- GUIA DE TCNICAS INMUNOLGICAS 2010 - INDICE

1. Interaccin antgeno-anticuerpo Pgina 1

2. Interaccin Secundaria Ag-Ac Pgina 1

2.a. Reacciones de precipitacin Pgina 1

2.b. Tcnicas inmunolgicas basadas en reacciones de precipitacin. Pgina 2

Inmunodifusin Radial Pgina 2

Inmunoelectroforesis Pgina 2

2.c. Reacciones de aglutinacin Pgina 3

2.d. Concepto de ttulo Pgina 5

3. Interaccin primaria Ag-Ac Pgina 7

3.a. Inmunomarcacin Pgina 7

Inmunomarcacin con Acs conjugados a ENZIMAS Pgina 8

Inmunomarcacin con Acs conjugados a FLUOROCROMOS Pgina 8

Citometra de Flujo Pgina 9

3.b. Radioinmunoanlisis y Tcnicas radioinmunomtricas Pgina 12

3.c. ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay) Pgina 13

4. Otras tcnicas

4.a. Proteinograma electrofortico Pgina 14

4.b. Nefelometra Pgina 15

4.c. Western Blot Pgina 15

5. Tcnicas de tipificacin de antgenos de histocompatibilidad Pgina 16

5.a. Tcnicas serolgicas Pgina 17

5.b. Tcnicas moleculares Pgina 18

6. Cross match Pgina 22

7. Tcnicas inmunolgicas para estudiar la funcionalidad de los fagocitos Pgina 22

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1. INTERACCIN ANTGENO-ANTICUERPO La unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interaccin reversible en la que estn involucrados enlaces no-covalentes. En la interaccin in vitro de un antgeno (Ag) con su correspondiente anticuerpo (Ac) se distinguen dos etapas, la interaccin primaria no visualizable y la interaccin secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparicin de un fenmeno visible como la aglutinacin o la precipitacin. Por otro lado, no siempre que se produce la interaccin primaria Ag-Ac, se produce la interaccin secundaria, ya que, para conseguir fenmenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y caractersticas de los Ags y Acs. 2. INTERACCIN SECUNDARIA ANTIGENO-ANTICUERPO. Las tcnicas inmunolgicas que evidencian la interaccin Ag-Ac a travs de una reaccin secundaria (precipitacin o aglutinacin) son, generalmente, ms econmicas y sencillas que aquellas que permiten visualizar la interaccin primaria (ver ms adelante). 2.a. Reacciones de precipitacin Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs especficos, la interaccin Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interaccin Ag-Ac. Tal como se observa en la figura, cuando se agregan concentraciones crecientes de Ag soluble a una cantidad fija de suero conteniendo Acs especficos, a medida que la cantidad de Ag agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta alcanzar un mximo, luego del cual declina. En un extremo de la curva de precipitacin, cuando se agregan pequeas cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ac. En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de Ag, los CI se forman en exceso de Ag siendo pequeos y probablemente constituidos por una molcula de Ac y dos de Ag. Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en donde la relacin Ag-Ac permite la formacin de grandes redes de CI que precipitan. La reaccin de precipitacin depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del nmero de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente posee dos sitios capaces de reconocer al Ag. Del mismo modo, la valencia de un Ag nos habla del mximo nmero de epitopes que posee. Para que se pueda producir la interaccin secundaria Ag-Ag con la consecuente formacin del precipitado, tanto el Ag como el Ac deben ser, al menos, bivalentes.

Exceso de Ac

Equiva- lencia

Exceso de Ag

Cantidad de Ag agregado

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2.b. Tcnicas inmunolgicas basadas en reacciones de precipitacin.

1- Inmuno Difusin Radial (IDR) Esta tcnica permite cuantificar de manera sencilla y econmica inmunoglobulinas de isotipo G, M y A o antgenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biolgicas. La tcnica se basa en la difusin de la muestra conteniendo el antgeno a medir (inmunoglobulinas o antgenos solubles) en una matriz semislida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac especfico. La muestra biolgica se introduce en los orificios cilndricos excavados en el agar y a medida que el antgeno difunde en forma radial, se alcanza la relacin Ag-Ac que permite la formacin precipitados visibles. Una vez finalizada la difusin se mide el radio (R) de los precipitados que es proporcional a la concentracin de antgeno (C). La concentracin de protena en la muestra biolgica (Cx) se calcula realizando una curva de calibracin utilizando muestras patrones de concentracin conocida.

2- Inmunoelectroforesis (IEF).

La inmunoelectroforesis es una tcnica cualitativa que permite la identificacin de diferentes componentes proteicos presentes en distintas muestras biolgicas (suero, orina, etc) a travs de arcos de precipitacin. La tcnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas:

1) La muestras se someten a una separacin electrofortica.

La asociacin entre Ac bivalentes y Ag monovalentes (un nico epitope no repetido) no permite la formacin de CI precipitantes.

La asociacin entre Ac bivalentes y Ag multivalentes permite la formacin de CI precipitantes. El Ag multivalente puede presentar un slo epitope repetido o varios epitopes distintos.

Curva de calibracin

Rx R1 R2 R3

C3

C3

Muestra Biolgica de concentracion desconocida

(Cx) C1 C2

Muestra patrn de concentracin conocida

(C)

R2

Concentracin de la muestra

C1 C2 Cx

Rx2

Halo de precipitado

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2) Terminada la electroforesis, las protenas interaccionan con los Acs especficos aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migracin. Luego de un perodo de difusin de los Acs, se observan arcos de precipitacin cuya forma y posicin dependen de las caractersticas inmunoqumicas y de la concentracin de cada protena.

2.c. Reacciones de aglutinacin Las reacciones de aglutinacin, tal como vimos para las reacciones de precipitacin, involucran una interaccin secundaria entre Ag-Ac que llevar a la aparicin de un aglutinado que se visualiza como grumos. Los principios fisicoqumicos que gobiernan la formacin de estos aglutinados son los mismos que gobiernan la formacin de un precipitado. En otras palabras, los principios discutidos anteriormente acerca de la zona de exceso de antgeno, la zona de equivalencia y la zona de exceso de anticuerpo, son vlidas y aplicables a las reacciones de aglutinacin. La gran diferencia entre las reacciones de precipitacin y las reacciones de aglutinacin son las caractersticas del antgeno: mientras que en las reacciones de precipitacin se emplean antgenos solubles, en las reacciones de aglutinacin el Ag es particulado. Con un Ag soluble, tambin es posible disear una reaccin de aglutinacin gracias a que es posible utilizar distintas partculas (partculas inertes o glbulos rojos) y realizar un pegado qumico o fisicoqumico del Ag soluble a dichas partculas, generando de esa manera un Ag particulado til para fines diagnsticos. La ventajas de las reacciones de aglutinacin desde el punto de vista de su utilidad en el laboratorio es que son muy sencillas de realizar, no requieren de ningn equipamiento para su lectura, son rpidas y fciles de implementar. Adems, presentan una mayor sensibilidad que las reacciones de precipitacin por lo que las

