sensori & biosensori: analisi dei prodotti gianfranco greppi laboratorio di bionanotecnologie....
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SENSORI & BIOSENSORI: Analisi dei Prodotti
Gianfranco GreppiLaboratorio di Bionanotecnologie.Porto Conte RicercheUniversità di Sassari
Sommario
Ricerca e Trasferimento Perché i biosensori La tecnolgia Le applicazioni
building block
Università
Enti pubblici e Non-profit
Imprese con i propri laboratori
infrastrutture di base
building block
Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione
RECESSIONE E MANCATA RICERCARECESSIONE E MANCATA RICERCA
Francia 38 miliardi
INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE
PIA, POR, MIUR innovazione
ULTIMO DEI PAESI DEL G7
Unico con oltre 50% finanziamento pubblico
PRODUTTIVITA’ +0,8
Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE
Un percorso per il trasferimento tecnologico nel settore delle Biotecnologie
Relatore: GIANFRANCO GREPPI- LEA BIOTECH SPINOFF UNIMI
Il sistema della ricerca, della sperimentazione e del trasferimento dell’innovazione
building block
Università
Enti pubblici e Non-profit
Imprese con i propri laboratori
infrastrutture di base
Le Università costituiscono da sempre uno Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi sistemi della ricerca e dell'innovazionedella ricerca e dell'innovazione
building block
Le Università costituiscono da sempre uno Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi sistemi della ricerca e dell'innovazionedella ricerca e dell'innovazione
Ogni istituzione può giocare molteplici ruoli: formazione, ricerca fondamentale e applicata, sviluppo tecnologico
- i legami tra gli attori del sistema si sono intensificati: le collaborazioni tra imprese, Enti e Università, non sono più eventi sporadici ma prassi comune; esse coinvolgono crescenti flussi di risorse finanziarie, di uomini e di conoscenze
- la comparsa e l'affermazione del sistema finanziario come nuovo attore nei SI, con un ruolo del Venture Capital
-Start-up nei settori di punta tecnologica, originate nelle Università e nei Centri di Eccellenza scientifica.
RECESSIONE E MANCATA RICERCARECESSIONE E MANCATA RICERCA
Francia 38 miliardi
INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE
PIA, POR, MIUR innovazione
ULTIMO DEI PAESI DEL G7
Unico con oltre 50% finanziamento pubblico
PRODUTTIVITA’ +0,8
Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro OCSE
DIDATTICA
RICERCA DI BASE
APPLICATA
TRASFERIMENTO
SPIN-OFF
DIDATTICA
RICERCA DI BASE
APPLICATA
SPIN-OFF
DIDATTICA
RICERCA DI BASE
APPLICATA
SPIN-OFF
RECESSIONE E MANCATA RICERCARECESSIONE E MANCATA RICERCA
I mpr es e bi otec nol ogi c he per s ettor e mer c eol ogi c o
12
11
22
58
0 10 20 30 40 50 60 70
Cura del la salute
Agroal imentare
Chimico
Ambiente
BIOTECH & PMI (2003)BIOTECH & PMI (2003)
Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro.Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro.
Tecnologie applicate nelle imprese biotecnologiche in Italia
42
28
14
24
23
22
22
10
5
13
12
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
P CR
Fermentazione, separazione dei prodotti
Biotrasformazioni, enzimologia e biocatalisi
Acidi nucleici e sonde
Clonaggio in microrganismi piante ed animali, DNA ricombinante
Anticorpi monoclonali
Genomica e proteomica
Chimica combinatoria
Cellule staminali
Bioremediation
Bioinformatica
n° imprese
BIOTECH & PMI (2003)BIOTECH & PMI (2003)
BASSI COSTIHIGH THROUGHPUT
QUALITA’ DEI DATIINTEGRAZIONESTANDARDIZZAZIONEDECENTRALIZZAZIONEINFORMAZIONE
Vecchi valori Nuovi valori
CURVA APPRENDIMENTO ACCELERATA
BIOTECH & PMI 1990 vs 2010BIOTECH & PMI 1990 vs 2010
MICRO DIMENSIONI INFORMAZIONE DIGITALE NUOVE PIATTAFORME BASSI CONSUMI REAGENTI MISURE DIRETTE
SCREENING
NUOVI LEAD
PROTEOMICA
GENOMICA
ARRAY
BIOTECH & PMI 2006-2010BIOTECH & PMI 2006-2010
BIOTECH & PMI TRENDBIOTECH & PMI TREND
BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E PER LA BIOSICUREZZA DEI PER LA BIOSICUREZZA DEI PRODOTTIPRODOTTI
BIOTECH & PMI TRENDBIOTECH & PMI TREND
BIOTECH & PMI PRODOTTIBIOTECH & PMI PRODOTTI
GENOMICA
SVILUPPORICERCA
ANALISI CHIMICAANALISI CHIMICAANALISI BIOLOGICA
IDENTIFICA IL TARGET
VALIDAIL TARGET
IDENTIFICA IL LEAD
OTTIMIZZA LEAD
TEST PRE-CLINICI
TEST CLINICI
PROTEOMICA FARMACOGENOMICA DRUG DELIVERY
Bioinformatica
PIATTAFORMA BIOTECH
Bioinformatica
Biotech & Fusion Technologies
Genomics, Proteomics and Bioinformatics: Combinatorial –chemistry Peptide libraries- tea bags, beadsCombinatorial –biology Directed evolution DNA Shuffling, Molecular Breeding High throughput analysis:
Nucleic Acid based SequencingMicroarrays Protein based.2-D, electrospray/nanospray MS: MALDI-TOF, LC/MS/MS, SELDI
Imaging/optical biology.Biosensors, Bioelectronics Bionetworks (Nanotechnology).
