DESCRIPCIN DE LAS CARACTERSTICAS DE

TRES TCNICAS INMUNOLGICAS PARA

MEDIR PROGESTERONA EN SANGRE Y SU

APLICACIN EN MEDICINA VETERINARIA Y

ZOOTECNIA

MONOGRAFA

PRESENTADA POR

MAURICIO JOS CANTO LPEZ

EN OPCIN AL TTULO DE

QUMICO FARMACUTICO BILOGO

MRIDA, YUCATN, MXICO

2013

UADY FACULTAD DE

QUMICA

Mrida, Yuc, Mayo 22 de 2013 Oficio Nm. SAC/841/13

Asunto: Aprobacin del Trabajo Final de Monografa

COMIT REVISOR

La Monografa titulada "DESCRIPCIN DE LAS CARACTERSTICAS DE TRES

TCNICAS INMUNOLGICAS PARA MEDIR PROGESTERONA EN SANGRE Y SU

APLICACIN EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA" presentada por el C.

Mauricio Jos Canto Lpez, en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al ttulo

de Qumico Farmacutico Bilogo, ha sido aprobada en su contenido cientfico y en

cuanto al cumplimiento de lo establecido en el Manual de Procedimientos de Licenciatura.

M. en C. CanqnenUosefa Quintero Carrillo Secretaria Acadmica

Calle 41 No. 421 x 26 y 28 Col. Industrial CP. 97150 Mrida, Yucatn Tels. (999) 922-57-11 y 922-57-16 Fax. (999) 922-57-08

Artculo 100 del reglamento interior

de la Facultad de Qumica de la

Universidad Autnoma de Yucatn.

Aunque un trabajo en Opcin a

Titulacin hubiere servido para el

Examen Profesional y hubiere sido

aprobado por el Snodo, slo su

autor es responsable de las

doctrinas en l emitidas.

AGRADECIMIENTOS ACADMICOS

Al Dr. Rubn Montes Prez.

A la QFB. Luca Lpez Castillo.

A la QFB. Alheli de Jess Avils Denis.

Al QFB. Jos M. Marrufo Gmez.

Al QBA. Jos Fernando Domnguez Santana ().

A la M. en C. Martha L. Mena Reynoso.

A la M. en C. Maria Fidelia Crdenas Marrufo.

Al Dr. Vctor E. Arana Argez.

NDICE

Resumen

Introduccin 1

Objetivos 3

General 3

Especficos 3

I. Progestinas 4

II. Progesterona 5

II.1. Caractersticas estructurales 5

II.2. Biosntesis 6

II.3. Transporte y receptores 11

II.4. Actividad fisiolgica en tejidos blanco 14

III. Medicin de progesterona en sangre 17

III.1. Importancia de la medicin de la progesterona en la

reproduccin del ganado bovino 18

IV. Inmunoanlisis 20

IV.1. Principios bsicos 20

IV.2. Componentes primarios 30

IV.2.1. Antgeno 30

IV.2.2. Anticuerpo 31

IV.2.3. Trazador 32

IV.3. Caractersticas analticas 32

V. Radioinmunoanlisis 36

V.1. Caractersticas analticas 37

V.2. Ventajas y desventajas 40

VI. Enzimoinmunoanlisis 41

VI.1. Caractersticas analticas 44

VI.2. Ventajas y desventajas 46

VII. Quimioluminiscencia 47

VII.1. Caractersticas analticas 52

VII.2. Ventajas y desventajas 56

VIII. Anlisis y discusin 57

IX. Conclusin 64

Referencias bibliogrficas 65

Resumen

La determinacin de los niveles plasmticos de la progesterona

proporciona datos tiles para la monitorizacin de una adecuada fase ltea, los

procedimientos de sincronizacin e induccin del estro y para el estudio de la

fertilidad entre otros aspectos. Esta hormona ejerce su accin sobre el tero, el

eje hipotalmico-hipofisario, glndulas mamarias y el ovario.

La estructura bsica de la progesterona es el

ciclopentanoperhidrofenantreno. Es sintetizada en los ovarios y la placenta, y

vertida a la circulacin en mayor cantidad durante el diestro del ciclo estral y

tambien durante la gestacin. Por encontrarse en muy bajas concentraciones

en fluidos biolgicos como plasma o suero sanguneo o leche, en el orden de

ng/ml o pg/mL, se hace imprescindible el uso de mtodos inmunoanalticos

competitivos para detectar su presencia, entre los cuales destacan el

radioinmunoanlisis, el enzimoinmunoanlisis y la quimioluminiscencia. stos

constan de tres componentes primarios, el anticuerpo, el antgeno a determinar

y el trazador. En este tipo de anlisis el antgeno que se desea medir y el

trazador compiten por los sitios de unin del anticuerpo siguiendo la ley de

accin de masas. El grado de confiabilidad del mtodo depender de la

especificidad, sensibilidad, precisin y exactitud que ste proporcione; y

depender del analista escoger el mtodo que le resulte ms conveniente,

tomando en cuenta las ventajas y desventajas de cada sistema. Algunos de los

sistemas ms empleados en medicina veterinaria son el RIA en fase slida,

IMMULITE 1000, ADVIA Centaur y ELECSYS 2010; stos presentan

caractersticas analticas similares pero con diferencias en sus costos de

adquisicin.

Aunque para algunos laboratorios resulte costosa la implementacin de

estos sistemas en su centro de trabajo, se encuentra la posibilidad de reajustar

los gastos a travs de la implementacin de procedimientos antes o durante la

ejecucin de los inmunoanlisis, los cuales han sido probados dando

excelentes resultados e incluso comparables a los observados en sistemas

provistos por casas comerciales. Con estas medidas, se puede procurar que

mayor cantidad de laboratorios de investigacin y productores tengan acceso a

tecnologas que mejoren la calidad del trabajo en el laboratorio.

1

INTRODUCCIN

La evaluacin de la funcin endocrina ha presentado un avance

extraordinario. Diferentes instituciones como escuelas de medicina, medicina

veterinaria, laboratorios de diagnstico, clnicas, etc., han procurado el estudio y

medicin de hormonas en suero y plasma con diferentes propsitos:

diagnosticar problemas de piel, enfermedades endocrinas y metablicas como

hipotiroidismo, hiperadrenocorticismo, desbalances gonadales, infertilidad,

evaluar la seguridad de nuevos productos mdicos, e investigar funciones

endocrinas en estudios fisiolgicos.1

En ganadera, la medicin de las hormonas sexuales en plasma

sanguneo como la progesterona, la cual es producida por el cuerpo lteo y la

placenta2, es una herramienta til en el campo de la endocrinologa, ya que

tiene una aplicacin directa como mtodo para mejorar la eficiencia

reproductiva en la produccin animal. Por ejemplo, para determinar el

diagnostico de preez , confirmar el celo y determinar la funcionalidad

reproductiva en diferentes especies;1,3,4 en el rea de la inseminacin artificial,

la determinacin de los niveles plasmticos de progesterona tiene un gran valor

para documentar la existencia de ovulacin y una adecuada fase ltea en el

estudio de infertilidad,5 as como el diagnstico de quistes ovricos en el

ganado bovino.1 Los mtodos utilizados para estas determinaciones se hacen a

travs de inmunoensayos competitivos como el radioinmunoanlisis6,7,

enzimoinmunoanlisis2,8 y quimioluminiscencia9,10, los cuales son sumamente

sensibles y tiles debido a que la hormona se encuentra en concentraciones de

nanogramos por mililitro (ng/mL).11,12

El presente trabajo aborda las caractersticas de tres tcnicas

inmunolgicas para estimar los niveles de progesterona en sangre y su

aplicacin en el rea de medicina veterinaria y zootecnia. Las discusiones

2

aportadas en ste son el producto del anlisis de diversos estudios que se han

documentado acerca de los diferentes inmunoanlisis para la medicin de

progesterona, dentro de los cuales se aprecian un anlisis de costeo, con el fin

de reducir costos de operacin de las tcnicas produciendo uno de los

componentes, y con el mismo objetivo, se menciona la implementacin de un

mtodo alternativo de separacin, logrando una calidad comparable con la de

kits comerciales.4,13,14 Aunado a esto se destacan las caractersticas

tecnolgicas de cada una de stas, mencionadas en prrafos anteriores as

como los precios de adquisicin de los kits comerciales en el mercado. En

contraste se describen las desventajas que pudieran tener las tcnicas y que

limitan hasta cierto punto poderlas desarrollar.

3

OBJETIVOS

Objetivo general

Hacer una revisin actualizada acerca de los fundamentos y caractersticas

tecnolgicas en que opera las tcnicas inmunolgicas de radioinmunoanlisis,

enzimoinmunoanlisis y quimioluminiscencia.

Objetivos especficos

1) Describir los fundamentos y caractersticas tecnolgicas en que operan las

tcnicas de radioinmunoanlisis, enzimoinmunoanlisis y quimioluminiscencia

para cuantificar progesterona en sangre de ganado bovino.

2) Comparar las ventajas y desventajas de las tcnicas de radioinmunoanlisis,

enzimoinmunoanlisis y quimioluminiscencia para cuantificar progesterona en

sangre de ganado bovino.

3) Analizar alternativas para economizar el uso de algunos inmunoanlisis.

4

I. Progestinas

Los esteroides que poseen la estructura bsica del ciclo pentano

perhidrofenantreno con 4 o 5 y 21 carbonos en su composicin, se les

denomina progestinas, cuya principal accin biolgica es promover la gestacin,

por esta razn se les denomina de accin progestgena15, 16, la Figura 1,

muestra la estructura general de las progestinas. Una de las principales

progestinas en suero o plasma sanguneo es la progesterona.

Figura 1. Estructura general de las progestinas que posee el ncleo del ciclopentanoperhidrofenantreno y est compuesta de 21 carbonos.(A partir de datos en Nath, 2010; Litwack, 2004)

5

II. Progesterona

Se ha considerado que la progesterona es un progestgeno importante

en mamferos. En la mujer se secreta en cantidades significativas en la segunda

mitad de cada ciclo ovrico, de igual manera, en la vaca sta tiene sus niveles

ms altos durante el diestro del ciclo estrual, cuando es producida por el cuerpo

lteo.1, 2, 12, 17 La progesterona se sintetiza en los ovarios, principalmente, a

partir del colesterol sanguneo que proviene de la dieta, as como del colesterol

que se produce de novo en las clulas. La progesterona se forma durante la

fase folicular del ciclo, gran parte es convertida en estrgeno por las clulas de

la granulosa antes de que sta pueda abandonar los ovarios, al entrar a la fase

lutenica se habr formado ya demasiada progesterona, y por consiguiente

tendr que ser secretada, en gran medida, a la circulacin sangunea.12

II.1. Caractersticas estructurales

La clasificacin de las hormonas esteroides se basa en el nmero de

carbonos de sus respectivas estructuras; la progesterona, de 21 carbonos,

pertenece al grupo de esteroides C21,18 su nombre qumico es 4-pregnano-

3,20-diona, con un peso molecular de 314.47 g/mol19.

