPORUS
Se han realizado dos ensayos de patogenicidad siguiendo las prácticas habituales utilizadas
en los cultivos comerciales de champiñón de Castilla-La Mancha (Gea et al., 2010). Los ciclos de
cultivo se llevaron a cabo en cámaras de cultivo experimental de 20 m3 ubicadas en el Centro de
Investigación, Experimentación y Servicios del Champiñón (CIES, Quintanar del Rey, Cuenca),
equipadas con un sistema de humidificación, de calefacción/refrigeración, y de recirculación interna
de aire y ventilación externa. Las cámaras de cultivo disponen de puertas herméticas, y únicamente
entra en ellas el personal autorizado que desarrolla el ensayo para prevenir una posible
contaminación externa.
En cada ensayo se cultivaron 48 cajas de 0,15 m2 de superficie, con 10 kg de compost
incubado Fase III por caja, sembrado con semilla Amycel® XXX (Amycel Inc., San Juan Bautista,
California, EE.UU). Los bloques fueron cubiertos con mezcla de cobertura Euroveen B.V. (BVB
Substrates, Grubbenvorst, Limburg, Holanda) de aprox. 35 mm de espesor (5,5 litros por bloque). La
Tabla 13 recopila las características físico-químicas de los sustratos y cobertura usados.
Tabla 13. Caracterización físico-química del sustrato (al
finalizar la fase III) y cobertura empleados en los ensayos.
Table 13. Physic and chemical characterization of the compost
(phase III) and casing material employed in the trials.
Parameter Substrate (Phase III)
Casing
Trial A Trial B
pH (1:5, v/v) 6.27 6.76
7.85
Moisture (g kg-1) 602 566
771
Total nitrogen (g kg-1) 26.2 25.2
9.1
Ash (g kg-1) 281 294
268
Organic matter, g kg-1 719 706
-
C/N 16 16
- Electrical conductivity (1:5, w/v, µS cm
-1) - -
795
Bulk density (dry) (g cm-3) - -
0.12
Particle real density (g cm-3) - -
1744
Total pore space (mL L-1) - -
932
Water-holding capacity (kg 100 kg-1) - - 504
Para los ensayos se ha empleado un diseño de bloques al azar en estantes a tres alturas, con
una distancia entre alturas de aproximadamente 60 cm, elevándose la primera altura unos 20 cm
sobre el suelo (Figura 12). En el día 0 del ciclo de cultivo se aplicó la cobertura con un grado alto de
humedad, manteniendo condiciones de germinación (26ºC de temperatura en el compost, con una
humedad relativa (HR) del 85-90% y concentración de CO2>2000 µg mL-1
, sin ventilación). Nueve
días después se ventilaron las naves de cultivo con aire fresco filtrado para inducir la fructificación, a
V. Control químico
83
través de una reducción gradual en 3 días de la temperatura y humedad hasta 18ºC y 85-90% de HR.
Se mantuvo una temperatura de 17,5ºC y una HR de 85-90% a lo largo del ciclo de cultivo.
De las 48 cajas, 36 fueron infectadas artificialmente nueve días después de aplicar la
cobertura con un aislado de C. mycophilum, aplicando 20 mL bloque-1
de una suspensión conidial
(7,5x103 conidios mL
-1), para obtener una tasa de inoculación final de 10
6 conidios m
-2. La solución
conidial fue preparada el día de inoculación, y consiste en realizar una suspensión madre a partir de
un cultivo del patógeno en PDA con cinco días de edad. Para liberar los conidios de la placa madre
se emplea un pincel estéril de reducidas dimensiones y se lava con agua destilada estéril, filtrando
con filtro de red de polipropileno [25 µm de Ø de poro, Millipore® (Merck KGaA, Darmstadt,
Alemania)] para retirar los posibles fragmentos de micelio. La concentración conidial de la
disolución madre se determinó empleando un hemocitómetro y posteriormente se ajustó a la
concentración requerida diluyendo con agua destilada estéril. Las 12 cajas restantes no se infectaron
(tratamiento control: C), aplicando 20 mL de agua destilada estéril por caja. Las estructuras metálicas
donde se emplazaron los distintos bloques fueron cubiertas mediante plásticos para limitar las
corrientes de aire sobre los cultivos y prevenir la dispersión de los conidios, responsables de posibles
focos secundarios de contaminación.
En cada ensayo, las 36 cajas de sustrato infectadas con Cladobotryum en la cobertura se
dividieron en 6 tratamientos, con 6 repeticiones por tratamiento. A continuación se detallan los
tratamientos, las dosis y los momentos de aplicación de los fungicidas:
CI (control inoculado): cajas infectadas pero sin tratamiento fungicida.
CTL: aplicación de clortalonil 72% (Bravo® 720SC, Syngenta Agro S.A.), 4 días tras
la cobertura. Dosis: 2 mL L-1
m-2
.
TBD: aplicación de tiabendazol 60%(Textar® 60SC, Tecnidex, Paterna, Valencia,
España), 4 días tras la cobertura. Dosis: 0,1%.
MTF: aplicación de metil-tiofanato 70% (Topsin® 70WG, Bayer CropScience,
Alcácer, Valencia, España), 4 días tras la cobertura. Dosis: 0,1%.
PCL1: aplicación de procloraz-Mn 46%(Sporgon®, BASF Española S.L., Barcelona,
España), 4 días tras la cobertura. Dosis: 0,05%.
PCL2: dos aplicaciones de procloraz-Mn 46% (Sporgon®, BASF Española S.L.,
Barcelona, España) (0,05%), la primera 4 días tras la cobertura y la segunda tras la cosecha
de la primera florada.
Las formulaciones fungicidas empleadas se disolvieron en agua del grifo hasta la
concentración de aplicación indicada. Se aplicaron mediante aspersión 150 mL de disolución
fungicida por bloque. A los bloques control (12 no inoculados y 6 inoculados) se les aplicó un riego
por aspersión de 150 mL de agua del grifo.
A lo largo del periodo de cosecha (cuatro floradas) se anotó diariamente y de manera
independiente para cada bloque el peso y número de champiñones recolectados. Así mismo, también
se realizó un examen exhaustivo de la superficie de cobertura, anotando el día en que se detectó la
enfermedad, la superficie y número de champiñones afectados en cada uno de los bloques. Una vez
detectada una mancha de telaraña, se valoró la evolución de la superficie afectada durante 24 horas, a
continuación se tapó con un papel húmedo y se aplicó sal para evitar las dispersión de conidios
patógenos (Fletcher y Gaze, 2008).
V. Control químico
84
Se ha valorado la producción (kg m-2
) y eficiencia biológica (EB) del cultivo. (kg de
champiñón sano recolectados por cada 100 kg en peso seco de compost empleado: kg dt-1
) durante
las tres primeras floradas, bloques afectados, precocidad de la infección y área final de cultivo
colonizada por el patógeno. Se entiende por champiñón sano aquel que no presenta síntomas de
enfermedad, los champiñones con manchas donde se indentificó la infección han sido desechados
para el cálculo del rendimiento y EB del cultivo. Para calcular la EB se cuantificó la humedad de
cada uno de los sustratos de cultivo empleados en los ensayos, desecando una muestra de sustrato
fresco en estufa a 60ºC hasta pesada constante.
Las producciones de los diferentes tratamientos fueron comparadas por análisis de varianza
(ANOVA), después de efectuar las transformaciones angulares correspondientes para conseguir
homogeneidad de varianza. Al aplicar los tests de Cochran y Barlett para contrastar la normalidad y
homocedasticidad de los datos, se ha constatado que los datos de algunos de los tratamientos
presentaban una distribución no normal (P<0,05). En estos casos concretos, para establecer
diferencias significativas entre los valores correspondientes a cada uno de los tratamientos, o entre
los ensayos, se han empleado métodos no paramétricos. Se ha aplicado la prueba de Kruskal-Wallis
para determinar si existían diferencias significativas entre las medianas de los tratamientos de cada
ensayo. Los datos han sido analizados mediante el software Statsgraphics Versión 5.1 (Statpoint
technologies, inc., Warrenton, Virginia).
También ha sido evaluada la eficacia de los fungicidas empleados al final de la tercera
florada (cuando la práctica totalidad de la cosecha ya ha sido recolectada), atendiendo a dos factores:
a) Descenso de producción: el descenso de rendimiento en los bloques inoculados se calcula
respecto al control sin inocular (% descenso de rend.= 100-(x/y)*100; donde x= producción (kg m-2
)
del cultivo en bloques inoculados; y= producción (kg m-2
) del cultivo en el control no inoculado). La
eficacia de cada fungicida a la hora de minimizar el descenso de rendimiento ocasionado por la
enfermedad se calcula respecto al control inoculado mediante la fórmula propuesta por Mesterhazy
et al. (2003): % eficacia= 100-(It/Ic)*100 (donde It= descenso de rendimiento en el tratamiento
fungicida; Ic= descenso de rendimiento en el tratamiento control inoculado).
b) Superficie colonizada por la enfermedad: la eficacia de cada fungicidaa la hora de reducir
la superficie colonizada por la enfermedad se calcula respecto al control inoculado para cada
tratamiento, mediante la fórmula de Abbott (Abbott, 1925): % control (eficacia)= [(Ic−It)/Ic]×100;
Ic= superficie colonizada en el control inoculado; It= superficie colonizada en el tratamiento
inoculado. El hecho de haber detectado incidencia de la enfermedad en los bloques control (no
inoculados) ha obligado a corregir previamente los valores de superficie afectada (% superficie
colonizada corregida= 100*(y-x/100-x); x= incidencia de la enfermedad en el control no inoculado;
y= incidencia de la enfermedad en el tratamiento/control inoculado).
Los valores de eficacia obtenidos (a y b), correspondientes a los distintos tratamientos se
han tratado de comparar por análisis de varianza (ANOVA), sin embargo la dispersión de datos entre
bloques de un mismo tratamiento parace descartar los resultados del análisis estadístico por lo que
sólo se presentan y discuten los valores promedio de eficacia.
V. Control químico
85
3. RESULTADOS
3.1. SENSIBILIDAD IN VITRO A FUNGICIDAS DE CLADOBOTRYUM MYCOPHILUM Y
AGARICUS BISPORUS
Como puede apreciarse en el Gráfico 18, en todos los tratamientos ensayados, el
crecimiento del micelio patógeno disminuye linealmente respecto al control sin fungicida conforme
aumenta la concentración de sustancia activa en el medio de cultivo.
Gráfico 18. Crecimiento radial in vitro de C. mycophilum (%) frente al control sin fungicida al
aplicar concentraciones crecientes de sustancia activa (µg mL-1
). a) Clortalonil. b) Procloraz-
Mn. c) Tiabendazol. d) Metil-tiofanato.
Graph 18. Percentage of C. mycophilum radial growth in vitro in respect to the control
without fungicide, when applying increasing concentrations of active substance (µg mL-1
). a)
Chlorothalonil. b) Prochloraz-Mn. c) Thiabendazole. d) Thiophanate-methyl.
