BIOSENZORI

1. Definitie

2. Elemente biologice

3. Metode de imobilizare a elementului biologic

4. Traductori

5. Aplicatii

Un biosenzor este un dispozitiv format dintr-un element biologic (enzimă, biomoleculă, anticorp, celule microbiane, ţesut, etc) ce este imobilizat în vecinătatea unui traductor (electrochimic, optic, termic, etc) ce transformă un semnalul chimic rezultat în urma interacţiei analitului cu elementul biologic într-un răspuns măsurabil, de obicei într-un răspuns electronic.

Ce este un biosenzor?

Analit / bioreceptor / traductor / procesorAnaliti• microorganisme anthrax, tularemia, E. coli, Candida

• molecule miciglucoza, alcool, CO, CO2, agenti paralizanti, uree, pesticide, aspirina, paracetamol,

penicilina, TNT, colesterol, aminoacizi

• biomacromoleculeDNA, RNA, enzime, proteine, hormoni, virusi

1) ENZIME - cele mai utilizate in constructia biosenzorilor- catalizatori ai unor reactii- se poate utiliza o enzima sau se pot cupla doua sau

mai multe reactii enzimatice cu producerea unui compus ce poate fi determinat prin diverse metode

Elemente biologice

Enzime utilizate in biosenzori- cele mai multe sunt enzime REDOX (reductaze, oxidaze) producatoare /

consumatoare de electroni: detectie amperometrica sau colorimetrica- enzimele hidrolitice (proteaze, lipaze, esteraze) producatoare /

consumatoare de electroni: detectie potentiometrica sau conductometrica- sisteme enzimatice cuplate, cum ar fi peroxidaza cuplata cu luciferaza

ce duce la obtinerea unui produs colorat sau la emisia de fotoni: detectie optica

2) ANTICORPI / ANTIGENI Anticorpii

- proteine ce pot recunoste in mod specific o substanta specifica (antigen) ca mijloc natural de aparare

- caracterizati de interactii extrem de selective si puternice cu antigenii specifici

- pot fi obtinuti anticorpi pentru aproape orice antigen

Antigen binding sites

Light Chain

Heavy Chain

Anticorpii in biosenzori

Avantaje: - selectivitate foarte inalta; realizare de legaturi

puternice

Dezavantaje: - nu prezinta efect catalitic, fiind necesara

determinarea lor indirecta prin marcarea lor cu diversi agenti de marcare

Agenti de marcare: radio-izotopi, enzime, fluorofori, compusi chemiluminiescenti

Obs. In cazul traductorilor Piezoelectrici se poate face o determinare directa datorita modificarilor in frecventa de vibratie a cristalului in urma legarii antigenului

Y Y Y

Y Y Y

Y Y Y

Y Y YY Y Y

Y Y Y

Enzyme Linked Immuno-Sorbant Assay (ELISA)

3) PROTEINE RECEPTOR- proteinele receptor se afla de obicei la suprafata celulei

sau in membrana celulara.

- pot fi utilizate in special la determinarea neuro-transmitatorilor, hormonilor, medicamentelor neuro-active, anestezicelor, etc.

- extrem de selective, dar adesea greu se izolat, putandu-se utiliza si biomembrane intacte sau celule intregi.

4) ACIZI NUCLEICI- ADN-ul si ARN-ul pot fi utilizati pentru realizarea unor senzori in format chip

- biosenzorii bazati pe ADN si ARN se utilizeaza pentru detectia mutatiilor genetice si pentru determinarea nivelurilor de expresie a proteinelor.

5) CELULE / TESUTURI - biosenzorii bazati pe celule sau tesuturi sunt mai putin selectivi

- utilizati in special pentru determinari semicantitative; pentru determinarea indicilor de toxicitate

IMOBILIZARE

Legare covalentă

Legare încrucişată

Fizică

Chimică

Reţinere fizică în spatele unei membrane permeabile pentru molecule mici

Înglobare în reţeaua unui polimer

Adsorbţie

Metode de imobilizare a componentei biologice

Imobilizare eficienta:- orientare corecta a elementului biologic- accesibilitatea analitului la elementul biologic- retinerea activitatii biologice- difuzie usoara a analitului catre elementul biologic- Stabilitate operationala si durata de viata

In cazul imobilizarii chimice este necesara prezenta unor grupari functionale la nivelul elementului biologic sau functionalizarea acestuia.In cazul imobilizarii proteinelor pot fi exploatate urmatoarele grupari functionale ale aminoacizilor

Lizina (NH2) Cisteina (SH) Serina (OH) Acid Aspartic (COOH)

+ Stabilitate marita

+ Un bun control asupra orientarii elementului biologic in cazul imobilizarii covalente

