คูมือการตรวจวินิจฉัย Botulinum toxin ในตัวอยางผูปวย

ฝายแบคทีเรียไรอากาศ สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข

กรมวิทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสุข

คูมือการตรวจวินิจฉัย Botulinum toxin ในตัวอยางผูปวย ฝายแบคทีเรียไรอากาศ สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข กรมวิทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสุข พ.ศ. 2549

คํานํา

คูมือการตรวจวินิจฉยั Botulinum toxin ในตัวอยางผูปวย จัดทําขึ้นโดย สถาบันวิจัยวทิยาศาสตรสาธารณสุข กรมวิทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสุข เพื่อเปนแนวทางความรูใหกบั นักระบาดวิทยา แพทย และ นักวิทยาศาสตรการแพทย ที่ปฏิบัติงานในหองปฏิบัติการ ทราบถึง คุณสมบัติทั่วไปของเชื้อ C. botulinum การเก็บตัวอยางผูปวย วิธีการเก็บตวัอยาง และ นําสงตัวอยางใหกับหองปฏิบัตกิาร ไดอยางถูกตอง อีกทั้งวิธีการทดสอบหา C. botulinum toxin ในตวัอยางผูปวยชนดิตาง ๆ และ อาหาร โดยวิธี ตาง ๆ เชน การตรวจหา Toxin โดย Mouse bioassay DIG ELISA การตรวจหายีนส C. botulinum โดยวิธี Multiplex PCR

ซ่ึงคณะผูจัดทาํหวังวาคูมือฉบับนี้จะมีประโยชน ตอผูทีส่นใจ และ ผูที่ปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา นักระบาดวทิยา สามารถเขาใจ และ นําไปปฏิบัติไดอยางถูกตอง

สถาบันวิจัยวทิยาศาสตรสาธารณสุข กรมวิทยาศาสตรการแพทย พ.ศ. 2549

สารบัญ คุณสมบัติท่ัวไปของเชื้อ C. botulinum 1 การกอใหเกิดโรคในคน 1

- ชนิดของ Botulism 2 - อาการของโรค 3 - การปองกันโรค 4

ลักษณะเชื้อ C. botulinum บนอาหารเลี้ยงเชื้อ 4 คุณสมบัติทางชีวเคมีของ C. botulinum 6 การเก็บตัวอยางสงตรวจหา C. botulinum 7 วิธีท่ีทําการการตรวจสอบหา C. botulinum 9 ระยะเวลาการรายงานผลการตรวจวินิจฉัย C. botulinum 10 ความปลอดภยัท่ีควรระวังในการปฏิบตังิาน 11 การทําลายฆาเชื้อ C. botulinum และ Toxin 12 การตรวจหาเชื้อ C. botulinum จากตัวอยาง

- ตัวอยางอาหาร 13 - ตัวอยางอุจจาระ 16 - ตัวอยางSerum 18 - ตัวอยางVomitus หรือ Gastric Content 18 - ตัวอยางจากสิง่แวดลอม 18

Mouse Bioassay Protocol ตรวจหา Toxin C. botulinum 20 การตรวจหา Toxin ของ C. botulinum จากตัวอยางโดยใช Mouse Bioassay

- ตัวอยาง Serum 21 - ตัวอยาง Food / Stool / Gastric Content 22

การตรวจหา Neurotoxin ของ C. botulinum โดยวธิี Digoxigenin-label IgGs 24 ELISA (DIG-ELISA) kit ของ CDC-Atlanta การตรวจหายนีส ของ C. botulinum Type A,B โดยวธีิ Mutiplex PCR 28

เอกสารอางอิง 31 ภาคผนวก - อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใชในการตรวจวินจิฉัย Clostridium botulinum 32 - รายช่ือคณะทํางาน 36

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum เปนแบคทีเรียที่ไมตองการออกซิเจน (anaerobe) พบไดในดินและน้ําสิ่งแวดลอมทัว่ไป ยอมติดสีแกรมบวก มีรูปรางเปนทอน สรางสปอรที่สวน Subterminal (รูปที่3) สปอรสามารถทนตอความรอนทําใหสปอรยังคงหลงเหลืออยูในกระบวนการทีใ่หความรอนไมเหมาะสม คือไมมีออกซิเจนและอณุหภมูิที่เหมาะสมสปอรจะงอกเจริญเตบิโตเปน Vegetative cell และมีการสรางสารพิษขึ้น อาการปวยทีเ่กิดจากการบริโภคอาหารที่มีสารพิษปะปนเรียกวา Botulism Botulism เปนโรคในระบบ neuromuscular สารพิษเขาสูรางกายโดยไดรับสารพษิ หรือ อาจเปนการติดเชื้อแบคทีเรียชนิดนีใ้นรางกายแลวมีการสรางสารพิษขึ้น เปนโรคที่พบไดไมบอยสามารถปองกันได แตมีความสําคัญเพราะมีอันตรายถึงชีวิตเพยีงไดรับสารพษิขนาด 0.5 mcg. เทานั้น การกอใหเกดิโรคในคน Botulinum Toxin เปน heat labile toxin โดยการถูกทําใหหมดฤทธิ์ไดที่อุณหภมู ิ800c 30 นาที หรือ 1000c 10 นาที มีโครงสรางเปน dichain ขนาด 150 KDa ซ่ึงประกอบไปดวย heavy chain ขนาด 100 KDa และ light chain ขนาด 50 KDa เมื่อสรางระยะแรกเปน protoxin ซ่ึงตองอาศัยเอ็นไซม protease เชน Trypsin ในกระเพาะอาหารเพื่อแบง toxin เปน 2 chain เชื่อมกันดวย non-covalent bonds Botulinum Toxin จะถูกดูดซึมจากทางเดนิอาหารเขาสูกระแสโลหิตสงไปยังสวนตาง ๆ ของรางกาย เมื่อพบกับบริเวณที่จําเพาะซึ่ง Botulinum Toxin จะมีความจําเพาะตอปลายประสาทสวนปลาย ซ่ึงเปนจุดเชื่อมตอระหวางเสนประสาทและกลามเนื้อ กลไกการเกิดโรคคือ Toxin จะจับกับ Presynaptics Receptors ของเซลลประสาทซึ่ง Receptors จะแตกตางกันไปเล็กนอยตามชนิดของ Toxin

Botulinum Toxin จะเขาสูเซลลประสาทโดยวิธี Endocytosis เมื่อเขาไปแลว Toxin จะไปยับยั้งขบวนการปลอย AcetylCholine ของเซลลประสาท(รูปที่ 1)ซ่ึงทําใหระบบประสาทไมสามารถปลอยสารสื่อประสาท(Neurotransmitter) กอใหเกดิการหยุดการทํางานของ Motor Neuron system ทําใหเสียหนาที่ของระบบประสาทอัตโนมัติทําใหเกดิการเปนอัมพาตแบบออนแรง ซ่ึงแตกตางจากการเปนอัมพาตจากโรคบาดทะยักซึ่งเปนอัมพาตแบบ

1

แข็งเกร็ง การจับของ toxin เปนการจับ แบบถาวร ดังนั้นการฟนตวัจาก Botulism จึงเกิดไดโดยการงอกใหมของปลายประสาทบริเวณ neuromuscular junction ซ่ึงใชเวลานานมาก

Botulinum toxin แบงออกเปน 8 antigenic type (A,B,C1, C2,D,E,F และ G) type

ที่กอโรคในคนไดแก type A,B,E และ F ชนิด C และ D มักกอโรคในสัตวปก ววั ควาย และ ปลาบางชนิด C. botulinum ที่กอโรคในคน แบงออกเปน

1) Proteolytic strain ประกอบดวย type A,B และ F แบคทีเรียกลุมนี้ยอยอาหารได ทําใหอาหารมลัีกษณะถูกปนเปอน

2) Non-proteolytic strain ประกอบดวย type B,E,และ F แบคทีเรียกลุมนี้ไมทําใหอาหารมีลักษณะเปลีย่นแปลง