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han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe mencionar, que las reacciones de aglutinacin presentan una menor sensibilidad que las reacciones de interaccin primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia indirecta (ver mas adelante). Esto hace que en determinados casos se prefiera el empleo de una de estas 2 tcnicas para la deteccin de Acs contra un determinado agente patgeno. Las ventajas enumeradas hacen de las reacciones de aglutinacin una valiosa herramienta para diversos estudios serolgicos (bsqueda de Acs especficos contra agentes patgenos) y para la deteccin de antgenos en fluidos biolgicos. Tipos de reacciones de aglutinacin segn las caractersticas de las partculas aglutinantes: De acuerdo a las caractersticas de las partculas aglutinantes, las reacciones de aglutinacin pueden clasificarse en:

- reacciones de aglutinacin activa; o - reacciones de aglutinacin pasiva. Las reacciones de aglutinacin activa se basan en el empleo de la partcula aglutinante como antgeno.

Como ejemplos podemos mencionar:

Partcula aglutinante Reaccin Utilidad diagnstica

Glbulos rojos Determinacin de grupo sanguneo y factor Rh

Glbulos rojos Coombs indirecta Determinacin de sensibilizacin por incompatibilidad Rh

Glbulos rojos Coombs directa Determinacin de eritroblastosis fetal

Bacterias (Brucella) Huddleson Bsqueda de Ac anti-Brucella en sueros humanos (banco de sangre)

Parsitos (Trypanosoma cruzi)

AD-Chagas Bsqueda de Ac anti-T. cruzi en sueros humanos (banco de sangre)

Parsitos (Toxoplasma gondii)

AD-Toxo Bsqueda de Ac anti-T. gondii en sueros humanos (banco de sangre)

Las reacciones de aglutinacin pasiva se basan en el empleo de una partcula aglutinante inerte a la cual

se la ha unido un antgeno. Como ejemplos podemos mencionar:

Partcula aglutinante Reaccin Utilidad diagnstica

Glbulos rojos + lisado de T. cruzi

HAI-Chagas Bsqueda de Ac anti-T. Cruzi en sueros humanos (banco de sangre)

Glbulos rojos + lisado de T. gondii

HAI-Toxo Bsqueda de Ac anti-T. Gondii en sueros humanos (banco de sangre)

Ltex + gp120 Bsqueda de Ac anti-VIH en sueros humanos (banco de sangre)

Ltex + sHBV Bsqueda de Ac anti-HBV en sueros humanos (banco de sangre)

Ltex + estreptolisina O ASTO Bsqueda de Ac anti-estreptolisina O en sueros humanos (infeccin por

estreptococo -hemoltico)

Como se desprende de la tabla anterior, los soportes particulados para las reacciones de aglutinacin indirecta pueden ser glbulos rojos (en este caso se habla en general de hemaglutinacin) o partculas de ltex. El empleo de este tipo de partculas inertes ha permitido extender el rango de utilidad de la tcnica de aglutinacin a la determinacin de Ac contra agentes infecciosos tales como el VIH o el HBV, e inclusive para la determinacin de Ac contra molculas solubles (estreptolisina O, protena C reactiva, etc.). Como paso indispensable para la preparacin de este tipo de reactivos, es necesaria una etapa de incubacin entre la partcula inerte y el antgeno soluble sensibilizante (en general, los Ag sensibilizantes son protenas, aunque es posible inmovilizar hidratos de carbono), que permitir el pegado del mismo a la partcula. Este procedimiento puede realizarse por simple adsorcin (unin no covalente del Ag a la partcula) o por unin covalente. En la mayora de los casos se requiere un acondicionamiento previo de la superficie de la partcula. Para el caso de los glbulos rojos, esto se logra por incubacin con cido tnico (proceso denominado tanado) o con CrCl3. Una vez realizado el pegado del Ag a la superficie del glbulo rojo, las partculas pueden ser fijadas con agentes qumicos tales como el glutaraldehdo con el objeto de darles

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mayor estabilidad en el tiempo y a los cambios de temperatura, lo que aumenta la vida til del reactivo diagnstico. Tipos de reacciones de aglutinacin pasiva segn la identidad de la especie pegada a las partculas aglutinantes: Considerando que es posible inmovilizar muchos tipos diferentes de protenas a distintos tipos de partculas inertes, es posible clasificar las reacciones de aglutinacin pasiva en:

- reacciones de aglutinacin pasiva directa; o - reacciones de aglutinacin pasiva reversa. Las reacciones de aglutinacin directa se basan en la sensibilizacin de la partcula inerte con el Ag, por

lo que resultan tiles para la deteccin y titulacin de Ac en distintos fluidos biolgicos. Como ejemplos, basta repasar la informacin brindada en la tabla anterior.

Por el contrario, las reacciones de aglutinacin reversa se basan en la inmovilizacin del Ac (en general, se inmoviliza un anticuerpo monoclonal AcMo-) en la superficie de la partcula inerte, siendo este tipo de reacciones particularmente tiles para la deteccin de Ag en distintas muestras biolgicas.

2.d. Concepto de TTULO Ya se mencion que las reacciones de aglutinacin directa son tiles para la deteccin y titulacin de Ac en distintos fluidos biolgicos. Es importante destacar que NO es posible determinar la concentracin de Ac sino que, en el mejor de los casos, ser posible calcular un ttulo de Ac. Para ello, se realiza la incubacin de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades constantes de Ag y se elige arbitrariamente como ttulo la inversa de la mxima dilucin de suero que produce aglutinacin visible. En determinadas muestras en las que existe una gran cantidad de Ac es posible que a diluciones bajas (es decir, a altas concentraciones de suero) no se observe aglutinacin. Este fenmeno se denomina efecto prozona y se debe a que en exceso de Ac se forman preferentemente complejos Ag-Ac solubles (como los formados en la zona de exceso de Ac en la curva de precipitacin). En este caso, el ttulo de Ac sigue siendo la mxima dilucin de suero que produce aglutinacin visible.