Se observa que PCL es el fungicida al cual es más sensible el patógeno, puesto que la ED50
obtenida es la menor de las cuatro calculadas. Los valores de ED50 obtenidos para MTF y TBD son
los más elevados. Los valores de ED50 obtenidos tienen una distribución no normal. La dosis media
efectiva calculada para MTF presenta diferencias estadísticamente significativas con la de PCL
(prueba W de Mann-Whitney (Wilcoxon)=0,0; P=0,0) y la de CTL (W= 1900,0; P=0,0) aunque no
difiere estadísticamente con la calculada para TBD (W= 896,5; P=0,25). El valor calculado para
TBD también difiere estadísticamente del de PCL (W= 1999,0; P=0,0) y CTL (W= 2048,0; P=0,0).
Las dosis efectivas calculadas correspondientes a PCL y CTL presentan igualmente diferencias
estadísticamente significativas entre sí (W= 0,0; P=0,0) (Tabla 14).
y = -41,30x + 83,2
R² = 0,832
0
20
40
60
80
100
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
Mic
eli
um
gro
wth
(%
)
µg mL-1
a
y = -6,186x + 93,28
R² = 0,844
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
My
celi
um
gro
wth
(%
)
d
µg mL-1
y = -495,0x + 70,53
R² = 0,939
0
20
40
60
80
100
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
My
celi
um
gro
wth
(%
)
b
y = -7,882x + 96,72
R² = 0,963
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Mic
eli
um
gro
wth
(%
)
c
µg mL-1
µg mL-1
V. Control químico
86
La Tabla 14 muestra el valor medio de ED50 obtenido tras el análisis estadístico de los
valores, calculado mediante análisis probit de los 25 aislados enfrentados a los diferentes fungicidas.
Así mismo en dicha tabla se ha incluido el rango de valores entre los que oscilan los valores de ED50
para cada bloque de aislados/fungicida y el factor de resistencia al fungicida de los aislado
evaluados.
Tabla 14. Valores de ED50 calculados para los fungicidas
evaluados y factor de resistencia (RF) de los aislados de C.
mycophilum estudiados.
Table 14. ED50 values of selected fungicides and resistance factor
(RF) of the C. mycophilum strains studied.
Fungicide n1
ED50 (µg ml-1
) RF
3 Mean
2 Range
Chlorothalonil 50 0.54±0.24b 0.16-1.23 2.3
Thiophanate-methyl 42 5.29±3.09c 1.73-14.8 >13.9
Prochloraz-Mn 46 0.03±0.02a 0.001-0.11 7.5
Thiabendazole 42 4.85±1.56c 1.16-7.88 23.6 1Number of ED50 values considered per fungicide.
2Between the ED50 mean values followed by the same letter there is not a
statistically significant difference according to Kruskal Wallis test (P>0.05) and
Mann-Whitney (Wilcoxon) W test to compare medians (P>0.05) at the 95.0%
confidence level. 3RF: Resistance factor, expressed as the ratio of the highest ED50 of the isolates
tested to the mean ED50 calculated.
De entre los cuatro fungicidas, MTF y TBD presentan mayor dispersión en la sensibilidad
calculada de los aislados evaluados, seguidos por PCL. Por su parte, la sensibilidad registrada frente
a CTL de los distintos aislados es la más homogénea (Anexo. Tabla 28-31). De acuerdo con Gea et
al. (2005), a medida que el rango de sensibilidad se incrementa, también aumenta el riesgo de que
aparezcan individuos menos sensibles que el resto al fungicida. La mayor amplitud del rango de
datos puede indicar, por tanto, mayor probabilidad de aparición de resistencias. Esta apreciación se
constata al calcular los RFs, que son muy elevados para TBD (RF=23,6) y MTF (RF>13,9), e
incluso elevado para PCL (RF= 7,5). CTL, por su parte, presenta el menor RF (RF= 2,3) lo que
indica un riesgo menor de aparición de cepas resistentes.
Gouot (1994), al caracterizar distintos parásitos fúngicos resistentes a los fungicidas tipo
dicarboximidas establece, en función del factor de resistencia, dos tipos de aislados resistentes:
moderadamente resistentes (RF= 3-20) y altamente resistentes (RF>100). Esta escala indica que
entre los aislados estudiados parecen existir aislados resistentes a MTF y TBD y moderadamente
resistentes a PCL.
Grogan y Gaze (2000) al evaluar la resistencia de distintos aislado de Cladobotryum spp
frente a fungicidas, establecen una escala de sensibilidad para los fungicidas tipo bencimidazoles
analizados: sensibles al fungicida (ED50<1 μg mL-1
); débilmente resistentes (ED50=1-10 μg mL-1
);
resistentes (ED50>50μg mL-1
). Atendiendo a los valores de ED50 calculados para cada uno de los
aislados (Anexo, Tablas 28-31), se han detectado cepas escasamente sensibles entre las evaluadas a
los dos fungicidas del grupo de los bencimidazoles. Concretamente en el caso de MTF se han
V. Control químico
87
encontrado valores de dosis media efectiva elevados en dos aislados: CM13 (KP698966): ED50>74
µg mL-1
; CM24: ED50>74 µg mL-1
(estos aislados pueden considerarse resistentes frente a MTF). En
el caso de TBD, destacan: CM13 (KP698966): ED50= 45 µg mL-1
(este aislado puede considerarse
débilmentemente resistente a TBD); CM1 (JQ004734): ED50= 100 µg mL-1
; CM2 (JQ004737):
ED50= 94 µg mL-1
; CM24: ED50=105 µg mL-1
(pueden considerarse resistentes frente a TBD) (Gaze
y Grogan, 2000). En cualquier caso los valores medios de ED50 calculado tanto para MTF
(ED50=5,29 µg mL-1
) como para TBD (ED50=4,85 µg mL-1
), indican que todos los aislados
evaluados presentan al menos una débil resistancia a estos fungicidas (Tabla 14). En el caso de PCL
dos de los aislados evaluados muestran una menor sensibilidad al fungicida que el resto, CM12
(KP698965): ED50= 0,168 µg mL-1
; CM23 (KP698973)= 0,112 µg mL-1
, más de tres veces superior
a la media calculada. Esos valores de ED50 indican variabilidad en la respuesta de estos aislados al
fungicida respecto al grueso de los evaluados y podría entenderse como una débil resistencia, si bien
de acuerdo a la escala propuesta por Grogan y Gaze (2000), estos aislados siguen siendo muy
sensibles a PCL (ED50<1 µg mL-1
). Es importante mencionar también que todos los aislados
evaluados resultaron sensibles a las concentraciones de CTL empleadas en el ensayo.
El Gráfico 19 muestra la distribución de frecuencias de los valores de ED50 calculados en los
aislados evaluados para cada uno de los fungicidas.
Gráfico 19. Distribución de frecuencias de los valores de ED50 en los aislados de Cladobotryum
mycophilum estudiados. a) Clortalonil. b) Procloraz-Mn. c) Tiabendazol. d) Metil-tiofanato.
Graph 19. Frequency distribution of ED50 values of the strains studied. a) Chlorothalonil. b)
Prochloraz-Mn. c) Thiabendazole. d) Thiophanate-methyl.
Tanto PCL como TBD y MTF presentan aislados recopilados en 2011 y 2012 en los rangos
de ED50 más altos, lo que indica que en los años más recientes se han detectado aislados menos
sensibles o resistentes a los citados fungicidas, al incrementarse el rango de sensibilidad a los
fungicidas (Gráfico 19a, 19b, 19c). Sin embargo, dos aislados recolectados en 2008 y 2009
V. Control químico
88
respectivamente también han manifestado resistencias al TBD (Gráfico 19c). En el caso de CTL no
se detecta una tendencia de tipo regresivo en cuanto a la sensibilidad al fungicida de los aislados
repecto a su fecha de aislamiento, al contrario, en el rango de ED50 más alto se ha detectado un
aislado cosechado en 2008 (Gráfico 19a).
En el capítulo II las cepas estudiadas genéticamente quedaron enmarcadas en dos clados
diferentes correspondientes a la especie C. mycophillum (Figura 13). Los valores de ED50
calculados, para cada uno de los clados de C. mycophilum indentificados, respecto a los fungicidas
empleados, han sido comparados entre sí tratando de interrelacionar la respuesta al fungicida con su
correspondiente clasificación filogenética. Los valores calculados han sido sometidos a ANOVA, no
registrándose diferencias significativas entre clados en ninguno de los fungicidas (Tabla 15).
Tabla 15. Valores medios de ED50 comparando los dos clados de C. mycophilum
identificados.
Table 15. ED50 mean values of selected fungicides comparing the two clades of C.
mycophilum identified.
Fungicide Clade I Clade II 1
LSD (P<0.05)
n ED50 (µg ml
-1)
n ED50 (µg ml
-1)
2Kruskal-wallis (P<0.05)
Chlorothalonil
16
0.59±0.29
34
0.53±0.21
1F1,48=1.06; P=0.309
Thiophanate-methyl
13
4.49±3.15
29
5.65±3.13
2F1,39=0.10; P=0.74
Prochloraz-Mn
16
0.053±0.054
34
0.03±0.03
1F1,37=0.75; P=0.39
Thiabendazole 16 16.84±32.88 34 18.46±32.34 1F1,39=0.10; P=0.74
1Number of ED50 values considered per clade. 1Normal distribution.2Non normal distribution.
Atendiendo a los aislados que presentan menor sensibilidad a los fungicidas: las cepasCM1
(JQ004734) y CM13 (KP698966) del Clado I y el aislado CM2 (JQ004737) del Clado II presentaron
indicios de resistencias a los bencimidazoles; mientras que los aislados que presentan menor
sensibilidad a PCL, pertenecen ambos al mismo clado: CM12 (KP698965) y CM13 (KP698973)
(Clado II) (Figura 12).
CTL se ha mostrado como el fungicida más tóxico frente a las variedades comerciales de A.
bisporus ensayadas. Presenta un valor de ED50 frente al hospedador del orden de 20 veces inferior al
segundo calculado (PCL) (Tabla 16). Por el contrario, los micelios comerciales analizados resultaron
altamente resistentes a TBD. PCL y MTF, que muestran valores intermedios de ED50, son tolerados
por las variedades de A. bisporus evaluadas. Estos fungicidas no han registrado diferencias
significativas entre ellos (K= 2,56; P=0,11; df=11), pero sí respecto a CTL y TBD, que a su vez
también difieren estadísticamente (K= 16,65; P=0,0; df=20) (Tabla 16).
Los índices de selectividad obtenidos en los experimentos muestran que PCL es la sustancia
activa con mayor selectividad entre patógeno y hospedador. C. mycophilum es altamente sensible a
PCL mientras que A. bisporus muestra síntomas de resistencia al fungicida. TBD muestra también
buena selectividad al patógeno. Por el contrario, MTF es menos selectivo, siendo CTL el fungicida
que claramente presenta la peor selectividad. Los índices de selectividad calculados para los
fungicidas presentan diferencias significativas entre sí (K= 156,72; P=0,0; df=175) (Tabla 16).
Atendiendo a estos resultados, el uso de CTL podría afectar de forma directa al micelio hospedador.
V. Control químico
89
Tabla 16. Selectividad in vitro a los fungicidas entre patógeno y
hospedador.
Table 16. In vitro pathogen/host selectivity of fungicides.