Botulinum แบงเปน 4 แบบคือ

Food-borne botulism สาเหตุมาจากการรับประทานอาหารที่มีการปนเปอน neurotoxin ของเชื้อ C. botulinum เขาไปในรางกาย ระยะฟกตัวของเชื้อ อยูในชวง 12-36 ชม. อาหารที่เชื้อไปเจริญเติบโตมักเปนอาหารที่ถูกเก็บในสภาพ anaerobic เชน อาหารอัดกระปองโดยอาหารเหลานีม้ักไมผานการกําจัด spore อยางเพียงพอ ตัวอยางอาหารไดแก เนื้อสัตว ไสกรอก เห็ด asparagus และผักตางๆ สภาพที่แบคทีเรียเจรญิเติบโตไดดีไดแก อุณหภูมิ 4-100C มี pH 4.6-7.0 และมี organic acid alanine หรือ cysteine

2

รูปที่ 1. การเขาสูเซลลประสาทของ Botulinum toxin

Infant botulism เปนภาวะที่เกดิในเด็กอายุนอยกวา 1 ป โดยการที่ spore ของ C. botulinum เจริญในทางเดนิอาหารและสราง toxin แลวถูกดูดซึมจนเกดิอาการ Wound botulism เปนภาวะที่ spore ของ C. botulinum ปนเปอนเขาทางบาดแผล สูรางกายจนสราง toxin เขาสูกระแสโลหติ Undeterminated classification เปนกลุมที่เกิดในคนที่มีอายุมากกวา 1 ป ไมสามารถคนพบอาการที่เปนสาเหตุของโรคได

อาการของโรค

ผูที่บริโภคอาหารที่มีสารพิษของ Clostridium botulinum เขาไปพบวาอาการจะเกิดขึน้ภายใน 12-36 ชม. หลังการบริโภค และอาจเสียชีวิตภายใน 1-6 วัน อาการสารพิษแตละ type พบวาคลายคลึงกันคือจะมีอาการ คล่ืนไส อาเจียน หนามืด ระบบยอยอาหารผิดปกต ิปวดทอง อาจมีอาการทองเสียเกิดขึ้น หลังจากนั้นจะพบวามีอาการอิดโรย มึนงง กระหายน้ํา มคีวามรูสึกแหงที่ปาก มีเสมหะมากในคอ สําหรับในรายที่รุนแรง มีอาการระบบประสาทดวย เชน มองเห็นไมชัด มองเห็นภาพซอน กลามเนื้อตาเปนอัมพาต ลืมตาไมขึ้น ตากระตุกตลอดเวลา กลืนอาหารลําบาก พูดตะกุกตะกัก หายใจขัด ระบบหายใจขดัของ และเสียชีวิตในที่สุด โรคนี้พบวามีอัตราการตายสูงประมาณ 60 เปอรเซ็นต สําหรับในรายทีไ่มเสียชีวิตนั้นพบวาตองใชเวลาในการรักษาเปนเวลาหลายเดือน

รูปท่ี 2 อาหารที่มักมีการปนเปอน C. botulinum

3

3

การปองกันโรค 1. การถนอมอาหารอยางถูกตองทําใหอาการเปนกรดทีม่ี pH<4.5 หรือใหความรอนสูงและนานเพยีงพอเพื่อทําลาย toxin และการแชแข็งเพื่อถนอมอาหารเปนเวลานาน 2. ถาอาหารมีลักษณะผิดปกติเชน กระปอง หรือเสียหาย หรือมีรสผิดปกติอาจมี fermentation เปนความเสี่ยงตอการนําโรค อยางไรก็ตาม botulism สามารถสราง toxin ไดแมอาหารและกระปองยังดปูกตินอกจากนี้ type E ยังไมทําใหอาหารมีรสผิดปกติเลย

3. บริโภคอาหารกระปองทีผ่านความรอนเพียงพอทีจ่ะทาํลาย toxin ทุกคร้ัง

ลักษณะเชื้อ C. botulinum บนอาหารเลี้ยงเชื้อ

นําตัวอยางเชื้อที่สงตรวจมาทาํการเพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดแข็ง Sheep Blood agar และ Egg Yolk Agar นําไปเขาตูอบที่ 35-37oC ในสภาพวะ ไรออกซิเจน (Anaerobic Condition) นานประมาณ 48 ชม. ตองพิสูจนวาเชื้อสามารถเจริญเติบโตไดเฉพาะในภาวะไรออกซิเจน ไมเจริญในภาวะอากาศปกติ และ เชื้อที่ขึ้นบน Sheep Blood Agar มีลักษณะสีเทาขาว ผิวมนัหรือดาน ให Beta-hemolysis สวน โคโลนีบน Egg yolk Agar มีลักษณะ ผิวดาน มีความมันวาวสะทอนแสง มีสีเหลือบคลายรุงหรือไขมุก ซ่ึงหมายถึงใหผลบวกตอ Lipase แตไมมีขอบขุนขาวรอบ ๆ โคโลนี(Opaque zone) แสดงวาใหผลลบตอ Lecithinase ดังแสดงในรูป 4-7 จากนั้นนําไปทดสอบปฏิกริยาทางชีวเคม ี ซ่ึงตองมีการทดสอบปฏิกริยาของน้ําตาล และสารอื่น ๆ ตามตารางที่ 1.

4

รูปท่ี 3 ลักษณะของเซลล C. botulinum Gram positive rod oval subterminal spore

รูปท่ี 4 ลักษณะโคโลนี C. botulinum บน Wilkins Charlgen Sheep Blood agar

รูปท่ี 5 ลักษณะโคโลนี C. botulinum(Type A) บน Egg yolk agar ให Lipase Positive

รูปท่ี 7 ลักษณะโคโลนี C, botulinum (Type F) บน Egg yolk agar ให Lipase Positive

รูปท่ี 6 ลักษณะโคโลนี C, botulinum (Type B) บน Egg yolk agar ให Lipase Positive

รูปท่ี 8 PCR C. botulinum Type A band size 782 bp

5

ตารางที่ 1 คุณสมบัติทางชีวเคมีของเชื้อ C. botulinum รายการทดสอบ C. botulinum

Type A,B,F (Proteolytic)

C. botulinum Type B,E,F

(Non-Proteolytic)

C. botulinum Type C,D

C. botulinum Type G

Arabinose - w - - Esculin Hydrolysis

+ -+ - -

Fructose -w aw -a - Glucose -w aw a - Lactose - - - - Maltose -w aw v - Mannitol - -w - - Mannose - a w - Starch pH - v -w - Starch Hydrolysis

- +- - -

Sucrose - aw - - Xylose - -w - - + = Positive reaction for 90-100 % of strains - = Negative reaction for 90-100 % of strain +-= Most strains positive, some strains negative -+= Most strains negative, some strains positive v = variable -w= Most strains negative, some strains weak a = Strong Acid (pH < 5.5) for 90-100 % of strain -a= Most strains negative, some strains acid w= Weak Acid (pH 5.5-6.0) for 90-100 % of strain aw= Most strains acid, some strains weak

6

ตารางที่ 1 คุณสมบัติทางชีวเคมีของเชื้อ C. botulinum (ตอ) รายการทดสอบ C. botulinum

Type A,B,F (Proteolytic)

C. botulinum Type B,E,F

(Non-Proteolytic)

C. botulinum Type C,D

C. botulinum Type G

Gelatin Hydrolysis

+ + + +

Milk Digest Curd Digestc Digestc Indol - - -+ - Nitrate - - - - Catalase - - - - Lecithinase - - - - Lipase + + + + Motility + + + - + = Positive reaction for 90-100 % of strains - = Negative reaction for 90-100 % of strain +-= Most strains positive, some strains negative -+= Most strains negative, some strains positive

การเก็บตัวอยางสงตรวจหา Clostridium botulinum Serum

ควรเก็บอยางนอย 5-10 ml. กอนทําการให antitoxin ใสใน Sterile tube นําสงในหองปฏิบัตกิารเร็วที่สุด หลังจากทําการเก็บแลวไมควรเก็บแชแข็ง (Frozen) นําสงโดยใสภาชนะที่มีความเย็น 4-8 oC

