cátedra de inmunología inmunopatología de la infección por ... · organización genética del...

Inmunopatología de la Infección por VIH-1

Prof. Edwin [email protected]

Universidad Central de Venezuela

Facultad de Medicina

Escuela de Medicina “José María Vargas”

Cátedra de Inmunología

Tema 242018

• Recuento Histórico•Primeros Reportes•Grupos de Riesgo•Vías de Transmisión•Aislamiento del Virus

• Aspectos Clínicos•Curso Clínico de la Infección•Diagnóstico

•ELISA•Western Blot

•Seguimiento•Carga Viral•Subpoblaciones de Linfocitos T

• Inmunopatogénesis•Afección del Sistema Inmunitario•Resultados en Nuestros Pacientes

• El Virus•Proceso de Invasión Celular•Células Susceptibles a la Infección•Ciclo de Replicación•Tratamiento•Cuasiespecies

Inmunopatología de la

Infección por VIH-1

• Epidemiología•Global•Latinoamérica•Venezuela

RECUENTO HISTÓRICOInfección por VIH-1

1er. Reporte de la Inmunodeficiencia

5 de Junio de 1981

Gottlieb et al; Mor Mrt Wkly Rep 1981; 30(21): 250-252

Grupos de Riesgo

Pacientes Homosexuales Masculinos

Grupos de Riesgo

Adictos a Drogas Intravenosas

An outbreak of community-acquired Pneumocystis

carinii pneumonia:

initial manifestation of cellular immune dysfunction

Masur et al, N Engl J Med 1981 Dec 10; 305(24):1431-8

Grupos de Riesgo

Receptores de

Derivados Sanguíneos

Pneumocystis carinii Pneumonia among Persons

with Hemophilia ACDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1982 Jul 16; 31(27):365-7.

Possible Transfusion-Associated Acquired Immune

Deficiency Syndrome (AIDS) - CaliforniaCDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1982 Dec 10; 31(48):652-4.

Grupos de Riesgo

MujeresParejas Sexuales de Hombres en Riesgo

Opportunistic infection in previously healthy women. Initial

manifestations of a community-acquired cellular

immunodeficiencyMasur H et al; Ann Intern Med 1982 Oct; 97(4):533-9

Immunodeficiency among Female Sexual Partners of Males

with Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) - New YorkCDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1983 Jan 7; 31(52):697-8

Unexplained Immunodeficiency and Opportunistic

Infections in Infants - New York, New Jersey, California CDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1982 Dec 17; 31(49):665-7

Grupos de Riesgo

Recién Nacidos:Hijos de Madres en Grupos de Riesgo

Grupos de Riesgo

África:Población Heterosexual Promiscua

Adquired immune deficiency syndrome in Black AfricansClumeck et al, Lancet 1983 Mar 19; 1(8325):642

Adquired immune deficiency syndrome in a heterosexual

population in ZairePiot et al, Lancet 1984 Jul 14; 2(8394):65-69

• Población Heterosexual Promiscua

• Pacientes Homosexuales Masculinos

• Mujeres, Parejas Sexuales de Hombres en Riesgo

• Receptores de Derivados Sanguíneos

• Adictos a Drogas Intravenosas

• Recién Nacidos, Hijos de Madres en Grupos de Riesgo

Grupos de Riesgo y

Vías de Trasmisión

Relaciones

Sexuales

Vía Sexual

Trasmisión VerticalDe Madre a Feto

Vía Sanguínea

Presente en

Sangre

Isolation of a T-Lymphotropic Retrovirus from a Patient

at Risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS)Barré-Sinoussi et al, Science 1983; 220:868-871

20 de Mayo de 1983

1er. Reporte del

Aislamiento del Virus

Hallazgos confirmatorios

VIH-1:Agente Causal del SIDA

Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses

(HTLV-III) from patients with AIDS and at risk of AIDSGallo et al, Science 1984; 224(4648):500-503

Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San

Francisco patients with AIDSHoffman et al, Science 1984; 225(4664):840-842

4 de Mayo de 1984

Determinación de Anticuerpos Específicos

Pruebas Diagnósticas(ELISA, Western Blot)

