Curs Biosensori

Download Curs Biosensori

Post on 16-Jun-2015

1.460 views

Category:

Documents

4 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

<p>BIOSENZORI1. Definitie 2. Elemente biologice 3. Metode de imobilizare a elementului biologic 4. Traductori 5. Aplicatii</p> <p>Ce este un biosenzor?Un biosenzor este un dispozitiv format dintr-un element biologic (enzim, biomolecul, anticorp, celule microbiane, esut, etc) ce este imobilizat n vecintatea unui traductor (electrochimic, optic, termic, etc) ce transform un semnalul chimic rezultat n urma interaciei analitului cu elementul biologic ntr-un rspuns msurabil, de obicei ntr-un rspuns electronic.</p> <p>Analiti</p> <p>Analit / bioreceptor / traductor / procesor</p> <p> microorganisme anthrax, tularemia, E. coli, Candida molecule mici glucoza, alcool, CO, CO2, agenti paralizanti, uree, pesticide, aspirina, paracetamol, penicilina, TNT, colesterol, aminoacizi biomacromolecule DNA, RNA, enzime, proteine, hormoni, virusi</p> <p>Elemente biologice1) ENZIME- cele mai utilizate in constructia biosenzorilor - catalizatori ai unor reactii - se poate utiliza o enzima sau se pot cupla doua sau mai multe reactii enzimatice cu producerea unui compus ce poate fi determinat prin diverse metode Enzime utilizate in biosenzori - cele mai multe sunt enzime REDOX (reductaze, oxidaze) producatoare / consumatoare de electroni: detectie amperometrica sau colorimetrica - enzimele hidrolitice (proteaze, lipaze, esteraze) producatoare / consumatoare de electroni: detectie potentiometrica sau conductometrica - sisteme enzimatice cuplate, cum ar fi peroxidaza cuplata cu luciferaza ce duce la obtinerea unui produs colorat sau la emisia de fotoni: detectie optica</p> <p>2) ANTICORPI / ANTIGENIAnticorpii - proteine ce pot recunoste in mod specific o substanta specifica (antigen) ca mijloc natural de aparare - caracterizati de interactii extrem de selective si puternice cu antigenii specifici - pot fi obtinuti anticorpi pentru aproape orice antigen</p> <p>Anticorpii in biosenzoriAvantaje: - selectivitate foarte inalta; realizare de legaturi puternice Dezavantaje: - nu prezinta efect catalitic, fiind necesara determinarea lor indirecta prin marcarea lor cu diversi agenti de marcare Agenti de marcare: radio-izotopi, enzime, fluorofori, compusi chemiluminiescenti Obs. In cazul traductorilor Piezoelectrici se poate face o determinare directa datorita modificarilor in frecventa de vibratie a cristalului in urma legarii antigenului</p> <p>Antigen binding sites</p> <p>Light Chain Heavy Chain</p> <p>Enzyme Linked Immuno-Sorbant Assay (ELISA)</p> <p>YYY</p> <p>YYY</p> <p>YYY YYYY Y Y</p> <p>YYY</p> <p>YYY</p> <p>3) PROTEINE RECEPTOR- proteinele receptor se afla de obicei la suprafata celulei sau in membrana celulara. - pot fi utilizate in special la determinarea neurotransmitatorilor, hormonilor, medicamentelor neuro-active, anestezicelor, etc. - extrem de selective, dar adesea greu se izolat, putanduse utiliza si biomembrane intacte sau celule intregi.</p> <p>4) ACIZI NUCLEICI- ADN-ul si ARN-ul pot fi utilizati pentru realizarea unor senzori in format chip - biosenzorii bazati pe ADN si ARN se utilizeaza pentru detectia mutatiilor genetice si pentru determinarea nivelurilor de expresie a proteinelor.</p> <p>5) CELULE / TESUTURI- biosenzorii bazati pe celule sau tesuturi sunt mai putin selectivi - utilizati in special pentru determinari semicantitative; pentru determinarea indicilor de toxicitate</p> <p>etode de imobilizare a componentei biologicAdsorbie</p> <p>Fizic</p> <p>Reinere fizic n spatele unei membrane permeabile pentru molecule mici nglobare n reeaua unui polimer</p> <p>IMOBILIZARE</p> <p>Chimic</p> <p>Legare covalent</p> <p>Legare ncruciat</p> <p>Imobilizare eficienta:- orientare corecta a elementului biologic - accesibilitatea analitului la elementul biologic - retinerea activitatii biologice - difuzie usoara a analitului catre elementul biologic - Stabilitate operationala si durata de viata In cazul imobilizarii chimice este necesara prezenta unor grupari functionale la nivelul elementului biologic sau functionalizarea acestuia. In cazul imobilizarii proteinelor pot fi exploatate urmatoarele grupari functionale ale aminoacizilor Lizina (NH2) Cisteina (SH) Serina (OH) Acid Aspartic (COOH)</p> <p>IMOBILIZAREA FIZICA+ + + Nu este afectata structura elementului biologic Limiteaza contaminarea cu proteine prezente in proba Limiteaza biodegradarea elementului biologic Difuzia analitului catre elementul biologic poate fi incetinita Retinerea unor molecule nedorite (interferente) in spatele membranei sau in reteaua polimerului Pierderea elementului biologic</p> <p>IMOBILIZAREA CHIMICA+ + + Stabilitate marita Un bun control asupra orientarii elementului biologic in cazul imobilizarii covalente In cazul utilizarii unui electrod ca traductor, la imobilizare se poate utiliza un agent de legare conducator de electroni ducand la o eficienta mai mare a semnalului electronic Afectarea structurii elementului biologic si pierderea selectivitatii / activitatii catalitice in timpul reactiilor chimice de imobilizare (in special in cazul legarii incrucisate) Rezistenta mecanica a sistemului poate fi slaba</p> <p>-</p> <p>-</p> <p>IMOBILIZAREA BAZATA PE AFINITATE BIOLOGICAElement biologic Biotina</p> <p>1. Sistemul Avidina (proteina tetramerica) avidina - biotinaBiotina Traductor</p> <p>Element biologic Antigen Anticorp traductor</p> <p>2. Sistemul antigen - anticorp</p> <p>3. Imobilizarea celulelor bazata pe afinitate biologicaCelule cu integrine de suprafata Matrice extra-celulara (EMC)fibronectin tri-peptida RGD (Arg-Gly-Asp) in EMC Peptide RGD Integrine (factori de atasare)</p> <p>traductor</p> <p>Timp de viata Adsorbtie Inglobarea in polimer Legare incrucisata Imobilizare covalenta Afinitate biologica 1 zi 1 saptamana 3- 4 saptamani 4-14 luni saptamani - luni (variabil)</p> <p>Functionalizarea suprafetei traductorilor1) Monostraturi auto-asamblate (Self-assembled Monolayers - SAMs) se formeaza prin adsorbtia pe suprafete de aur a unor derivati alcan-tiolici X(CH2)nSH sunt caraterizate printr-o orientare foarte precisaGrup functional : OH, NH2, COOH Alcan Tiol dizolvat in etanol SH</p> <p>Suprafata de aur imersata in solutie Monostrat auto-asamblat</p> <p>2) Silanizarea oxizilor metaliciGrup functional Alcan Si C2 H 5 O X Hidroliza + H 2O + Condensare Sticla (SiO2) sau alt oxid metalic O OO O</p> <p>CHO C2H5O 2 5</p> <p>O</p> <p>O</p> <p>O</p> <p>Agenti pentru prevenirea adsorbtiei non-specificePEG (poli-etilenglicol) Fosfocolina- componenta a membranelor biologice</p> <p>Albumina serica- proteina serica neadeziva</p> <p>Heparina- Zahar ce previne coagularea sangelui</p> <p>TRADUCTORI 1. Traductori electrochemicia)Potentiometrici:- se masoara potentialul celulei electrochimice la curent zero. Potentialul celulei este proportional cu concentratia ionilor. - in constructia biosenzorilor potentiometrici intra de obicei enzime ce determina schimbari semnificative ale pH-ului: penicilinaza, ureaza, esteraza.VElectrod de lucru ProbaPunte de sare</p> <p>Electrod de referinta</p> <p>Enzima imobilizata la suprafata electrodului</p> <p>b) Amperometrici- se aplica un potential intre un electrod de lucru si un electrod de referinta, masurandu-se in mod continuu curentul din celula. cele mai utilizate enzime sunt oxidoreductazele: glucozoxidaza, colesterol oxidaza, aminoacid oxidaza, etc.</p> <p>Glucoza Acid gluconic Glucozoxidaza Oxigen Apa oxigenata</p> <p>2H+, 2e-</p> <p>ELECTRODE ELECTROD</p> <p>c) Conductometrici</p> <p>curent 5.4mM</p> <p>- se masoara conductanta / rezistenta unei solutii - se pot utiliza cand in timpul conversiilor enzimatice sunt generate sarcini electrice (amidase, esterase, kinaze). Examplu: determinarea ureei (in urina) utilizand ureaza:</p> <p>Urea + 2H2O</p> <p>ureaza</p> <p>2NH4+ + HCO3</p> <p>(Dez)avantaje ale biosenzorilor electrochimici+ usurinta in operare + interfata directa cu sistemul electronic + posibilitate de miniaturizare - selectivitate limitata, fiind necesara utilizarea mediatorilor pentru imbunatatirea acesteia - poate fi aplicata numai sistemlor la car eparticipa specii electrochimic active</p> <p>2. Traductori opticiTehnici optice ce pot fi utilizate in domeniul biosenzorilor: absorbtia in UV / Vizibil emisie de fluorescenta (fosforescenta) Bio-luminescenta Chemi-luminescenta Spectroscopie de Reflexie Interna (IRS) Metode bazate pe dispersia luminii</p> <p>Despozitive necesare: tuburi fotomultiplicatoare, spectrofotometre, fluorimetre, fibre optice, ghiduri de unda</p> <p>FluorescentaProprietatea unor molecule (fluorofori) de a absorbi lumina la o anumita lungime de unda (de obicei in UV) urmata de emisie de lumina la o alta lungime de unda (in Vizibil). Aplicatii: chip-uri ADN, imunoanaliza</p> <p>Fluorescenta de transfer a energiei de rezonanta (FRET)FRET consta intr-o interactie, dependenta de distanta, dintre doi fluorofori, in care energia de excitare a unuia (donor) este transferata la celalalt (acceptor) fara emisie de fotoni. Eficienta FRET este dependenta de distanta intermoleculara si este utila la distante comparabile cu dimensiunea macromoleculelor biologice.