MICROARRAY
PROTEOMICA
La conoscenza deve scorrere daquelli che sannole cose a quelli che fannocose
Joel Mokyr “Historical Origins of Knowledge Economy”Princeton University 2002
Joel Mokyr “Historical Origins of Knowledge Economy”Princeton University 2002
Perchè i biosensori?
I biosensori sono degli strumenti analitici con potenzialità enormi, sia in termini di interesse scientifico, sia in termini di applicazioni commerciali:
– Capo medico diagnostico. – Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque– Analisi in remoto per contaminazioni batteriche nelle attività
bioterrorismo. – Analisi dei patogeni negli alimenti – Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e
acido pantotenico – Analisi di antibiotici negli alimenti
I biosensori
I BIOSENSORI sono degli strumenti analitici costituiti da un componente biologico e un trasduttore.
trasduttorecomp. biologico
film protettivo
PC
Schema logico di un sensore
Bioreceptor
Biological sensing element
Bioreceptor
Biological sensing elementTransducer Signal
Analite
Interfaccia elettronica
Unità di memorizzazione
Unità di elaborazione
Perchè i biosensori?
Analisi degli alimenti – Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque– Analisi dei patogeni– Analisi diossine– Analisi di routine dell’acido flico, biotina,
vitamina B12 e acido pantotenico – Analisi di antibiotici
Cosa misura il biosensore?
L’attività dell’enzima:
I trasduttori
Trasduttori usati per la costruzione di biosensori:
Trasduttori
Elettrochimici
Ottici
Acustici
Termici
Amperometrici
Potenziometrici
Conduttimetrici
I generazione
II generazione
III generazione
Elettrodi a vetro
ISE
ISFET
Trasduttori ottici
Un biosensore a trasduttore ottico misura i cambio di assorbanza di uno strato di reagente biologico che interagisce con l’analita.
CI
IA t
0
log CI
IA t
0
log
Risonanza di superficie a plasmon
SPR
Trasduttori acustici
Sauebrey) di (eq.
mkf Sauebrey) di (eq.
mkf
Trasduttori potenziometrici
pHmetro:– Glucosio ossidasi
glucose + O2 gluconolactone + H2O2 gluconate + H+
– Lipasi lipide neutro + H2O glicerolo + acidi grassi + H+
Nernst) di (eq.
ln0ianF
RTEE
Nernst) di (eq.
ln0ianF
RTEE
Trasduttori potenziometrici
ISE al NH4+:
– L-amino ossidasi L-amino acido + O2 + H2O keto acido + NH4
+ + H2O2
– asparaginasi L-asparagine + H2O L-aspartate + NH4
+
Nernst) di (eq.
ln0ianF
RTEE
Nernst) di (eq.
ln0ianF
RTEE
Trasduttori potenziometrici
ISE al I-:– perossidasi
H2O2 + 2H+ + 2I- I2 + 2H2O
ISE al CN-:– glucosidasi
amigdalina + 2H2O 2glucose + benzaldeide + H+ + CN-
Nernst) di (eq.
ln0ianF
RTEE
Nernst) di (eq.
ln0ianF
RTEE
Trasduttori conduttimetrici
Il prodotto di una reazione enzimatica cambia la conducibilità della soluzione in prossimità degli elettrodi.
120.0
substrato prodotto
120.0
substrato prodotto
Lamina d’oro o di platino
Enzima
Trasduttori amperometrici
L’amperometria misura una corrente ad un potenziale applicato costante.
Cur
rent
Time
background
Add 10M
Add 10M
steady-state
steady-state
Plank)Nernst di (eq.x
CnFADi
Plank)Nernst di (eq.x
CnFADi
Amperometria
Corrente e potenziale
Su un metallo inerte, applico un potenziale anodico, o catodico, relativamente ad un elettrodo di riferimento.