Ag particulado:

cantidades constante

Suero:

Diluciones crecientes

AGLUTINACION

1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64

- + + + + -

TITULO: 32 Prozona

Particula inerte

Ag soluble

Ac especfico

REVERSA

Aglutinacin pasiva

DIRECTA

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Teniendo dos muestras de suero de un mismo paciente tomadas a diferentes tiempos, es posible comparar mediante esta tcnica el ttulo de Acs en ambas muestras. Se denomina SEROCONVERSIN a la aparicin de Acs o al aumento del ttulo de Acs en 4 veces en un periodo entre 3 y 4 semanas. En el caso de reacciones de aglutinacin reversa, ser posible calcular una concentracin de Ag en una muestra si se realiza en paralelo una curva de titulacin empleando una solucin estndar de Ag. Por comparacin de la mxima dilucin de la solucin estndar que produce aglutinacin visible con la mxima dilucin de la muestra que produce aglutinacin visible, se podr calcular la concentracin de Ag en la muestra. Existe adems una variante de la aglutinacin que permite calcular la concentracin de Ag en una muestra. Dicha tcnica se denomina inhibicin de la hemaglutinacin y consiste en incubar cantidades constantes de la partcula aglutinante sensibilizada con el Ag de inters (Ag particulado), con cantidades constantes y aglutinantes del Ac especifico. A esta mezcla, capaz de aglutinar, se la enfrenta con cantidades variables de Ag libre como competidor. A partir de una determinada concentracin de Ag libre, se producir una inhibicin de la aglutinacin por competicin del Ag libre por el Ac (que de esta manera no podr unirse al Ag particulado para aglutinar).

Si se realiza una curva de este tipo con una solucin estndar de Ag libre se podr calcular la concentracin

(micromolar, g/ml, etc) que inhibe la aglutinacin. Luego, determinando qu dilucin de Ag libre presente en una muestra biolgica produce dicha inhibicin de la aglutinacin, ser posible calcular la concentracin de Ag libre en la muestra problema. Deteccin de IgG e IgM+IgG: reacciones de aglutinacin con y sin 2-mercaptoetanol (2-ME): Varios reactivos diagnsticos actualmente disponibles en el mercado y en los laboratorios permiten determinar si el ttulo de Ac obtenido en una reaccin de aglutinacin directa o indirecta corresponden a IgG o a la suma de IgM ms IgG. Esto se debe a que ambos tipos de inmunoglobulinas son aglutinantes. Por otra parte, en muchos casos es til conocer si el paciente posee Ac de tipo IgM o IgG porque eso puede facilitar el seguimiento del paciente o determinar un tratamiento. Para ello, se ha desarrollado la tcnica de aglutinacin en ausencia y en presencia de 2-ME. Cuando se realiza la titulacin del suero del paciente por aglutinacin en ausencia de 2-ME y se informa un ttulo, en realidad se est informando una actividad aglutinante que es la suma de la actividad aglutinante de la IgM y de la IgG. Si, siguiendo el protocolo provisto por el fabricante, se realiza la tcnica en presencia de 2-ME produce una reduccin suave/parcial de la IgM. Como la IgM monomrica resultante no es aglutinante, el ttulo que se obtiene al realizar la tcnica de aglutinacin en presencia de 2-ME corresponder exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG. De este modo, la realizacin de la aglutinacin en presencia y ausencia de 2-ME permitir determinar la presencia de IgG e IgM contra el Ag sensibilizante. En determinados casos (toxoplasmosis) es importante determinar la presencia de IgM porque es indicio de infeccin activa. La cada en el ttulo del suero por aglutinacin en ausencia vs. en presencia de 2-ME es indicio de la presencia de IgM especfica para el parsito.

Globulo rojo con Ag + Ac

(relacin aglutinante)

AGLUTINACION + - - - + +

Inhibicin de la hemaglutinacin

Sin Ag libre

Ag libre:

Diluciones crecientes 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32

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3. INTERACCIN PRIMARIA ANTGENO-ANTICUERPO Si bien la interaccin primaria Ag-Ac no es visible, existen distintos mtodos que hacen posible visualizarla. La estrategia consiste en "marcar" al Ac o al Ag mediante la unin covalente (conjugacin) de determinadas molculas, tales como FLUOROCROMOS, ISOTOPOS RADIOACTIVOS o ENZIMAS, para poder hacer visible esa primera interaccin. Tal como se observa en la Tabla, dependiendo del marcador que se utilice, la tcnica inmunolgica recibe un determinado nombre y utiliza un sistema de deteccin diferente. Las tcnicas que veremos a continuacin no son tan sencillas y econmicas como las que vimos anteriormente, sin embargo son mucho mas sensibles, es decir, son capaces de detectar menores concentraciones de Ag o Ac.

Tcnica Inmunolgica MARCADOR Sistema de deteccin

a- Inmunomarcacin Enzima Microscopio ptico

Fluorocromo Microscopio de fluorescencia Citmetro de Flujo

b- Radioinmunoanlisis (RIA) Tcnicas radioinmunomtricas

(PRIST, RAST)

Istopo Radioactivo

Contador de Radiacin

c- ELISA Enzima Espectrofotmetro

3.a. INMUNOMARCACION Las tcnicas de inmunomarcacin utilizando Ac conjugados permiten detectar la presencia de Ags en tejidos (inmunohistoqumica) o clulas (inmunocitoqumica). La imunomarcacion de tejidos se realiza sobre cortes de tejido fijado montado sobre un portaobjetos. A travs de estas tcnicas es posible detectar tanto Ags celulares (de membrana, citoplasmticos o nucleares) como extracelulares (matriz extracelular, membrana basal, etc.) La imunomarcacion de clulas puede efectuarse sobre clulas vivas o fijadas, las cuales pueden hallarse en suspensin o adheridas a un soporte slido (portaobjetos). Esta tcnica permite detectar Ags localizados en la membrana plasmatica, citoplasma o ncleo de la clula. La inmunomarcacin DIRECTA es la forma mas simple de localizar un Ag y consiste en utilizar un Ac "marcado" especfico para dicho Ag (Ac primario). Para realizar esta tcnica, se incuba la muestra con el Ac primario "marcado" durante un determinado tiempo, a la temperatura indicada, luego del cual se retira el exeso de Ac mediante un lavado y se procede a la deteccin de la marca. La inmunomarcacion INDIRECTA utiliza un Ac primario sin marcar que reconoce al Ag de inters y luego, para evidenciar la presencia del Ag, emplea un segundo Ac marcado (Ac secundario) capaz de reconocer el Ac primario. Por ejemplo, si el Ac primario es una IgG de ratn, el Ac secundario podr ser anti-IgG de ratn hecho en conejo.

INMUNOMARCACION DIRECTA

Ac marcado

Ag

Clula

portaobjetos

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Para realizar esta tcnica, se incuba la muestra con el Ac primario, tal como vimos anteriormente, se realiza un lavado para retirar el exeso de Ac y luego se incuba con el segundo Ac marcado. Posteriromente se realiza un lavado y se procede a la deteccin de la marca.

Inmunomarcacin VENTAJAS DESVENTAJAS

Directa Rpida y sencilla. Se necesita un Ac primario marcado para cada Ag a detectar (los Ac marcados son ms caros que los Ac no marcados . Menos sensible.

Indirecta Mas sensible. Un mismo Ac secundario puede reconocer distintos Ac primarios (generados en la misma especie)

Lleva mas tiempo.