La estructura de la Progesterona est relacionada con el ncleo del

ciclopentanoperhidrofenantreno, un sistema tetracclico de androstano, los

cuatro anillos se identifican como A, B, C y D comenzando con el anillo de la

izquierda inferior; en la figura 2 se muestra la numeracin del sistema anular de

dicha estructura as como las letras con las que se designan los anillos. Otras

caractersticas estructurales, consisten en la presencia de un grupo Oxo

(carbonilo) en el carbono 3, un doble enlace conjugado entre los carbonos 4 y 5

6

en el anillo A, y sustituyentes metilo en el carbono 10 del anillo A y en el

carbono 13 del anillo C. Tanto la cetona ubicada en C3 como el doble enlace

que se encuentra entre C4 y C5, le confieren el efecto progestacional a sta

molcula.20-22 La figura 2 muestra la estructura de la progesterona.

Figura 2. Estructura de la progesterona. Se observa la numeracin del sistema anular del ciclopentanoperhidrofenantreno, as como las letras con las que se designan los anillos.(A partir de datos en Litwack, 2004)

II.2. Biosntesis

Se cree que casi todas las clulas ovricas poseen la dotacin

enzimtica completa necesaria para convertir el colesterol en estradiol, sin

embargo, los diferentes tipos celulares del ovario contienen cantidades

variables de estas enzimas, por lo que en cada compartimiento principal

predominan hormonas diferentes. Por ejemplo, el cuerpo lteo produce

fundamentalmente P4 y 17-hidroxiprogesterona.23

Tras la ovulacin, la sntesis de progesterona se inicia en el cuerpo lteo

del ovario, formado a partir del residuo retenido del folculo ovulado. En el

7

ovario existen tres tipos de clulas productoras de hormonas: clulas de la teca,

clulas de la granulosa y clulas intersticiales del estroma, las dos primeras

forman parte de la estructura de los folculos, las cuales al aumentar de tamao

y acumular lpidos durante el pico preovulatorio de la LH adquieren la capacidad

de producir progesterona y pierden la capacidad de producir estrgenos debido

a la inhibicin de la enzima aromatasa P450 arom y P450 17-, este fenmeno

es conocido como luteinizacin.23, 24

El precursor bsico de la biosntesis esteroidea del ovario es el

colesterol,25 la principal fuente de ste, procede de las lipoprotenas de baja

densidad (LDL) circulantes,26, 27 las cuales se unen a receptores especficos de

las clulas productoras de esteroides y penetran en stas. En el interior de ellas

se unen con lisosomas, cuyas proteasas y esterasas desdoblan las

lipoprotenas y dejan en libertad al colesterol no esterificado y aminocidos28. El

colesterol tambin puede ser obtenido por medio de la sntesis de novo que se

da lugar en el retculo endoplasmtico liso a partir de la acetl-CoA. En el primer

paso de la sntesis, dos molculas de acetil-CoA reaccionan para formar

acetoacetil-CoA, la cual reacciona con otra molcula de acetl-CoA para formar

el compuesto 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (3HMG-CoA). En el siguiente paso, el

grupo 3-HMG libera CoA y simultneamente se reduce a mevalonato; los

primeros pasos de la sntesis se llevan a cabo con la ayuda de la enzima 3-

HMG-CoA-reductasa. El mevalonato es descarboxilado hasta producir

isopentenil-difosfato, el cual es convertido en su ismero dimetilalil-difosfato,

sta molecula se condensa con isopentenil-difosfato para obtener geranil-

difosfato al cual se le agrega otra molcula de isopentenil-difosfato para obtener

farnesil-difosfato el cual por medio de la fusin cabeza-cabeza con otra

molcula igual, forma el escualeno. Esta molcula se cicla para obtener

lanosterol, de la cual se eliminan tres grupos metilo, lo que da como producto

final el colesterol.20 (Fig.4)

8

La biosntesis de progesterona comienza con la unin de la LH a su

receptor especfico en la membrana celular del cuerpo lteo,29 lo que produce

un incremento en la produccin de AMP cclico que constituye el principal

mediador intracelular de LH. La unin de la LH a estos receptores,

pertenecientes a la familia de los receptores acoplados a protena G,30 activa el

sistema adenilato ciclasa, donde el ATP es convertido en AMP cclico (AMPc),

este ltimo activa el sistema protena kinasa A (PKA) que produce la

fosforilacin de diversas protenas, lo que multiplica la hidrolisis de los steres

de colesterol de las LDL e incrementa el transporte de colesterol a las

mitocondrias.18, 24 La figura 3 muestra el mecanismo de accin de la hormona

luteinizante sobre las clulas del ovario, lo que desencadena la

esteroidognesis.

Figura 3. Mecanismo de accin de la hormona luteinizante sobre las clulas del

ovario para llevar a cabo la esteroidognesis. (Modificado de Litwack, 2004)

9

Por medio de la protena reguladora de la esteroidognesis aguda

(StAR), el colesterol intracelular es transportado a la membrana mitocondrial

interna, donde est localizado la enzima P450.18, 28

Para que la cadena lateral del colesterol pueda ser escindida por medio

de la citocromo P450 (CYP11A1), cuya funcin es romper el enlace entre los

tomos de carbono 20 y 22, es necesario primeramente hidroxilar estos dos

carbonos por medio de un complejo sistema enzimtico (22-hidroxilasa; 20-

hidroxilasa; 20,22-desmolasa),28, 31 produciendo pregnenolona de 21 carbonos;

sta fuera de la mitocondria se transforma en P4 por medio de la 3-

hidroxiesteroide deshidrogenasa que transforma el grupo 3-OH en un grupo 3-

ceto, y la 5,4-isomerasa que desplaza el doble enlace desde el anillo B hasta

el anillo A,18 una vez formada la P4 es liberada de la clula mediante un

proceso de difusin24. La figura 5 muestra la ruta de biosntesis de la

progesterona.

Figura 4. Ruta de biosntesis de novo del colesterol. (Modificado de Koolman, 2004)

10

Figura 5. Ruta de biosntesis de la progesterona. (Modificado de Litwack, 2004)

Si tiene lugar la preez en la hembra, el cuerpo lteo persiste por efecto

de las gonadotropinas corinicas placentarias y secreta progesterona para

apoyar la fase inicial de la gestacin.23 La placenta produce esta hormona en

cantidades suficientes como para no ser necesaria la presencia del cuerpo

lteo32.

Los esteroides no se almacenan dentro de las clulas que los producen,

sino que son sintetizados, secretados por difusin y transportados en la sangre

unidos a protenas del tipo de globulinas o albumina.33, 34

11

II.3. Transporte y receptores

Las hormonas esteroideas son muy poco solubles en el plasma debido a

su carcter no polar, adems, cuando se encuentran libres penetran

rpidamente en las clulas por difusin a travs de la membrana,26 en especial

a nivel heptico y renal, que es donde se lleva a cabo su catabolismo,

principalmente. Por tanto, es necesario que circulen asociadas (de manera

reversible) a protenas plasmticas para que puedan permanecer un cierto

tiempo en la sangre y aumente la probabilidad de que lleguen a los tejidos

diana.35 No obstante, las hormonas unidas a las protenas no difunden bien a

travs de los capilares y no pueden acceder a sus clulas diana, por lo que

carecen de actividad biolgica hasta que se disocian de las protenas

plasmticas.12, 24

Las cantidades relativamente grandes de hormonas unidas a las

protenas actan como depsito y reponen la concentracin de hormonas libres

cuando se unen a sus receptores diana o son eliminadas de la circulacin.

Asimismo, la unin de las hormonas a las protenas plasmticas retrasa

considerablemente su eliminacin del plasma.12

La progesterona vertida en la circulacin general se une a las protenas

plasmticas y de esta forma es trasladada para mantener sus niveles en la

circulacin y protegerla del metabolismo y de la inactivacin (Fig. 6).18 La

Transcortina o globulina de fijacin de corticoesteroides (CGB) es una

glucoprotena plasmtica que se une a la progesterona, el cortisol, la

desoxicorticosterona, la corticosterona y algunos otros compuestos corticales

menores. Tambin la progesterona, como el cortisol, se unen dbilmente a la

albmina y una pequea porcin queda libre.28 Los determinantes estructurales

ms sealados en la unin de los esteroides a la CBG son los grupos 4-3-

cetona y 20-cetona18.

12

Figura 6. La progesterona vertida en la circulacin se une de manera reversible a

protenas de transporte.(A partir de datos en Litwack, 2004)

13

Figura 7. Modelo de accin de una hormona esteroide.(Modificado de Litwack, 2004)

Las hormonas esteroides, ejercen su accin por medio de su unin a

receptores miembros de la superfamilia de receptores nucleares de factores de

transcripcin, entre los que se encuentran los receptores de andrgenos,

glucocorticoides, mineralocorticoides, estrgenos y progesterona. Estos

receptores se caracterizan por tener una regin A/B amino-terminal requerido

para la completa actividad transcripcional del receptor, una regin de unin al

ADN formada por dos dedos de zinc, una regin bisagra participante en la

14

dimerizacin de la protena y un dominio carboxi-terminal de unin a la

hormona.36

Estos receptores se localizan en el citoplasma y al unirse a su ligando,

dimerizan y traslocan al ncleo donde actan como factores de transcripcin. La

unin de la P4 a su receptor produce la liberacin de los complejos de protenas

de choque trmico (HSP) que se encontraban unidas al receptor ocultando el

dominio de unin con el DNA. Una vez liberado el complejo de HSP, se produce

la unin del receptor a una secuencia consenso en el ADN denominada

elemento respondedor a Progesterona. Despus de la unin, el complejo

receptor activado, en el sitio aceptor del DNA, tiene lugar la estimulacin o

inhibicin de la transcripcin.35 Los nuevos RNA mensajeros, producto de la

transcripcin, se translocan desde el ncleo hacia el citoplasma a fin de formar

complejos de traduccin para la sntesis de protenas que modifican el

metabolismo y el funcionamiento de la clula diana (Fig. 7).18, 36

II.4. Actividad fisiolgica en tejidos blanco

Todos los cambios que se producen por efecto de la Progesterona en el

aparato reproductor de la hembra, la preparan para la preez y el

mantenimiento del feto.57 Los rganos en los que ejerce su accin esta

hormona, son el tero a nivel de endometrio y miomtrio, el eje hipotlamo-

hipofisario, las glndulas mamarias y el ovario.35, 37, 38

A nivel de endometrio, activa pasos enzimticos que vuelven a los

estrgenos biolgicamente inactivos, adems de que disminuye el nmero de

receptores de stos, provocando su hipertrofia al inhibir la mitosis,

engrosndolo y transformndolo de proliferativo a secretor. 39, 40

En el miomtrio, mantiene los niveles de relaxina inhibiendo la

contraccin del musculo liso y trompas uterinas inducida por prostaglandinas,

15

adems disminuye la sntesis de stas, provoca el aumento de la viscosidad del

moco cervical, aumenta el entorno de colgeno y la distensible del tero.23, 27, 41-