+ In cazul utilizarii unui electrod ca traductor, la imobilizare se poate utiliza un agent de legare conducator de electroni ducand la o eficienta mai mare a semnalului electronic

- Afectarea structurii elementului biologic si pierderea selectivitatii / activitatii catalitice in timpul reactiilor chimice de imobilizare (in special in cazul legarii incrucisate)

- Rezistenta mecanica a sistemului poate fi slaba

+ Nu este afectata structura elementului biologic

+ Limiteaza contaminarea cu proteine prezente in proba

+ Limiteaza biodegradarea elementului biologic

- Difuzia analitului catre elementul biologic poate fi incetinita

- Retinerea unor molecule nedorite (interferente) in spatele membranei sau in reteaua polimerului

- Pierderea elementului biologic

IMOBILIZAREA FIZICA

IMOBILIZAREA CHIMICA

IMOBILIZAREA BAZATA PE AFINITATE BIOLOGICA

Element biologic

Biotina

Avidina (proteina tetramerica)

Biotina

Traductor

1. Sistemul avidina - biotina

Element biologic

Antigen

Anticorp

traductor

2. Sistemul antigen - anticorp

fibronectin tri-peptida RGD (Arg-Gly-Asp) in EMC Peptide RGD

Integrine (factori de atasare)

Celule cu ‘integrine’ de suprafata

Matrice extra-celulara (EMC)

traductor

3. Imobilizarea celulelor bazata pe afinitate biologica

• Adsorbtie 1 zi• Inglobarea in polimer 1 saptamana• Legare incrucisata 3- 4 saptamani• Imobilizare covalenta 4-14 luni• Afinitate biologica saptamani - luni (variabil)

Timp de viata

• se formeaza prin adsorbtia pe suprafete de aur a unor derivati alcan-tiolici X(CH2)nSH

• sunt caraterizate printr-o orientare foarte precisa

Functionalizarea suprafetei traductorilor

1) Monostraturi auto-asamblate (Self-assembled Monolayers - SAMs)

Tiol dizolvat in etanol

Suprafata de aur imersata in solutie

Monostrat auto-asamblat

Grup functional :OH, NH2, COOH

Alcan

SH

2) Silanizarea oxizilor metalici

C2H5O C2H5OC2H5O

+ H2O +

X

C2H5O C2H5OC2H5O

+ H2O +

O O O O

Hidroliza

Condensare

Sticla (SiO2)sau alt oxid metalic

O O O

Grup functional

Alcan

Si

Agenti pentru prevenirea adsorbtiei non-specifice

PEG (poli-etilenglicol)

Fosfocolina - componenta a membranelor biologice

Albumina serica- proteina serica neadeziva

Heparina- Zahar ce previne coagularea sangelui

TRADUCTORI

1. Traductori electrochemici a)Potentiometrici:

- se masoara potentialul celulei electrochimice la curent zero. Potentialul celulei este proportional cu concentratia ionilor.

- in constructia biosenzorilor potentiometrici intra de obicei enzime ce determina schimbari semnificative ale pH-ului: penicilinaza, ureaza, esteraza.

Electrod de referinta

V

Punte de sare

Proba

Electrod de lucru

Enzima imobilizata la suprafata electrodului

b) Amperometrici

- se aplica un potential intre un electrod de lucru si un electrod de referinta, masurandu-se in mod continuu curentul din celula.

- cele mai utilizate enzime sunt oxidoreductazele: glucozoxidaza, colesterol oxidaza, aminoacid oxidaza, etc.

Glucoza Acid gluconic

Oxigen Apa oxigenata

Glucozoxidaza

ELECTRODE

2H+, 2e-

5.4mM

ELECTROD

2H+, 2e-

curentc) Conductometrici

- se masoara conductanta / rezistenta unei solutii- se pot utiliza cand in timpul conversiilor enzimatice sunt generate sarcini electrice (amidase, esterase, kinaze).

Examplu: determinarea ureei (in urina) utilizand ureaza:

Urea + 2H2O 2NH4+ + HCO3

ureaza

+ usurinta in operare+ interfata directa cu sistemul electronic+ posibilitate de miniaturizare - selectivitate limitata, fiind necesara utilizarea mediatorilor pentru imbunatatirea acesteia- poate fi aplicata numai sistemlor la car eparticipa specii electrochimic active

(Dez)avantaje ale biosenzorilor electrochimici

Tehnici optice ce pot fi utilizate in domeniul biosenzorilor:• absorbtia in UV / Vizibil• emisie de fluorescenta (fosforescenta)• Bio-luminescenta• Chemi-luminescenta• Spectroscopie de Reflexie Interna (IRS)• Metode bazate pe dispersia luminii

Despozitive necesare: tuburi fotomultiplicatoare, spectrofotometre, fluorimetre, fibre optice, ghiduri de unda

2. Traductori optici

Proprietatea unor molecule (fluorofori) de a absorbi lumina la o anumita lungime de unda (de obicei in UV) urmata de emisie de lumina la o alta lungime de unda (in Vizibil).