Inmunomarcacin con Acs conjugados a ENZIMAS Esta tcnica suele utilizarse para inmunohistoqumica y para detectar Ag sobre clulas adheridas a portaobjetos. Una vez realizada la inmunomarcacin (directa o indirecta) la presencia del Ac conjugado con la enzima se evidencia por el agregado de un sustrato incoloro. La accin de la enzima sobre el sustrato genera un producto coloreado que precipita en el lugar donde ocurri la reaccin y es visualizado al microscopio ptico. Los sustratos incoloros que viran a un producto coloreado se los conoce con el nombre de cromgenos. El hecho de que existan distintos cromgenos capaces de generar productos de distinto color, permite que puedan detectarse Ag diferentes en un mismo corte de tejido o clula. Inmunomarcacin con Acs conjugados a FLUOROCROMOS Esta tcnica es comnmente conocida como Inmunofluorescencia se utiliza tanto para imnunohistoqumica como para imnunocitoqumica. La presencia del Ac conjugado con el flourocromo no necesita de ninguna reaccin qumica para hacerse evidente. Los fluorocromos emiten luz de una determinada longitud de onda luego de ser exitados por un haz de luz de longitud de onda menor. Cada fluorocromo es capaz de emitir luz dentro de un determinado espectro de longitud de onda. Por ejemplo, el fluorocromo denominado Isotiocianato de Fluoresceina (FITC) emite en la gama del verde, mientras que la Ficoeritrina emite en la gama del rojo. El hecho de que existan distintos fluorocomos capaces de emitir a diferentes longitudes de onda, permite que puedan detectarse Ag diferentes en un mismo corte de tejido o clula. La visualizacin de la fluorescencia puede realizarse utilizando un microscopio de fluorescencia (para cortes de tejido o clulas en portaobjetos) o por Citometra de flujo (para clulas en suspensin).

INMUNOMARCACION INDIRECTA

Clula

portaobjetos

Ac secundario marcado

Ac primario

Ag

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Citometra de flujo La citometra de flujo (CMF) es un procedimiento altamente eficiente para caracterizar poblaciones celulares que se encuentren en suspensin. En un principio, se utilizaba fundamentalmente para identificar el fenotipo celular, es decir la expresin diferencial de antgenos en la membrana plasmtica, pero hoy da son muchos los parmetros estructurales y funcionales que se pueden medir por CMF (Figura 1). Entre las muchas ventajas que presenta en relacin a la microscopa de fluorescencia se encuentran la posibilidad de analizar un nmero muy elevado de clulas en pocos segundos y la posibilidad de cuantificar la intensidad de fluorescencia. La principal desventaja radica en el alto costo de la adquisicin y mantenimiento del citmetro de flujo. Figura 1:

La citometra de flujo se ha utilizado en biomedicina con diferentes objetivos: En hematologa: contaje celular, frmula leucocitaria, contaje reticulocitario, anlisis de mdula sea. En farmacologa: estudios de cintica celular. En inmunologa: subpoblaciones de linfocitos, estimulacin linfocitaria. En oncologa: diagnstico/pronstico, monitorizar tratamiento. En microbiologa: diagnstico bacteriano y vrico, sensibilidad a antibiticos. Citmetro de flujo: Se define como citmetro de flujo al aparato que es capaz de medir componentes y propiedades de clulas y organelas celulares (partculas biolgicas) que fluyen en una suspensin celular. Los cell sorters tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los citmetros de flujo pero con la capacidad adicional de separar partculas selectivamente de la suspensin lquida. Debido a las especiales caractersticas de los citmetros de flujo, la muestra a analizar debe encontrarse en forma de suspensin monodispersa. Hay muestras como la sangre perifrica, mdula sea, u otros fluidos biolgicos, que precisan de un mnimo procesamiento; en cambio los tumores slidos o las muestras parafinadas necesitan de una disgregacin ms o menos intensa (mecnica, enzimtica, etc.). Para su anlisis, las clulas en suspensin son forzadas a pasar, de a una por vez, a travs de un filamento muy delgado. Un haz de rayo lser incide en cada clula lo que resulta en la dispersin de la luz en distintas direcciones. Una serie de tubos fotomultiplicadores (FM) detectan la luz dispersada brindando informacin acerca del tamao, la granularidad o complejidad celular, como as tambin de la emisin de fluorescencia en el caso de que la clula haya unido un anticuerpo marcado con un fluorocromo. A continuacin, se muestra un esquema de un citmetro de flujo:

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Anlisis y presentacin de los resultados: Los datos de tamao celular, granularidad celular y fluorescencia (en caso de haberse usado anticuerpos marcados con fluorocromos) son analizados mediante un software especfico y se presentan como grficos, de los cuales se dan a continuacin los ejemplos ms comunes: 1) Grfico dot plot de tamao versus granularidad: Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre perifrica humana en el que se diferencian claramente las regiones correspondientes a los neutrfilos (de mayor complejidad granular por la presencia de lisosomas), monocitos (de complejidad intermedia, pero mayor tamao) y linfocitos (pequeos y sin grnulos en el citoplasma). En este caso no se utiliz ningn anticuerpo para marcar las clulas.

Tamao celular (FSC)

Gra

nula

ridad

(S

SC

)

Leucocitos de sangre perifrica

Neutrfilos

Monocitos

Linfocitos

Ac con

fluorocromo

verde

Corriente de flujo

con las clulas

pasando de a una

FM para

fluorescencia verde

FM para fluorescencia roja

FM para tamao

FM para granularidad

Clulas

marcadas con

Acs

fluorescentes

Ac con

fluorocromo

rojo

Computadora que analiza los datos

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2) Histograma de fluorescencia:

Se muestra un ejemplo de clulas de estirpe monoctica marcadas con un anticuerpo monoclonal dirigido contra el antgeno CD18. El anticuerpo est marcado con isocianato de fluorescena (FITC) (fluorescencia verde) y es de isotipo IgG1 murino. Como control de pegado inespecfico, las clulas se incuban, por otro lado, con IgG1 murina marcada con FITC pero que no est dirigida contra ningn antgeno celular (control de isotipo). 3) Grfico dot plot de fluorescencia verde (FL1) versus fluorescencia roja (FL2): Se muestra un ejemplo de leucocitos de sangre perifrica de un paciente con leucemia linftica crnica de clulas B que fueron marcados simultneamente con 2 anticuerpos: anti-CD4 marcado con FITC y anti-CD8 marcado con ficoeritrina (PE) (fluorescencia roja, FL2). Se distinguen 3 poblaciones: en el cuadrante superior izquierdo se encuentran los linfocitos T CD8 positivos, en el cuadrante inferior derecho, los T CD4 positivos y en el cuadrante inferior izquierdo las clulas que no expresan ni CD8 ni CD4 (linfocitos B, clulas NK). La ausencia de puntos en el cuadrante superior derecho indica que no hay clulas que expresen simultneamente CD4 y CD8. Si se hubiesen marcado clulas de timo, la mayora de los puntos se encontraran en el cuadrante superior derecho.