43

La Progesterona acta a nivel del eje hipotlamo-hipofisario regulando la

secrecin de gonadotropina y el comportamiento de apareamiento.44, 45

Sobre la glndula mamaria intensifica el desarrollo de ascinos

glandulares preparndolos para la lactancia.27, 41

De manera general, en el ovario, la progesterona inhibe el desarrollo de

folculos ovricos y los somete a atresia;46 reduce la mitosis y apoptosis de las

clulas de la granulosa, de igual manera inhibe la secrecin de estrgenos y

promueve su propia secrecin en estas clulas, la progesterona tambin acta

en el mantenimiento de las clulas luteales suprimiendo su apoptosis.45

Durante las primeras semanas de la gestacin, la progesterona

sintetizada por el cuerpo lteo sostiene la preez para luego asumir esta

funcin la placenta.27, 41 Induce la reaccin decidual del endometrio preparando

al epitelio para la implantacin del blastocisto y manteniendo el tono uterino

durante la preez.23, 39 De igual manera inhibe nuevas ovulaciones durante esta

etapa reduciendo el pulso de liberacin de la hormona liberadora de

gonadotropina (GnRH).38

Es relevante destacar que tambin posee una actividad inmunosupresora

para evitar el rechazo del blastocisto y de la placenta del feto procurando su

retencin, ya que la progesterona regula el reconocimiento del complejo mayor

de histocompatibilidad paternos, la polaridad de las clulas T efectoras y la

sensibilidad de las clulas presentadoras de antgeno, as como la supresin de

la actividad de los macrfagos. Todas estas acciones estn mediadas por el

Factor Bloqueador Inducido por Progesterona (PIBF), sintetizado en los

linfocitos de hembras en gestacin por accin de la progesterona. 38, 46, 47

16

La accin hipertrmica que produce la Progesterona se debe a un

aumento de la temperatura basal, ocasionado por la disminucin del flujo

sanguneo que tiene por consecuencia una prdida menor de calor, dato de

gran valor diagnstico de la ovulacin.23, 27, 41

17

III. Medicin de progesterona en sangre

Las concentraciones de la mayora de las hormonas que dirigen la

funcin reproductiva, son mucho menores que las de las sustancias

bioqumicas habituales como carbohidratos o lpidos, y se necesitan tcnicas

especializadas para medir stas concentraciones tan bajas, por tanto las

determinaciones de stas en el laboratorio deben ser precisas, especficas y

exactas para identificar cambios en los valores hormonales.48

Para cuantificar molculas, como las hormonas, en fluidos biolgicos que

se encuentran en concentraciones de nanogramos por mililitro, se utilizan los

inmunoanlisis que son tcnicas de unin que utilizan anticuerpos como

ligadores que se enlazan especfica y reversiblemente a la sustancia que se

interesa detectar o cuantificar. Existen junto con esta tecnologa otras ms,

como la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) o la cromatografa de

gas-lquido, que tambin son capaces de medir cantidades de masa a estas

concentraciones; sin embargo, se han descrito interferencias hidrosolubles en

algunas pruebas directas para la determinacin de esteroides, por lo que

todava no han logrado ser ampliamente disponibles para su uso cotidiano

como los inmunoanlisis.11, 48

Actualmente se cuantifican los niveles de progesterona mediante

inmunoanlisis competitivos10 como el radioinmunoanlisis6, 7,

enzimoinmunoanlisis2, 8 y quimioluminiscencia9, los cuales miden

concentraciones, no actividad biolgica. Sin embargo, para la mayora de las

hormonas existe una fuerte relacin entre la concentracin del esteroide que se

ha de determinar y la actividad biolgica.48

Es factible realizar el anlisis de progesterona en muestras de leche,

debido a que stas pueden obtenerse de forma repetida sin provocar ninguna

respuesta negativa en el animal. No obstante, cuando se desea conocer con

18

precisin los niveles existentes de esta hormona es necesario determinarlos en

sangre.8

III.1. Importancia de la medicin de la progesterona en la reproduccin del

ganado bovino

De manera global, la determinacin de los niveles plasmticos de

progesterona proporciona datos tiles en el estudio de la fertilidad, de la

efectividad de los procedimientos de sincronizacin e induccin del estro y para

documentar la existencia de ovulacin y una adecuada fase ltea.5 As mismo,

es til para la verificacin del estro, monitoreo del ciclo estral y deteccin de

disfuncin ovrica2. Adicionalmente, constituye una poderosa herramienta en el

estudio de los procesos reproductores de las especies domsticas, en la clnica

de fertilizacin In Vitro, trasplante embrionario y para explicar los factores que

afectan la eficiencia reproductiva.39, 49

De manera puntual, en el estudio de la fertilidad, es importante

determinar una adecuada fase ltea en las vacas, esto se logra cuantificando

los niveles de progesterona en sangre ya que sta se incrementan

progresivamente y de forma paralela al crecimiento del cuerpo lteo, formado a

partir del remanente de las clulas foliculares despus de la ovulacin; las

concentraciones de progesterona se mantienen elevadas durante toda la vida

del cuerpo lteo hasta el final del ciclo cuando se produce su regresin.32, 50, 51

La correcta deteccin del estro mejora el rendimiento reproductivo del

ganado bovino, a travs de la vigilancia de la actividad ovrica.50 La

determinacin de las concentraciones de progesterona es de gran ayuda junto

con otros mtodos veterinarios como auxiliar para confirmar con precisin la

deteccin del estro,50 etapa con mayor receptividad al macho, en la cual se

observan niveles de progesterona inferiores a 1 ng/mL, esta disminucin es

19

importante para suprimir la retroalimentacin negativa sobre la secrecin de

gonadotropinas aumentando la frecuencia pulstil en los niveles de stas, las

que estimulan el desarrollo de un folculo ovrico; a medida que ste se

desarrolla, se produce un aumento de los niveles de estradiol. Los niveles de

estradiol continan aumentando y cuando se alcanza cierto nivel se estimula la

receptividad al macho y comienza el periodo de estro.24 Al no detectar el estro

con precisin, se podran inseminar vacas que no estn receptivas, lo que

disminuye el ndice de concepcin del hato.50

De igual manera, el diagnstico exacto de la preez es de importancia

crucial para un programa reproductivo. Por ejemplo, el productor debe saber tan

pronto como sea posible si una vaca ha sido montada y no est gestante, para

que pueda ser montada sin demora en el prximo celo.1 Cuando se haya

producido el apareamiento y fecundacin, la cuantificacin de progesterona

permitir diagnosticar la gestacin,52 ya que el embrin sintetiza y secreta

protenas para sealar su presencia al sistema materno, las cuales sirven para

inhibir la sntesis de PGF2 luteoltica del tero y evitar la regresin del cuerpo

lteo, manteniendo de esta forma la produccin de progesterona.53 Sin

embargo debido a que sta refleja la funcin del cuerpo lteo, vacas que no

estn gestantes pero presentan prolongaciones del ciclo por cualquier razn,

pueden ser diagnosticadas positivas.1

La medicin de progesterona tambin es til en el diagnostico de quistes

ovricos; las vacas con quistes luteales presentan un nivel elevado de

progesterona en el suero, en contraste, vacas con quistes foliculares producen

bajos niveles de progesterona. Es importante diferenciar ambos tipos de quistes

ovricos puesto que el rgimen teraputico puede ser diferente.38

20

IV. Inmunoanlisis

Los inmunoanalisis han sido de especial valor para el estudio de las

funciones endocrinas de los rganos reproductivos y de diversos procesos

metablicos, ya que permite medir con exactitud la dinmica de los cambios

hormonales. Asimismo, son una poderosa herramienta de laboratorio en la

identificacin de problemas nutricionales, reproductivos y de manejo a nivel de

finca2. Ya que las hormonas esteroides son molculas pequeas con un peso

molecular de 300 a 400 Da, para su determinacin se requieren inmunoanlisis

del tipo competitivo.19, 54-56 stos se caracterizan por contar con tres

componentes primarios, el anticuerpo que tiene la funcin de molcula

enlazadora, la molcula o antgeno que se desea medir y el trazador que se

trata del mismo antgeno pero marcado.11 En este tipo de anlisis, ocurre una

competencia entre el antgeno que se desea medir y el antgeno marcado por

los sitios de unin del anticuerpo.57

IV.1. Principios bsicos

Los inmunoanalisis competitivos consisten bsicamente en una reaccin

qumica de unin reversible, no covalente, que se lleva a cabo entre una

molcula y un anticuerpo especfico para sta, mediante sitios reactivos

especficos en stas molculas y que obedece la ley de accin de masas.58, 59

La ley de accin de masas expresa las velocidades de asociacin y

disociacin de los complejos, asi como las concentraciones de reactivos y

productos en el equilibrio. Estas velocidades de reaccin son directamente

proporcionales a las concentraciones de las substancias que reaccionan. De tal

forma, que cuando una reaccin se encuentra en equilibrio, las concentraciones

de las especies qumicas que se encuentran en ambos lados de la reaccin

21

sern constantes,60 as como sus respectivas velocidades de formacin las

cuales sern iguales hacia ambos lados de la reaccin. El concepto de

equilibrio qumico se puede representar con una reaccin monomolecular con

un sitio de unin como sigue:61

V1 [A] [B]

V2 V1=k1[A]

V2=k2[B]

Dnde [A] y [B] representan a la concentracin de los reactivos y los

productos, V1 y V2 son las velocidades de formacin de productos y de reactivos

y K1 y K2 son las constantes de proporcionalidad de la reaccin de formacin y

disociacin del complejo. Los compuestos presentes en esta reaccin se

encuentran en equilibrio. Por consiguiente las velocidades de reaccin sern

iguales:

V1 = V2

k1[A] = k2[B]

Al despejar esta igualdad se obtiene:

[B] = k1 = Keq

[A] k2

Se puede observar que al relacionar las concentraciones de [A] y [B] se

obtiene la constante de equilibrio (Keq). Por medio de sta ecuacin se expresa

la condicin de equilibrio de la concentracin de los reactivos y productos de

acuerdo con la Ley de Accion de Masas:

Keq = [B]

[A]

22

De manera similar la reaccin de formacin de complejos entre el

antgeno y el anticuerpo puede ser descrita mediante la ley de accin de masas:

V1

[Ag] + [Ac] [Ag:Ac]

V2

V1 = k1 [Ac][Ag]

V2 = k2 [Ac:Ag]

Donde [Ac] y [Ag] son las concentraciones molares de los reactivos,

[Ag:Ac] la concentracin del complejo formado, K1 y K2 son las constantes de

formacin y disociacin del complejo, asi como V1 y V2 sus respectivas

velocidades.11

Cuando se alcanza el equilibrio en la reaccin de formacin del complejo

[Ag:Ac] las velocidades de reaccin son iguales:

V1 = V2

k1 [Ac][Ag] = k2 [Ac:Ag]

La relacin de las dos constantes de velocidad proporciona la constante

de equilibrio (Keq); sta tambin es conocida como la constante de afinidad, la

cual es una caracterstica clave para que un anticuerpo funcione correctamente

en un inmunoanlisis.55

Keq = k1 = [Ac:Ag]

k2 [Ac][Ag]

La afinidad es la fuerza de la union el antgeno y el anticuerpo que

puede determinarse por medio de la ecuacin anterior.58 Pero, debido a que el

anticuerpo se encuentra distribuido entre la fraccin libre y la unida, podemos

obtener el valor del anticuerpo libre de la siguiente manera:55

[Ac] = [Act] - [Ac:Ag]

23

Donde [Ac] es la concentracin del anticuerpo libre en el equilibrio, [Act]

es la concentracin del anticuerpo total y [Ac:Ag] la concentracin del

anticuerpo unido.55

Substituyendo en la ecuacin de la constante de equilibrio, se obtiene:

Keq = [Ac:Ag]

[Act] [Ac:Ag][Ag]

despus de despejar los trminos, la ecuacin obtenida es:

Keq [Act] - Keq [Ac:Ag] = [Ac:Ag]

[Ag]

La ecuacin anterior indica la relacin lineal entre la proporcin del

antgeno unido entre el libre, que est representada con el trmino [Ac:Ag]/

[Ac][Ag], y la concentracin del antgeno unido, representada como [Ac:Ag]. Al

graficar esta relacin, representando en el eje X la concentracin de antgeno

unido y en el eje Y la relacin de los analtos unidos y los libres, se obtiene la

grafica de Scatchard, la cual se emplea frecuentemente para evaluar la funcin

del anticuerpo (Fig. 8).55, 62

24

Figura 8. Grfica de Scatchard lineal. La pendiente de la lnea proporciona la constante de afinidad y la interseccin de sta al eje x permite estimar la concentracin de los sitios de unin del anticuerpo cuando se emplean anticuerpos monoclonales.(Modificado de Montes, 1995)

Para representar los valores grficamente, es necesario estimar la

proporcin unido/libre que se encuentra representada como [Ac:Ag]/ [Ac][Ag] y

tambin puede representarse como B/F, as como obtener la expresin molar

del antgeno unido. Para obtener los resultados es preciso separar la fraccin

libre de la unida. Al separar ambas fracciones se medir la seal caracterstica

del trazador empleado en el anlisis procedente de los complejos [Ac:Ag] o la

proveniente de los reactivos libres, ya que la especie trazadora se encontrar

en ambas fracciones. Como se ver ms adelante, el tipo de marcaje para

detectar el analto condicionar el mtodo de deteccin de la seal, de sta

manera se podr obtener la razn B/F. Al representar B/F contra la

concentracin se observar la grfica de Scatchard.11, 63

25

La grafica de Scatchard es de utilidad para obtener el valor de la

constante de afinidad, la cual ser determinada por el valor de la pendiente de

la lnea. Sin embargo, otra utilidad de la grfica consiste en estimar la

concentracin de los sitios de unin del anticuerpo por la interseccin de la

recta en el eje X, siempre y cuando el anticuerpo tuviera un comportamiento

lineal en el sistema, como ocurre en el caso de los anticuerpos monoclonales.11,

55, 62

Cuando se utilizan anticuerpos policlonales y se grafican los mismos

valores para realizar una grafica de Scatchard se obtiene una lnea curva,

dificultando las estimaciones, ya que esto significa que existen varias

poblaciones de anticuerpos con diferentes afinidades.55, 64-66 El valor de la

afinidad de un antisuero policlonal, se puede obtener determinando el promedio

de las constantes de asociacin entre los anticuerpos de alta y baja afinidad. A

este valor se le llamar avidez y tendr la misma interpretacin matemtica que

la afinidad (Fig. 9).65, 66

Figura 9. Grfica de Scatchard curva de un antisuero policlonal. El valor de la constante de afinidad se obtiene determinando el promedio de las constantes de asociacin de los anticuerpos de alta y baja afinidad.(Modificado de Montes, 1991)

26

En la reaccin de competencia, dos molculas de progesterona, una

marcada y otra sin marcar, compiten por un nmero limitado de sitios de unin

en el anticuerpo, el cual es especfico para unirse a esta hormona esteroide con

la misma afinidad, sin importar si sta se encuentra unida a una molcula

marcadora48, formando as complejos antgeno-anticuerpo y antgeno marcado-

anticuerpo,57 hasta alcanzar el equilibrio como se representa a continuacin11:

Ag + 2Ac + Ag* Ag:Ac + Ag*:Ac

Debido a que las cantidades de anticuerpo y trazador son constantes, la

inhibicin o favorecimiento de la unin del antgeno marcado con el anticuerpo

est relacionada con la concentracin del analto en la muestra, de esta

manera, conforme aumenta la concentracin de analto sin marcar en la

muestra, ocurre el desplazamiento del trazador por el analto para ocupar los

sitos de unin en el anticuerpo, la concentracin de trazador unido al anticuerpo

ser menor que la concentracin de analto unido, por lo tanto, despus de

separar las fraccin unida de la libre y medir la seal emitida por la fraccin

unida, sta ser menor si hay concentraciones mayores de analto.48, 63 La

seal detectada brinda un estimado de los sitios de unin que no se encuentran

ocupados por el analto, esto quiere decir, que la proporcin de trazador que se

une al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentracin del analto

en la muestra.11, 55

Este proceso de desplazamiento de la P4 marcada por la P4 sin marcar

cuando la concentracin de esta ltima aumenta puede observarse graficando

los datos obtenidos a partir del anlisis de muestras con concentraciones

conocidas, la grafica que resulta de este anlisis es llamada grafica dosis-

respuesta o curva de calibracin.66 Para obtener los datos necesarios se utiliza

una serie de tubos conteniendo cantidades de progesterona marcada y

anticuerpo, bajo condiciones controladas, conocidas y constantes, como

temperatura, volumen, pH y concentracin, para que el anticuerpo se una con

la progesterona11. A estos tubos se les aade cantidades conocidas pero

27

variables de progesterona sin marcar, y despus de incubar los tubos hasta que

la reaccin inmune alcance el equilibrio, se separan las fracciones unidas de las

libres y se mide la emisin de la seal del trazador en la fraccin unida.66

Los datos obtenidos se pueden analizar de distintas formas para realizar

la grafica dosis respuesta, el valor de la ordenada puede ser calculada de

cualquiera de las siguientes formas:67

Como el porcentaje de la emisin de seal detectada en la fraccin unida de

cada tubo (B), dividida entre la emisin en la fraccin unida al anticuerpo en

ausencia de ligando no marcado (B0):

% B = B/ B0 * 100

Porcentaje de la emisin de la seal de la fraccin unida, dividida entre la

emisin total en cada tubo (T) antes de la separacin de fracciones:

% B/T = B/T * 100

Porcentaje de la seal de la fraccin unida, entre la seal de la fraccin libre (F):

% B/F = B/F * 100

Cualquiera de los valores obtenidos para la ordenada, sean estos %B,

%B/T o %B/F, pueden ser graficadas contra la concentracin de la dosis de

progesterona no marcada o con el logaritmo de la concentracin de sta. De

igual manera, puede ser graficada directamente la relacin de la seal emitida

por la fraccin unida sin modificaciones matemticas, contra la concentracin

de la progesterona no marcada o el logaritmo de la dosis.11, 67

Una de las curvas de calibracin que se utiliza con ms frecuencia es la

curva Logit-Log, que es la relacin entre el logaritmo de (% B/F) en la ordenada

y el logaritmo de la concentracin de progesterona en la abscisa.67 Con esta

grafica se obtiene una lnea recta, con la cual es ms simple comparar los

resultados, pero resulta ser complicado de realizar de manera manual, por lo

que se requiere la ayuda de un programa de clculo para computadora para

28

realizarla de forma relativamente simple.11, 67, 68 En la figura 10 se muestran tres

ejemplos de graficas usadas en inmunoanlisis.

Figura 10. Tres grficas de uso comn en inmunoanlisis competitivo.(Modificado de Gobello, 1998)

Con la grfica dosis respuesta para inmunoanlisis competitivos,

independientemente de los valores que se desee utilizar, se puede apreciar el

desplazamiento del trazador por el antgeno frio o analto, ya que todos los

modelos de graficas producen curvas que son inversamente proporcionales a la

cantidad de progesterona no marcada presente.67 Conforme aumenta la

concentracin de sta, la seal del trazador detectada en la fraccin unida

disminuye hasta un valor mnimo con concentraciones elevadas.48 El principio

29

bsico del desplazamiento del marcador unido debido a la dosis es un principio

que se aplica a todo inmunoanlisis competitivo.67

La curva dosis-respuesta es muy til no solamente para observar el

desplazamiento de la Progesterona marcada por la Progesterona sin marcar,

sino que tambin para estimar las concentraciones de la hormona en las

muestras problema, ya que los valores de la seal detectada estn en funcin

de la concentracin del analto.66, 68 Debido a que una muestra problema

experimenta un proceso de incubacin y separacin de fracciones bajo las

mismas condiciones que las muestras estndar al realizar la curva, tambin se

pueden detectar las emisiones de su fraccin unida, las cuales permitirn

estimar la concentracin del analto en la muestra, como en la curva estndar

se conocen las respuestas para un intervalo determinado de concentraciones,

el valor de la muestra problema puede ser identificado mediante interpolacin

en la curva estndar, la cual puede ser realizada por medio de un programa

para clculos en computadora (Fig. 11).66, 68, 69

Figura 11. Curva estndar e interpolacin.(Modificado de Garcs, 2008)

30

IV.2. componentes primarios

Los inmunoensayos estn constituidos por tres componentes principales:

el anticuerpo, el trazador y el antgeno no marcado (analto).