Feces ควรเก็บอยางนอย 25-50 กรัม กอนทําการให antitoxin ใสในภาชนะที่สะอาด ไมตองใช transport medium นําสงหองปฏิบัติการใหเร็วที่สุด นําสงโดยใสภาชนะที่มีความเย็น 4-8 oC

7

Vomitus เก็บใสภาชนะที่ปดสะอาด กอนทําการให antitoxin นาํสงหองปฏิบัติการใหเร็วที่สุด โดยใสภาชนะที่มีความเยน็ 4-8 oC

Gastric contents เก็บใสภาชนะที่ปดสะอาด กอนทําการให antitoxin นาํสงหองปฏิบัติการใหเร็วที่สุด โดยใสภาชนะที่มีความเยน็ 4-8 oC

Suspected food ควรสงตรวจอาหารพรอมภาชนะที่บรรจุอาหารนั้นถาเปนไปได แตถาทําไมไดใหเก็บตวัอยางอาหารใสภาชนะที่ปราศจากเชื้อ ปริมาณอยางนอย 200-300 กรัม นําสงใหหองปฏิบตัิการที่อุณหภมูิหอง

Wound ควรเก็บตวัอยางจากแผลบริเวณลึก ทําดวยความรวดเร็ว ใสใน transport medium สําหรับตรวจหาเชือ้ anaerobe เชน Wilkins broth ปดฝาจุกเกลียวใหแนน รีบนําสงหองปฏิบัติการทันที ไมตองแชเย็น

ในกรณีสงเชื้อบริสุทธิ์ที่ทําการแยกไดแลวสงสัยวาเปนเชือ้ Clostridium botulinum ตองการสงเพื่อตรวจสอบยืนยันและทดสอบ Type ของ สารพิษ ใหนําเชื้อเล้ียงใน Cooked meat medium ปดจุกเกลียวแนน อาจปดทับผิวหนาดวย Sterile Parafin นําสง กรมวิทยาศาสตรการแพทย โดยไมตองแชเย็น

หมายเหตุ - ติดตอสอบถามเพิ่มเติมที่ฝายแบคทีเรียไรอากาศ สวส.

เบอรโทรศัพท 02-5899850 – 7 ตอ 99403 - ตอตอสงตัวอยางตรวจ ไดที่ งานรับตัวอยาง สวส.

เบอรโทรศัพท 02-5899850 – 7 ตอ 99248

8

วิธีท่ีทําการตรวจสอบหา Clostridium botulinum Serum ตรวจหา toxin โดยวิธี Mouse bioassay โดยหา toxigenicity และ specific neutralization กับ antitoxin

Feces / Vomitus / Gastric contens / Wound Directly test โดยวิธี Mouse bioassay หา Toxigenicity Culture และ biochemical test Multiplex PCR จากตัวเชื้อ (pure culture) Mouse bioassay จากตัวเชื้อ (pure culture) หา Specific neutralization กับ Antitoxin

Suspected food

Directly test โดยวิธี Mouse bioassay Directly test หา toxin ใช DIG-ELISA kits (kit from CDC-Atlanta) Culture และ biochemical test Multiplex PCR จากตัวเชื้อ (pure culture)

Mouse bioassay จากตัวเชื้อ (pure culture) หา Specific neutralization กับ Antitoxin

9

ระยะเวลาการรายงานผลการตรวจวินิจฉัย Clostridium botulinum 1.1 วิธี การเพาะเชื้อและทดสอบทางชีวเคมี

- รายงานผลเบื้องตน 48 ชม. Suspected พบ Clostridium spp. สราง subterminal spore และสรางเอนไซม lipase บน Egg yolk agar

- รายงานผลภายใน 7 วันทําการ Suspected Clostridium botulinum โดยการทดสอบทางชีวเคม ี

หมายเหตุ : กรณีที่ตวัอยางมีการปนเปอนมากอาจตองใชเวลาเพิ่มขึน้ในการแยกเชื้อใหบริสุทธิ์กอนจึง ทําการทดสอบทางชีวเคมีได

1.2 วิธี Multiplex PCR

- รายงานผลภายใน 7 วนัทําการ เปน Clostridium botulinum ที่มียีนสสราง band จําเพาะตอ type A หรือ B

1.3 วิธี Detection toxin ใช DIG-ELISA kits

- รายงานผลเบื้องตนจากตวัอยางอาหาร ภายใน 48 ชม. เปน Clostridium botulinum toxin A หรือ B หรือ E

1.4 วิธี Mouse bioassay (Gold standard)

- รายงานผลเบื้องตนจาก ตวัอยางอาหาร มี toxigenicity ภายใน 48-96 ชม. - รายงานผล Clostridium botulinum สราง toxin โดย specific neutralization

ภายใน 7-10 วนัจากตวัอยางอาหาร และ 14-20 วันจากตวัอยางอุจจาระ หมายเหตุ : การทดสอบสารพิษจากอาหารตอง เล้ียงใน Enrichment broth 5 วัน และ จากอจุจาระ 10 วัน เพื่อใหเพิ่มปริมาณของสารพิษ

10

ความปลอดภัยที่ควรระวังในการปฏิบัติงาน Clostridium botulinum

1. เจาหนาที่ปฎิบตัิงาน ผูสงตัวอยาง ควรใส เสื้อกาวน ถุงมอื แวนตา หรือใชแผนกัน้ (Shileds) เวลาเก็บตัวอยาง ขณะปฎิบัติงานในหองปฏิบัตกิาร

2. ขณะเตรยีมตัวอยาง หรือเตรียม Toxin ควรปฏิบัติใน Biological Safety Cabinet(BSC) เพื่อปองกันการฟุงกระจาย(Aerosol) ในอากาศของสารพิษจากตัวอยาง

3. ภาชนะทุกชนดิที่ใชในการเตรียมตัวอยางที่อาจปนเปอน Toxin ควรจะ Neutralized ดวย 0.1 N NaOH กอนแลวนําไป Autoclaved อีกครั้งหนึ่ง

4. ทําความสะอาดบริเวณที่ปฏิบัติงาน กอนและหลังปฏิบัติงานดวย 1% Hypoclorite 5. หาม ใชปากดดู Pipette ดูดสารละลาย ควรใช Mechanical Pipette 6. ขณะใช centrifuge ควรปดฝาครอบ Buccket ใหแนน เพือ่ปองกันการหก หรือ แตก

ของภาชนะ 7. ไมควรปฏิบัติงานคนเดยีว โดยเฉพาะ การ Injected ตัวอยางในสัตวทดลอง 8. หามนําอาหารหรือเครื่องดื่มเขามารับประทานระหวางการปฏิบัติงาน 9. มีเบอรโทรศัพทสําหรับติดตอขอความชวยเหลือจากสถานพยาบาลที่ม ี Anti-Toxin

ใหทันเวลา กรณีเกิดอุบัตเิหตุฉุกเฉิน เมื่อเกิดการ Exposure Toxin ระหวางทดสอบ หรือ ฉีดสัตวทดลองพลาดโดนตัวเอง โดยติดอยูในสถานที่มองเห็นไดชัดเจน

11

การทําลายฆาเชื้อ Clostridium botulinum และ Toxin 1. Inactivated Botulinum Toxins โดยใช

- 0.1 % Sodium Hypochlorite - 0.1 N NaOH - Heating 80 oC 30 นาที หรือ 100 oC 10 นาที - Chlorine, Disinfectant ใชทําลายไดในน้ํา

2. Vegetative Cell C. botulinum ไวตอ Disinfectant เชน 1 % Sodium Hypocholrite

หรือ 70 % Alcohol เปนตน 3. Spore ของ C. botulinum สามารถทนอยูในสภาพแวดลอมไดนาน ถูกทําลายโดยความ