Antibodies reactive with Human T-Lymphotropic

Retroviruses (HTLV-III) in serum of patients with AIDSSarngadharan et al, Science 1984; 224(4648):506-508

Serological analysis of a subgroup of Human T-

Lymphotropic Retroviruses (HTLV-III) associated with AIDSShupbach et al, Science 1984; 224(4648):503-505

EPIDEMIOLOGÍAInfección por VIH-1

Epidemia del SIDA2016

http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/20170720_Core_epidemiology_slides

Personas Infectadas

36.7 millones[30.8–42.9 millones]

Personas Infectadas con VIH-11990 - 2016

http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/2017_data_book

Adultos y Niños Infectados con VIH-1 (estimación)

Rango de Incertidumbre

Global

Nuevas Infecciones por VIH-11990 - 2016


Nuevas Infecciones por VIH-1 en Adultos y Niños (estimación)


Global

Muertes Asociadas con el VIH-11990 - 2016


Muertes Asociadas al VIH-1 en Adultos y Niños (estimación)


Global

Epidemia del SIDA


2017

Personas Infectadas

Global: 36,7 millones

Latinoamérica: 1,8 millones

Venezuela: 120.000

Nuevas Infecciones

Global: 1,8 millonesLatinoamérica: 97.000

Venezuela: 6.500

MuertesRelacionadas con el VIH-1

Global: 1,0 millón

Latinoamérica: 36.000

Venezuela: 2.500

(30,8 – 42,9 millones)

(1,4 – 2,1 millones)

(110.000-130.000)

(1,6 – 2,1 millones)

(79.000 – 120.000)

(5.800-7.100)

(830.000 – 1,2 millones)

(28.000-45.000)

(2.100-2.900)

Trabajadores Sexuales

Adictos a

Drogas Intravenosas

Contacto

Homosexual Masculino

Transgénero

Parejas Sexuales

De Grupos en Riesgo

Resto de

La Población

Población en Mayor Riesgo de Infección por VIH-1A Nivel Mundial


Excluyendo a África Sub-Sahariana

EL VIRUSInfección por VIH-1

Estructura del VIH-1

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HIV_Virion-en.png

Familia: RetroviridaeSubfamilia: LentivirinaeGénero: Lentivirus

Organización Genética del VIH-1

Emerman M; Current Biology 1996; 6(9):1096-1103

Proteínas Estructurales•Gag: nucleocápside (p7), cápside (p24), matriz (p17)

•Pol: transcriptasa inversa, integrasa, proteasa

•Env: glicoproteínas de envoltura (gp120, gp41)

Proteínas Reguladoras•Tat: trans-activador viral de transcripción

•Rev: regulador de expresión de proteínas virales

Proteínas Accesorias•Nef: factor negativo

•Vif: factor viral de infectividad

•Vpr: proteína viral r

•Vpu: proteína viral u

Proceso de Invasión Viral

Membrana

Célula Blanco

Membrana

Viral

Receptor

CD4

Correceptores

CCR5, CXCR4


Células Susceptibles

• Interacción Virus-Célula Blanco– Molécula Receptora: CD4

– Moléculas Co-receptoras: CCR5, CXCR4

• Células Susceptibles

–Linfocitos T CD4+

–Monocitos/Macrófagos

–Células Dendríticas

Ciclo de Replicación del VIH-1

Barré-Sinoussi F et al.; Nat Rev Microbiol 2013; 11:877–883

CD4

CCR5CXCR4

Variabilidad Genética del VIH-1

Cuasiespecies

Secuencia Consenso

Ciclo de

Replicación

Secuencia Consenso

Ciclo de

Replicación

Secuencia Consenso

Microbio Mol Biol Rev 2012; 76(2):159-216

Microbio Mol Biol Rev 2012; 76(2):159-216

Enorme Reto

• Sistema Inmunitario: Evasión de la respuesta

• Tratamiento Anti-Retroviral: Resistencia

Variante Viral

Predominante(Fitness)