IV.2.1. Antgeno

Para que las sustancias de inters a medir puedan ser cuantificadas por

medio de inmunoanlisis, es necesario que stas posean actividad antignica.70

El antgeno o ligando frio11 se puede definir como cualquier sustancia

que puede ser especficamente unida por un anticuerpo o por un receptor de

linfocito B, pero que no necesariamente genera una respuesta inmune. Los

antgenos que se pueden unir a anticuerpo pueden ser desde molculas

pequeas como las hormonas, hasta macromolculas como protenas,

glicoprotenas y otros productos naturales. nicamente las macromolculas son

capaces de estimular por si mismas respuestas inmunitarias, estas molculas

se denominan inmungenos. A pesar del conocimiento de la diferencia entre

estos dos trminos se continua utilizando el trmino antgeno como sinnimo de

inmungeno.58, 62, 71

De igual manera, las molculas pequeas pueden unirse

especficamente a los anticuerpos, pero a diferencia de los inmungenos, estas

molculas no pueden activar a los linfocitos B por si mismas. stas, sin

embargo, pueden ser unidas covalentemente a macromolculas para formar un

inmungeno. En stos casos la molcula pequea se denomina hapteno y la

macromolcula, transportador.58, 71

31

Tabla 1. Caractersticas diferenciales entre inmungenos y haptenos.58, 71

INMUNGENO HAPTENO

Peso molecular: >1000 Daltons Peso molecular:

32

IV.2.3. Trazador

Es la sustancia que se desea medir, pero sta se encuentra unida a un

marcador radioactivo, enzimtico o quimioluminiscente.11 Una de las

caractersticas que distingue a cada mtodo es el antgeno marcado, el cual

debe estar altamente purificado y al ser marcado no debe perder su

inmunorreactividad, debido a la falta de alteraciones alostricas cuando se

conjugan molculas marcadoras con antgenos pequeos.62, 63, 74

El tipo de marcaje para detectar el analto condiciona el mtodo de

deteccin. Por ejemplo, los mtodos radioisotpicos se basan en la deteccin

de la radiacin emitida; los espectrofotomtricos, fluorescentes o luminiscentes,

en la deteccin de luz; los electroquimioluminiscentes se basan en la emisin

de radiacin electromagntica producida por una reaccin qumica.63

IV.3. Caractersticas analticas

Conocer las caractersticas analticas de un inmunoanlisis es de gran

utilidad para el analista a fin de saber el grado de confiabilidad que le puede

proveer el mtodo elegido. Para tal caso es necesario conocer las principales

caractersticas analticas del mtodo, como son la especificidad, sensibilidad,

precisin y exactitud.70

La especificidad de un mtodo inmunoanaltico est ntimamente

relacionada con la especificidad de los anticuerpos empleados en ste.70 Esta

caracterstica, como se dijo anteriormente, es la capacidad de un anticuerpo de

distinguir entre varios antgenos de estructuras similares.57, 63, 66 La actividad

inmunolgica de la progesterona y otras molculas de estructura relacionada

puede ser semejante, pero no refleja la actividad biolgica de esta hormona y

por lo tanto se puede alterar la interpretacin de los resultados, obteniendo de

33

esta manera resultados falsos positivos cuando se pretende medir la actividad

biolgica a partir de la actividad inmunolgica. La especificidad puede ser

determinada mediante la medicin de los porcentajes de reaccin cruzada con

otras molculas relacionadas con la que deseamos cuantificar, en este caso

con la progesterona. 57, 73

La reaccin cruzada se define como la cantidad de antgeno diferente del

analto de inters que reacciona con el anticuerpo y que es necesaria para

reducir el 50% de la seal obtenida de la unin mxima de antgeno marcado,

en relacin a la cantidad de antgeno original que ocasiona la misma cada en la

seal.55, 66

%RC= Concentracin de analto que reduce el 50% de la seal x100

Concentracin de analto que interfiere y reduce el 50% de la seal

Otra caracterstica que debe de cumplir un inmunoanlisis es ser

altamente sensible; esto, se refiere a la cantidad ms pequea de antgeno no

marcado que puede ser distinguida del estndar cero. La sensibilidad depende

de la afinidad del anticuerpo por el antgeno, la actividad especfica del antgeno

marcado, el volumen medio de incubacin, el pH del medio, el tiempo de

incubacin y la precisin del anlisis.57

Despus de haber analizado en repetidas ocasiones el estndar cero, el

valor de la sensibilidad puede ser determinado restando al valor de la media de

la respuesta dos desviaciones estndar, para obtener de esta manera el lmite

de deteccin de la respuesta, cuyo valor ser interpolado en la grafica dosis

respuesta para obtener la mnima concentracin de analto que puede ser

detectada (Fig. 12).55, 75

34

Figura 12. Grfica para obtener el valor de la sensibilidad. Este valor se obtiene restando dos desviaciones estndar al valor de la media de la respuesta obtenida con el estndar cero (B0), e interpolando ste en la grfica dosis respuesta.

(Modificado de Davies,

2005)

La precisin describe la dispersin de los resultados con respecto al valor

esperado de una misma muestra. Cuando la dispersin de los valores

determinados en un anlisis es pequea, se dice que la precisin es alta.76, 77

La precisin suele expresarse como coeficiente de variacin48, es decir, el

porcentaje de la desviacin estndar sobre el valor de la media75:

%CV= s x 100

X

35

Donde s es el valor de la desviacin estndar, X es la media aritmtica de los

resultados individuales.

Cuando se estudia la variacin en la cuantificacin de muestras iguales

en un mismo anlisis se dice que el coeficiente de variacin es intraensayo, y

cuando se estudia la misma variacin entre muestras iguales pero cuantificadas

en diferentes anlisis se le conoce como coeficiente de variacin interensayo.70

Cabe destacar que no se debe de confundir la precisin con la exactitud,

ya que sta se refiere a la cercana del valor medio de la muestra al valor

verdadero del anlisis.75 El cual se puede saber cundo se dispone de patrones

de referencia certificados. En consecuencia, la exactitud puede evaluarse

realizando experimentos de recuperacin consistentes en aadir cantidades

conocidas del analto a muestras de suero o plasma libre del analto a

cuantificar y a relacionar la cantidad determinada en el anlisis con la

esperada.66 La exactitud se expresa como porcentaje de recuperacin en la

valoracin de una cantidad conocida de analto sobre la muestra.78 La forma de

obtener el porcentaje de recuperacin es la siguiente:

%Recuperacin = valor observado x 100 valor esperado

Otra forma de evaluar la exactitud, es comparar los resultados del analto

en las muestras obtenidos por medio del inmunoanlisis que se est

empleando, con los resultados obtenidos por otros inmunoanlisis previamente

validados correlacionando los resultados por el proceso de regresin lineal, del

que se espera un coeficiente de correlacin igual o cercano a 1.00.66

36

V. Radioinmunoanlisis

Las primeras tcnicas inmunoanalticas aplicadas en endocrinologa

fueron los trabajos de Yallow y Berson en 1959, en los cuales se utilizaron

isotopos radioactivos y anticuerpos para analizar insulina.79-81 Posteriormente,

en la dcada de los 80, los inmunoanlisis que utilizaban isotopos radioactivos

fueron establecidos en los laboratorios de produccin animal. Se comenzaron a

desarrollar y validar protocolos de RIA para ser utilizados para el anlisis de

Progesterona.59 Actualmente el RIA es aplicado en ganadera y en el campo de

la endocrinologa clnica para medir los niveles de progesterona en sangre con

mucha precisin.6, 7 , 81

El antgeno marcado es la sustancia que se desea detectar pero sta se

encuentra unida a una partcula radiactiva, lo cual es una de las principales

caractersticas que distingue a este mtodo. Los radioistopos ms frecuentes

empleados como marcaje en los radioinmunoanlisis son el I125, I131, H3, C14 y

P32. 11, 62

La caracterstica ms relevante de un radioistopo para ser seleccionado

como molcula marcadora es su vida media, que se refiere al tiempo que tarda

el ncleo original en desintegrase a la mitad.57 La mayora de los RIA

actualmente emplean el I125, la razn por la que este radioistopo es utilizado

con ms frecuencia, es debido a que necesita un tiempo relativamente corto

para el conteo y tiene una vida media superior al I131, pero no puede

almacenarse mucho tiempo, debido a su vida media de 60 das.62 Este

radioistopo es un tomo inestable cuyo ncleo decae espontneamente a un

estado ms estable, emitiendo energa en forma de radiacin gamma.57, 82, 83

Otro radioistopo utilizado es el tritio (H3), que emite radiaciones beta y que

tiene una vida media de 12.3 aos, pero requiere un tiempo mayor para el

conteo, y por tanto incrementa la duracin del ensayo, razn por la cual su uso

en RIA no es frecuente.62 En cambio, debido a sus caractersticas, el uso de

37

antgenos marcados con I125 posibilita el diseo de protocolos donde una de las

fracciones se queda en el tubo de ensayo cuya seal puede ser contada

directamente en trminos de cuentas por minuto (CPM) como emisiones de

radiacin gamma,62 mediante un contador de centelleo que detecta el numero

de desintegraciones por minuto (Fig. 13).83

Figura 13. RIA en fase slida que emplea I125. (Modificado de Ashihara, 2007)

V.1. Caractersticas analticas

Los RIA para determinar Progesterona siguen el mtodo competitivo, un

ejemplo de estos inmunoanlisis es el ensayo Coat-A-Count Progesterona7

cuyas caractersticas analticas son las siguientes:84

Sensibilidad: 0.02 ng/mL

Precisin

Coeficiente de variacin intraensayo (ng/mL)

Los datos mostrados en la tabla 2 fueron calculados para las muestras a partir

de los resultados de 20 pares de tubos en un solo ensayo.