Fungicide ED50 (µg mL
-1) Selectivity
index2
C. mycophilum
A. bisporus
Chlorothalonil
0.54±0.24b1
1.41±0.47a
0.38±0.01d
Thiophanate-methyl
4.47±1.77c
25.58±7.07b
0.17±0.02c
Prochloraz-Mn
0.03±0.02a
20.15±2.94b
0.001±0.01a
Thiabendazole
4.77±1.49c
466.07±170.98c
0.01±0.02b 1Between data in columns followed by the same letter there is not a statistically significant
difference according to Kruskal Wallis test (P>0.05) and Mann-Whitney (Wilcoxon) W test to
compare medians (P>0.05) at the 95.0% confidence level. 2Selectivity index expressed as the ratio between the ED50 mean value of C. mycophilum for
each fungicide with the corresponding ED50 mean value of A. bisporus.
3.2. CONTROL DE TELARAÑA MEDIANTE FUNGICIDAS EN CULTIVOS DE AGARICUS BISPORUS
Durante los ensayos se observaron distintos síntomas asociados a la enfermedad de la
telaraña: manchas de micelio fino algodonoso semejantes a una tela de araña (Figura 17a); masas de
esporulación de color blanco y textura harinosa (Figura 17b); manchas de color marrón y borde mal
definido en los sombreros afectados (Figura 17c) y decoloraciones de borde regular y color amarillo-
grisáceo como consecuencia de la podredumbre del tejido hospedador por el micelio patógeno
(Figura 17d) (Adie, 2000; Adie et al., 2006; Grogan, 2006; Fletcher y Gaze, 2008).
1) En el primer ensayo, ensayo A, el rendimiento registrado en el tratamiento control (C)
fue de 28,9 kg m-2
, o lo que es lo mismo, una eficiencia biológica de 99,9 kg de champiñón por cada
100 kg de compost peso seco (kg dt-1
) (Tabla 17). En casi todos los tratamientos inoculados se
registraron descensos de producción, aunque únicamente se detectaron diferencias significativas
(Kruskal Wallis test (K)=13,94; P=0,03; df=47) entre los tratamientos Control y PCL1 (EB=99,9 y
Figura 17. Sintomatología de la
enfermedad de la telaraña observada
en los ensayos. a) Fase inicial de la
infección. b) Masa de conidios. c)
Manchas marrones de borde mal
definido. d) Manchas regulares de
color amarillo-grisáceo.
Figure 17. Symptoms of cobweb
disease observed in the trials. a) Fluffy
mycelium over casing and fruit bodies.
b) Dense mass of pathogenic conidia.
c) Brown spots with an ill defined
edge. d) Yellow-grey spots with a clear
defined edge.
V. Control químico
90
102,3 kg dt-1
) y los tratamientos TBD y CTL (EB=84,4 y 79,6 kg dt-1
), con descensos del 15-20%
(Tabla 17).
A lo largo de las tres floradas los diferentes tratamientos mostraron producciones
comparables, aunque se detectaron descensos estadísticamente significativo (Tabla 17): en la primera
florada TBD (10,4 kg m-2
) registra un rendimiento significativamente menor a MTF (12,0 kg m-2
); en
la segunda florada el tratamiento menos productivo fue CTL (7,1 kg m-2
), mostrando diferencias
significativas con casi todos los tratamientos, con la excepción de PCL2; y en la tercera florada
vuelve a ser TBD (4,4 kg m-2
) el que se diferencia estadísticamente de PCL1 (7,7 kg m-2
).
Tabla 17. Producción (kg m-2
) y eficiencia biológica, BE (kg dt-1
), del cultivo en el ensayo A.
Table 17. Mushroom production (kg m-2
) and BE (kg dt-1
) along the trial A.
Treatment
1st flush (kg m
-2) 2
nd flush (kg m
-2) 3
rd flush (kg m
-2) Total (kg m
-2)
BE (kg dt
-1)
*Control
11.2±1.0ab 10.7±2.9a 7.0±1.6ab 28.9±2.3a
99.9±8.0a
CI
11.0±1.1ab 10.0±1.5a 5.8±2.9ab 26.9±3.7abc
92.8±12.9abc
TBD
10.4±0.7b 9.6±1.6ab 4.4±3.5b 24.4±4.8bc
84.4±16.5bc
PCL1
11.5±1.0ab 10.4±1.2a 7.7±1.5a 29.6±1.0a
102.3±3.3a
PCL2
11.6±1.2ab 7.9±1.2bc 7.0±1.2ab 26.5±2.9abc
91.6±10.2abc
CTL
11.1±1.5ab 7.1±2.5c 4.8±3.9ab 23.0±5.9c
79.6±20.3c
MTF
12.0±1.5a 9.3±1.3ab 5.6±3.3ab 26.9±3.1ab
92.8±10.7ab *Mean values followed by equal letters in the columns, are not significantly different according to Fisher´s LSD
(least significant difference) at P= 0.05.For those groups that had non-normal distribution, Kruskal-Wallis test has
been used to establish significant differences by comparing medians at the 95.0% confidence level(P<0.05).
En este primer ensayo la precocidad de la enfermedad, es decir, el día cuando detectó por
primera vez, fue de 21 días tras la cobertura, es decir, al inicio de la cosecha de la primera flor (F1);
en este momento solo 1 bloque del tratamiento TBD estaba afectado. Durante la primera florada
(hasta el día 25 del ciclo), la incidencia de la enfermedad siguió aumentando, afectando a algunos
bloques de los tratamientos CTL y MTF (Tabla 18). La Tabla 18 recopila precocidad de la infección
(en días tras cubrir) y número de bloques afectados al final del ciclo de cultivo en el ensayo A.
Tabla 18. Precocidad de la telaraña y número de bloques infectados al
final del ciclo de cultivo (%). Ensayo A.
Table 18. Earliness of cobweb and number of infected blocks at the end
of the crop cycle (%). Trial A.
Treatments *Earliness (days)
No of infected blocks (%)
CI 28
5 (83%)
TBD 21
6 (100%)
PCL1 37
3 (50%)
PCL2 33
1 (17%)
CTL 23
6 (100%)
MTF 24
3 (50%) *Earliness: days after casing.
El número de cajas afectadas aumentó progresivamente en TBD y CTL, mientras que este
avance fue menos evidente en el tratamiento MTF. Por otra parte, en los tratamientos en que se
aplicó procloraz-Mn (PCL1 y PCL2) la aparición de telaraña se retrasó prácticamente hasta la tercera
florada (días 37 y 33 del ciclo). Al final del ciclo de cultivo, el 83% de las cajas del tratamiento CI, el
V. Control químico
91
100% de TBD, el 50% de PCL1, el 17% de PCL2, el 100% de CLT y el 50% de MTF estaban
infectados por telaraña (Tabla 18). En este ensayo, al igual que en el ensayo B descrito
posteriormente, los bloques control no inoculados manifestaron la enfermedad, como consecuencia
de una contaminación cruzada. La telaraña se detectó durante la tercera florada, alcanzando al final
del ciclo un 20% de la superficie total del control no inoculado.
La Gráfica 20a muestra, para cada tratamiento del ensayo A, la superficie afectada al
finalizar la cosecha de cada una de las tres floradas. Esta evolución se recoge con más detalle (día a
día) en la Gráfico 24a del anexo.
Como se observa, la superficie final colonizada por el patógeno fue mayor en aquellos
tratamientos que manifestaron antes la enfermedad, como es el caso de CTL y TBD, que alcanzaron
niveles del 60% y 67,5% respectivamente al final de la tercera florada. En el caso del tratamiento
MTF, la progresión fue mucho más lenta, afectando al 27% de la superficie cultivada. En el
tratamiento CI, la superficie afectada alcanzó el 35% al finalizar la 3ª florada. Por último, en los
tratamientos en que la enfermedad apareció más tarde (PCL1 y PCL2) la superficie afectada fue
claramente inferior, con un 4,5 y 12,5% afectado, respectivamente (Gráfico 20a). La progresión de la
enfermedad siguió mientras se prolongó el ciclo, aumentando la superficie colonizada por telaraña
hasta la retirada de las cajas de cultivo (Anexo, Gráfico 24a).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
C CI TBD PCL1 PCL2 CTL MTF
F1 F2 F3
Cro
psu
rface
colo
niz
ed b
y c
ob
web
(%
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
C CI TBD PCL1 PCL2 CTL MTF
F2 F3
Cro
psu
rface
colo
niz
ed b
y c
ob
web
(%
)
a
b
Gráfico 20. Superficie de cultivo
colonizada por telaraña a lo largo del
ciclo. a) Ensayo A. b) Ensayo B. F1: final primera flor; F2: final segunda flor;
F3: final tercera flor. Graph 20. Crop surface colonized
by cobweb along the crop cycles. a)
Trial A. b) Trial B. F1: end of the first flush; F2: end of second
flush; F3: end of third flush.
V. Control químico
92
En este primer ensayo se han registrado diferencias de rendimiento estadísticamente
significativas entre el tratamiento PCL1 (el más productivo) y TBD y CTL (menos productivos)
(Tabla 17). En el tratamiento PCL1 se obtuvo una producción comparable al tratamiento C por lo
que la eficacia del fungicida para prevenir descensos de rendimiento puede ser considerada del
100%, sin embargo, TBD y CTL presentaron producciones inferiores al CI, por lo que no resultaron
eficaces. Por otro lado, al final de la tercera florada, tanto el tratamiento TBD como el CTL
presentaban gran parte de su superficie de cultivo colonizada por la enfermedad (67,5% y 60%
respectivamente), muy superior a la superficie afectada en el tratamiento CI, mientras que el
tratamiento PCL1 únicamente presentaba infección en el 4,5% de la superficie (incluso inferior a la
superficie afectada del bloque C, no inoculado). Es decir, TBD y CTL no resultan eficaces en el
control de la superficie afectada, mientras que PCL1 es eficaz al 93,5% para prevenir la colonización
de la superficie por telaraña al final de la tercera florada (Tabla 19).
Table 19. Eficacia (%) de los tratamientos
en el control de la telaraña al final de la
tercera flor.
Table 19. Effycacy (%) of treatments to
control cobweb disease in A. bisporus crops
at the end of 3rd flush. Trial A.
Treatment
Yield
1 Surface
2
TBD
0 0
PCL1
100 93.5
PCL2
0 59.9
CTL
0 0
MTF
0 13.1
2) En el ensayo B no se detectaron diferencias significativas en la producción recolectada en
las sucesivas floradas ni en la EB del cultivo entre los distintos tratamientos fungicidas y los
controles (K=7,29; P=0,29; df=47) (Tabla 20).
Tabla 20. Producción (kg m-2
) y eficiencia biológica, BE (kg dt-1
), del cultivo en el ensayo B.
Table 20. Mushroom production (kg m-2
) and BE (kg dt-1
) along the trial B.