CD18-FITC

fluorescencia verde (FL1)

Nm

ero

de

clu

las

Clulas no marcadas

(control de isotipo)

Clulas CD18

positivas

Linfocitos T CD4+ y CD8+ de

sangre perifrica en un paciente

con leucemia de clulas B

CD4-FITC

CD

8-P

E

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3.b. RADIOINMUNOANLISIS (RIA) Y TCNICAS RADIOINMUNOMTRICAS (PRIST, RAST) La tcnica de radioimnunoanlisis (RIA) permite cuantificar la presencia de pequeas cantidades de un determinado Ag o Ac en una muestra biolgica. Si bien es una tcnica sumante sensible, en la actualidad no es tan utilizada como lo era antes y ha sido reemplazada por otras tcnicas que no utilizan radioistopos. La tcnica se basa en la inhibicin competitiva de la unin de un Ag marcado radiactivamente con su Ac especifico, por parte de Ags idnticos no marcados presentes en la muestra a analizar. Para realizar la tcnica debe contarse de antemano con: 1) Acs especficos contra la molcula a cuantificar (esa molcula puede ser un Ag o una inmunoglobulina), 2) la molcula a cuantificar marcada radioactivamente y 3) la muestra a analizar (donde se encuentra la molcula a cuantificar). Tal como puede verse en el esquema, los complejos inmunes formados por la molcula marcada (Ag caliente) y el anticuerpo especfico se enfrentan a la muestra que posee la molcula sin marcar (Ag fro). Si la concentracin de Ag fro es mayor, se producir el desplazamiento del Ag caliente y por lo tanto, la radioactividad de los complejos Ag-Ac ir disminuyendo, mientras que la radioactividad de la fraccin de Ag libre aumentar. Realizando una curva patrn con concentraciones conocidas de Ag libre puede calcularse, luego, la concentracin de Ag en la muestra biolgica. Las tcnicas radioinmunomtricas permiten la deteccin de un Ag presente en una muestra mediante el uso de anticuerpos conjugados a un isotopo radioactivo. No deben considerarse sinnimo de RIA ya que no se basan en la inhibicin competitiva por desplazamiento del Ag caliente. La tcnica de PRIST (Paper disk Radio ImmunoSorbent Test) es utilizada para medir los niveles de IgE en sueros. La IgE srica est presente normalmente en bajas concentraciones y se encuentra aumentada, por ejemplo, en pacientes alrgicos. Tal como se observa en la figura, se utiliza un soporte slido (disco de papel) en el cual vienen adsorbidos los Ac anti-IgE (anticuerpos de captura). Los discos de papel se incuban con el suero del paciente y los Ac IgE presentes en el suero se unirn con los Ac especficos del disco de papel. Luego de la incubacin y lavado, se adiciona un Ac anti-IgE conjugado con un istopo radioactivo, el cual reconocer a la IgE unida al anticuerpo de captura. Luego de la incubacin y lavado, se realiza la lectura de radioactividad del disco de papel. Los resultados se comparan con aquellos obtenidos en una curva de calibracin a fin de determinar la concentracin de IgE en el suero. La tcnica de RAST (disk RadioAllergoSorbent Test) se utiliza para dosar los niveles de IgE especfica para un alergeno en particular. El alergeno viene adsorbido a un disco de papel y luego se incuba el suero del paciente alrgico. Si en el suero estn presentes las IgEs especficas quedarn unidas al alergeno y luego podrn ser reconocidas por Acs anti-IgE conjugados con istopos radioactivos. Luego de la incubacin y lavado, se realiza la lectura de radioactividad del disco de papel y los resultados se comparan con aquellos obtenidos en una curva de calibracin a fin de determinar la concentracin de IgE especfica en el suero.

Ag: antgeno caliente. Ac: anticuerpo especfico. Ag: antgeno fro.

Radioinmunoanlisis (RIA)

Ag-Ac

Ag-Ac

Ag-Ac

Ag-Ac

Ag-Ac

Ag-Ac

Ag-Ac

Ag-Ac

+

Ag

Ag Ag Ag

Ag Ag

Ag Ag Ag

Ag

Ag

Ag Ag Ag

Ag Ag

Ag Ag Ag

Ag

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3.c. ELISA (Enzime Linked ImmunoadSorbent Assay) La tcnica de ELISA utiliza Acs marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa) para poder visualizar la reaccin Ag-Ac. La tcnica se utiliza tanto para la determinacin de Ags como de Acs.

Determinacin de Ag por ELISA

La modalidad ms frecuente del mtodo ELISA para la determinacin de Ags es el modelo ELISA "Sandwich" directo. En este modelo, el Ac especfico para el Ag de inters, se encuentra adsorbido en un soporte slido (placa de petri), sobre el que se aadir la muestra biolgica. En el caso de que en dicha muestra se encuentre el Ag, quedar capturado en la placa y ser puesto en evidencia tras la adicin de otro Ac especfico conjugado con la enzima. Por ltimo, se aade el substrato sustrato incoloro que, por accin de la enzima, dar un producto coloreado que producir un color observable a simple vista y cuantificable mediante un espectrofotmetro.

Agregado del suero del paciente

IgE especfica presente en el suero

del paciente

Agregado del Ac anti-IgE marcado radioactivamente

Disco de papel con alergeno adsorbido

Lectura de radioactividad

RAST

Acs anti-IgE marcado radioactivamente

Agregado del suero del paciente

IgE presente en el suero del paciente

Agregado del Ac anti-IgE marcado radioactivamente

Disco de papel con Ac.de captura anti-IgE

Lectura de radioactividad

PRIST

Acs anti-IgE marcado radioactivamente

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Determinacin de Acs por ELISA Para la determinacin de Acs especficos para un determinado Ag se utiliza normalmente la modalidad de ELISA indirecto en donde el Ag de inters se encuentra adsorbido en la placa de ELISA. Se pueden utilizar como antgenos, protenas virales o bacterianas e incluso virus completos, pero cada da es ms frecuente adsorber exclusivamente las protenas de inters inmunolgico. Esta es una de las tcnicas de eleccin para buscar Acs contra protenas del virus HIV en sueros de pacientes. Los pasos de la tcnica se encuentran esquematizados en la figura.