38

Tabla 2. Coeficientes de variacin intraensayo del ensayo Coat-A-Count Progesterona.84

Media DS CV (%)

1 0.34 0.03 8.8

2 0.82 0.04 4.9

3 1.5 0.06 4

4 3.3 0.12 3.6

5 18 0.7 3.9

6 30 0.8 2.7

Coeficiente de variacin interensayo (ng/mL)

Los datos mostrados en la tabla 3 fueron calculados para las muestras a partir

de los resultados de 20 pares de tubos en diferentes ensayos de la tcnica:

Tabla 3. Coeficientes de variacin interensayo del ensayo Coat-A-Count

Progesterona.84

Media DS CV (%)

1 0.31 0.03 9.7

2 0.84 0.06 7.1

3 1.4 0.08 5.7

4 3.3 0.13 3.9

5 18 1 5.6

6 28 1.1 3.9

Especificidad

En la tabla 4 se muestran las reacciones cruzadas que se observaron con otras

molculas diferentes a la progesterona pero con estructura relacionada:

39

Tabla 4. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a la progesterona observadas en el ensayo Coat-A-Count Progesterona.84

Componente Reactividad cruzada (%)

Progesterona 100

Androstenediol ND

Corticosterona 0.9

Cortisol 0.03

Danazol 0.006

11-Desoxicorticoesterona 2.2

11-Desoxicorticoesterol 0.01

DHEA-SO4 0.002

20-Dihidroprogesterona 0.2

Estradiol ND

17-Hidroxiprogesterona 3.4

Medroxiprogesterona 0.3

Pregnano ND

5-Pregnan-3-ol-20-ona 0.05

5-Pregnan-3,20-diona 9

5-Pregnan-3,20-diona 3.2

Pregnenolona 0.1

5-Pregnen-3-ol-20-one-sulfato 0.05

Testosterona 0.1

ND= No Detectable

Exactitud

Trescientas cuarenta muestras de suero de pacientes fueron sujetas a

ensayo con el procedimiento Progesterona Coat-A-Count y con el kit de

Progesterona IMMULITE, con concentraciones de progesterona que van desde

aproximadamente 0.17 a 18 ng/mL. La siguiente ecuacin define la relacin

lineal:

(CAC) = 1.05 (IML) + 0.13 ng/mL

R = 0.993

40

V.2. Ventajas y desventajas

El RIA tiene la ventaja de ser una tcnica de elevada sensibilidad ya que

permite cuantificar sustancias que se encuentran en concentraciones del orden

de pg/mL85 y la seal puede ser detectada sin optimizacin y con bastante

estabilidad frente a la interferencia ambiental del ensayo, adems de que el

empleo de isotopos radioactivos como marca no suele afectar a la actividad

antignica, debido a la falta de alteraciones alostricas62

. Las desventajas del

RIA son la pronta caducidad del istopo radioactivo, como es el caso del I125

que tiene una vida media de 60 das, as como la necesidad de disponer de

instalaciones adecuadas y personal calificado para su realizacin, adems de la

debida disposicin de los desechos debido al riesgo de contaminacin

radioactiva para el personal y el medio ambiente.62, 86

41

VI. Enzimoinmunoanlisis

En la dcada del 70, se desarrollaron inmunoanlisis que emplean

enzimas como molcula marcadora,87, 88 siendo de esta manera una alternativa

a la necesidad de trabajar con istopos radioactivos, para lo cual hace falta

siempre autorizaciones oficiales.62, 86

Actualmente, los ensayos inmunoenzimticos se encuentran

comercialmente disponibles para su uso en veterinaria para determinar niveles

de progesterona en sangre, de los cuales se pueden encontrar ensayos

semicuantitativos as como tambin cuantitativos.89-92

El principio de los inmunoanlisis enzimticos es similar al de RIA,

excepto que no son istopos radioactivos los que se emplean como marca sino

enzimas, de las cuales la peroxidasa de rabano y la fosfatasa alcalina son las

de mayor aplicacin,79, 93 por lo tanto, no es la radioactividad la que se mide,

sino la actividad enzimtica del complejo formado.62 Esto ltimo puede lograrse

con la adicin de un sustrato en un segundo paso de incubacin. El tipo de

sustrato empleado es lo que va a definir si el inmunoanlisis es colorimtrico,

fluoromtrico o quimioluminiscente.83

En medicina veterinaria los EIA mas empleados para determinar

Progesterona son los del tipo colorimtrico8 y los quimioluminiscentes. El

mtodo colorimtrico funciona mejor con peroxidasa de rabano, ya que la

intensidad de la seal obtenida con sta enzima es mayor que la obtenida con

fosfatasa alcalina ante un substrato colorimtrico, brindando de esta manera

mayor sensibilidad al anlisis. El substrato que ms se usa comnmente con la

peroxidasa es el TMB (tetrametilbencidina),94 cuya reaccin genera un color el

cual es ledo por un espectrofotmetro que expresa el resultado en densidad

ptica79, stos resultados son graficados en la curva estndar para estimar la

concentracin del analto.83

42

El mtodo enzimtico quimioluminiscente es el mtodo de preferencia

por algunos laboratorios de investigacin veterinaria10, 91, 92 debido a que el

sustrato empleado en ste, por presentar alta estabilidad,93 ha permitido el

desarrollo de sistemas automatizados, facilitando de esta manera su ejecucin,

como es el caso del sistema IMMULITE,10 el cual utiliza fosfatasa alcalina como

molcula marcadora y adamantil-1-2-dioxetano aril fosfato (AMPPD) como

substrato. La reaccin inmunolgica en ste sistema es llevada a cabo en un

tubo que contiene una perla recubierta de anticuerpos especficos para

progesterona, dentro del cual se agregan la muestra y el reactivo de manera

automtica. Despus de la primera incubacin a 37C, el tubo es centrifugado

sobre su eje longitudinal y sometido a pasos de lavado entre cada

centrifugacin, dejando de esta manera, al tubo que contiene la perla recubierta

totalmente libre de antgeno no unido (Fig. 14). Despus del paso de lavado, se

adiciona el substrato AMPPD, cuyo grupo fosfato es escindido para producir

una molcula inestable que emite luz en el rango comprendido entre 400 y 750

nm, la cual es medida en un contador de fotones; las cuentas por segundo son

interpretadas, mediante la curva de calibracin almacenada en el equipo, como

la concentracin del analto (Fig. 15).95

43

Figura 14. Pasos del ensayo IMMULITE. 1) El reactivo y la muestra son pipeteados

automticamente en el tubo el cual es incubado a 37C; 2) En el paso de lavado, la unidad es centrifugada a alta velocidad sobre su eje vertical; 3) La fraccin no unida es retirada eficientemente de la unidad de ensayo; 4) Se aade el substrato quimioluminiscente a la unidad para lograr la emisin de la luz.(Modificado de Bapson, 2005)

Figura 15. Reaccin enzimtica que se lleva a cabo en el sistema IMMULITE.(Modificado de Bapson, 2005)

44

VI.1. Caractersticas analticas

Las caractersticas analticas del ensayo IMMULITE 1000 Progesterone

son las siguientes:96

Sensibilidad: 0.2 ng/mL

Precisin:

Coeficiente de variacin intraensayo (ng/mL)

Los datos estadsticos mostrados en la tabla 5 fueron obtenidos a partir de 20

replicas en una sola corrida.

Tabla 5. Coeficientes de variacin intraensayo del ensayo IMMULITE 1000 Progesterone.96

Media DS CV%

1 0.93 0.15 16

2 1.9 0.15 7.9

3 4.3 0.35 8.1

4 7.9 0.5 6.3

Coeficiente de variacin interensayo (ng/mL)

Los datos estadsticos mostrados en la tabla 6 fueron obtenidos a partir de

muestras analizadas en 20 corridas distintas.

Tabla 6. Coeficientes de variacin interensayo del ensayo IMMULITE 1000 Progesterone.96

Media DS CV%

1 0.81 0.13 16

2 1.7 0.17 10

3 3.9 0.31 7.9

4 7.2 0.42 5.8

45

Especificidad:

En la tabla 7 se muestran las reacciones cruzadas que se observaron con otras

molculas diferentes a la progesterona.

Tabla 7. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a la progesterona observadas en el ensayo IMMULITE 1000 Progesterone.96

Componente Reactividad cruzada (%)

Progesterona 100

Androstendiona 0.047

Corticosterona 0.38

Cortisol 0.066

Danazol 0.004

11-Desoxicorticosterona 1.18

11-Desoxicortisol ND

Estradiol ND

17-Hidroxi-progesterona 1.04

Medroxi-progesterona 0.21

Pregnenolona 0.3

Testosterona 0.12

ND = no detectable

Exactitud:

El ensayo fue comparado con el IMMULITE 2000 Progesterona (L2KPW) en

182 muestras de pacientes. El intervalo de concentracin fue aproximadamente

de 0.2 a 20ng/mL. La relacin se define por la siguiente ecuacin:

(IML-LKPG)=1.19 (IML 2000-L2KPW) 0.60 ng/mL

r=0.969

46

VI.2. Ventajas y desventajas

Las ventajas de emplear mtodos enzimticos es que se evita el uso de

istopos radioactivos que pueden causar contaminacin y efectos nocivos a la

salud;62 las enzimas empleadas son ms estables que los isotopos radioactivos

y presentan una mayor vida de almacn3, 83; una sola molcula de enzima

puede causar la conversin de 107 molculas de sustrato por minuto logrando

de esta manera una seal ms fuerte83

; los reactivos necesarios son menos

costosos que los de RIA; todos los pasos de incubacin, separacin de las

fases, deteccin de la seal y procesamiento de datos, son realizados de

manera automtica en el sistema IMMULITE 1000 95por lo que los resultados

pueden ser obtenidos con mayor rapidez3.