รอนชื้น 120 oC 15 นาที

12

การตรวจหาเชื้อ Clostridium botulinum จากตัวอยาง ตัวอยางอาหาร การเตรียมตัวอยาง 1. ช่ังตัวอยางในภาชนะที่ปราศจากเชื้อ ประมาณ 25 กรัม 2. ใช Forceps และ กรรไกร ทีป่ราศจากเชื้อ ตัดอาหารเปนชิ้นเล็ก ๆ 3. บดอาหารใหละเอียดโดยใชที่บด (Motar) ปราศจากเชื้อ ถาอาหารแหงมากควรใส 50

% Glycerol broth (เก็บไวในตูเย็น 4 oC) ในอัตราสวน 1: 1 ควรวัดความเปนกรดหรือดางกอนโดยปรับ pH ใหอยูที่ 7.0

4. ถายใส Sterile Microcentrifuge tube และ นําไป Centrifuge ที่ 12,000 rpm 4oC นาน 30 นาที

5. แยกสวนน้ํา(supernatant)ออกจากกากของอาหาร(pellet)และกรองดวย Sterile 0.45 µm. Filter

6. นํา supernatant มาทํา Direct Mouse Inoculation Test เพื่อทดสอบ Toxicity ถาใหผล Toxicity positive ใหทํา Neutralization Test ดวย Anti-botulinum toxin รอดูผล 1-4 วัน หรือนําไปทดสอบดวยวิธี ELISA (ถามีชุดทดสอบ)

7. นําสวน pellet มาเพาะเชี้อ บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Egg yolk agar(EY) incubate ที่ 35oC 48 ชม. และตรวจสอบโคโลนีที่ให lipase positive ทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี ถาใหผล Suspected C. botulinum ใหทดสอบ Polymerase Chain Reaction(PCR) สําหรับ C. botulinum type A,B ตอไป และนําเชื้อทีไ่ดไปทดสอบ Mouse Inoculation Test หา Toxicity ถาใหผลบวกทํา Neutralization Test กับ Specific Anti-Botulinumtoxin ตอไปโดยนําเชื้อเล้ียงใน Enrichment broth 5 วัน กอนนาํไปทดสอบทําการ Diluted ที่ 1:10 ขอควรระวัง ควรตากเพลท EY ใหหนาแหงสนิทกอนทําการ Culture เพื่อปองกัน Spread Colonies

13

8. แยก pellet สวนหนึ่งมาใส Enrichment broth เชน Cooked Meat Dextrose Glycerol(CMDG) Tryptone Peptone Glucose Yeast-extract (TPGY) สําหรับกลุม Non-proteolytic ใหเติม 0.5%Trypsin 1 ml. ลงไปTPGY broth (TPGYT) ขอสําคัญ ! กอนนํา Broth ทุกชนิดมาใชใหตม ใน Water bath ที่อุณหภูมิ 100 oC นาน 10 นาทีและรีบทําใหเย็นโดยเร็วเพื่อเปนการไล Oxygen กอน

9. นํา Enrichment broth ไป incubateที่ 35 oC นาน 5 วัน สําหรับกลุม Proteolytic และ incubateที่ 25 oC นาน 5 วัน สําหรับกลุม Non-Proteolytic

10. หลังจาก Incubate ครบตามเวลา นํา 2 ml. ของ Enrichment broth ผสมกับ 2 ml. ของ Sterile(โดยใช 0.45 µm. Filter) Absolute Alcohol ในอัตราสวน 1 : 1 เขยาใหเขากนัดี ตั้งทิ้งไวที่อุณหภูมหิอง นาน 1 ชม. ควรทาํการเขยา tube ทุก ๆ 15 นาที

11. นํา 2 ml. ของ แตละ Enrichment broth จากขอ 9 ใสใน Sterile Tube นํามา Heat ที่ 80 oC นาน 10 นาที สําหรับ กลุม Non – Proteolytic ไมควรทําวิธี Heat เนื่องจากเชื้อมีความไวตอความรอน

12. จากขอ 10, 11 หลังจากที่ตั้งไวที่ อุณหภูมิหอง และ Heat แลว ใหนํามาเพาะเชี้อ บนอาหารเลี้ยงเชือ้ Egg yolk agar incubate ที่ 35oC 48 ชม. และตรวจสอบโคโลนีที่ให lipase positive เพาะเลี้ยงตอไปเพื่อทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี ถาใหผล Suspected C. botulinum ใหทดสอบ Polymerase Chain Reaction(PCR) สําหรับ C. botulinum type A,B ตอไป และนําเชือ้ที่ไดไปทดสอบ Mouse Inoculation Test หา Toxicity ถาใหผลบวกทํา Neutralization Test กับ Specific Anti-Botulinumtoxin ตอไปโดยนําเชือ้เล้ียงใน Enrichment broth 5 วันกอนนําไปทดสอบทําการ Dilutedที่ 1:10

หมายเหตุ ถาตัวอยางที่ Enrichmentไว นาํมาทําโดยวิธี Alcohol และ Heat แลวพบวาเชื้อ

ไมขึ้น ควรนําหลอด Enrichment มาทําซ้ําใหมอีกครั้ง โดยวิธี Unheat

14

Flow Chart ของการตรวจหาเชื้อ C. botulinum จากอาหาร Food 25 gm.

ตัดเปนชิ้นเล็ก ๆ เติม 50 % glycerol broth 1 : 1, บดใหละเอียด

Centrifuge ที่ 12,000 rpm 4oC 30 นาที Supernatant 0.45 µm. filter

- Direct mouse test 1:10

- ELISA Test 1 : 10

Plain,Heat,Trypsin

Neutralization

Pellet

Directed plate on Egg yolk (EY) (Anaerobe 35oC 2 วัน)

Lipase +(ve)

Biochemical test (2 วัน)

PCR Mouse test

Enrichment broth : CMDG ,TPGY,TPGYT(1ml.)

Incubate 35oC 5วัน (Proteolytic) Incubate 25oC 5วัน (Non-Proteolytic)

2 ml. Enrichment broth + 2 ml. Sterile absolute alcohol

2 ml. Enrichment broth

mix RT 1 ชม.

Egg yolk ( 2 วัน) Lipase +(ve)

Biochemical test

PCR Mouse test

Heat 80oC 10 นาที

Egg yolk ( 2 วัน)

Plain,Heat,Trypsin

Suspected C. botulinum

Suspected C. botulinum

Enrichment broth 5 วัน (1 :10)

Enrichment broth 5 วัน (1 :10)

Toxicity +(ve)

Plain,Heat,Trypsin

Neutralization Toxicity +(ve)

Neutralization Toxicity +(ve)

supernatant supernatant

15

ตัวอยางอุจจาระ การเตรียมตัวอยาง

1) ช่ังเนื้ออุจจาระประมาณ 10 กรัม ใส 0.2% gelatin buffer ในอัตราสวน 1: 1 ผสมใหเขากันด ี

2) ถายใส Sterile centrifuge tube และ นําไป Centrifuge ที่ 12,000 rpm 4oC นาน 30 นาที 3) แยกสวนน้ํา(supernatant)ออกจากกากของอุจจาระ(pellet) และกรองดวย Sterile 0.45

µm. Filter นําไปทดสอบ Toxicity โดย Mouse test ถาใหผล Toxicity เปนบวก ใหทาํ Neutralization Test ดวย Anti-botulinum toxin รอดูผล 1-4 วัน

4) สวน pellet ใหแยกเปน 2 สวน สวนแรกนํามาเพาะเชีอ้ บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Egg yolk agar(EY) incubate ที่ 35oC 48 ชม. ตรวจสอบโคโลนีที่ให lipase positive ทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมีตอไป ถาใหผล Suspected C. botulinum ใหทดสอบ Polymerase Chain Reaction(PCR) สําหรับ C. botulinum type A,B ตอไป และนําเชื้อที่ไดไปทดสอบ Mouse Inoculation Test หา Toxicity ถาใหผลบวกทํา Neutralization Test กับ Specific Anti-Botulinum toxin ตอไปโดยนําเชื้อเล้ียงใน Enrichment broth 5 วัน กอนนําไปทดสอบทําการ Dilutedที่ 1:10