4. OTRAS TCNICAS INMUNOLGICAS 4.a PROTENOGRAMA ELECTROFORTICO El protenograma electrofortico es un tcnica sencilla de laboratorio que permite separar en 5 fracciones o grupos a las protenas presentes en un determinado fluido biolgico (suero, orina, etc.). La tcnica se basa en la separacin electrofortica de las distintas protenas por medio de la aplicacin de un campo elctrico sobre un soporte de agarosa o acetato de celulosa. Una vez finalizada la corrida electrofortica las bandas proteicas pueden ser visualizadas luego de la utilizacin de colorantes para protenas. Posteriormente, las bandas que se observan a simple vista (Figura A) pueden ser cuantificadas por un densitmetro, el cual cuantifica la intensidad y anchura de cada banda (Figura B), pudiendo obtenerse los porcentajes de cada una de las 5 fracciones proteicas.

Las distintas fracciones que podemos encontrar son: Albumina, alfa 1 globulinas (1), alfa 2 globulinas

(2), beta globulinas () y gamma globulinas ().

ALBMINA: es una protena que se sintetiza en el hgado y es la de mayor concentracin en el suero. 1: dentro de esta fraccin se encuentran numerosas protenas entre las cuales podemos mencionar a la alfa 1-antitripsina y la alfa 1-antiquimiotripsina

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2: dentro de esta fraccin se incluyen la haptoglobina y la protena C reactiva. : en esta fraccin podemos encontrar, entre otras, a la fibronectina, transferrina y beta 2 microglobulina. : en esta fraccin se encuentran las inmunoglobulinas, las cuales pueden disminuir en ciertas inmunodeficiencias y aumentar en ciertos procesos de inflamacin crnica (artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistmico), infecciones y alergias.

4.b. NEFELOMETRIA.

Las inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA tambin pueden cuantificarse por nefelometra. Para ello, el suero incgnita deber ser incubado con exceso del anticuerpo especfico (anti-IgM, anti-IgG o anti-IgA) a fin de que se produzca la formacin de complejos inmunes. Esta tcnica, es un mtodo ptico que cuantifica la luz dispersada por los complejos inmunes formados, la cual es proporcional a la concentracin del antgeno especfico (en nuestro caso, la IgM, IgG o IgA del suero incgnita).

4.c. WESTERN BLOT

Es una tcnica muy sensible que permite identificar Ags y Acs. Tal como puede observarse en la figura, la tcnica de Western Blot se basa en la separacin electrofortica de protenas en geles de poliacrilamida, la transferencia (blotting) de dichas protenas a un soporte slido (membrana de nitrocelulosa o nylon) y la posterior deteccin de una o ms bandas identificadas por Acs especficos. La migracin de las protenas se realiza en presencia de detergentes (Dodecil Sulfato de Sodio, SDS) a fin de que su migracin dependa fundamentalmente de peso molecular (PM) de los pptidos.

As descripta, la tcnica permite investigar la presencia de un antgeno dado en una mezcla de protenas presentes en una determinada muestra y para ello se debe disponer del Ac especfico para marcar la membrana. Sin embargo, la tcnica de Western Blot es tambin muy til para la deteccin de Acs especficos en sueros. Si se desea detectar Acs especficos, debe contarse con el Ag de inters separado por electroforesis y transferido a una membrana, la cual se incubar con el suero a analizar. Posteriormente esa membrana deber incubarse con el segundo anticuerpo marcado con la enzima para poder detectar las bandas especficas.

La tcnica de Western Blot para determinar la especificidad de los Acs contra Ag del virus de HIV es la prueba confirmatoria de eleccin para los casos en que los sueros de los pacientes dieron un ELISA positivo

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5. TCNICAS DE TIPIFICACIN DE ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD Objetivos: 1. Estudios de histocompatibilidad para transplante de rganos vascularizados 2. Estudios de histocompatibilidad para transplante de mdula sea 3. Estudios de paternidad 4. Estudios de asociacin de alelos del HLA con enfermedades (susceptibilidad) 5. Estudios antropolgicos para establecer posibles relaciones entre distintas poblaciones o grupos tnicos. Clasificacin de las tcnicas de tipificacin 5.a. Tcnicas serolgicas: microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki 5.b. Tcnicas moleculares

a. PCR con cebadores especficos de secuencia (SSP) b. PCR con cebadores especficos de locus e hibridizacin con sondas marcadas, especficas de

alelos (SSOP) c. Secuenciacin directa (SBT) d. Otras: RFLP, SSCP

Protenas con SDS

Gel de poliacrilamida

Direccin de la migracin

Las protenas una vez separadas por PM son

transferidas a una membrana

Gel de poliacrilamida membrana

La membrana posteriormente se marca con los Acs especficos

Membrana con las protenas transferidas

Agregado del primer Ac

Lavado y agregado del Ac conjugado a una enzima

sustrato

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5.a. TCNICAS SEROLGICAS: Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki Fundamento: Este mtodo se basa en el empleo de anticuerpos especficos contra diferentes alelos del HLA (molculas de clase I y de clase II). Cuando estos anticuerpos reconocen al antgeno contra el cual son especficos, y en presencia de complemento, se produce la lisis celular. El ensayo se realiza en placas plsticas de 60 fosas denominadas placas de Terasaki y la muerte celular se cuantifica mediante una tincin diferencial de clulas viables y muertas. Etapas: 1. Extraccin de sangre del paciente 2. Aislamiento de clulas mononucleares (centrifugacin en gradiente de Ficoll) 3. Siembra de clulas en fosas de placas de Terasaki previamente sensibilizadas con sueros policlonales

contra diferentes alelos del HLA. 4. Incubacin (unin de los Ac a las molculas de clase I o de clase II del HLA) 5. Agregado de fuente de complemento (suero de conejo) 6. Incubacin y lisis de clulas que unieron Ac en la etapa anterior 7. Agregado de un colorante de contraste para diferenciacin de clulas vivas y muertas (diacetato de

fluorescena) 8. Observacin microscpica y clasificacin. Esquema general de la tcnica

Variantes de la tcnica: Mtodo de la anti-inmunoglobulina

1. Extraccin de sangre del paciente 2. Aislamiento de clulas mononucleares (centrifugacin en gradiente de Ficoll) 3. Siembra de clulas en fosas de placas de Terasaki* 4. Incubacin (unin de los Ac a las molculas de clase I del HLA) 5. Incubacin con IgG de conejo anti-inmunoglobulinas humanas 6. Agregado de fuente de complemento 7. Incubacin y lisis de clulas que unieron Ac 8. Agregado de un colorante de contraste para diferenciacin de clulas vivas y muertas (diacetato de

fluorescena) 9. Observacin microscpica y clasificacin o "scoring"

Consideraciones: Origen de los sueros: 1. Suero de mujeres multparas (4 o ms hijos del mismo padre), dado que durante el parto se produce

pasaje de sangre del feto a la madre y eso permite que clulas fetales semialogeneicas acten como

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inmungenos en la madre, quien montar una respuesta inmune contra los alelos del HLA del padre que las clulas fetales expresen.