Entre las desventajas de ste mtodo est que la actividad de las

enzimas puede ser modificada por los anticoagulantes, por lo tanto sta tcnica

no puede ser utilizada con cualquier medio de recogida de muestras3, 79 adems

de que se requieren de dos incubaciones, de las cuales la segunda se trata del

paso para la generacin de la seal la cual es muy susceptible a

interferencias.83

47

VII. Quimioluminiscencia

Las primeras aplicaciones de la quimioluminiscencia como tcnica analtica

fueron realizadas en el final de la dcada del 50, con la aplicacin de varias

sustancias quimioluminiscentes como indicadores volumtricos. A partir de

entonces, el inters analtico de la quimioluminiscencia ha aumentando

considerablemente debido a las ventajas como alta sensibilidad y rangos

amplios de deteccin, as como la alta actividad especfica y la gran versatilidad

de los compuestos quimioluminiscentes.97 Las investigaciones se han centrado

especialmente en el desarrollo de productos quimioluminiscentes para

aplicaciones de diagnstico mediante tcnicas inmunolgicas98, desde el

empleo de stos productos como substratos en inmunoanlisis enzimticos,

hasta su uso para marcar antgenos y anticuerpos de manera directa; as, la

quimioluminiscencia directa es hoy en da una alternativa ms al uso de

radioistopos, lo que puede significar un posible sustituto del RIA.97

Al igual que las tcnicas que emplean isotopos radioactivos y enzimas9, los

inmunoanlisis de quimioluminiscencia directa y los electroquimioluminiscentes

son tcnicas empleadas en la actualidad por laboratorios de investigacin

veterinaria para determinar niveles de progesterona en sangre y obtener

diagnsticos exactos.99, 100

La Quimioluminiscencia es la emisin de radiacin electromagntica,

normalmente en la regin del visible o del infrarrojo cercano, producida por una

reaccin qumica,97 en la cual, la molcula luminiscente que reacciona puede

ser descompuesta en un fragmento excitado que emite luz o ser llevada a un

estado excitado que retorna a su estado fundamental lo que es acompaado de

la emisin de un fotn.81 La reaccin quimioluminiscente se produce de forma

adiabtica, es decir, que la reaccin ocurre sin prdida ni ganancia de energa

en forma de calor.101

48

Para lograr la emisin de luz, se emplean compuestos como esteres de

acridinio o luminol que son oxidados en medio bsico, por el perxido de

hidrgeno provocando la emisin de un fotn.81

Una de las principales molculas marcadoras utilizadas para generar

quimioluminiscencia directa es el ester de acridinio como ocurre en el caso del

sistema ADVIA Centaur,100 el cual emplea como fase solida, micropartculas

paramagnticas recubiertas de progesterona y como marca el ster de acridinio

que se encuentra unido a anticuerpos especficos contra la sustancia a analizar,

los cuales se unirn a la progesterona presente en la muestra y tambin a la

progesterona unida a la fase slida. Las partculas paramagnticas empleadas

en estos ensayos ofrecen una mxima superficie de contacto y una rpida

separacin magntica. Este ensayo se caracteriza por la emisin de luz visible

debido a una reaccin qumica producida por la oxidacin del ester de acridinio

en medio bsico (Fig. 16).81

49

Figura 16. Pasos que se llevan a cabo en el sistema ADVIA Centaur. 1) En la celda de reaccin, el anticuerpo marcado con ster de acridinio se une a la progesterona presente en la muestra y a su vez a un derivado de la progesterona unido a partculas paramagnticas, se incuba la celda a 37C. 2) Despus del perodo de incubacin, se lleva a cabo la separacin magntica de la fase slida, el aspirado del lquido contenido en la celda y la separacin por lavado de los anticuerpos no unidos a la fase slida. 3) A la celda de reaccin donde se encuentra la fase slida se le aaden los reactivos para, 4) iniciar la reaccin de quimioluminiscencia.(Modificado de Taylor, 2005; Kricka, 2005)

El mtodo electroquimioluminiscente tambin es empleado en medicina

veterinaria para determinar niveles de progesterona en sangre, como es el caso

del sistema Elecsys 2010 con el cual se pueden obtener resultados exactos.99

ste sistema emplea partculas paramagnticas cubiertas de estreptavidina las

cuales en una segunda incubacin sern recubiertas de anticuerpos marcados

con biotina que habrn reaccionado de manera competitiva con la progesterona

de la muestra y la progesterona marcada en la primera incubacin (Fig. 17). La

molcula que es empleada como marca en este sistema es el rutenio II; ste

compuesto en presencia de tripropilamina es oxidado en la superficie de un

electrodo mediante la aplicacin de un potencial elctrico, el cual tambin oxida

50

a la tripropilamina de manera simultnea y es convertida en un catin radical,

que reacciona con el Rutenio oxidado el cual pasa a un estado excitado y emite

un fotn de luz a 620nm al decaer a su estado basal a travs de la reduccin

con tripropilamina(Fig. 18).102,103

Figura 17. Reacciones de unin involucradas en el sistema ELECSYS. 1) La muestra es incubada en presencia de anticuerpos unidos a biotina y progesterona marcada con rutenio II. 2) En la segunda incubacin, el complejo inmune formado es unido a partculas recubiertas de estreptavidina, las cuales tienen una alta capacidad de unin a la biotina. 3) La mezcla de reaccin es trasladada a la celda de medicin donde las micropartculas son magnticamente capturadas en la superficie de un electrodo y los componentes libres separados por lavado. 4) Como paso final, la quimioluminiscencia es inducida por medio de la aplicacin de un potencial elctrico en la superficie del electrodo.(Modificado de Myers, 2005)

51

Figura 18. La reaccin de oxidacin del rutenio en la superficie del electrodo se lleva a cabo en presencia de tripropilamina (TPA), que es oxidada simultneamente con el rutenio al aplicarse un potencial elctrico y convertida en un catin radical que pierde un protn y reacciona con el rutenio oxidado, resultando en el estado excitado de ste, el cual decae a su estado basal con la emisin de un fotn. (Modificado de Myers, 2005)

Para medir la luminiscencia obtenida por quimioluminiscencia directa as

como por electroquimioluminiscencia, cuyas reacciones se llevan a cabo en una

celda aislada de la luz, se utiliza un tubo fotomultiplicador, el cual detecta los

fotones de luz emitida y los convierte en pulsos elctricos que son contados por

el sistema en Unidades Relativas de Luz (RLU).81 La intensidad de la emisin

de luz es relacionada con la curva patrn almacenada en el sistema para la

cuantificacin del analto; los datos obtenidos son convertidos automticamente

por el software del sistema a datos de concentracin del analto, los cuales

tambin pueden ser convertidos a unidades del Sistema Internacional de

Unidades (SI). Esta caracterstica se presenta en el sistema ADVIA Centaur de

SIEMENS y en cualquiera de los sistemas Elecsys de Roche.102, 104

52

VII.1. Caractersticas analticas

Las caractersticas analticas del ensayo Elecsys Progesterone II son las

siguientes105:

Sensibilidad analtica: 0.03 ng/mL

Precisin intraensayo e interensayo (ng/mL).

La precisin fue determinada mediante reactivos Elecsys, sueros

humanos y controles segn un protocolo modificado (EP5-A) del CLSI (Clinical

and Laboratory Standards Institute) (tabla 8)

Tabla 8. Coeficientes de variacin intraensayo e interensayo del analizador Elecsys 2010.105

Elecsys 2010

Precisin Intraensayo Precisin Interensayo

Muestra Media (ng/mL) DS (ng/mL) CV % DS (ng/mL) CV %

SH 1 1.57 0.04 2.4 0.09 5.4

SH 2 12 0.17 1.5 0.48 4.1

SH 3 30.2 0.76 2.7 1.54 5.5

PC U 1 8.83 0.19 2.3 0.38 4.6

PC U 2 20.8 0.35 1.7 0.77 3.7

SH= suero humano PU C= PreciControl Universal

Tabla 9. Coeficientes de variacin intraensayo e interensayo del analizador MODULAR ANALYTICS E170.105

MODULAR ANALYTICS E170

Precisin Intraensayo Precisin Interensayo

Muestra Media

(ng/mL)

DS

(ng/mL)

CV % Media

(ng/mL)

DS

(ng/mL)

CV %

SH 1 0.73 0.02 2.9 0.79 0.04 4.8

SH 2 3.01 0.04 1.4 3.13 0.09 2.8

SH 3 32.4 0.3 0.9 35.3 0.7 2

PC U 1 4.89 0.05 1.1 5.26 0.17 3.3

PC U 2 19.3 0.14 0.7 20.4 0.38 1.8

53

Especificidad:

Las reacciones cruzadas observadas con otras molculas diferentes a la

progesterona se muestran en la tabla 10.105

Tabla 10. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a la progesterona observadas en el ensayo Elecsys Progesterone II (en %).105

COMPUESTO %

Androstendiol 0.002

Androstendiona 0.136

Corticosterona 0.687

Cortisol 0.005

Danazol 0.002

DHEA-S 0.009

D-(-)-Norgestrel 0.008

Estradiol 0.009

Etisterona 0.002

Etinoldioldiacetato n.d.

Medroxiprogesterona 0.812

Noretindrona 0.01

Noretindrona acetato n.d.

Testosterona 0.02

4-Pregnen-11-17-diol-3,20-diona 0.338

11-Desoxicorticosterona 0.296

11-Desoxicortisol 0.392

5--Dihidrotestosterona 0.04

5--Dihidroprogesterona 20.7

5-Pregnen-3-ol-20-ona 0.858

5-Pregnan-3-ol-20-ona 0.211

6-Metil-17-hidroxi-progesterona acetato 0.257

6-Metilprednisolona n.d.

17-Hidroxipregnenolona 0.018

17-Hidroxiprogesterona 1.3

20-Hidroxi-4-pregnen-3-ona 0.016

n.d.=no detectable

Exactitud: se compar el ensayo Elecsys Progesterone II con el ensayo

Elecsys Progesterone usando muestras clnicas, y se obtuvo la siguiente

correlacin:

54

Nmero de muestras: 88

Regresin lineal

y = 0.90x + 0.50

r = 0.998

Las concentraciones de las muestras eran de aproximadamente entre 0.2 y 44

ng/mL.

El mtodo quimioluminiscente directo ADVIA Centaur Progesterona

presenta las siguientes caractersticas analticas106:

Sensibilidad analtica: 0.15 ng/mL

Precisin

Para obtener la precisin se analizaron seis muestras seis veces, en cada una

de diez series, en tres sistemas, durante un perodo de tres das (tabla 11).

Tabla 11. Coeficientes de variacin intraensayo e interensayo del ensayo Progesterona de ADVIA Centaur.106

Media (ng/mL) CV intraensayo

(%)

CV interensayo

(%)

CV total (%)

1.2 12.4 2.6 12.7

1.5 7.2 5.7 9.2

7.2 3.7 3.9 5.4

11.9 2.5 3.1 3.9

20.9 3.2 1.9 3.7

48.7 2.5 4.2 4.8

Especificidad.

El ensayo Progesterona de ADVIA Centaur presenta una elevada

especificidad para la progesterona. Se aadieron los siguientes compuestos a

Multidiluyente 3 y se determin el Valor aparente de progesterona. El porcentaje

de reactividad cruzada es el resultado aparente en comparacin con la cantidad

agregada (tabla 12).