</p> <p>(Dez)avantajele traductorilor optici+ usurinta in operare + pot raspunde simultan la analiti diferiti + precizie mare + posibilitatea utilizarii fibrelor optice pentru un transport al fotonilor mai eficient + extrem de sensibili (in special in cazul celor bazati pe fluorescenta si luminescenta) - depind de disponibilitatea compusului cu proprietati optice - domeniu dinamic de aproximativ 102 (in cazurile in care se aplica legea LambertBeer) - dificultati in miniaturizare - timpul de raspuns poate fi mare - interferenta altor compusi prezenti in matrici complexe - interferenta luminii exteriaore in cazul traductorilor luminescenti</p> <p>Traductori termici- formarea / ruperea legaturilor chimic in reactiile enzimatice duc la modificari de entalpie - pot fi detectate modificari ale temperaturii solutiilor de 10-3 K - pentru o detectie mai buna reactiile de interes pot fi cuplate cu alte sisteme enzimatice ce produc mai multa caldura (de ex., glucozoxidaza poate fi cuplata cu catalaza)+ pot fi utilizate pentru majoritatea reactiilor - selectivitate scazuta - dificultati in miniaturizare</p> <p>Traductori piezoelectriciFrecventa (f) oscilatiilor cristalului depinde de masa cristalului (m) si de cea a oricarui material adsorbit pe suprafata sa (A). Frecventa oscilatiilor descreste cu masa adsorbita. Materiale piezolectrice : cuartz, materiale ceramice, polimeri organici+ extrem de sensibili (determinarea antigenului in domeniul picogramelor) + posibilitate de determinare a antigenilor atat in faza gazoasa, cat si in faza lichida + portabilitate + Timp scurt de raspuns + Nu necesita marcare - adsorbtia nespecifica a proteinelor poate duce la rezultate false</p> <p>anticorpCristal piezo-electric</p> <p>antigen</p> <p>Membrane conductoare (polipirol)Biosenzori amperometrici bazai pe imobilizarea componentei biologice pe / n membrane obinute prin electropolimerizare direct la suprafaa electrodului de lucru.</p> <p>Membrane ne-conductoare (politiramina)</p> <p>BIOSENZORI BAZAI PE ELECTROZI SERIGRAFIAI</p> <p>RE</p> <p>WE</p> <p>CE</p> <p>1 cm</p> <p>Producie de serie Pre de cost sczut Uor de nlocuit Necesit volume mici de prob Potrivii pentru determinri pe teren</p> <p>Voltamograma nregistrat la obinerea biosenzorului pentru glucoz prin electropolimerizare pe electrozi serigrafiai0.700x10-5 0.600x10-5 0.500x10-5 0.400x10-5</p> <p>i/A</p> <p>0.300x10-5 0.200x10-5 0.100x10-5 0 -0.100x10-5</p> <p>0</p> <p>0.250</p> <p>0.500</p> <p>0.750</p> <p>1.000</p> <p>E/V</p> <p>PERFORMANE CERUTE ALE BIOSENZORILOR 1. Precizie 2. Sensibilitate si selectivitate 3. Domeniul de analiz 4. Viteza de rspuns 5. Capacitate de reutilizare 6. Calibrare simpl 7. Robustee fizic 8. Preul de cost 9. Uurina n utilizare 10. Sigurana produsului</p> <p>Environmental factors that affect bio- interactions and biosensor performance Presence of interfering molecules (e.g. enzyme inhibitors) Denaturing agents (organic solvents and detergents) Hydrophobic surfaces Ionic strength, unfavourable pH Analyte concentration (Saturation; e.g. all antibody binding sites These factors can significantly affect the selectivity, specificity and tightness of binding. filled) Hence, analyte solutions commonly need to be prepared prior to analysis (neutral pH, no detergents, certain concentrations).</p> <p>Application areas medical glucose, alcohol, DNA, RNA, proteins, hormones, aspirin, paracetamol, penicillin industrial bio-processes amino acids, yeast, lactic acid, ethanol, etc. environmental pesticides,fertilizers,oestrogen mimicks, CO, CO2 defense/forensic anthrax, small pox, ricin, nerve agents, TNT, cocaine</p> <p>Test de sarcina</p> <p>Antrax</p> <p>Glucoza</p>