2. Sueros de pacientes que hayan rechazado un transplante previo, donde en general se observa una respuesta inmune humoral (y celular) dirigida contra los alelos del HLA que el transplante expresaba.

3. Sueros de pacientes politransfundidos, dado que en la sangre transfundida hay leucocitos de los donantes, que actuarn como inmungenos en el paciente transfundido.

Ventajas: Tcnica sencilla que requiere poco equipamiento sofisticado (microscopio invertido de epifluorescencia) Desventajas: La tcnica debe realizarse sin interrupcin desde su inicio hasta su finalizacin, dado que se trabaja con clulas viables. No se detectan Ac no fijadores de complemento, excepto en la variante que emplea la anti-inmunoglobulina Alto costo Baja resolucin No existen sueros contra alelos poco frecuentes La mayora de los sueros no son monoespecficos y adems presentan reactividad cruzada con otros alelos. La alta homologa e identidad entre muchos epitopes de las molculas de clase I y de clase II del HLA permite agrupar a estas molculas en "grupos de reactividad cruzada" o "CREGs" No adecuado para tipificacin de donantes cadavricos (en especial en el caso de transplante de mdula sea) Interpretacin difcil por escasez de sueros monoespecficos y reactividades cruzadas No se detecta homocigosis (en general se informa 1 alelo y el otro se informa como "blanco") Ambigedades (no se pueden definir determinadas combinaciones de alelos) 5.b. TCNICAS MOLECULARES: SSP Fundamento: En este mtodo se realiza una reaccin de cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se emplean combinaciones de oligonucletidos especficos para diferentes alelos del HLA. De esta manera se logra la amplificacin de fragmentos de ADN de diferente longitud. El patrn de fragmentos de ADN obtenido, que se analiza en una electroforesis en gel de agarosa, permite asignar alelos a la muestra analizada. Esto implica que para cada muestra se deben realizar un nmero considerable de reacciones de PCR (tantas como pares de "primers" se estn empleando, lo que a su vez se reflejar en el grado de resolucin alcanzado). Etapas: 1. Extraccin de sangre del paciente 2. Aislamiento del ADN 3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes combinaciones de "primers" 4. Electroforesis en geles de agarosa conteniendo bromuro de etidio 5. Observacin del patrn de bandas de ADN amplificadas en la PCR bajo luz UV 6. Integracin de los resultados obtenidos 7. Asignacin de alelos a la muestra analizada Esquema general de la tcnica

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Consideraciones: Ventajas: Tcnica sencilla que requiere poco equipamiento sofisticado (mquina para PCR) No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera) Resolucin mayor que las tcnicas serolgicas ("Resolucin intermedia", lo que significa que no se pueden resolver determinadas combinaciones de alelos) Costo relativamente bajo Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos (luego de la extraccin del ADN, luego de la PCR o luego de la electroforesis) Permite la deteccin de alelos "nulos" Desventajas: No es adecuado para tipificacin de donantes cadavricos (en especial en el caso de transplante de mdula sea) debido a que la resolucin alcanzada es intermedia Ambigedades (no se pueden definir determinadas combinaciones de alelos) Cada par de "primers" permite amplificar uno o unos pocos alelos del HLA, por lo que debido al elevado polimorfismo de este sistema, ser necesario el empleo de un gran nmero de pares de "primers" con el fin de obtener una resolucin aceptable en la asignacin de alelos a la muestra. Por lo tanto, cada muestra requiere de un nmero elevado de reacciones de PCR (que se realizan en forma simultnea). De esta manera el mtodo no resulta prctico para anlisis simultneo de un gran nmero de muestras. No se detecta homocigosis. SSOP Fundamento: En este mtodo se realiza una reaccin de cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se emplean pares de oligonucletidos especficos para diferentes loci del HLA (se amplifica por separado el locus HLA-A, el locus HLA-B, el locus HLA-C, etc). Los fragmentos de ADN amplificados son luego inmovilizados sobre membranas de nylon e hibridizados con sondas (oligonucletidos) marcadas, especficas para diferentes alelos del HLA. El patrn de seales obtenidas de acuerdo a las sondas que reaccionaron se detecta con placas de autorradiografa, lo que permite asignar un alelo a la muestra analizada. Etapas: 1. Extraccin de sangre del paciente

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2. Aislamiento del ADN 3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes "primers" especficos para diferentes loci del

HLA 4. Electroforesis en geles de agarosa para chequear la calidad de la reaccin de PCR 5. Inmovilizacin de los productos de la PCR en membranas de nylon 6. Hibridizacin de las membranas con sondas especficas de alelos, marcadas con 32P 7. Exposicin de las membranas a placas de rayos X 8. Anlisis del patrn de seales obtenidas en las membranas 9. Integracin de los resultados obtenidos 10. Asignacin de alelos a la muestra analizada Esquema general de la tcnica

Consideraciones: Ventajas: No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera) Alta resolucin Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos Empleando un nmero suficientemente alto de sondas, es posible detectar homocigosis Adecuado para tipificacin de donantes cadavricos Utilizando sondas marcadas con digoxigenina y anticuerpos anti-digoxigenina marcados con perioxidasa, se puede realizar la deteccin por quimioluminiscencia, por lo que no se generan desechos radiactivos Permite la deteccin de alelos "nulos" Permite el anlisis simultneo de un nmero grande de muestras Desventajas: Interpretacin compleja (reactividad cruzada entre sondas, deteccin de determinadas combinaciones de alelos producen patrones similares en las placas de autorradiografa) Las condiciones de lavado de las diferentes sondas pueden ser diferentes, lo que complica en procesamiento simultneo de muchas muestras A pesar de su elevada resolucin, siguen existiendo ambigedades (aunque son muchas menos que en las tcnicas anteriores) Tcnica compleja y costosa que requiere equipamiento algo ms sofisticado (mquina para PCR, horno para hibridizaciones, infraestructura para manipulacin de radioistopos) Generacin de desechos radiactivos SBT Fundamento:

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En este mtodo se realiza una reaccin en cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN extrado de clulas de sangre perifrica del paciente. Como oligonucletidos cebadores ("primers") se emplean pares de oligonucletidos especficos para diferentes loci del HLA (se amplifica por separado el locus HLA-A, el locus HLA-B, el locus HLA-C, etc). Los fragmentos de ADN amplificados son luego secuenciados directamente mediante el empleo de un secuenciador automtico de ADN, que adems analiza las secuencias obtenidas y por comparacin con una base de datos interna, realiza la asignacin de alelos de HLA a la muestra analizada. Etapas: 1. Extraccin de sangre del paciente 2. Aislamiento del ADN 3. Reaccin de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes "primers" especficos para diferentes loci del

