infezioni da hpv: prime esperienze nel campo della

Infezioni da HPV:

prime esperienze nel campo della

Biologia Molecolare

Taranto, 3 Novembre 2004

Dott.ssa Rosa Tripaldi

Dr.ssa Rosa Tripaldi 2

HPV

Dr.ssa Rosa Tripaldi 3

Papovaviridae

• 2 Genera:

– Papillomaviruses:

• Human, Rabbit, Bovine, Canine, Equine

– Polyomaviruses:

• Mice, BK & JC viruses (man), RK virus (rabbit), SV40

(monkey)

• ds DNA, 45nm, non-enveloped, icosahedral

• Cyclic, infectious when separated from capsid

Human Papillomavirus (HPV)

General:

• Ether-resistant, acid & heat stable

• Circular dsDNA ~8kb, non-enveloped

• Icosahedral,72 capsomeres, 55nm diameter

• Surface Antigen

• Over 100 genotypes*, High & Low Risk strains

• Causes warts; transforms cells

• Polycistronic, 8 ORF

• Genome: 3 Regions

• Replicates in Nucleus

• Plasmid-like state

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Incidenza e distribuzione dei tumori da HPV

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Il primo tumore solido che è stato

riconosciuto essere di origine virale è

il carcinoma della cervice …

e l’ HPV ne è l’agente causale

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Ruolo dell’HPV nel tumore cervicale“ A partire dalla seconda metà degli anni ‘90 numerosi studi hanno dimostrato che il Papilloma Virus Umano (HPV) è presente nella quasi totalità dei tumori cervicali

“ La persistenza di alcuni tipi virali aumenta la probabilità di sviluppo di un tumore cervicale

“ Attualmente sono stati identificati 200 tipi di HPV, di cui 85 genotipi ben caratterizzati

“I genotipi HPV coinvolti nelle infezioni genitali sono circa una trentina, distinti in basso e alto rischio oncogeno

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La prevalenza dell’HPV nei Carcinomi

della cervice è praticamente totale: 99.8%

Una relazione più forte di quella

tra tabacco e CA polmonare

tra epatite B e CA epatico

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A livello mondiale il carcinoma cervicale è la prima causa di morte per tumore nella popolazione femminile:

470 mila nuovi casi/233 mila decessi all’anno

In Europa è la seconda, dopo il tumore al polmone:

65 mila nuovi casi/28 mila decessi all’anno

Struttura del virus

3 Regioni:LLR=Long Regulatory Region (non coding)E=Early Region (encodes proteins)L=Late Region (encodes capsid proteins)

HPV: virus a dsDNA circolare di circa 8000 bp con capside proteico

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HPV: Life Cycle

Copyright © 1999 Academic Press

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HPV Genome: Proteins

• E1: Initiation of DNA replication (helicase)

• E2: Transcriptional regulation/DNA replication

• E4: Late NS protein; Disrupts cytoskeleton

• E5: Transforming protein, interacts with growth

factor receptors, e.g. PDGF

• E6: Transforming protein, binds to p53 leading to

degradation

• E7: Transforming protein, binds to pRB

• L1: Major capsid protein (capsomeres)

• L2: Minor capsid protein

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La persistenza dell’infezione da HPV

è condizione necessaria allo sviluppo

del cervicocarcinoma

Progressione a Carcinoma indotta da HPV“ L’HPV è responsabile della alterata regolazione del ciclo cellulare

che conduce alla trasformazione maligna “ La presenza persistente di HPV è condizione essenziale……anche se da sola non basta allo sviluppo del Carcinoma cervicale

HPV

infezione

HPV

infezione

persistente

Alterata

regolazione

cellulare

CIN

“High grade

Carcinoma

Invasivo

Fattori

Immunologici Co-carcinogeni

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Progressione della malattia: dall’infezione HPV a Cervicocarcinoma : > 10 anni

Infezione

Clearance

Progressione

Regressione

Invasione

Cervice

con

Infezione

HPV

6-13 anni

Persistenza

(oltre 1 anno)

Cervice

normaleCancro

Anormalità citologiche

moderate

Risoluzione spontanea

nell’ 80 % delle infezioni

Lesione

precancerosa

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“Lo sviluppo del tumore cervicale è preceduto dalla comparsa di lesioni pre-cancerose che impiegano molti anni ad evolvere in carcinoma invasivo

“poiché sono lesioni asintomatiche possono essere rilevate solo grazie a programmi di screening

“se rilevate per tempo possono essere eliminate con intervento ambulatoriale di efficacia quasi del 100%

UN CORRETTO PROGRAMMA DI SCREENING POTREBBE ELIMINARE COMPLETAMENTE IL TUMORE CERVICALE

Terminologia“ CIN: cervical intraepithelial neoplasia, di grado I, II o III stabilito in seguito a prelievo bioptico ed esame istologico

“ ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance; è la forma più lieve di anomalia citologica

“ LSIL: low-grade squamous intraepithelial lesion (CIN I nel vecchio sistema di classificazione) di solito a regressione spontanea

“ HSIL: high-grade squamous intraepithelial lesion; è l’anomalia non cancerosa più grave e richiede trattamento immediato

“ Displasia: anomalie nella divisione cellulare o nella morfologia

“ Carcinoma in situ: forma di HSIL refertata al Pap test come tumore cervicale

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Prevalenza di HPV

010

20

30

40

5060

70

80

90

100

Normal ASCUS Low-CIN High-CIN InvasiveCancer

11.2%

55.0%

88.8%

72.9%

>95%

HPV HPV

DNADNA

%%

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Contatto con HPV: quasi sempre regressione spontanea

La persistenza di HPV ‚high risk‛ può condurre a stati pre-cancerosi (CIN)

La presenza di HPV e CIN3 è condizione necessaria per l’accumulo di mutazioni random che possono portare allo sviluppo del tumore cervicale

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Sensibilità relativa delle tecniche di analisi

degli acidi nucleici

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PCR

1984 Kary Mullis at Cetus

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Tipologia di campione

• Materiale istologico

sezioni tagliate al microtomo di materiale fissato

ed incluso

• Materiale cellulare a fresco prelevato in

sede cervico-vaginale

sospensione di cellule prelevate mediante

Bactopick o Cytobrush dall’eso-endocervice,

fornici e vagina

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Percorso diagnostico

HPV DNA screening

Se positivo

HPV Genotipizzazione

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Fasi del processo analitico

HPV DNA screening

• Estrazione

• Amplificazione

• Rilevazione

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Estrazione

• In generale l’acido nucleico è liberato dalla cellula per digestione con proteinasi K, lisi con agenti caotropici, lisi osmotica a caldo o lisi alcalina a caldo.

• A questa prima fase può seguire una purificazione con solventi organici, resine, matrici di silice, precipitazione in alcoli.

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Amplificazione

.

• Viene utilizzata una

sequenza della

regione L1, comune a

circa 40 tipi di HPV,

compresi tutti quelli

d’interesse clinico.

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HPV Genome

8 ORF

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Rivelazione

• La rivelazione degli

amplificati è condotta

mediante elettroforesi

in gel di agarosio, in

tampone TBE 1x,

colorato con bromuro

di etidio

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standard interno 600 bp

Frammento

specifico 450 bp

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HPV GENOTIPIZZAZIONE

• Sui casi positivi si esegue la tipizzazione:

alto rischio (16,18,31,33,35,45,52,58)

basso rischio (6,11)

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Strategie di tipizzazione dell’HPV

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HPV – Genotipizzazione

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HPV ” Genotipizzazione

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1. Organizzazione di

Laboratorio e strumentazione

necessaria

2. Aspetti pre-analitici

3. Fattori interferenti con le procedure

analitiche

4. Il Sistema di Garanzia di

Qualità Totale

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Preparazione del campione

Preparazione del reagente e conservazione

Pre-amplificazione reazione iniziale

Amplificazione

Conservazione del kit

Analisi del prodotto della PCR

Stoccaggio concentrato di controlli positivi

conservati

Area priva del prodotto PCR

Area contenente il prodotto PCR

Ricevimento e accettazione del campione

Flusso di lavoro unidirezionale

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Abbinamento dello screening con Pap test e conferma con HPV

Citologia cervicale di routine: Pap test

Positivo Negativo

ASC-US: diagnosi citologica

Eseguire Colposcopia

Eseguire Colposcopia citologia cervicaledi screening

citologia cervicale

di screening

* Source: ACCSP Guidelines – JAMA

Risultati Pap Anomali,ASC-USe HPV

positivo

Risultati NormaliPap test

ASC-US Pape HPV

negativo

Ripetere il Pap Test entro 6 mesi

HPV DNA test sui campioni cellulari

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Linee guida dell’ESIDOG (European Society for Infectious and Immunological Diseases in Obstetrics and Gynaecology)

L’impiego di test HPV è stato valutato per le seguenti categorie:

“donne > 30 anni: screening primario del tumore cervicale in combinazione con l’esame citologico

“ pazienti con referti citologici indefiniti (ASC-US)

“ pazienti con stadi precancerosi lievi e moderati (LSIL, HSIL) per prevederne la regressione, la persistenza o la progressione

“ pazienti già sottoposte a trattamento per CIN (displasia) e carcinoma cervicale

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Attuale utilizzo clinico accettato del test HPV DNA :

“ Conferma dei casi ASCUS ( TRIAGE )“ Follow up dei casi CIN 2, 3 per predire la regressione ”

progressione“ Dopo trattamento per displasia per predire la possibilità di recidive