Variabilidad Genética del VIH-1

Cuasiespecies

ASPECTOS CLÍNICOSInfección por VIH-1

Curso Clínico de la Infección por VIH-1

Modificado de: Fauci AS et al.: Harrison: Principios de Medicina Interna, 17ª Edición


Diagnóstico y Seguimiento• Diagnóstico: confirmar la infección por VIH-1

– Detección de Anticuerpos* Específicos

• ELISA (1ra, 2da, 3ra y 4ta Generación): *4ta. también detecta Ag virales (p24)

• Western Blot (Prueba Confirmatoria, hacia el desuso)

• Seguimiento: evaluar la progresión de la infección

– Carga Viral: cantidad de virus en circulación

• PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): cuantificación de ARN Viral

– Subpoblaciones de Linfocitos T: determinación de

Linfocitos T CD4+ y T CD8+

• Citometría de Flujo

– Clínica: evaluación general, signos y síntomas del paciente

ELISADiagnóstico de la Infección por VIH-1


http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf

Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1

ARN de VIH-1 Anticuerpos

anti-VIH-1

Díasde Infección

Infección Aguda Infección Crónica

Ventana de

Seroconversión

Período de

Eclipse

Diagnóstico de Infección por VIH-1

ELISA de 1ra. Generación


Sensibilidad Limitada

Proteínas Celulares Contaminantes

Reactividad Cruzada

Fase de

Captura

Ag de VIH-1Lisado Viral

(Cultivo Celular)

Marcador

Identificado

IgG anti-VIH-1Anticuerpos en

Sangre del Paciente

Fase de

Detección

Anti-IgGConjugados a

Enzima

Revelado

Reacción de ColorSustrato Apropiado


anti-VIH-1

Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


anti-VIH-1

Díasde Infección


Ventana de

Seroconversión

Período de

Eclipse

IgG anti-VIH-1ELISA 1G

Diagnóstico de la Infección por VIH-1



ELISA de 2da. Generación


Fase de

Captura

Ag de VIH-1/VIH-2Péptidos Sintéticos

Proteínas Recombinantes

Marcador

Identificado

IgG anti-VIH-1/VIH-2Anticuerpos en

Sangre del Paciente

Fase de

Detección

Anti-IgG

Proteína AConjugados a

Enzima

Revelado


VIH-1, VIH-2

Mejora Sensibilidad

No Proteínas Celulares Contaminantes

Mejora Especificidad


anti-VIH-1

Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


anti-VIH-1

Díasde Infección


Ventana de

Seroconversión

Período de

Eclipse


IgG anti-VIH-1 / VIH-2

ELISA 2G




ELISA de 3ra. Generación


Fase de

Captura



Marcador

Identificado

IgM e IgG

anti-VIH-1/VIH-2Anticuerpos en

Sangre del Paciente

Fase de

Detección

Ag ViralesConjugados a

Enzima

Revelado


VIH-1, VIH-2

Detecta IgM e IgG

Detección más Temprana


anti-VIH-1

Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


anti-VIH-1

Díasde Infección


Ventana de

Seroconversión

Período de

Eclipse


IgG anti-VIH-1 / VIH-2

ELISA 2G

IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2

ELISA 3G




ELISA de 4ta. Generación


Revelado


Fase de

Captura

Anti-p24



Marcador

Identificado

Ag p24

IgM e IgGanti-VIH-1/VIH-2

Ac y Ag enSangre del Paciente

VIH-1, VIH-2

Detecta Antígeno Viral (p24)

Detecta IgM e IgG

Detección más Temprana

Fase de

Detección

Anti-p24

Ag ViralesConjugados a Enzima

E


anti-VIH-1

Infecciónpor VIH-1

p24 de VIH-1


anti-VIH-1

Díasde Infección


Ventana de

Seroconversión

Período de

Eclipse

Acs: IgG anti-VIH-1ELISA 1G

Acs: IgG anti-VIH-1 / VIH-2ELISA 2G

Acs: IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2ELISA 3G

Acs: IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2; Ags: p24ELISA 4GCarga Viral