Treatment
1st flush (kg m
-2) 2
nd flush (kg m
-2) 3
rd flush (kg m
-2) Total (kg m
-2)
BE (kg dt
-1)
*Control
6.6±1.6 12.8±4.4ab 6.9±1.1 26.3±2.6
99.0±10.6
CI
6.8±1.3 11.8±2.1bc 6.0±0.5 24.5±1.7
92.5±12.9
TBD
6.7±1.4 11.5±1.9bc 7.0±0.9 25.1±2.2
94.7±20.2
PCL1
6.8±0.5 13.0±0.4ab 7.3±1.4 27.2±2.8
102.5±12.8
PCL2
7.9±1.7 12.8±1.6ab 6.8±1.9 26.5±2.7
99.7±5.3
CTL
7.4±0.6 10.3±1.8c 7.0±3.3 24.7±4.9
92.9±3.9
MTF
6.7±2.1 14.1±1.9a 7.2±1.3 28.0±2.6
105.4±8.3 *Mean values followed by equal letters in the columns, are not significantly different according to Fisher´s LSD
(least significant difference) at P= 0.05.For those groups that had non-normal distribution, Kruskal-Wallis test has
been used to establish significant differences by comparing medians at the 95.0% confidence level(P<0.05).
La presencia de telaraña en el cultivo se detectó al final de la segunda flor (día 32), en un
bloque del tratamiento CI (control inoculado) (Tabla 21). Posteriormente, al inicio de la tercera flor
(día 35 tras aplicar la cobertura) la enfermedad se manifestó en algunos bloques más,
V. Control químico
93
generalizándose al final de esta flor en todos los tratamientos. Esta tardía expresión de la enfermedad
ha condicionado el descenso de rendimiento ocasionado por la telaraña, que fue apenas perceptible,
como refleja la ausencia de diferencias significativas entre los bloques (Tabla 20). Al final del ciclo
de cultivo,en el día 44 tras la cobertura, el 67% de los bloques del CI, 83% de TBD, 67% de PCL1,
33% de PCL2, 33% de CLT y 83% de MTF presentaban infección por telaraña (Tabla 21). En este
segundo ensayo, el 33% de los bloques control no inoculados presentaron síntomas de infección.
La Tabla 21 recopila la precocidad de la infección (en días trascubrir) y el número de
bloques afectado tras la cosecha de la tercera florada en los tratamientos inoculados en el ensayo B.
Tabla 21. Precocidad de la telaraña y número de bloques
infectados al final del ciclo de cultivo (%). Ensayo B.
Table 21. Earliness of cobweb and number of infected
blocks at the end of the crop cycle (%). Trial B.
Treatments *Earliness (days)
No of infected blocks (%)
CI 32
4 (67%)
TBD 35
5 (83%)
PCL1 39
4 (67%)
PCL2 35
2 (33%)
CTL 35
2 (33%)
MTF 39
5 (83%) *Earliness: days after casing.
El Gráfico 20b muestra el valor medio de la superficie afectada por la enfermedad a lo largo
de la cosecha en los tratamientos aplicados en el ensayo B. La evolución de la superficie colonizada
por la enfermedad a lo largo del ciclo de cultivo sigue un patrón común al igual que en el ensayo A,
incrementándose conforme avanza el ciclo (Anexo, Gráfico 24b). Debido a la tardía aparición de la
enfermedad en este ensayo la superficie colonizada por telaraña al final de la tercera flor no fue muy
significativa. El tratamiento CI resultó el más afectado con el 13% de la superficie colonizada por
telaraña. En el resto de tratamientos la superficie invadida fue: 0,3% en MTF; 8,1% en TBD; 5.2%
en CTL; 3,6% en PCL2 y 0,3% en PCL1. Se ha observado que la superficie colonizada por telaraña
sigue aumentando conforme avanza el ciclo de cultivo, siendo significativo el impacto de la
enfermedad una vez cosechada la 3ª flor. El ensayo se prolongó hasta la cuarta flor para analizar la
evolución de la enfermedad en la superficie de cultivo. La telaraña llegó a colonizar el 18% del C,
47,5% de CI, 35% de TBD, 26% de PCL1, 23% de PCL2, 9,2% de CTL y 40% de MTF,
previamente a la retirada del sustrato agotado.
Como ya ha sido comentado anteriormente, en este segundo ensayo donde la aparición de la
enfermedad fue muy tardía, no se registraron diferencias de rendimiento estadísticamente
significativas entre tratamientos (Tabla 20). Al finalizar la tercera flor la superficie de cultivo
invadida por la enfermedad en todos los tratamientos fue también reducida, con un porcentaje de
infección en superficie inferior al 13% (CI) (Gráfica 20b). Sólo los bloques TBD y CTL muestran
una infección de cierta consideración en superficie, en comparación con el control inoculado: 8,1 y
5,2% respectivamente, registrando una eficacia más reducida que el resto para prevenir la
colonización de la superficie por el patógeno. Los valores de eficacia obtenidos son comparables por
el impacto reducido de la telaraña aun cuando los valores absolutos (datos no mostrados) difieren. En
este ensayo debido a la dispersión de datos y la baja tasa de infección registrada expuesta en los
V. Control químico
94
resultados, no es posible extraer conclusiones en términos de eficacia de los tratamientos para
prevenir y controlar la telaraña.
4. DISCUSSION
4.1. IN VITRO SENSITIVITY OF CLADOBOTRYUM MYCOPHILUM AND AGARICUS
BISPORUS TO FUNGICIDES
C. mycophilum showed the highest sensitivity towards prochloraz-Mn. ED50 values
calculated for the two benzimidazole fungicides tested (thiophanate-methyl and thiabendazole) are
higher; they do not present statistical significant differences between them, although they differ
statistically with prochloraz-Mn and chlorothalonil. Several researchers have previously reported the
low sensitivity of the pathogen towards benzilmidazole fungicides, as well as the occurrence of
resistance symptoms (Grogan y Gaze, 2000; McKay et al., 1998). Dactylium dendroides resistance
to thiophanate-methyl and thiabendazole was already reported in England in 1983 (Lockley and
Gay, 1983). A previous in vitro assay revealed the ability of all the Cladobotryum spp. isolates
evaluated to tolerate thiophanate-methyl (Potočnik et al., 2008). Looking for the reasons of a
cobweb epidemy in Australia, all the Cladobotryum spp. isolates tested were resistant to
thiabendazole (Fletcher et al., 2004). C. mycophilum isolates resistant to thiophanate-methyl have
been also described in USA, the majority of them also manifested resistance against thiabendazole.
In addition, the authors showed that older isolates tested were more sensitive to thiabendazole and
thiophanate-methyl; this shift in fungicide sensitivity of C. mycophilum is associated with an
outbreak of cobweb on Pennsylvania farms (Beyer y Kremser, 2004). Accordingly to these results,
during our study isolates resistant to thiabendazole and thiophanate-methyl have been detected
among the isolates collected in recent years (2011 and 2012).
Since the resistance to benzimidazole fungicides in C. dendroides is characterized by a
point mutation causing an amino acid substitution (McKay et al., 1998), it is plausible that some of
the strains that show symptoms of resistance towards thiabendazole, according to Grogan and Gaze
(2000), could be also resistant to thiophanate-methyl, as evidenced by the strains CM13 (KP698966)
and CM24 evaluated in this study. These strains that exhibited reduced sensitivity to benzimidazole
fungicides, and can be considered as resistant (Grogan and Gaze, 2000), showed the highest
sensitivity to prochloraz-Mn.
Two isolates [CM12 (KP698965) and CM14 (KP698967)] were also slightly more tolerant
to prochloraz-Mn than average response. These were curiosly collected in 2011 and 2012, which
could indicate that among the youngest strains evaluated there are some of them less sensitive to
prochloraz-Mn. This is consonant with other studies that reported some degree of tolerance among
Cladobotryum spp. isolates to prochloraz-Mn (Grogan et al., 1996; Grogan y Gaze, 2000; Fletcher y
Gaze, 2008), although the isolates tested by Grogan and Gaze (2000) to check symptoms of
resistance in Cladobotryum to prochloraz ranged from 0.14 to 7.8 μg mL-1
, while our isolates range
from 0.001 to 0.214 μg mL-1
. The in vitro response of the isolates tested against prochloraz-Mn was
quite scattered, indicating a potential threat of resistant strains to the fungicide, which must be
V. Control químico
95
considered as a challenge. These findings coincide with the results obtained by previous works.
Lane et al. (1991) showed variations in the sensitivity of Dactylium dendroides to prochloraz-Mn.
Sensitive strains of Cladobotryum dendroides to prochloraz-Mn were also reported in Australia
(with ED50<2 μg mL-1
), although their sensitivity varied with the farm, in one of the farms tested
isolates which showed ED50>2 μg mL-1
where also detected (Fletcher et al., 2004). A survey of
fungicide resistance among C. dendroides and C. mycophilum Type I and II showed variable ED50
values for prochloraz-Mn (Grogan y Gaze, 2000). Since some tolerance to the active ingredient has
been detected in the trials, this product should be applied responsibly.
The ED50 values obtained for chlorothalonil are very homogeneous; all the isolates have
been susceptible to the fungicide, despite the mean value of ED50 is greater than the calculated for
prochloraz-Mn. Our results are in consonant with Potočnik et al. (2009c), who pointed out the good
toxicity achieved with chlorothalonil against Serbian isolates of C. dendroides. Beyer and Krenser
(2004) observed that an older isolate of C. mycophilum Type II, tested against chlorothalonil, was
more tolerant when compared to younger isolates, they suggest that the fungicide torerance of this
pathogen has changed. This is consonant with our observations, in this work one of the oldest
isolates tested, collected in 2008, showed the highest ED50 (the least sensitive).
Selectivity indexes obtained in the experiments prove that prochloraz-Mn is the active
substance with the highest selectivity between pathogen and host among the evaluated. Somewhat in
line with the results obtained by Potočnik et al. (2009a), who reported the good selectivity of
prochloraz-Mn to cope with Cladobotryum dendroides isolates. Thiabendazole also shows an
adequate selectivity towards the pathogen; its reduced toxicity to the host along with the fact of its
high persistence in the casing layer (Grogan y Jukes, 2003) are positive aspects of this fungicide to
consider against sensitive strains, although the ED50 and FR values calculated for thiabendazole
were the highest. So far, for example, a wild-type C. mycophilum was efficiently controlled by
thiabendazole in vivo (Grogan, 2006). Accordingly to Grogan and Gaze (2000), isolates which are
only weakly-resistant to thiabendazole, such as C. mycophilum, may well be controlled by this
fungicide. Chlorothalonil displayed the worst selectivity among the evaluated substances, being
significantly greater its toxicity in vitro against A. bisporus in respect to the other fungicides. These
results are in agreement with the obtained by Potočnik et al. (2009b), who analyzed the in vitro
sensitivity of fungicides against two commercial strains of A. biporus, reporting that chlorothalonil
showed more toxicity than prochloraz and thiophanate-methyl. So, the use of this fungicide could
retard or, in some degree, diminish the production. This result also agrees with the expressed by
other authors in respect to the moderate mycotoxicity of chlorothalonil towards A. bisporus
(Fletcher, 2002; Beyer y Kremser, 2004).
4.2. COBWEB CONTROL BY FUNGICIDES IN AGARICUS BISPORUS CROPS
Disease patches over the casing layer, when not properly treated, tend to grow radially
outwards and to colonize larger crop surface. Punctual outbreaks have been controlled effectively by
placing a damp paper over the patch and spreading salt on the affected area, sealing the edges of the
covered area at first to prevent the spread of pathogenic conidia. This will avoid sporulation and
disrupt the pathogen growth (Fletcher y Gaze, 2008; Adie, 2000). As cited previously in this working
memory, currently it is not recommended to apply salt over the patches of disease, since there could
V. Control químico
96
be food safety implications; instead, only a thick damp paper over the punctual patches is
recommended to prevent the spread of the harmful conidia (Pyck y Grogan, 2015).