ขอควรระวัง ควรตากเพลท EY ใหหนาแหงสนิทกอนทาํการ Culture เพื่อปองกัน

Spread Colonies 5) pellet สวนที่สองนํามาใสใน Enrichment brothเชน Tryptone Peptone Glucose Yeast-

extract (TPGY), Tryptone Peptone Glucose Yeast-extract Trypsin(TPGYT), Cooked Meat Dextrose Glycerol(CMDG) และ Heated CMDG(ใส pelletใน CMDG และนําไป Heat ใน Water bath 80 oC นาน 10 นาที) incubateที่ 35 oC นาน 10 วัน

6) นําสวนน้ําของ Enrichment broth ที่ Incubate ไว 10 วนัแลวมา Centrifuge ที่ 12,000 rpm 10 นาทีใหตกตะกอน(pellet)

7) แยกสวน Supernatant ออก และนําไปกรองดวย Sterile 0.45 µm. Filter นําไปทดสอบ Toxicity โดย Mouse test ถาใหผล Toxicity เปนบวก ใหทาํ Neutralization Test ดวย Anti-botulinum toxin รอดูผล 1-4 วัน

16 16

8) จากขอ 6 กอนที่จะนําสวน pellet ไปลงอาหารเลี้ยงเชื้อ EY ควรปฏิบัติตามขั้นตอนการตรวจหา C. botulinum จากตัวอยางอาหารขอ 10,11 กอนเพื่อลดการปนเปอนจากแบคทีเรียอ่ืน

9) จากขอ 8 หลังจากนํามาเพาะเชี้อ บนอาหารเลี้ยงเชื้อ Egg yolk agar ที่ 35oC 48 ชม. และนําโคโลนทีี่ให lipase positive ทดสอบคุณสมบัติทางชีวเคมี ถาใหผล Suspected C. botulinum ใหทดสอบ Polymerase Chain Reaction(PCR) สําหรับ C. botulinum type A,B ตอไป และนําเชือ้ที่ไดไปทดสอบ Mouse Inoculation Test หา Toxicity ถาใหผลบวกทํา Neutralization Test กับ Specific Anti-Botulinum toxin ตอไป โดยนําเชื้อเล้ียงใน Enrichment broth 5 วัน กอนนําไปทดสอบทําการDilutedที่ 1:10

10) ในกรณีผูปวยเด็ก ถาไมสามารถเก็บตัวอยางอุจจาระได ใหเก็บ Rectal swab อยางนอย 3 อัน โดยใชไม Swab ใสลงใน Enrichment broth CMDG Heated CMDG และ TPGYT (มี 0.5% Trypsin,Difco 1:250) อยางละ 1 ไม Swab incubateที่ 35 oC นาน 10 วัน และทําการทดสอบตอตามที่กลาวมาแลวในขอ 6 – ขอ 9 หมายเหตุ : 1. ถาตัวอยางที่ Enrichmentไว นํามาทําโดยวิธี Alcohol และ Heat แลวพบวาเชื้อไมขึ้น

ควรนําหลอด Enrichment มาทําซ้ําใหมอีกครั้ง โดยวิธี Unheat 2. การทดสอบ Mouse test ถาหนูตายเร็ว และ ยังไมทันแสดงอาการของ Botulism ควร

นําตัวอยางที่ฉีดมา Diluted ใหมใหเจือจางลง ทําการทดสอบซ้ํา และ สังเกตอาการ Botulism

17

17

ตัวอยาง Serum การเตรียมตัวอยาง 1) Serum ที่ทําการทดสอบอยางนอย 5-10 ml. ไมสามารถทาํการเพาะเชื้อจาก Serum

Serum ที่เก็บตองเก็บกอน ให Anti-Toxin และไมตองทําการ Dilute Serum 2) นํา Serum มาทดสอบ Direct Mouse Test หา Toxicity (ใช Plain Serum) และ ทํา

Neutralization ตอAnti – A, Anti - B และ Anti - E

ตัวอยาง Vomitus หรือ Gastric Contents ใหดําเนินขั้นตอนทําเหมือนตัวอยางจากอาหาร ตัวอยางจากสิ่งแวดลอมท่ีปนเปอน ใหดําเนินขั้นตอนทําเหมือนตัวอยางจากอาหาร

18

Flow Chart ของการตรวจหาเชื้อ C. botulinum จากอุจจาระ

เนื้อ Stool 10 gm.

เติม 0.2% gelatin buffer (1 : 1)

Centrifuge ที่ 12,000 rpm 4oC 30 นาที Supernatant 0.45 µm. filter

Day 1 - Direct mouse test (Plain,Heat,Trypsin)

Toxicity +(ve) Day 2 - Neutralization Test ดูผล 1-4 วนั

Pellet Directed plate on Egg yolk (EY)

(Anaerobe 35oC 2 days) Lipase +(ve)

Biochemical test (2 days)

PCR

Mouse test Plain,Heat,Trypsin

Enrichment broth : CMDG,CMDG(heat) ,TPGY,TPGYT

Incubate 35oC 10 วัน

1) 2 ml. Sterile absolute alcohol RT 1 ชม. 2) Heat 80oC 10 นาที

Lipase +(ve) Biochemical test 2 days

PCR Mouse test

Plate on EY

Plain,Heat,Trypsin

Suspected C. botulinum

ผสมใหเขากนัด ี

Centrifuge Supernatant 2ml.

0.45 µm. filter

(Anaerobe 35oC 2 days) Plain,Heat,Trypsin Mouse test

Neutralization Toxicity +(ve)

Neutralization Toxicity +(ve)

Suspected C. botulinum Neutralization Toxicity +(ve)

19

Mouse Bioassay Protocol สําหรับตรวจหา Toxin Clostridium botulinum 1 ใชหนู Out Breed Strain สายพันธุ White ICR ขนาดน้ําหนักตวั 20-30 กรัม 2 Anti-Toxins ชนิด Monovalent Types A, B, C, D, E, และ F 3 Mouse Injection Intra-Peritoneal Route โดยใช Tuberculin Syringe 25-Guage

5/8inc. Needle หรือเล็กกวา 4 สังเกตอาการหนูหลังจากฉดีตัวอยางในชวงเวลา 4,8,12 และ 18 ชม.ถึง 4 วัน โดย

สังเกตอาการปวย และ จํานวนหนูที่ตาย หมายเหตุ Botulinum Toxin สามารถทําใหหนูตายไดภายใน 6-24 ชม. โดยเริ่มจากมีอาการขนพอง (Ruffling of Fur) ตามดวยหายใจหอบแรง(Labored Abdominal Breathing), ขาออนแรง(Weakness of Limbs) อัมพาต(Paralysis) และตายดวยอาการหายใจลมเหลว

5 การอานผล หนูที่ทําการฉีด ตายทั้งหมด แสดงวามี Toxin ยกเวนตวัอยางที่ผสมดวย Anti-Toxins เฉพาะ Type นั้นๆ และ ตวัอยางที่ผานการตมที่ 80 oC นาน 10 นาท ีหนูจะไมตายเพราะ Toxin ของ Botulinum เปน Heat Labile Toxin ขอควรสังเกต ถาการใช monovalent antitoxins ฉีดหนแูลวมีการตายของหนูทั้งหมดใหคํานึงถึง - ปริมาณ Toxin ในตัวอยางมมีาก อาจตองทําการ Dilute Sample - ในตัวอยางมี Toxin มากกวา 1 ชนิด - สาเหตุการตายเนื่องจากสาเหตุอ่ืนเชน เปน Toxin ชนิดอื่น, มีการปนเปอน

เชื้ออ่ืน ฯลฯ

20

การตรวจหา Toxin ของ Clostridium botulinum จากตัวอยางโดยใช Mouse Bioassay

การเตรียมตัวอยาง I Serum

1. ใช 1 ml. Serum ใสในหลอดปราศจากเชื้อ และ เติม 0.25 ml. Monovalent anti-toxin ( ตาม type ที่ตองการทดสอบ) ตามตารางที่ 1

2. Mix โดยใชมือเขยาให Serum กับ Anti-toxin เขากันด ีไมควร ใช Vortex จะทําใหเกิดฟอง ซ่ึงทําใหเกิด Inactivated Anti-toxin

3. Incubate Serum- antitoxin ที่อุณหภูมิหอง นาน 30-60 นาที 4. นําไป ฉีดเขาชองทอง(Intra-peritoneal)หนทูดลอง 2 ตัว ปริมาณตัวละ 0.5 ml. และ

ฉีด Untreated Serum ในหนู 2 ตัว ตัวละ0.5 ml. เพื่อเปน Negative Control 5. สังเกตอาการหนูหลังจากฉดี ทุก 2 ชม.ในวันแรก และ ทุก ๆวันจนครบ 96 ชม.