HLA 4. Electroforesis en geles de agarosa para chequear la calidad de la reaccin de PCR 5. Realizacin de la reaccin de secuencia mediante el empleo de "primers" marcados con fluorocromos

adecuados para el tipo de detector que posee el secuenciador 6. Anlisis de las secuencias obtenidas 7. Comparacin con la base de datos de secuencias que posee el aparato e integracin de los resultados

obtenidos 8. Asignacin de alelos a la muestra analizada Esquema general de la tcnica

Consideraciones: Ventajas: No requiere el aislamiento de clulas (se trabaja con sangre entera) Alta resolucin (se alcanza el mximo de resolucin posible) Se puede interrumpir la tcnica en diversos pasos Ideal para la deteccin de homocigosis ptimo para tipificacin de donantes cadavricos Interpretacin automatizada Permite la deteccin de alelos "nulos" Desventajas: Tcnica sofisticada que requiere equipamiento complejo y altamente costoso (secuenciador automtico de ADN) Elevado costo (todava) Se puede analizar un nmero reducido de muestras simultneamente (dependiendo esto del tipo de detector que posee el secuenciador)

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6. CROSS MATCH. Objetivo: Determinar la presencia de anticuerpos especficos contra alelos del HLA en suero de pacientes en lista de espera para transplante de rganos slidos vascularizados. Modalidades: 6.a. Cross-match final contra dador: Tiene por objeto analizar la presencia de anticuerpos sricos dirigidos especficamente contra los alelos del HLA de un posible donante. El anlisis de la presencia o ausencia de estos anticuerpos es fundamental para decidir si el transplante se realiza o no. Esto se debe a que la presencia de este tipo de anticuerpos preformados en el receptor de un transplante lleva inevitablemente a un rechazo hiperagudo. Esta tcnica puede realizarse por microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki o citometra de flujo. En el primer caso se enfrenta suero del receptor con clulas de sangre perifrica del posible donante (si es donante vivo) o con clulas de bazo o ganglio linftico (si es donante cadavrico). Luego de una etapa de incubacin, se agrega fuente de complemento y se prosigue con la tcnica tal como se describi en "Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki". En el caso del cross-match final contra dador por citometra de flujo, se enfrentan clulas mononucleares de sangre perifrica o de bazo o ganglio linftico del posible donante, con suero del receptor. Luego de una incubacin, se revela el sistema con inmunoglobulinas de cabra o conejo anti-inmunoglobulinas humanas, marcadas con fluorocromos (en general se emplea isotiocianato de fluorescena). Finalmente, se analizan las clulas en un citmetro de flujo. 6.b. Cross-match contra panel: Tiene por objeto analizar la presencia de anticuerpos sricos dirigidos contra diferentes alelos del HLA de un posible donante. Esta tcnica suele realizarse por microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki, donde se enfrenta suero del receptor con clulas de sangre perifrica del diferentes individuos cuyos alelos del HLA sean representativos de la poblacin (en general de emplean 20 individuos heterocigotas de manera de cubrir 40 alelos de cada locus). Luego de una etapa de incubacin, se agrega fuente de complemento y se prosigue con la tcnica tal como se describi en "Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki". Mediante esta tcnica se calcula el porcentaje de clulas que son lisadas en el ensayo, lo que es equivalente al nmero de alelos contra los cuales el paciente posee Ac especficos, expresado como porcentaje respecto del nmero total de alelos analizados en el ensayo. El parmetro calculado se denomina PRA ("panel reactive antibodies") y se ha observado que existe una relacin entre el PRA y la probabilidad de xito o fracaso de un transplante renal. 7. TCNICAS INMUNOLGICAS PARA ESTUDIAR LA FUNCIONALIDAD DE LOS FAGOCITOS 7.a Ensayo de Reduccin del Nitroblue Tetrazolium (NBT) Este ensayo evala la capacidad microbicida de determinadas clulas del sistema inmune a travs de la conversin un compuesto qumico incoloro, el NBT, en un compuesto intensamente coloreado. Para este ensayo se le extrae sangre al paciente y se realiza un procedimiento de separacin de las clulas polimorfonucleares (en su mayora neutrfilos). A estas clulas se les agrega el NBT. Los neutrfilos tienen la enzima NADPH Oxidasa que es capaz de generar intermediarios reactivos del oxgeno que atacan a los microorganismos. Estos intermediarios reactivos del oxgeno son tambin los responsables de convertir al NBT incoloro en un compuesto azul oscuro, llamado Formazn. Esto se visualiza observando los neutrfilos del paciente en el microscopio para ver si stos tienen el compuesto azul oscuro. Si los neutrfilos del paciente tienen alguna alteracin en el funcionamiento de la enzima NADPH Oxidasa (tal como ocurre en aquellos que padecen enfermedad granulomatosa crnica) podrn ingerir bacterias pero no destruirlas y, por lo tanto, no podrn inducir el cambio de color del NBT. En un individuo sano, ms del 95% de los neutrfilos son capaces de reducir el NBT. En la mayora de los pacientes con enfermedad granulomatosa crnica slo entre el 20% y el 80% de los neutrfilos son capaces de reducir el NBT. En los casos donde la sospecha clnica de enfermedad granulomatosa crnica es alta se deben realizar ensayos ms especficos del metabolismo oxidativo de los neutrfilos (oxidacin por parte de los neutrfilos de colorantes que producen compuestos fluorescentes, etc). El uso de la droga D-Penincilamina puede dar resultados anormales en el ensayo de reduccin del NBT, tal como si se tratara de la enfermedad granulomatosa crnica.

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7.b. Ensayo Microbicida Este ensayo evala la funcin fagoctica de las clulas del sistema inmune. Requiere que estas clulas sean capaces de fagocitar y de hacer el estallido respiratorio, dependiente de la enzima NADPH Oxidasa. Para este ensayo se le extrae sangre al paciente y se realiza un procedimiento de separacin de las clulas polimorfonucleares (en su mayora neutrfilos) o de monocitos. A estas clulas se les agregan bacterias opsonizadas (Staphylococcus aureus), se incuba a 37C y se extraen muestras a intervalos de 30 minutos durante 2 horas. Estas muestras son plaqueadas en agar sangre* e incubadas durante toda la noche a 37C. Esto permite que las bacterias crezcan y formen colonias visibles. As, se cuenta el nmero de colonias para cada tiempo de extraccin y se grafica el n de colonias vs tiempo. Es de esperar que a medida que el tiempo de incubacin es mayor, el nmero de colonias sea menor porque las clulas del paciente fagocitan a las bacterias y, por lo tanto, cada vez hay menos bacterias. *El agar es un medio de cultivo nutritivo (parece gelatina). En particular, el agar sangre est enriquecido con sangre y sirve para detectar ciertas bacterias como Staphylococcus aureus, que liberan exotoxinas llamadas hemolisinas que son capaces de lisar los

glbulos rojos.

% Muerte Bacteriana

tiempo