However, the presence of cobweb in non-inoculated blocks during our trials showed that it
took place a cross contamination from inoculated blocks. This could be a result of the experimental
design; since the cobweb patches behavior was analyzed for 24h after detection. Subsequently they
were covered, but some of them showed significant sporulation already when treated. So, these
conidia could have been released and disseminated through the mushroom growing room to form
secondary colonies in non-inoculated control blocks. In accordance with Grogan (2006) it is very
difficult to control cross-contamination in vivo when working with C. mycophilum. The presence of
pathogenic conidia in air was also noticed because of the spotting symptoms observed along the
cycle. Some mushrooms exhibited lesions and spots due to the germination of harmful conidia in the
cap surface, these mushrooms were rejected to determine the crop yield (Fletcher and Gaze, 2008).
The nature of the substrates and casing material employed (as proved in pathogenicity trials. Chapter
IV) ensures that they were free of disease once introduced in the mushroom units previously to
artificial inoculation.
Cobweb disease became widespread at the end of the cycle, when every treatment showed
infection in some of the blocks. The evolution of the crop surface colonized by the pathogen
displayed a progressive pattern along the crop cycle (Annex, Graph 24). The earlier the precocity of
the infection, the larger was the crop surface colonized. In each of the trials, those treatments that
showed an earlier infection resulted in greater crop surface infected at the end of the crop cycle. In
agreement with McKay et al. (1999) if an early infection is inadequately controlled the disease
becomes more dangerous.
In both trials the crop surface affected within the inoculated control was very significant.
While, in treatments where fungicides have been applied, it is remarkable the very poor control
achieved in both assays by using thiabendazole. This aspect could be intrinsically related to the
pathogen ability to generate resistance towards thiabendazole, as stated the high number of C.
mycophilum isolates that have been previously reported as highly tolerant to thiabendazole (Grogan y
Gaze, 2000; Beyer y Kremser, 2004). It is also important to remark that in agreement with previous
reports, thiabendazole seems to act rather as a fungistatic chemical and not so much as a fungicide
(Sokolski, 1981; Eicker, 1984). Thiabendazole does not show toxicity against A. bisporus, no effect
on production was noted when the phytotoxic effect of this fungicide on mushroom mycelium was
evaluated, owing to its specific mode of action (Rucklidge, 1978; Navarro et al., 2011), so yield
losses are due to the disease impact but to the action of the fungicide over the host.
The PCL1 treatment has been proved as the most effective to control the cobweb by
preventing crop surface colonization. Prochloraz-Mn appears to be non-toxic against A. bisporus at
the application rates. A previous work has reported that this fungicide does not have mycotoxic
effects on yield of A. bisporus hybrid strain Silvan A15 when incorporated into casing or applied as a
drench (Shamshad et al., 2009). However, toxicity of prochloraz-Mn against the host mycelium has
been noted, with yield losses of around 10%, as well as with thiophanate-methyl (Navarro et al.,
2011). MTF, which was the least effective treatment in the second trial, has showed more efficiency
than TBD and CTL during the first. On the contrary, CTL was very inefficient in both trials. When
the toxicity of CTL against the host mycelium has been evaluated, losses up to 7% have been
registered (data non published).
V. Control químico
97
Despite BE of the crop in trial B did not showed significant differences between treatments,
CTL treatment recorded the smallest BE among fungicide treatments in trial A, where significant
differences have been detected. This suggests that the lowest specificity of this product could have
conditioned the mushroom production (Fletcher, 2002; Beyer y Kremser, 2004). Since chlorothalonil
is a broad-spectrum protectant fungicide, it can definetly act against the host mycelium (Gandy and
Spencer, 1978). Non-inoculated controls together with PCL1 have shown the highest BE values, with
significant differences in trial A in respect to CTL and TBD, the two least productive treatments. As
Gogran (2006) reported, prochloraz-Mn is effective to control cobweb growth on the casing, both
thiabendazole sensitive and thiabendazole resistant strains, although prochloraz-Mn was not effective
to control spotting symptoms.
Regarding efficacy of the fungicides, the first trial, where disease precocity and incidence
was higher, showed that PCL1 was efficient to control the disease both in production and colonized
surface, while on the other hand TBD and CTL remained inefficient to control the pathology.
Sensitivity to fungicides is generally higher in vitro than in vivo. Problems with mushroom
mycelium growth caused by fungicide residues in casing layer have to be taken seriously (Potočnik
et al., 2009b). By using so few fungicides, the pathogens are constantly subjected to the same
chemicals and the success of a pathogen to develop resistance through mutation increased (Fletcher
and Jaffe, 1993). It is necessary to highlight the importance of a correct use of available substances
to prevent resistance occurrence, combining fungicides application with a correct management of
hygiene and disinfection within mushroom facilities to accomplish an integrated control of cobweb
disease.
Conclusion
99
COnCLUSIONs
The main conclusions obtained in this Doctoral Thesis are:
Cobweb disease usually appears in Spanish button mushroom crops when they age. Crops in the
third flush are much more likely to express the infection than those of the second and first flushes.
An early occurrence can lead to a widespread infection at the end of the crop cycle. The pathology
may appear at any time during the year although its presence and severity are higher in autumn
and winter than in spring and summer; it is especially common in autumn. No significant
differences were registered as regard the disease´s emergence when checking the casing materials
analyzed during the field sampling.
Morphological, molecular and phylogenetic characterisation of studied isolates, the absence of the
characteristic camphor odour when planted on PDA, and the fact that some of the isolates tested
showed symptoms of resistance to benzimidazole fungicides, strongly suggests that the specimens
belong to the species described as Cladobotryum mycophilum and Cladobotryum mycophilum
Type II.
The pathology described in this thesis causes losses of production at the affected facilities, losses
increasing as the disease spreads. If an outbreak is not controlled properly, it grows radially
outwards in such a way that it can colonize a large crop surface and adjacent carpophores.
The progressive replacement of traditional casing materials by peat-based casings could have
caused a spike of cobweb disease. A higher moisture degree favours pathogenic spore germination
and the rapid development of the disease. The research shows that peat-based casing, with its
higher water holding capacity, is more prone to suffer cobweb.
Prochloraz-Mn, currently the most widely used fungicide to prevent cobweb by the mushroom
industry, was the most effective at controlling cobweb disease during the trials conducted.
If the patches of disease are not treated as soon as they are detected, they will sporulate profusely,
generating harmful conidia that can be distributed throughout the farm, producing secondary points
of infection and spotting the surface of carpophores, resulting in production losses and crop
depreciation.
In this work different degree of sensitivity to prochloraz-Mn has been detected. The reduced range
of active substances approved to fight the pathology in question, as well as the recalcitrant use of
prochloraz-Mn to cope with the major fungal diseases of button mushroom may transform these
pockets of resistance into real threats. Indeed, the emergence of resistant strains has been
detected in this work, since some of the isolates showed resistance symptoms to the
benzimidazole fungicides analyzed. These isolates resistant to the bencimidazole fungicide
should be classified as Cladobotryum mycophilum Type II.
ANEXO
Anexo
102
1. TÉCNICAS DE AISLADO Y CONSERVACIÓN
Los 25 aislados de Cladobotryum mycophilum empleados en esta memoria fueron reaislados
a partir de cuerpos fructíferos infectados o manchas de telaraña registradas sobre la cobertura en
cultivos comerciales de la comarca de La Manchuela (Castilla-La Mancha) y de La Rioja.
a) Cuerpos fructíferos: En cultivos comerciales se han recolectado carpóforos con síntomas de
infección. Los cuerpos fructíferos seleccionados se lavan superficialmente con agua para
eliminar los restos de cobertura e impurezas. En cabina de flujo laminar se toma la muestra
empleando un bisturí convenientemente esterilizado. Tomar pequeñas porciones (aprox. 2x5x5
mm) de la zona que presenta síntomas de infección, sembrando las muestras en medio de
cultivo agar-patata dextrosa (PDA) dispensado en placas Petri de 90 mm de diámetro.
b) Manchas sobre la cobertura: Mediante una espátula se retira en bandejas de polietileno el
fragmento de cobertura donde se encuentra la mancha, que preferiblemente debe presentar
buena esporulación. Se toman las muestras en cabina de flujo laminar utilizando un asa de
siembra convenientemente esterilizada. Por contacto se transfieren esporas y micelio de la zona
superficial del hongo, evitando la cobertura, a placas Petri con medio PDA
Las placas se sellan con Parafilm® (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago,
Illinois, EE.UU) para prevenir la desecación del medio y se incuban a 22ºC en oscuridad.
Los aislados se han conservado en cámara de cultivo, en oscuridad a 22ºC. Se replican
periódicamente en una nueva placa, empleando medio PDA, cada 15 días. El replicado se realiza
tomando pequeños fragmentos de medio, de la zona externa de la placa, que son transferidos a una
nueva placa enfrentando la superficie donde ha crecido el hongo con el medio de la placa nueva.
También puede replicarse la cepa transfiriendo con un asa de siembra parte de los conidios o
fragmentos de micelio a la nueva placa.
Cada uno de los aislados se conserva también en tubo. Para ello se rellenan tubos de ensayo
de vidrio esterilizados y rellenados con medio PDA estéril, preparado según se ha descrito con
anterioridad. Los tubos se rellenan hasta 3 o 4 centímetros por debajo de la boca y se dejan
solidificar inclinados para aumentar la superficie disponible para el crecimiento del hongo.
Sembramos los tubos con asa de siembra estéril en cabina de flujo laminar. Se seleccionan para ello
placas madre con 5 días de antigüedad y un crecimiento normal de las que se toman pequeños
fragmentos de micelio o esporas procurando evitar transferir el medio de cultivo. Los tubos se sellan
con Parafilm® (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, Illinois) y se dejan crecer en cámara
de cultivo a 22ºC y oscuridad. Cuando el micelio ha colonizado el medio del tubo y se observa
esporulación se aplica una cobertura de 2 o 3 cm de aceite de vaselina (Panreac®, Castellar del
Vallès, Barcelona, España) estéril (se esteriliza en autoclave durante 2 horas a 121ºC) y se sellan
nuevamente los tubos con Parafilm®. Los aislados en tubo se conservan refrigerados en nevera a 2ºC
y se replican a los 6 meses.
Los aislados también se han conservado en solución de glicerol al 10%. Para ello se rellenan
tubos criogénicos de 2 mL con la solución estéril de glicerol al 10% (en autoclave a 121ºC y 1 at
durante 20 min). En cada tubo se aplica 1 mL de glirerol al 10% y se introducen pequeños
fragmentos de la parte externa de la colonia de C. mycophilum con 5 días de antigüedad crecida en
Anexo
103
PDA. Los aislados se conservan en nitrógeno líquido, congelador de -70 o -80ºC o bien en nevera a
2ºC. Se replican a los 6 o 12 meses. Para ello se vacía el contenido del tubo en una placa con PDA y
se retira el glicerol con una pipeta, incubando a continuación la colonia.