55

Tabla 12. Reacciones cruzadas con otras molculas diferentes a progesterona observadas en el ensayo Progesterona de ADVIA Centaur.106

Compuesto Reactividad cruzada (%)

Cortisol ND

11-desoxicorticosterona 0.08

Corticosterona 0.95

Testosterona ND

Aldosterona ND

Pregnenolona 0.46

Androstenodiol ND

17-hidroxiprogesterona 0.31

11-desoxicortisol ND

Danazol ND

Prednisolona ND

17-estradiol ND

Estrona ND

Estriol ND

Clomifeno ND

Bromocriptina ND

ND=No detectable

Exactitud:

Se compar el ensayo Progesterona ADVIA Centaur con el ensayo

Progesterona ACS:180, realizando el anlisis de 230 muestras con

concentraciones dentro del rango de 0.15 a 53.7 ng/mL, la relacin se define

por la siguiente ecuacin:

Progesterona de ADVIA Centaur = 0,97 (Progesterona de ACS:180) 0,12

ng/ml

Coeficiente de correlacin (r) = 0,99.

56

VII.2. Ventajas y desventajas

Todos los pasos de adicin de reactivos, generacin de la seal y deteccin

de sta son realizados de manera automtica en el equipo analizador; debido a

la automatizacin se reduce la manipulacin de los reactivos conservndolos en

buen estado; las molculas marcadoras utilizadas para la quimioluminiscencia

no generan ruido de fondo, adems de no generar radioactividad lo que no

produce riesgos a la salud derivados de la exposicin a los reactivos, por lo

tanto, no se necesitan licencias especiales de operacin para el personal que

realiza el anlisis, como en el caso de Radioinmunoanlisis, lo que significa un

importante ahorro de recursos econmicos81, 83; no se necesita realizar la curva

patrn de manera manual, ya que sta se encuentra almacenada en l sistema,

adems de que la estabilidad de las calibraciones presenta un tiempo

prolongado, lo que reduce el tiempo de operacin y optimiza el costo por

prueba; pueden obtenerse limites de deteccin muy bajos y los resultados son

interpretados directamente en unidades de concentracin del analto en

cuestin de minutos.81, 102, 104 Pero a pesar de las ventajas ofrecidas, se debe

de tener especial cuidado al manipular los reactivos, ya que los ensayos por

quimioluminiscencia requieren reactivos escrupulosamente puros debido a que

las impurezas pueden causar una seales de fondo no especficas que afecta a

la sensibilidad del ensayo.83

57

VIII. Anlisis y discusin

Se realiz la revisin bibliogrfica de las tcnicas inmunolgicas para

medir progesterona en sangre, de las cuales los sistemas ms empleados en

medicina veterinaria son los sistemas Coat-A-Count, IMMULITE 1000 y ADVIA

Centaur de SIEMENS y ELECSYS 2010 de Roche, los cuales se basan en el

mtodo competitivo.

Los sistemas descritos en ste trabajo presentan caractersticas

analticas apropiadas para medir progesterona, pues presentan una sensibilidad

que permite detectar las concentraciones mnimas de sta hormona durante el

ciclo estral, y cuyos valores son cercanos a 1 ng/mL. As mismo, muestran

buena especificidad hacia la progesterona, ya que el porcentaje mximo de

reaccin cruzada que se registra es de 20.7% para 5--dihidroprogesterona;

ste porcentaje no es significativo ya que este metabolto es derivado de la

progesterona, en consecuencia, si la concentracin de progesterona en sangre

aumenta o disminuye, la 5--dihidroprogesterona tambin lo har de manera

proporcional, pero siempre se encontrar en menor cantidad.107 Los valores

mximos de coeficientes de variacin intra e inter ensayo se observan en el

sistema IMMULITE 1000, los cuales son admisibles para los inmunoanlisis que

determinan hormonas en medicina veterinaria.10, 73, 91 Los cuatro sistemas son

exactos ya que al ser relacionados con otros sistemas previamente validados

demostraron coeficientes de correlacin cercanos a uno.

Si bien los cuatro sistemas tienen caractersticas analticas similares,

cada uno recurre a cierta tcnica que no presentan iguales particularidades

tecnolgicas. Las tcnicas quimioluminiscentes y la enzimtica mencionadas en

esta monografa se valen de sistemas automatizados y la radioinmunoanaltica

de un mtodo manual. sta condicin conlleva de manera adjunta ciertas

ventajas y desventajas. Por ejemplo, los sistemas automatizados no requieren

de gran manipulacin de los reactivos por parte del operador a diferencia del

58

sistema manual, adems de tener el inconveniente de utilizar reactivos

peligrosos por ser radioactivos hacindose presente el riesgo de contaminacin

radiactiva en caso de ocurrir un accidente, y en adicin, el simple hecho de

manipularlos constituye una exposicin a la misma. Derivado de estos

aspectos, las normativas establecidas exigen contar con personal clasificado

como ocupacionalmente expuesto, as como los requerimientos que deben

tener los laboratorios que manipulen este tipo de materiales.86, 108-110

En cuanto a la estabilidad de los reactivos, los utilizados en mtodos

enzimticos son ms estables que los isotopos radioactivos, por presentar una

mayor vida de anaquel, sin embargo, en el mtodo enzimtico la actividad de

las enzimas puede ser modificada por anticoagulantes, por consiguiente no

puede ser empleado cualquier medio de recoleccin de muestra. Por su parte la

quimioluminiscencia directa requiere de reactivos escrupulosamente puros, ya

que las impurezas pueden afectar la sensibilidad del ensayo. En contraste el

empleo de isotopos radioactivos no afecta la actividad antignica ya que no

crea alteraciones alostricas que puedan afectar la sensibilidad del ensayo.

Es importante considerar que el precio por unidad de anlisis de un

sistema automatizado puede ser ms elevado que el precio por tubo de un

sistema manual. Por ejemplo, el precio del paquete que contiene 100 tubos

para realizar RIA es de 237.80 USD, el de 200 tubos es de 408.32 USD y el del

que contiene 500 tubos es de 997.60 USD. El precio del paquete de unidades

de anlisis del sistema IMMULITE 1000 para 100 pruebas es de 377.02 USD.

Todos los precios son vigentes al 2012 con IVA incluido.111 Por lo tanto es ms

caro el costo por tubo del sistema IMMULITE 1000 (3.77 USD) que el de RIA

(2.37 USD).

Los datos obtenidos en el presente trabajo, son de utilidad para

considerar qu mtodo es conveniente establecer en el laboratorio, pero

tambin se debe tomar en consideracin la capacidad econmica para la

adquisicin de uno u otro sistema, por lo que tambin puede considerarse en

59

qu parte de la tcnica es posible tener un ahorro de los recursos econmicos e

integrarlos en la rutina, haciendo a la tcnica menos cara. A pesar de las

ventajas que ofrecen los mtodos automatizados, estos pudieran no ser una

opcin para algunos laboratorios ya sea porque stos no cuentan con los

suficientes recursos econmicos para adquirirlos o bien porque ya han

establecido el sistema Radioinmunoanaltico.

Es importante tomar en cuenta el costo de operacin de la tecnologa,

porque el costo de un equipo automatizado es mayor que el del sistema

manual, y el impacto del costo est reflejado en la frecuencia e intensidad de

uso de este mismo equipo, por ejemplo si un equipo manual cuesta 4,977 USD

y el automatizado 5,880 USD, y ambos procesan 500 muestras por da, el costo

de operacin del equipo por unidad de muestra procesada para el primero es de

9.95 USD y para el segundo 11.76 USD.112

Desde el punto de vista del tiempo de vida til del equipo, que se

determina a travs de la depreciacin, si dos equipos tienen la misma vigencia

til, pero uno de ellos es ms costoso, al final ste ltimo tambin tendr un

valor ms alto de depreciacin. Por ejemplo, si los equipos mencionados

anteriormente, tienen los mismos periodos de vida til, la depreciacin a 10

aos, suponiendo que no existe costo de recuperacin del equipo mismo ($0.0),

por el mtodo lineal es de 497.7 USD/ao para el equipo manual y de 588.0

USD/ao para el automatizado.112, 113

Finalmente se puede aadir los costos de mantenimiento del equipo, este

costo es mayor para un equipo cuyos componentes sean ms caros, ya sea

por el costo de sus refacciones o por la mano de obra tcnica. Estas son

condiciones que deben analizarse al momento de decidir cual tecnologa

implementar, principalmente en pases como Mxico, en el cual la investigacin

es altamente dependiente de tecnologa extranjera.114, 115

60

Para atender el inconveniente econmico que acarrea realizar pruebas

inmunoanalticas, se han encontrado investigaciones en la literatura que han

propuesto alternativas para superar este obstculo.

Una de estas investigaciones encontradas, fue la realizada por Montes et

al.4 en la cual se validaron dos tcnicas radioinmunoanalticas para medir

progesterona, establecidas utilizando anticuerpos obtenidos mediante la

inmunizacin de animales con progesterona. La primera tcnica utiliz

anticuerpos inducidos en plasma de conejo y la segunda con anticuerpos

inducidos en gallina de postura extrados de la yema de huevo.

Al hacer la evaluacin de las caractersticas analticas, se encontr que

stas fueron adecuadas para reconocer actividad luteal, ya que presentaron

reacciones cruzadas inferiores a 7% y sensibilidad menor a 0.27 ng/mL, a pesar

de observarse coeficientes de variacin intraensayo de 14.7 y 19.6%, y

coeficientes de variacin interensayo de 22.7 y 22.2% para la tcnica

establecida con anticuerpos de conejo y la establecida con anticuerpos de yema

de huevo, respectivamente. Estos valores elevados fueron explicados por la

presencia de residuos de solventes orgnicos en los tubos donde se

concentraron los esteroides para ser analizados despus del proceso de

extraccin. Aunque los valores de coeficientes de variacin fueron elevados,

stos se encontraron por debajo de los de algunos inmunoensayos comerciales

para medir progesterona, disponibles en 1996, los cuales presentaban

coeficientes de variacin intra e interensayo de 33 y 32% respectivamente.

Adems, al comparar el valor de las concentraciones de progesterona

determinadas con los radioinmunoanlisis establecidos en los cuales se

emplearon los anticuerpos obtenidos y las estimadas con un estuche

comercial, se obtuvo una elevada correlacin.

Aunque ambas tcnicas establecidas por Montes et al. presentaron una

precisin comparable a la ofrecida por algunos inmunoensayos comerciales,

ste es un parmetro que ha sido mejorado en la actualidad, logrando

61

coef