Aplicatii: chip-uri ADN, imunoanaliza

Fluorescenta

FRET consta intr-o interactie, dependenta de distanta, dintre doi fluorofori, in care energia de excitare a unuia (donor) este transferata la celalalt (acceptor) fara emisie de fotoni.

Eficienta FRET este dependenta de distanta intermoleculara si este utila la distante comparabile cu dimensiunea macromoleculelor biologice.

Fluorescenta de transfer a energiei de rezonanta (FRET)

(Dez)avantajele traductorilor optici

+ usurinta in operare+ pot raspunde simultan la analiti diferiti+ precizie mare + posibilitatea utilizarii fibrelor optice pentru un ‘transport al fotonilor’ mai eficient+ extrem de sensibili (in special in cazul celor bazati pe fluorescenta si luminescenta)

- depind de disponibilitatea compusului cu proprietati optice- domeniu dinamic de aproximativ 102 (in cazurile in care se aplica legea Lambert-Beer)- dificultati in miniaturizare- timpul de raspuns poate fi mare- interferenta altor compusi prezenti in matrici complexe- interferenta luminii exteriaore in cazul traductorilor luminescenti

Traductori termici- formarea / ruperea legaturilor chimic in reactiile enzimatice duc la modificari de entalpie- pot fi detectate modificari ale temperaturii solutiilor de 10-3 K - pentru o detectie mai buna reactiile de interes pot fi cuplate cu alte sisteme enzimatice ce produc mai multa caldura (de ex., glucozoxidaza poate fi cuplata cu catalaza)

+ pot fi utilizate pentru majoritatea reactiilor- selectivitate scazuta- dificultati in miniaturizare

anticorp

antigen

Cristal piezo-electric

Frecventa (f) oscilatiilor cristalului depinde de masa cristalului (m) si de cea a oricarui material adsorbit pe suprafata sa (A).

Frecventa oscilatiilor descreste cu masa adsorbita.

Materiale piezolectrice : cuartz, materiale ceramice, polimeri organici

Traductori piezoelectrici

+ extrem de sensibili (determinarea antigenului in domeniul picogramelor) + posibilitate de determinare a antigenilor atat in faza gazoasa, cat si in faza lichida+ portabilitate+ Timp scurt de raspuns+ Nu necesita marcare- adsorbtia nespecifica a proteinelor poate duce la rezultate false

Biosenzori amperometrici bazaţi pe imobilizarea componentei biologice pe / în membrane obţinute prin electro-polimerizare direct la suprafaţa electrodului de lucru.

Membrane conductoare (poli-pirol)

Membrane ne-conductoare (poli-tiramina)

BIOSENZORI BAZAŢI PE ELECTROZI SERIGRAFIAŢI

CEREWE

1 cm

Producţie de serie

Preţ de cost scăzut

Uşor de înlocuit

Necesită volume mici de probă

Potriviţi pentru determinări pe teren

0 0.250 0.500 0.750 1.000-5-0.100x10

0

-50.100x10

-50.200x10

-50.300x10

-50.400x10

-50.500x10

-50.600x10

-50.700x10

E / V

i / A

Voltamograma înregistrată la obţinerea biosenzorului pentru glucoză prin electropolimerizare pe electrozi serigrafiaţi

PERFORMANŢE CERUTE ALE BIOSENZORILOR

1. Precizie

2. Sensibilitate si selectivitate

3. Domeniul de analiză

4. Viteza de răspuns

5. Capacitate de reutilizare

6. Calibrare simplă

7. Robusteţe fizică

8. Preţul de cost

9. Uşurinţa în utilizare

10. Siguranţa produsului

Environmental factors that affect bio- interactions and biosensor performance • Presence of interfering molecules (e.g. enzyme inhibitors)

• Denaturing agents (organic solvents and detergents)

• Hydrophobic surfaces

• Ionic strength, unfavourable pH

• Analyte concentration (Saturation; e.g. all antibody binding sites filled)These factors can significantly affect the selectivity, specificity and tightness of binding.

Hence, analyte solutions commonly need to be prepared prior to analysis (neutral pH, no detergents, certain concentrations).

Test de sarcinaGlucoza

Antrax

• medical glucose, alcohol, DNA, RNA, proteins, hormones, aspirin,paracetamol, penicillin

• industrial bio-processesamino acids, yeast, lactic acid, ethanol, etc.

• environmental pesticides,fertilizers,oestrogen mimicks, CO, CO2

• defense/forensicanthrax, small pox, ricin, nerve agents, TNT, cocaine

Application areas