Tanto el aislado como el replicado y conservación de los especímenes debe realizarse en
cabina de flujo laminar convenientemente esterilizada. El material empleado para la manipulación
del hongo debe ser igualmente estéril. Es conveniente emplear un mechero de alcohol en la cabina de
cultivo para facilitar una atmósfera libre de potenciales agentes contaminantes.
Medios de cultivo empleados
- PDA: Este medio de cultivo se ha empleado fundamentalmente para el crecimiento, conservación y
evaluación de los distintos aislados de C. mycophilum estudiados. 30 g de agar-patata dextrosa
(PDA; Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) disueltos en un litro de agua destilada. Los medios fueron
esterilizados en autoclave a 121ºC y 1 atmósfera de presión durante 20 min. Posteriormente se
dispensaron en las placas Petri de 90 mm de diámetro tras enfriarlos hasta 40-50 ºC.
- MEA+fungicida: Este medio de cultivo fue utilizado para realizar los ensayos de sensibilidad in
vitro de C. mycophilum frente a los distintos fungicidas evaluados. 5 g de extracto de malta (ME;
Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) + 10 g de agar (Agar Technical (Agar nº3); Oxoid, Basingstoke,
Inglaterra) + 0,5 L de agua destilada. Los medios fueron esterilizados en autoclave a 121ºC y 1
atmósfera de presión durante 20 min., y una vez enfriados, en torno a 40 ºC se añadió la
concentración de fungicida adecuada para obtener las concentraciones finales requeridas. A las
placas control se les añadió agua destilada estéril. Tras agitación magnética intensa los medios
fueron dispensados en placas Petri tipo canadiense (con marca de cruz) de 90 mm de diámetro.
- Agar compost+fungicida: El medio agar compost fue el empleado para realizar los ensayos de
sensibilidad in vitro del hospedador, A. bisporus, frente a las sustancias activas evaluadas, así como
para el crecimiento y conservación de las variedades empleadas en el estudio. 50 g en peso seco de
compost germinado y triturado (el compost frescose introduce en una estufa a 60ºC durante 12 horas
y se tritura en un molinillo eléctrico hasta obtener un polvo homogéneo) para un litro de agua
destilada. Se esteriliza la mezcla en autoclave a 121ºC y 1 atmósfera de presión durante 20 minutos.
Posteriormente tras dejar decantar el compost se filtra el sobrenadante dos veces a través de doble
capa de muselina y enrasamos a un litro con agua destilada. El medio se prepara añadiendo 20 g de
agar (Agar Bacteriológico (Agar Nº. 1); Oxoid, Basingstoke, England) por cada litro de extracto
acuoso de compost. Los medios se esterilizan nuevamente en autoclave a 121ºC y 1 atmósfera de
presión durante 20 min., y una vez enfriados, en torno a 40 ºC, se añade la concentración de
fungicida requerida.
Anexo
104
2. INCIDENCIA
2.1. Instalaciones visitadas
Figura 18. Locales tradicionales
para cultivo de champiñón en
Castilla-La Mancha.
Figure 18. Traditional facilities
for mushroom cultivation in
Castilla-La Mancha.
Figura 19. Invernaderos para
cultivo de champiñón.
Figure 19. Plastic tunnels for
mushroom cultivation.
Anexo
105
Figura 20. Naves industrials para cultivo de champiñón.
Figure 20. Industrial buildings for mushroom cultivation.
Figure 21. Instalaciones tipo holandés de paneles aislantes tipo sandwich..
Figure 21. Dutch design, made from isolating panels.
Anexo
106
2.2. Registro metereológico durante el muestreo
Gráfico 21. Condiciones climáticas registradas en la comarca durante el periodo de muestreo. Datos
provistos por la estación meteorological del CIES (Quintanar del Rey). a) Temperatura media (ºC). b)
Humedad relativa (%). c) Precipitación acumulada (mm). d) Velocidad del viento (m s-1).
Graph 21. Weather conditions recorded in the region during the sampling period. Data provided by
the weather station of the CIES (Quintanar del Rey). a) Average temperature (ºC). b) Relative humidity
(%). c) Accumulated precipitation (mm). d) Wind speed (m s-1).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
5
10
15
20
25
30
Autumn Winter Spring Summer Autumn Winter Spring Summer
2011-2012 2012-2013
a) Average temperature b) Relative humidity
Av
era
ge
tem
per
atu
re (
ºC) R
elativ
e hu
mid
ity (%
)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
50
100
150
200
250
Autumn Winter Spring Summer Autumn Winter Spring Summer
2011-2012 2012-2013
c) Accumulated precipitation d) Wind speed
Acc
um
ula
ted
pre
cip
ita
tio
n (
mm
)W
ind
speed
(m/s)
(CIES, Quintanar del Rey)
(CIES, Quintanar del Rey)
Anexo
107
2.3. Análisis de datos
Tabla 22. Datos del muestreo. Número de puntos de muestreo registrados atendiendo a cada factor evaluado.
Table 22. Sampling data. Number of sampling points regarding each of the factors considered.
1ª FLUSH 2ª FLUSH 3ª FLUSH TOTAL TOTAL
1Abs.
2Pres. TOTAL
Abs. Pres. TOTAL
Abs. Pres. TOTAL
Abs. Pres.
201
1-2
012
AUTUMN Mineral
10 2 12
11 5 16
5 23 28
26 30 56
66
254
Peat
1 1 2
3 1 4
3 1 4
7 3 10
WINTER Mineral
21 3 24
14 9 23
9 21 30
44 33 77
81 Peat
2 0 2
0 0 0
0 2 2
2 2 4
SPRING Mineral
12 2 14
13 2 15
7 7 14
32 11 43
55 Peat
5 0 5
3 0 3
2 2 4
10 2 12
SUMMER Mineral
6 0 6
5 3 8
4 6 10
15 9 24
52 Peat
8 0 8
7 0 7
4 9 13
19 9 28
20
12-2
01
3
AUTUMN Mineral
7 1 8
15 3 18
11 9 20
33 13 46
73
253
Peat
7 1 8
2 7 9
3 7 10
12 15 27
WINTER Mineral
12 0 12
9 1 10
6 10 16
27 11 38
56 Peat
2 0 2
7 2 9
4 3 7
13 5 18
SPRING Mineral
8 1 9
4 0 4
9 1 10
21 2 23
64 Peat
14 0 14
12 1 13
9 5 14
35 6 41
SUMMER Mineral
7 0 7
3 2 5
5 0 5
15 2 17
60 Peat
12 0 12
12 2 14
8 9 17
32 11 43
TOTAL Mineral
83 9 92
74 25 99
56 77 146
213 111 337
507 Peat 51 2 53 46 13 59 33 38 71 130 53 183
1Abs.: Absence of disease in crop.
2Pres.: Presenceof disease in crop
Anexo
108
2.4. Severidad estacional de la infección
50%
24%
12%
8%
6%
AUTUMN 2011/12: 66 crops
0 1 2 3 4
62%16%
7%
11%
4%
AUTUMN 2012/13: 73 crops
0 1 2 3 4
a
71%
11%
9%
7% 2%WINTER 2012/13: 56 crops
0 1 2 3 4
b
57%
18%
15%
5%
5%
WINTER 2011/12: 81 crops
0 1 2 3 4
76%
14%
2%4% 4%
SPRING 2011/12: 55 crops
0 1 2 3 4
87%
8%5%
SPRING 2012/2013: 64 crops
0 1 2 3 4
c
76%
14%
2% 4%4%
SUMMER 2011/12: 52 crops
0 1 2 3 4
78%
15%
5%
2%SUMMER 2012/13: 60 crops
0 1 2 3 4
d
Gráfico 23. Severidad estacional
de la infección en cultivos de
champiñón. a) Otoño (2011/12;
2012/13). b) Invierno (2011/12;
2012/13).c) Primavera (2011/12;
2012/13). d) Verano (2011/12;
2012/13).
Graph 22. Severity of disease
concerning degree of infection (%)
along the study. a) Autumn
(2011/12; 2012/13). b) Winter
(2011/12; 2012/13). c) Spring
(2011/12; 2012/13). d) Summer
(2011/12; 2012/13).
Anexo
109
3. IDENTIFICACIÓN
3.1. Caracterización de las fiálides
Tabla 22. Dimensiones de las fiálides en los aislados estudiados.
Table 23. Phyalide measurements of the evaluated strains.
Strains Length (µm) Base width (µm) Apexwidth (µm)
min [y-x-y] max min [y-x-y] max min [y-x-y] max
CM1 13.5 20.2-30.6-44.9 50.2 4.1 4.4-5.4-6.5 7 2.2 2.2-3.2-4.3 4.7
CM2 16.1 19.0-31.4-43.7 47.1 3.9 4.5-6.4-8.8 9 1.5 1.8-3.0-4.4 4.9
CM3 15.5 24.1-33.4-47.1 53.9 3.6 3.7-5.0-6.5 7 1.4 1.7-2.9-4.6 4.8
CM4 13.6 19.4-26.4-34.7 36.2 4.1 4.4-5.7-7.4 9 2.6 2.6-3.4-4.3 4.9
CM5 22.2 25.7-35.4-47.5 53.0 3.0 3.9-5.0-6.5 7 1.3 1.8-2.6-3.6 4.2
CM6 22.6 25.5-34.6-48.3 67.0 3.3 4.0-5.0-6.4 7 1.3 1.5-2.3-3.4 4.2
CM7 18.3 22.0-29.5-45.9 50.8 3.2 3.9-5.8-7.5 8 1.4 1.7-2.9-3.7 4.1
CM8 11.1 16.0-29.1-40.6 48.6 2.5 3.6-5.7-7.3 9 1.4 1.5-2.6-3.7 4.0
CM9 14.0 16.1-26.5-37.7 42.4 3.0 3.2-5.5-7.5 8 1.4 1.5-2.6-3.6 4.0
CM10 23.9 26.0-36.9-49.3 55.2 3.5 4.0-5.5-6.7 7 1.3 1.5-2.2-3.2 3.7
CM11 13.4 18.7-29.0-37.2 43.4 4.6 5.0-6.2-7.5 8 1.5 1.9-2.6-3.8 4.3
CM12 18.8 23.6-31.7-42.9 45.2 3.7 4.3-5.3-6.5 8 1.2 1.5-2.5-3.4 3.6
CM13 14.1 15.1-27.5-42.2 45.5 2.5 3.3-4.6-6.5 8 1.4 1.5-2.2-3.1 4.1
CM14 21.1 24.4-33.8-45.3 54.1 3.7 4.3-5.3-6.9 7 1.6 1.9-2.7-3.6 3.8
CM15 16.4 19.4-26.6-38.6 47.6 3.2 4.1-5.6-7.1 8 1.9 2.1-3.0-4.0 4.6
CM16 12.4 15.1-22.7-32.5 41.7 3.3 3.9-5.3-7.0 7 1.2 2.1-3.0-4.1 4.9
CM17 18.4 22.1-35.0-46.1 56.6 3.6 4.1-5.4-7.1 9 1.3 1.8-2.5-3.3 3.9
CM18 19.4 23.2-30.3-37.7 44.3 4.2 4.7-5.8-7.4 8 1.6 2.1-3.1-4.3 4.7
CM19 23.3 26.0-36.4-49.2 51.9 4.0 4.9-6.4-8.0 9 1.6 1.6-2.5-3.5 4.0
CM20 19.5 26.7-36.5-45.1 51.3 3.8 4.1-5.2-6.5 7 1.3 1.5-2.2-3.1 3.6
CM21 17.8 19.8-27.5-35.3 38.3 4.0 4.3-6.1-7.6 9 1.3 2.1-2.9-4.1 4.4
CM22 14.0 16.3-25.7-36.0 42.8 3.6 4.1-5.7-7.3 8 1.3 1.5-2.7-4.1 4.4
CM23 17.5 21.1-27.9-36.2 44.9 3.8 4.5-5.8-7.1 7 1.4 2.0-3.0-4.4 4.9
CM24 10.1 14.2-25.5-37.2 47.8 2.9 3.4-5.1-6.5 7 1.4 1.5-2.7-3.7 4.4
CM25 15.2 18.6-28.7-43.3 60.0 3.9 4.7-6.3-8.3 9 2.6 2.8-3.4-4.4 5.2
Average 16.9 18.3-30.3-44.3 48.8
3.6 3.9-5.6-7.4 7.9
1.5 1.6-2.8-4.0 4.3
n=50 (No of phyalides measured for each strain).