หมายเหตุ :-นํา Serum มาทดสอบ Direct Mouse Test หา Toxicity(ใช Plain

Serum) กอน ถาใหผลบวกจงึทํา Neutralization ตอ Monovalent anti-toxin - กําหนดใหปริมาณ Serum ที่ฉีดเขาในหนูทดลองจะตองไมเกิน 0.8 ml. ตอตัว เนื่องจากถาฉีด Serum มากเกิน 0.8 ml. หนูอาจตายได -ในกรณีที่หนตูายเมื่อฉีดปรมิาตร 0.8 ml. ใหทํา Neutralization โดยเพิ่มปริมาณ Serum เปน 1/8 ของ Anti-toxin เชน 2 ml. ของ Serum ตอ 0.25 ml. anti-toxin

20 21

ตารางที่ 1 Method of Testing Serum for Botulinum Toxin Tube number

Vol. of Serum (ml.)

Vol. of anti-toxin ( ml.)

Type of Anti-toxin

Vol. Drain into syringe(ml.)

Vol. injected into Each mice (ml.)

1 1.0 0.0 none 1.0 0.5 2 1.0 0.25 A 1.0 0.5 3 1.0 0.25 B 1.0 0.5 4 .. ..

1.0 .. ..

0.25 .. ..

E .. ..

1.0 .. ..

0.5 .. ..

II Food / Stool / Gastric Content

1. ใช ตัวอยางที่ผานการเตรียมตัวอยาง อาหาร และ อุจจาระ ตามที่กลาวมาแลวขางตน 1.1 ใช Supernatant จาก Direct Sample ที่ผานการ Centrifuge และ Filter แลว 1.2 ถาเปน Supernatant ที่มาจาก enrichment broth ควรทํา Dilute 1:10 เพื่อลด

ปริมาณ Toxin ลง 1.3 ถาเปนโคโลนีของเชื้อที่แยกไดจากตัวอยาง ที่ Suspected C. botulinum ควรนํา

เชื้อมาเพาะเลีย้งใน Enrichment broth 5 วันกอน แลวนาํไป Dilute 1:10 2. ทําการทดสอบเหมือนตวัอยาง Serum แตใหเพิ่มหลอดสําหรับ Heated sample

และ Trypsin activation sample ดวยตามตารางที่ 2 3. ถาพบ Toxin Positive ในเฉพาะ Trypsinized Sample ควรทํา Neutralization ซํ้าอีก

คร้ังโดยใช 0.5%Trypsinized extract Incubate ที่อุณหภมูิหองนาน 30 –60 นาทีตามตารางที่ 3

4. ในตัวอยาง Stool อาจมี Toxic Substance ทําใหเกิดผล error ไดควรทําการ Diluted Two-fold เพื่อกําจัดหรือลดสารพิษที่ interfere อยู

21

22

ตารางที่ 2 Method of Testing Extractes and Culture fluids for Botulinum Toxin Tube number

Vol. of Specimens (ml.)

Treatment Type of Anti-toxin

Vol. Drain into syringe(ml.)

Vol. injected into each mice (ml.)

1 1.0 None None 1.0 0.5 2 1.0 Heat 100 oC 10 นาที None 1.0 0.5 3 1.0 0.25 ml. of Trypsin None 1.0 0.5 4 1.0 0.25 ml. of Anti-toxin A 1.0 0.5 5 1.0 0.25 ml. of Anti-toxin B 1.0 0.5 6 ..

1.0 ..

0.25 ml. of Anti-toxin ..

E ..

1.0 ..

0.5 ..

ตารางที่ 3 Method of Testing Trypsinized Extractes and Culture fluids for Botulinum Toxin Tube number

Vol. of Trypsinized test material (ml.)

Vol. of anti-toxin

( ml.)

Type of Anti-toxin

Vol. Drain into syringe (ml.)

Vol. injected into Each mice (ml.)

1 1.25 0.25 A 1.2 0.6 2 1.25 0.25 B 1.2 0.6 3 .. ..

1.25 .. ..

0.25 .. ..

E .. ..

1.2 .. ..

0.6 .. ..

หมายเหตุ : ควรนําตัวอยางผสมกับ Trypsin กอน เขยาใหกนัดวีางไวที่อุณหภูมิหอง นาน

30-60 นาทีกอน แลวเติม Anti-toxin ลงไปเขยาใหเขากันดี แลววางไวที่อุณหภูมิหองนาน 30–60 นาทีกอนนําไปฉีดหนู

22

23

การตรวจหา Neurotoxin ของ C. botulinum โดยวิธี Digoxigenin-label IgGs ELISA (DIG-ELISA) kit ของ CDC-Atlanta

เปนวิธี presumptive ในการตรวจหา neurotoxin A, B, E ใน culture supernatant อาหาร และตัวอยางจากสิ่งแวดลอม อยางไรก็ตามเมื่อ ELISA ใหผลบวก จะตอง confirm ทุกครั้งดวย mouse bioassay ควรปฏิบัติงานโดยใช Biosafety level 2 ขณะทําการ diluted toxin ควรทําการทดสอบภายใตอุณหภูมิ 20-25 oC การเตรียมตัวอยาง

1) Supernatant ที่แยกไดจากตัวอยางอาหารกอนทําการทดสอบควรผานการ filter 0.45 um. และ diluted 1:10 ดวย dilution buffer

2) Single colony ที่ใสใน enrichment broth ควร diluted 1:10 ดวย dilution buffer หมายเหตุ : Gelatin buffer ที่ใชใน mouse bioassay ก็สามารถนํามาใช diluted

ตัวอยาง 1:10 ได การเตรียมน้ํายาท่ีใชในการทดลอง

1) Positive control : ใชความเขมขนที่ 1 ng/ml (diluted 2.0 µl ตอ 1.998 ml dilution buffer

2) Wash buffer : ควรเตรียมใหมทุกคร้ัง โดย diluted จาก 10 เทาเปน 1 เทา โดยใช sterile Milli Q water

3) Dilution buffer : ควรเก็บท่ีอุณหภูมิ 4 oC ตลอด และใชเปน negative control 4) Detector antibody : เติม 1 ml deionized water ในขวด lyophilized detector Ab

mix โดย invert 3 คร้ัง และปลอยวางที่อุณหภูมิหองนาน 10 นาท ีกอนใช สามารถเก็บไวท่ี 2-8 oC นาน 2 สัปดาห : กอนใช A , B , E ตองทําการ diluted ใหได dilution 1:12 (solution 0.083 ml ตอ

0.917 ml dilution buffer)

23 24

5) Anti-DIG HRP : เติม 0.3 ml deionized water ในขวด lyophilized anti-DIG HRP mix ใหสวนผงละลายใหหมด และปลอยวางที่อุณหภูมหิองนาน 10 นาที กอนใช สามารถเก็บไวท่ี 2-8 oC นาน 2 สัปดาห : กอนใช anti-DIG HRP ตองทําการ diluted ใหได dilution 1:240 (solution 4.2 µl ตอ 0.996 ml dilution buffer)

6) Tetramethylbenzidine (TMB) : ควรเก็บไวในที่มืด ไมมแีสงที่อุณหภูมิ 4 oC เพราะจะไวตอแสงมาก (light sensitive) ทําใหเกิด oxidation