Il metallo misura una corrente anodica o catodica, in base al numero delle specie in soluzione che si possono ossidare o ridurre.
Potenziale anodico e catodico
+++++Potenziale anodico:
La superficie è povera di elettroni.
Una specie chimica capace di donare elettroni verrà ossidata
Potenziale catodico:
La superficie è ricca di elettroni.
Una specie chimica capace di ricevere elettroni verrà ridotta
---------
e-e-
Biosensori amperometrici
Working
electrode
Substrato
red
H2O2Substrato
ox
O2
elettroni
Biosensori amperometrici
Si classificano in I, II e III generazione
Biosensori della I generazione
La prima classe di biosensori amperometrici riguarda la misura diretta del prodotto della reazione enzimatica:
– Perossido di idrogeno– NADH– Consumo del cofattore (ossigeno)
Working
electrode
Substrato
red
H2O2Substrato
ox
O2
elettroni
Working
electrode
Substrato
red
H2O2Substrato
ox
O2
elettroni
Biosensori della I generazione
Il primo biosensore fu ideato da Clark nel 1962. Esso si basava sulla misura dell’ossigeno consumato durante la reazione enzimatica di un ossidasi, tramite un elettrodo di platino polarizzato a -700 mV, seguendo la reazione:
OHeHO 22 244
Il range dinamico di questo dispositivo è circa tra 50 M e 1 mM.
Biosensori della I generazione
Un’alternativa al primo biosensore si basa:– sulla imobilizzazione dell’enzima direttamente sulla
superficie dell’elettrodo – sulla misura del perossido di idrogeno prodotto durante la
reazione enzimatica, tramite un elettrodo di platino polarizzato a +700 mV, seguendo la reazione:
eOHOH 22 222
Biosensori della I generazione
Il perossido di idrogeno può anche venire ridotto all’elettrodo di platino, secondo la seguente equazione:
OHeHOH 222 222
Biosensori della I generazione
Alternativamente, è possibile misurare la produzione di NADH da NAD+ quando si usano enzimi tipo deidrogenasi:
eHNADNADH 2
Il NADH è ossidato all’elettrodo, ma sono richiesti potenziali molto alti.
Biosensori II generazione
I biosensori si sono evoluti, sostituendo il cofattore naturale dell’enzima con una molecola capace di traghettare gli elettroni dal centro attivo dell’enzima alla superficie del trasduttore amperometrico.
Working
electrode
Substrato
red
Mediatore redSubstrato
ox
Mediatore ox
elettroni
Cos’è un mediatore?
I mediatori si possono classificare in:– Molecole organiche– Complessi organici di metalli di transizione– Molecole inorganiche– Polimeri conduttori
Idealmente, il mediatore dovrebbe essere piccolo da entrare facilmente nel sito attivo dell’enzima, essere riciclabile, scambiare elettroni velocemente con l’elettrodo.
Cos’è un mediatore?
Cos’è un mediatore?
Per un processo reversibile:2/12/12/351069.2 CvADnip
nEE pcpa /059.0
2'0 pcpa EE
E
1pc
pa
i
i
Biosensori II generazione
Ulteriori sviluppi nell’utilizzo dei biosensori della II generazione riguardano l’impiego di polimeri conduttori:– Polipirrolo– Polianilina– Politiofene
Questi polimeri hanno la capicità di formare film conduttivi, che possono essere impiegati per immobilizzare enzimi e mediatori di vario tipo.
Biosensori II generazione
Il premio nobel per la Chimica nel 2000 fu attribuito a Alan J. Heeger, Alan G MacDiarmid, e Hideki Shirakawa per il loro lavoro sui polimeri conduttori.
politiofenepolipirrolo
polianilina
Biosensori III generazione
Componenti bioattivi
COMP. BIOATTIVI Enzimi
Anticorpi
Cellule
Acidi Nucleici
microrganismi
tessuti
biocatalitici
biorecettori
Biotecnologia Applicata: Analisi dei Prodotti Vegetali
AA 2007 - 2008
Lezione 7
reactant 1 +
reactant 2
products
energy
Intermediate :
enzyme/reactant 1
+ reactant 2
no enzyme present
enzyme present
+ enzyme
+ enzyme
Course of reaction Replay Close window
Fattori che influenzano l’attività
Tecniche di immobilizzazione
Chimica Legame covalente
sull’elettrodo
su membrana
Fisica
assorbimento fisico
ritenzione
incorporazione
polimerizzazione
pasta di carbone
inchiostri
su gel
su membrane
polimeri conduttori