[y-x-y]: Range (y) where 90% of data are considered. x: Mean value.
Anexo
110
3.2. Caracterización de los conidios
Tabla 23. Longitud y anchura de conidios en los aislados evaluados.
Table 24. Conidia length and width of the evaluated strains.
Strains Length (µm) Width (µm)
min [y-x-y] max min [y-x-y] max
CM1 12.0 14.6-20.2-24.5 28.4
6.3 7.1-8.7-10.6 11.7 CM2 14.7 16.2-21.8-28 30.3
6.2 6.8-8.8-10.6 11.2
CM3 14.1 16.8-22.1-26.8 29.0
5.3 6.7-8.5-10.1 11.0 CM4 9.4 13.6-18.1-23.2 26.4
5.9 7.3-9.3-11.0 22.9
CM5 15.6 17.3-22.3-26.4 27.6
5.1 7.2-8.8-10.4 11.4 CM6 10.6 14.6-18.8-24.6 27.7
5.4 6.9-8.9-10.6 11.7
CM7 15.0 17.1-21.0-25.2 28.0
7.2 7.7-9.4-11.0 11.3 CM8 15.0 16.1-19.9-24.8 27.6
7.2 7.9-9.5-11 12.2
CM9 13.7 15.7-19.0-22.9 27.9
5.5 7.1-8.9-11.0 13.5 CM10 13.9 14.7-20.9-25.5 29.9
5.9 6.6-8.4-10.4 11.0
CM11 13.5 14.5-18.8-23.5 26.2
4.2 6.7-8.2-9.6 10.4 CM12 13.5 14.5-19.0-23.8 26.7
4.4 5.8-7.5-9.1 10.3
CM13 5.8 7.4-15.2-22.6 27.1
2.4 3.1-6.5-9.2 10.4 CM14 10.4 13.9-17.9-22.4 24.5
5.2 6.2-8.0-10.3 11.3
CM15 12.7 13.9-18.5-24.3 26.1
5.1 6.7-8.5-10.6 11.5 CM16 10.7 14.3-19.0-23.5 24.2
4.4 6.2-8.0-9.9 11.1
CM17 13.5 15.2-20.5-26.0 27.9
5.2 6.0-7.7-9.4 9.9 CM18 14.3 16.1-20.4-25.8 30.0
6.7 7.2-9.1-11.2 13.3
CM19 11.6 12.9-16.5-20.1 21.5
3.5 5.9-7.4-9.2 10.0 CM20 11.4 17.0-21.0-25.5 28.3
5.2 7.3-8.4-9.7 10.8
CM21 12.4 15.7-19.6-23.2 27.1
5.3 6.2-7.9-9.3 11.4 CM22 11.3 14.3-18.3-21.9 23.3
5.7 6.5-8.1-10.1 11.0
CM23 14.3 16.3-21.2-26.9 28.9
6.6 7.4-9.1-10.8 12.3 CM24 12.9 13.4-17.0-20.9 22.0
4.6 6.1-7.7-9.1 9.9
CM25 12.4 13.9-19.6-24.8 26.5
4.6 6.0-8.6-10.9 11.9
Average 12.6 14.3-19.5-25.2 26.9
5.3 6.2-8.4-10.6 11.7 n=100 (No of conidia measured for each strain).
[y -x- y]: Range (y) where 90% of data are considered. x: Mean value.
Tabla 24. Porcentaje de septos en los conidios.
Table 25. Percentage of septa in conidia.
Strains Septa
0 1 2 3
CM1
0% 100% 0% 0% CM2
5% 85% 6% 4%
CM3
0% 71% 16% 13% CM4
4% 57% 17% 22%
CM5
0% 79% 14% 7% CM6
4% 51% 30% 15%
CM7
1% 83% 11% 5% CM8
10% 50% 22% 18%
CM9
11% 80% 7% 2% CM10
8% 83% 7% 2%
CM11
5% 62% 12% 21% CM12
2% 76% 12% 10%
CM13
3% 84% 13% 0% CM14
10% 88% 2% 0%
CM15
22% 76% 2% 0% CM16
9% 72% 14% 5%
CM17
9% 88% 2% 1% CM18
4% 67% 21% 8%
CM19
13% 86% 1% 0% CM20
3% 61% 26% 10%
CM21
9% 89% 2% 0% CM22
5% 95% 0% 0%
CM23
6% 75% 10% 9% CM24
8% 83% 6% 3%
CM25
18% 80% 1% 1%
Average
7% 77% 10% 6%
n=100 (No of conidia measured for each strain).
Anexo
111
3.3. Secuencias de máxima similitud. Búsqueda MegaBlast
Tabla 25. Secuencias de la región ITS del ADNrn que muestran maxima similitud con los
aislados estudiados mediante búsquedas MegaBlast.
Table 26. Maximum likelihood of the DNArn ITS sequences from the studied strains through
MegaBlast searches.
Name Previous identification Maximum likelihood sequences in GenBank Base pairs identity
CM1 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 100% (579/579; 522/522)
CM2 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 99% (579/580; 559/560)
CM3 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 100% (579/579; 522/522)
CM4 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 100% (579/579; 522/522)
CM5 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 100% (579/579; 368/368)
CM6 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 100% (579/579; 511/511)
CM7 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809 99% (556/564)
CM8 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 98% (356/362)
CM9 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 99% (526/527; 518/519)
CM10 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 98% (311/316)
CM11 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 99% (556/559; 538/540)
CM12 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 99% (287/288)
CM13 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 99% (537/539; 489/491)
CM14 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 99% (510/513; 486/490)
CM15 Cladobotryum sp. - -
CM16 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809 99% (556/564)
CM17 Cladobotryum sp. - -
CM18 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 98% (286/293)
CM19 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF505112; Y17096; Y17095 99% (486/488)
CM20 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 99% (346/350)
CM21 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 97% (352/364)
CM22 Cladobotryum sp. - -
CM23 Cladobotryum sp. C.mycophilum: JF693809; AB527074 99% (355/359)
CM24 Cladobotryum sp. - -
CM25 Cladobotryum sp. - -
Anexo
112
4. PATOGENICIDAD
4.1. Colonización de la cobertura
Gráfico 24. Superficie de cultivo colonizada por telaraña en cada cobertura. a) Ensayo A. b) Ensayo B.
Graph 23. Crop surface colonized by cobweb in each casing material. a) Trial A. b) Trial B.
0
10
20
30
40
50
29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
Cro
p s
urf
ace
colo
niz
ed (
%)
Euroveen Tmix Infertosa Mineral
a
0
10
20
30
40
50
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41
Cro
p s
urf
ace
colo
niz
ed (
%)
Euroveen Tmix Infertosa
b
Anexo
113
4.2. Producción registrada en los ensayos de cabina
Tabla 26. Producción (kg m-2
) y eficiencia biológica, BE (kg dt-1
), del cultivo en los ensayos.
Table 27. Mushroom production and biological efficiency (BE: kg dt-1
) of crop obtained in the trials.
Trial Casing 1
st flush (kg m
-2) 2
nd flush (kg m
-2) 3
rd flush (kg m
-2) Total (kg/m
-2) BE
Room 1 Room 2 Room 1 Room 2 Room 1 Room 2 Room 1 Room 2 Room 1 Room 2
A
Euroveen
11.1±1.7 10.9±0.8b 12.3±1.5B 14.6±0.8A 13.9±2.9Aa 7.6±1.9B 37.4±2.6Aa 33.1±1.9B 176.1±12.3Aa 156.1±9.0B
Tmix
11.5±1.2 10.9±0.9b 12.7±1.1 13.7±1.3 12.3±2.8Aab 7.2±3.1B 36.5±3.3Aab 31.8±3.2B 171.7±15.7Aab 149.8±15.0B
Infertosa
10.8±0.6B 11.9±0.9Aa 12.8±1.1 13.5±1.2 10.3±3.6b 7.1±3.2 33.9±3.4b 32.5±3.3 159.9±16.3b 153.2±15.4
Mineral
6.6±1.3 9.9±0.8c 11.6±1.6 6.4±0.8 7.6±1.1c 8.3±3.0 25.8±1.5c 24.6±2.9 121.8±6.9c 115.9±13.7
B
Euroveen
12.1±0.7a 12.1±1.2a 8.4±1.4Ab 6.8±1.0Bb 5.7±1.5 5.5±1.8b 26.2±2.3Aa 24.5±1.9B 117.5±10.2a 109.5±16.8
Tmix
9.2±1.1b 8.8±0.9b 9.2±1.8a 7.7±2.1ab 6.2±1.4 6.5±1.4ab 24.5±1.4Ab 23.0±1.9B 109.7±6.4b 102.9±8.5
Infertosa
8.3±1.2b 7.8±1.1c 8.1±1.3c 8.2±1.5a 5.9±2.0 6.8±1.0a 22.3±1.8c 22.9±1.9 99.6±8.1c 102.5±8.6
Mineral 4.3±0.9c 2.3±1.9d 1.5±0.6d 1.3±0.6c 6.5±1.0 4.1±1.5c 12.2±1.3d 7.8±3.8 54.7±6.0d 34.9±16.8
1Room 1: Control room. Room 2: Inoculated room.
3Data are means ± SEMs (standard error of measurement).
*Mean values followed by different letters, lowercase in the columns per trial, are significantly different according to Fisher´s
LSD (least significant difference) at P= 0.05. For each flush, comparing Room 1 and Room2, mean values followed by different
uppercase letters in the rows (Trial A and Trial B respectively) differ significantly by Fisher´s LSD (least significant difference)
at P= 0.05. For those groups that had non-normal distribution, Kruskal-Wallis test has been used to establish significant
differences by comparing medians at the 95.0% confidence level (P<0.05).
Anexo
114
5. CONTROL QUÍMICO
5.1. Valores de dosis media efectiva
Tabla 27. Valores de ED50 de los aislados frente a clortalonil.
Table 28. ED50 values of the strains against chlorothalonil.