7) Stop solution : 1 N H2SO4 (4.68% H2SO4) 8) Sodium Hydroxide (NaOH) : สําหรับ toxin inactivation โดยใช 40 ml ของ 10

N NaOH ตอ 4 ลิตรของขวดสําหรับทิ้ง buffer (waste reservoir)

หมายเหตุ 1) ไมควรทํา reagent ตาง lot no. มาผสมกันใชทํา test 2) Reagent และตัวอยาง ตองนํามาไวที่อุณหภูมิหองกอนใช 3) Wash buffer ที่ใชแลว รวมทั้ง microplate ควรทําการ autoclave

กอนนําไปทิ้ง ขั้นตอนการทดสอบ

1. ตัวอยางทีจ่ะนาํมาใชในการทดสอบตอง diluted 1:10 กอนดวย dilution buffer 2. เติม 100 µl ของตัวอยาง , positive control , negative control (ใช dilution buffer)

โดยทํา duplicate (2 ชองตอ 1 solution) ปดทับดวย Plate Sealer 3. ปด microplate ดวย aluminum foil 4. Incubate ที่อุณหภูมิหอง (20-25 oC) นาน 2 ชม. โดยวางบน microplate shaker

ปรับความเร็ว 950 RPM 5. ทําการ Dilute detector antibody ตามที่ระบุในการเตรยีมน้ํายาที่ใชในการทดสอบ 6. ครบ 2 ชม. ลาง microplate 5 คร้ัง ดวย wash buffer 7. เติม 100 µl Diluted detector antibody และปด microplate ดวย Plate sealer

และ ปดดวย aluminum foil อีกครั้ง 8. Incubate ที่อุณหภูมิหอง (20-25 oC) นาน 1 ชม. โดยวางบน microplate shaker

24

25

9. ครบ 1 ชม. ลาง microplate 5 คร้ัง ดวย wash buffer 10. ทําการ dilute anti-DIG HRP ตามที่ระบุในการเตรียมน้าํยาที่ใชในการทดสอบ 11. เติม 100 µl dilute anti-DIG HRP และปด microplate ดวย Plate sealer และ ปด

ทับดวย aluminum foil อีกครั้ง 12. Incubate ที่อุณหภูมิหอง (20-25 oC) นาน 1 ชม. โดยวางบน microplate shaker 13. ครบ 1 ชม. ลาง microplate 3 คร้ัง ดวย wash buffer และพยายามเคาะน้ําที่ตดิ

อยูออกใหหมด 14. เติม 100 µl TMB และปด microplate ดวย Plate sealer และ ปดทับดวย

aluminum foil อีกครั้ง 15. Incubate ที่อุณหภูมิหอง (20-25 oC) นาน 15 นาท ี โดยวางบน microplate

shaker ขอควรระวัง อยาปลอยเกนิเวลา 15 นาท ี

16. เติม 100 µl stop solution 17. นําไปอานที่ absorbance 450 และ 690 nm ( หรือ 630 nm) ภายในเวลา 30

นาที หลังจากที่เติม stop solution แลว

การอานผล 1) คา Absorbance ที่ 450 nm ใชสําหรับในการแปลผล สวน Absorbance

ที่ 690 nm ใชเปน background 2) หาคา average (คาเฉลี่ย) ที่ทํา duplicate ของทุกชอง มี positive

control, negative control และ Sample 3) คา Absorbance ของ negative control ควร < 0.35 4) คา Absorbance ของ positive control ควร > 1.0 5) คา Absorbance ของ Sample ที่อานเปน positive จะตองมีคามากกวา

0.2 + คาเฉลี่ยของ negative control.

25

26

Flow Chart ของการตรวจหา neurotoxin type A,B,E ของ C. botulinum โดยวธิี DIG-ELISA

Sample dilute 1:10 ใน ditution buffer

Add 100 µl Sample และ Control (positive, negative)*

Incubate 20 - 25 oC ( RT), 2 ชม. บน microplate shaker

wash microplate 5 คร้ัง ดวย wash buffer

Add 100 µl of diluted detector antibody*

Incubate 20 - 25 oC ( RT), 1 ชม. บน microplate shaker

wash microplate 5 คร้ัง ดวย wash buffer

Add 100 µl of dilute anti-DIG HRP*

Incubate 20 - 25 oC ( RT), 1 ชม. บน microplate shaker

wash microplate 3 คร้ัง ดวย wash buffer และเคาะใหแหง

Add 100 µl of TMB*

Incubate 20 - 25 oC ( RT), 15 นาท ี บน microplate shaker

Add 100 µl of stop solution

Read absorbance. At 450, 690 nm (หรือ 630 nm)

* ปด microplate ดวย Plate sealer และ ปดทับดวย aluminum foil อีกครั้ง

26 27

การตรวจหายีนส ของ C. botulinum Type A,B โดยวิธี Mutiplex PCR

I การสกัด DNA มี 3 วิธี คือ วิธีท่ี 1

1. จาก pure โคโลนี ที่ให lipase positive 48 ชม. ใชไมจิ้มฟนที่ปราศจากเชื้อ เขี่ยจากโคโลนี ใสใน eppendrof tube ที่มี PCR mixture ไมมี Tag Polymerase

2. นําไป heat ที่ Water bath 95 oC นาน 10 นาที 3. เติม Tag polymerase 4. นําไปทํา Multiplex PCR amplification A, B toxin gene

หมายเหตุ วิธีนี้เปน rapid screen จากโคโลนีที่ให lipase positive ซ่ึงอาจไมตองรอผลทางชีวเคมีอีก 2 วัน

วิธีท่ี 2

1. เลือกโคโลนีที่ให lipase positive อายุ 48 ชม. 1 โคโลนี ลงใน TPGY 1 หลอด ควรทําอยางนอย 10 หลอด ตอตัวอยาง เพราะโอกาสที่จะพบโคโลนีที่เปน non-toxin ได

2. นํา TPGY broth เล้ียงสภาวะ anaerobe ที่ 35 oC 24 ชม. สําหรับ Proteolytic

ที่ 25 oC 24 ชม. สําหรับ non- proteolytic 3. นําหลอดจากขอ 2 มาถายใส eppendrof tube 1 ml. นําไปตมที่ 95oC

นาน 10 นาที และ centrifuge ที่ 4oC นาน 5 นาท ี4. เก็บ supernatant เปน template ทํา Multiplex PCR ตอ ถายังไมทํา

PCR ใหเก็บ DNA ที่ -20 oC

27 28

วิธีท่ี 3 1. เลือก 5 โคโลนี จาก Pure โคโลนี ที่ให Lipase positive 48 ชม. ใสลงใน

lysis buffer 1 ( 25% Sucrose in TES, Lysozymes) ที่ 37 oC นาน 15 นาที 2. นําไป Centrifuge 4 oC นาน 15 นาที 3. ทิ้งสวนที่เปน Supernatant 4. เติม lysis buffer 2 (0.8% Sarkosyl,Protinase K, TEN:Tris-EDTA-NaCl)

incubate ที่ 56 oC นาน 1 ชม. 5. นําไป Centrifuge 4 oC นาน 15 นาที 6. เก็บ Supernatant เปน Template ทํา Multiplex PCR ตอไป ถายังไมทํา

PCR ใหเก็บ DNA ที่ -20 oC

II ขั้นตอนการทํา Multiplex PCR 1. Oligonucleotide Primers (ตามหลกัการ MIIA LINDSTROM)

Type A F5/ - AGC TAC GGA GGC AGC TAT GTT -3/ R5/ - CDT ATT TGG AAA GCT GAA AAG G -3/

Type B F5/ - CAG GAG AAG TGG AGC GAA AA -3/ R5/ - CTT GCG CCT TTG TTT TCT TG -3/

2. PCR reaction preparation 2.1 PCR Mixture Total Volume 30 µl. containing

- 1X PCR buffer - 1.5 mM MgCl2 - 0.2 mM dNTP mixture - 1U Taq DNA polymerase - 0.3 µl. Template DNA - 0.1 µl. of each Primer set

28

29

2.2 Temperature Cycling One Cycle at 94 oC for 5 นาท ี35 Cycle of 95 oC for 20 sec. (Denaturation)

55 oC for 30 sec. (Annealing) 60 oC for 2 นาท ี(Extension)

Final 60 oC for 7 นาท ี Holding Temperature of 4 oC

2.3 Agarose gel Analysis of PCR Products - 2% Agarose gel - 10 µl. PCR Product + 2 µl. of Loading dye - Run 100 Volt 60 นาท ี- ETBr 5 นาท ี

2.4 การอานผลภายใต Short wave UV light - Type A 782- bp - Type B 205- bp

29

30

เอกสารอางอิง 1. Centers for Disease Control and Prevention. Botulism in the United States, 1899-

1996. Handbook for Epidermiologist, Clinicians and Laboratory workers. 2. U.S. Food and Drug Administrition. In .Chepter 17 Clostridium botulinum,

Bacteriological Analytical Manual Online, Jan 2001. 3. Lindstrom M, et al(2001). Multiplex PCR Assay for Detection and Identification

of Clostridium botulinum Type A, B ,E and F in Food and Fecal Material. Appl. Environ. Microbiol. 67:5694-5699.