PCR


http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdfNeonatos

de madres infectadas

WESTERN BLOTDiagnóstico de la Infección por VIH-1

http://images.slideplayer.es/1/121053/slides/slide_53.jpg


Algoritmo Recomendado – CDC 2014


CARGA VIRALSeguimiento de la Infección por VIH-1

• Cuantificación del virus presente (Copias de ARN de VIH-1)

– PCR Cuantitativo (<2 x 102 – 1 x 106)

• Más sensible para bajos valores de Carga viral

• Requiere 200 ul de muestra

– ADN de Cadena Ramificada (<5 x 102 – 1 x 106)

• Más preciso para altos valores de Carga Viral

• Requiere 2 ul de muestra

– NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (<4 x 103 – 1 x 106)

• Interpretación Clínica– Tomar en cuenta el tipo de ensayo utilizado

– Diferencias inter-ensayo de hasta 0,5 Log

Seguimiento de la Infección por VIH-1

Determinación de la Carga Viral

SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS T CITOMETRÍA DE FLUJO

Seguimiento de la Infección por VIH-1

FSC

m

Población de LeucocitosSangre Periférica

Granulocitos

Linfocitos

MonocitosMonocito

Laser(Fuente de

Luz)

SSC

FSC

Citometría de Flujo

http://www.bdbiosciences.comDreamstime.com

Análisis de DatosSelección de Regiones

Histograma

CD3Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log)

Análisis de DatosIntensidad de Fluorescencia

72%

Células Positivas para FL-1 (CD3)

Linfocitos T

Análisis de DatosIntensidad de Fluorescencia

Gráficos de Dos Parámetros

CD4 Vs. CD3

CD8 Vs. CD3

Subpoblaciones de Linfocitos T

Porcentaje (%)

Recuento (Cél./µL)

Valores de Referencia

Leucocitos 7.400 4.100 – 10.900

Linfocitos Totales 25 1.850 2.200 – 4.200

Linfocitos T Totales 72 1.332 1.500 – 3.000

Linfocitos T CD4+ 12 222 800 – 1.900

Linfocitos T CD8+ 57 1.055 500 – 1.000

Relación CD4/CD8 0.21 1.5 – 2.4

INMUNOPATOGÉNESISInfección por VIH-1

Cómo el Virus Causa la Inmunodeficiencia

VIH-1 afecta al Linfocito T

Activación CelularHLA-DR, CD38

Señales de SupervivenciaIL-7Rα

Virgen / MemoriaCD45RA / CD45RO

Funciones EfectorasPerforina

Coestimulación NegativaPD-1

ApoptosisCD95Proliferación Celular

Producción de CitoquinasIFN-, IL-2

Linfocitos TFuncionalidad

• Destrucción de Células por Efectos Citopáticos• Destrucción Masiva de Linfocitos T CD4+ en Mucosas (CCR5+, Memoria Efectora)

• Disminución de la Vida Media de Linfocitos T (Turnover)

• Menor Producción de Linfocitos T (Timo, M.O., Ganglios)

• Aumento de Apoptosis (CD95)

• Menos Receptores de Supervivencia (IL-7, IL-7Rα)

• Aumento de Co-estimulación Negativa (PD-1)

• Activación Crónica (CD38, HLA-DR)

• Estimulación Antigénica Persistente• Daño a la mucosa intestinal – LPS Bacteriano

• Proteínas Virales (gp120, gp41)

• Agotamiento Funcional / Desacoplamiento Linf. T CD4 / T CD8

Inmunopatología de la Infección por VIH-1

Diferentes Respuestas a Infecciones Virales

Boasso & Shearer; Clin Immunol 2008; 126(3): 235–242

Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T en pacientesinfectados con el VIH-1

Producción de Citoquinas in vitro


Diseño Experimental

• Población Estudiada

– Grupo Control (C): individuos no infectados con VIH-1, asintomáticos (n=14)