Strain ED50 Range
Strain ED50 Range
CM1 0.704 0.695-0.835
CM14 0.424 0.390-0.462 CM1 0.577 0.493-0.687
CM14 0.674 0.622-0.734
CM2 0.187 0.137-0.238
CM15 0.547 0.509-0.590
CM2 0.245 0.220-0.271
CM15 0.195 0.168-0.223
CM3 0.448 0.410-0.492
CM16 0.623 0.577-0.674
CM3 0.155 0.106-0.203
CM16 0.949 0.888-1.020
CM4 1.189 1.026-1.426
CM17 0.303 0.273-0.336
CM4 0.805 0.666-1.011
CM17 0.457 0.424-0.494
CM5 0.589 0.542-0.641
CM18 0.531 0.486-0.583
CM5 0.381 0.323-0.450
CM18 0.420 0.375-0.471
CM6 1.228 1.032-1.526
CM19 0.305 0.276-0.335
CM6 0.315 0.277-0.356
CM19 0.292 0.258-0.328
CM7 0.726 0.657-0.811
CM20 0.580 0.530-0.639
CM7 0.800 0.708-0.917
CM20 0.651 0.598-0.713
CM8 0.344 0.295-0.400
CM21 0.487 0.438-0.548
CM8 0.369 0.339-0.403
CM21 0.455 0.408-0.514
CM9 0.272 0.208-0.340
CM22 0.496 0.437-0.569
CM9 0.885 0.716-1.155
CM22 0.456 0.403-0.524
CM10 0.782 0.722-0.853
CM23 0.497 0.453-0.549
CM10 0.712 0.634-0.807
CM23 0.577 0.531-0.632
CM11 0.618 0.530-0.727
CM24 0.329 0.286-0.380
CM11 0.982 0.903-1.073
CM24 0.369 0.310-0.443
CM12 0.738 0.658-0.834
CM25 0.425 0.385-0.471
CM12 0.407 0.354-0.467
CM25 0.540 0.475-0.625
CM13 0.395 0.355-0.441 CM13 0.643 0.570-0.734
Tabla 28. Valores de ED50 de los aislados frente a metil-tiofanato.
Table 29. ED50 values of the strains against thiophanate-methyl.
Strain ED50 Range
Strain ED50 Range
CM1 1.731 1.414-2.152
CM14 4.561 4.064-5.323 CM1 - -
CM14 3.292 2.946-3.740
CM2 2.081 1.579-2.943
CM15 3.102 2.968-3.239
CM2 1.734 1.501-2.027
CM15 2.943 2.724-3.194
CM3 6.722 5.775-8.079
CM16 4.108 3.842-4.437
CM3 - -
CM16 6.606 6.009-7.352
CM4 2.204 1.905-2.596
CM17 4.319 3.965-4.781
CM4 1.928 1.620-2.329
CM17 4.475 4.100-4.998
CM5 7.031 6.273-8.045
CM18 3.570 3.415-3.744
CM5 8.838 7.747-10.419
CM18 3.301 3.156-3.460
CM6 8.247 7.253-9.614
CM19 >73.6 -
CM6 - -
CM19 >73.6 -
CM7 13.051 9.135-21.989
CM20 3.732 3.464-4.062
CM7 12.331 8.853-19.751
CM20 3.677 3.435-3.966
CM8 3.165 2.731-3.767
CM21 3.959 3.731-4.232
CM8 4.417 3.480-6.203
CM21 - -
CM9 4.680 4.319-5.150
CM22 4.603 4.266-5.054
CM9 12.324 7.989-25.719
CM22 6.128 5.621-6.771
CM10 7.570 7.250-7.926
CM23 4.574 4.415-4.756
CM10 14.753 10.216-27.079
CM23 5.670 5.101-6.398
CM11 >73.6 -
CM24 4.711 4.321-5.242
CM11 >73.6 -
CM24 4.852 4.195-5.787
CM12 4.082 3.799-4.426
CM25 4.279 4.017-4.603
CM12 7.260 6.741-7.880
CM25 4.647 4.174-5.265
CM13 3.693 3.449-3.986 CM13 3.248 3.028-3.503
Anexo
115
Tabla 29. Valores de ED50 de los aislados frente a procloraz-Mn.
Table 30. ED50 values of the strains against prochloraz-Mn.
Strain ED50 Range
Strain ED50 Range
CM1 0.024 0.017-0.034
CM14 0.041 0.038-0.045 CM1 0.016 0.011-0.020
CM14 0.110 0.078-0.195
CM2 0.006 0.003-0.008
CM15 0.020 0.016-0.025
CM2 0.011 0.008-0.015
CM15 0.029 0.024-0.034
CM3 0.030 0.023-0.039
CM16 0.023 0.017-0.031
CM3 0.021 0.018-0.026
CM16 0.001 0.000-0.002
CM4 0.043 0.035-0.053
CM17 0.047 0.042-0.053
CM4 0.015 0.011-0.020
CM17 0.102 0.080-0.145
CM5 0.011 0.008-0.014
CM18 0.051 0.043-0.061
CM5 0.009 0.005-0.012
CM18 0.069 0.055-0.096
CM6 0.054 0.046-0.063
CM19 0.005 0.001-0.008
CM6 0.021 0.017-0.025
CM19 0.004 0.002-0.005
CM7 0.038 0.034-0.043
CM20 0.034 0.028-0.042
CM7 0.025 0.022-0.029
CM20 0.011 0.004-0.017
CM8 0.052 0.043-0.065
CM21 0.011 0.009-0.013
CM8 0.035 0.030-0.043
CM21 0.007 0.004-0.009
CM9 0.004 0.002-0.006
CM22 0.050 0.043-0.059
CM9 0.021 0.016-0.026
CM22 0.024 0.016-0.034
CM10 0.052 0.047-0.059
CM23 0.033 0.028-0.039
CM10 0.029 0.022-0.037
CM23 0.019 0.013-0.025
CM11 0.002 0.001-0.002
CM24 0.004 0.002-0.005
CM11 0.001 0.000-0.002
CM24 0.017 0.015-0.019
CM12 0.042 0.040-0.045
CM25 0.135 0.076-0.108
CM12 0.034 0.028-0.040
CM25 0.089 0.099-0.249
CM13 0.121 0.099-0.158 CM13 0.214 0.126-0.602
Tabla 30. Valores de ED50 de los aislados frente a tiabendazol.
Table 31. ED50 values of the strains against thiabendazole.
Strain ED50 Range
Strain ED50 Range
CM1 110.001 96.348-127.661
CM14 3.309 2.905-3.840 CM1 91.100 79.797-105.067
CM14 3.705 3.169-4.458
CM2 93.845 82.115-108.624
CM15 7.526 5.600-11.705
CM2 94.460 82.903-107.942
CM15 3.804 3.255-4.567
CM3 5.640 4.956-6.539
CM16 4.824 4.405-5.320
CM3 4.757 4.331-5.266
CM16 4.793 4.068-5.848
CM4 3.102 2.827-3.425
CM17 5.264 4.685-6.023
CM4 4.317 3.910-4.772
CM17 2.940 2.736-3.164
CM5 6.457 5.735-7.431
CM18 4.515 4.031-5.133
CM5 6.566 5.801-7.610
CM18 5.472 4.680-6.581
CM6 6.847 6.191-7.706
CM19 114.366 98.266-136.297
CM6 5.302 4.440-6.590
CM19 97.225 85.878-110.759
CM7 3.974 3.346-4.864
CM20 3.782 3.268-4.451
CM7 6.321 5.418-7.615
CM20 4.198 3.494-5.224
CM8 5.231 4.511-6.038
CM21 3.151 2.820-3.614
CM8 6.510 5.354-8.014
CM21 4.090 3.357-5.177
CM9 4.290 3.773-4.979
CM22 1.493 1.355-1.649
CM9 4.291 3.776-5.012
CM22 1.161 0.930-1.408
CM10 5.217 4.695-5.880
CM23 5.833 4.949-7.162
CM10 6.955 6.221-7.945
CM23 3.627 3.294-4.011
CM11 45.492 38.013-53.649
CM24 5.511 4.866-6.378
CM11 47.157 36.802-57.774
CM24 3.050 2.705-3.478
CM12 7.877 6.773-9.672
CM25 6.871 6.141-7.857
CM12 7.669 6.373-9.800
CM25 4.963 4.232-6.038
CM13 3.992 3.687-4.331 CM13 4.299 3.923-4.731
Anexo
116
Tabla 31. Valores de ED50 de los aislados de A. bisporus frente a los fungicidas.
Table 32. ED50 values of A. bisporus strains against selected fungicides.
Strain Chlorothalonil
Thiophanate-methyl
ED50 Range
ED50 Range
Amycel XXX
0.967 0.796-1.240
24.647 21.785-28.198
Amycel XXX
1.079 0.742-1.805
31.534 27.441-36.997
Gurelan 45
1.526 1.022-3.197
15.147 13.332-17.217
Gurelan 45
0.999 0.839-1.217
26.114 23.659-28.972
Gurelan 90
2.040 1.885-2.235
34.821 29.992-41.575
Gurelan 90
1.861 1.585-2.255
21.192 19.136-23.536
Strain Prochloraz-Mn
Thiabendazole
ED50 Range
ED50 Range
Amycel XXX
17.637 16.541-18.802
580.526 414.659-928.578
Amycel XXX
20.403 18.331-22.769
- -
Gurelan 45
16.305 15.053-17.706
548.17 456.314-683.966
Gurelan 45
20.698 16.004-27.905
- -
Gurelan 90
27.718 23.529-25.902
269.52 223.423-339.256
Gurelan 90
21.128 18.661-23.896
- -
Anexo
117
5.2. Inhibición del crecimiento miceliar
Figura 22. Ensayos in vitro (MEA). Inhibición del crecimiento de C.
mycophilum mediante concentraciones crecientes de fungicidas.
Figure 22. Assays in vitro (MEA). Inhibition of C. mycophilum growth by
chemical fungicides.
Anexo
118
Figura 23. Ensayos in vitro (medio agar-compost). Inhibición del
crecimiento de A. bisporus mediante concentraciones crecientes de
fungicidas.
*[PCL]: 1= 4 µg mL-1
; 2= 8 µg mL-1
; 3= 16 µg mL-1
; 4= 32 µg mL-1
; 5= 64 µg mL-1.
Figure 23. Assays in vitro (agar-compost medium). Inhibition of A.
bisporus growth by chemical fungicides.
*[PCL]: 1= 4 µg mL-1
; 2= 8 µg mL-1
; 3= 16 µg mL-1
; 4= 32 µg mL-1
; 5= 64 µg mL-1.
*Plocloraz-Mn. A. bisporus
Anexo
119
5.3. Colonización de la cobertura
Gráfico 25. Superficie de cultivo colonizada por telaraña en cada tratamiento. a) Ensayo A. b) Ensayo B.
Graph 24. Crop surface colonized by cobweb in each treatment. a) Trial A. b) Trial B.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
Cro
p s
urf
ace
colo
niz
ed (
%)
Control CI TBD PCL1 PCL2 CTL MTF
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
Cro
p s
urf
ace
colo
niz
ed (
%)
Control CI TBD PCL1 PCL2 CTL MTF
b
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