4. Holdeman LV and Moore WEC. Anaerobe Labolatory Manual. Virginia Polytedinic Institute and State University. Blacksbury, Virginia 3rd ed., 1975.

5. Dowell VR, Hawkins TM. Detection of Clostridium botulinum and Botulinal toxin in Laboratory Methods in Anaerobic Bacteriology CDC Laboratory Manual. 5th ed., 1981, P.41-44.

6. Paula S, Ellen JB, Drane MC, Catherine S, Hannah MW and Sydney MF. Advanced Identification Methods (level III) in Wadworth Anaerobic. Bacteriologyy Manual 5th ed., 1993,P. 85-87.

7. Ramathibodi Poison Center. พิษจากอาหาร : Botulism Bulletin. July – September 1998, Vol.6 no. 3

8. โรงพยาบาลบานหลวง. ความรูทั่วไปเกีย่วกับเชื้อ Clostridium botulinum. 9. Laboratoty Response Net work(LRN), Center for Diseases Control and

Prevention. Botulinum Toxin Type A,B,E DIG-ELISA KIT 10. Albert Balows. Manual of Clinical microbiology. Fifth Edition. USA:

Washington D.C, 1991.

31

ภาคผนวก อาหารเลี้ยงเชื้อท่ีใชในการตรวจหา Clostridium botulinum

1. Egg York agar (EY) 2. Tryptone-Peptone-Glucose-Yeast Extract (TPGY) broth 3. Tryptone-Peptone-Glucose-Yeast Extract (TPGY) broth with trypsin (TPGYT) 4. Cooked Meat Dextrose Glycerol (CMDG) broth 5. Trypsin solution (Difco 1:250)

Egg Yolk Agar

ใชสําหรับเพาะเชื้อและทดสอบ Enzyme lecithinase และ lipase ของเชื้อ anaerobes (Clostridium) และเชื้อ Bacillus

สวนประกอบ

ผสม Egg yolk emulsion ซ่ึงเตรียมตามวิธีขางลาง Egg yolk emulsion

1. เลือกไขขนาดใหญ ที่เปลือกไมมีรอยราว ลางเบาๆ ดวยใยขัดผสมน้ํายาลางจานแลวลางดวยน้าํใหสะอาด

2. แชไขใน 70% alcohol นาน 15-20 นาที นําขึ้นมาผึ่งบนจานที่ปราศจากเชื้อ ในขั้นตอนตอไปตองทําดวยความระมัดระวังอยาใหเกิดการปนเปอนจากมอืหรือส่ิงสกปรกภายนอก

3. ใชปากคีบลนไฟ เจาะเปลือกไขดานที่ตรงขามกับดานแหลม จะมีเยื่อบางๆ หุมเนื้อไขอยู เลาะเปลือกไขทีอ่ยูรอบๆ เยือ่ออกพอใหเทไขขาวออกไดสะดวก แลวลอกเยื่อออกทิ้งไป

4. เทเนื้อไขขาวออกใหหมด เหลือแตไขแดง แลวเทใสใน Flask ขนาด 250 ml ที่ปราศจากเชื้อ เขยาใหไขแดงแตก แลวเติม Steriled Normal Saline 5 ml/1 ฟอง เขยาใหเขากันใช Loop เผาไฟ ทิ้งไวใหเย็น เขี่ยถุงหุมไขแดงออก หรือ กรองผานกระชอนที่ปราศจากเชือ้ แลวนําไปผสมกับ Base Agar ที่ลดอุณหภูมแิลว

32

Mac Clung - Toabe agar base gm/litre

Proteose peptone No.2 (Polypeptone) 40 Disodium phosphate (Na2HPO4) 5 Monopotassium phosphate (KH2PO4) 1 Magnesium sulfate 0.1 D-Glucose 2 Sodium chloride 2 Agar 15 Hemin soln 5 mg/ml 1 ml

Final pH. 7.6 ± 0.2at 25 °C วิธีทํา

1. ช่ังสวนประกอบตามสูตรผสมในน้ํากลั่น 2. ตมให agar ละลาย นําไป Sterilize ใน autoclave 121°C (15 ปอนด) นาน15

นาที 3. ลดอุณหภูมิเหลือประมาณ 55-60°C 4. เติม Egg yolk emulsion 5. เทใสจานอาหารเลี้ยงเชื้อที่ปราศจากเชื้อ จานละ 18 –20 ml

31 33

Tryptone-Peptone-Glucose-Yeast Extract (TPGY) broth สวนประกอบ

gm/litre

Tryptone 50 Proteose peptone 5 Yeast Extract 20 Dextrose 4 Sodium Thioglycolate 1 Starch 1 วิธีทํา

1. ช่ังสวนประกอบตามสูตรผสมในน้ํากลั่น 2. ผสมใหเขากันดวย Magnetic Stirrer 3. นําไป Sterilize ใน autoclave 121°C (15 ปอนด) นาน15 นาที 4. กรอกใสหลอดแกว Sterlized หลอดละ 10 ml.

Tryptone-Peptone-Glucose-Yeast Extract (TPGY) with Trypsin broth สวนประกอบ Tryptone-Peptone-Glucose-Yeast Extract (TPGY) broth1 หลอด (10 ml.)

0.5 %(w/v) Trypsin 1 : 250(difco) Sterized by filter 1 ml. วิธีทํา

1. เตรียม Tryptone-Peptone-Glucose-Yeast Extract (TPGY) broth ตามวิธีขางตน

2. เติม 0.5 %(w/v) Trypsin 1 : 250 (difco) Sterized by filter หลอดละ 1.0 ml.

32 34

Cooked Meat Dextrose Glycerol (CMDG) broth สวนประกอบ Water part

gm/litre Dextrose 4 Cellobiose 1 Maltose 1 Starch 1 Cooked Meat(Difco) วิธีทํา

1. ช่ังสวนประกอบของ water part ตามสูตรผสมในน้ํากลัน่ 2. ผสมใหเขากนัดวย Magnetic Stirrer 3. นําไป Sterilize ใน autoclave 121°C (15 ปอนด) นาน15 นาที 4. ช่ัง Cooked Meat (Difco) 1.25 กรัม ใสลงในหลอดแกว Steriled 5. เติม Water part หลอดละ 10 ml. ปดฝา

0.5% Trypsin solution (Difco 1:250) สวนประกอบ Trypsin 1:250 (Difco) Sterlized Distilled water วิธีทาํ

1. ชั่ง Trypsin 0.5 กรัม ละลายใน Sterlized Distilled water 100 ml. 2. Steriled โดยการ Filter

33 35

รายชื่อคณะทํางาน

นายแพทย ปฐม สวรรคปญญาเลิศ ที่ปรึกษา นาง ลีลาวด ี แสงสุก ประธาน นาย กรัณย สุทธิวราคม คณะทํางาน นาย ธนิตชยั คําแถลง คณะทํางาน นางสาว ชุติมา จิตตประสาทศีล คณะทํางาน

34 36