– Pacientes: infectados con VIH-1, sin tratamiento anti-retroviral

• PA: Recuento de Linfocitos T CD4+ >350/μL (n=13)

• PB/C: Recuento de Linfocitos T CD4+ <350/μL (n=19)

• Muestra: Células Mononucleares de Sangre Periférica

• Condiciones de Cultivo: 72 horas

– Medio: Condiciones basales, sin estimulación

– PHA (Fitohemaglutinina): estimulación policlonal

– Env (gp41): estimulación específica con antígeno viral

• Determinaciones: IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ

Producción de IL-6(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

ncen

tració

n d

e IL

-6 (

pg

/ml)

0

1500

3000

4500

6000

7500

C (VIH-) (n=14)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n= 13)

PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=19)

PHA EnvMedioCondiciones de Cultivo

(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

IL-6Citoquina Pro-Inflamatoria

Producción de TNF-(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

ncen

tració

n d

e T

NF

- (p

g/m

l)

0

10

20

500

1000

1500

2000

2500

C (VIH-) (n=12)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=9)

PB/C (VIH+; CS4<350/uL) (n=17)


(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

TNF-αCitoquina Pro-Inflamatoria

Producción de IFN-(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

ncen

tració

n d

e IF

N-

(pg

/ml)

0

100

200

300

400

500

10000

20000

30000

40000

50000

60000

C (VIH-) (n=12)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=11)

PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=17)


(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

: vs. PA

IFN-γRespuesta Citotóxica Antiviral

Producción de IL-10(CMSP Cultivadas por 72 Horas)

Co

ncen

tració

n d

e IL

-10

(p

g/m

l)

0

25

50

75

100

125

500

1000

1500

2000C (VIH-) (n=10)

PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=10)

PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=17)


(Estímulos)

p<0.05:

: vs. Medio

: vs. C

: vs. PA

IL-10Citoquina Inmunomoduladora

Estimulación Policlonal

Pacientes tienen capacidad de ProducirIL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ

¿Es posible recuperar la Respuesta Antiviral?

Producción Espontánea

TNF-α: Efecto Pro-Inflamatorio¿Activación Crónica?

IL-10 : Efecto Inmunomodulador

¿Inhibición de la Respuesta Antiviral?

Estimulación Específica

TNF-α, IL-6 e IL-10: Efectos Antagónicos

IFN-γ: No hay producción

Respuesta Antiviral Comprometida la Respuesta Antiviral

Producción de Citoquinas

Conclusiones


Una compleja combinación de citoquinas en larespuesta anti-VIH-1 en pacientes puede asociarse a:

– Un ambiente pro-inflamatorio que podría relacionarse conel estado de activación crónico del sistema inmunitarioobservado en pacientes

– Una respuesta antiviral no eficiente para controlar laprogresión de la infección

– Es relevante que los pacientes mantienen la capacidadfuncional de producción de citoquinas, lo cual abre laposibilidad de intervención terapéutica para generar unarespuesta anti-VIH-1 efectiva

• Laboratorio de Inmunofisiología Celular - Escuela “JM Vargas”, UCV

– Dr. Miguel Alfonzo (Investigador Principal, Director de la Tesis)

– Miembros del Laboratorio:

• Laboratorio de Fisiopatología – IVIC

– Dra. Mercedes Fernández (Tutora de la Tesis)

• Servicio de Infectología - Hospital “José Ignacio Baldó”, El Algodonal

– Dra. Yhajaira Roldán: pacientes referidos

• Servicio de Inmunología - Instituto de Medicina Tropical, UCV

– Dra. Belkisyolé Alarcón de Noya: pacientes referidos

• Laboratorio Clinifar – Escuela “JM Vargas”, UCV

– Dra. Mélida Bermúdez: citómetro de flujo

•Gustavo Rico•Ydelys Fuentes•José Abelardo Carrero•Wolfgang Vivas•Eduardo Navarro

•Alexandra Díaz•Josibel Camacho•Riward Campelo•Alexandra Díaz

Reconocimientos

cátedra de inmunología inmunopatología de la infección por ... · organización genética del...

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