Selección de columnas Sugerencias para limitar elSelección de columnas de HPLC y como

reducir el consumo de

Sugerencias para limitar el uso y gasto de solvente

reducir el consumo de disolvente

A il t T h l iAgilent Technologies

ACN(MeCN)

1

( )

Alternativas para el ahorro de acetonitrilo

Siempre es conveniente ahorrar en solvente, pero más hoy debido a la escasez de Acetonitrilo

1) Revise la flexibilidad de su método y si es posible hacerajustes en el metodo. Analizar qué ajustes requiren revalidaciónj q j qdel método y cuales no.(Criterios de ajustes de métodos)

2) Contemple el uso de un solvente alternativo (metanol) y de2) Contemple el uso de un solvente alternativo (metanol) y de columnas con dimensiones diferentes.

3) Sugerencias de ahorro no relacionadas con el cambio de3) Sugerencias de ahorro no relacionadas con el cambio de método o columna

4)Utilice un equipo UHPLC 1290 de altas prestaciónes y4)Utilice un equipo UHPLC 1290 de altas prestaciónes y columnas RRHD de 2,1mm

2

1) Criterios USP y FDA de ajuste de métodosCriterios de ajuste de Método para las dimesiones de la columna

Parámetro Especificaciones Máximas Comentarios/ejemplos

Longitud de columna ± 70% 250mm 75mm150mm 50mm

% ( O *)

Diametro interno de columna

±50% (FDA ORA-LAB 5.4.5*)

USP – ± 25%Se puede ajustar el diámetro interno

de la columna siempre que se

4.6 mm 3.0 mm (-35%)

4.6 mm 2.1 mm (-54%)de la columna siempre que se

mantenga constante la velocidadlineal**(en estudio)

3.0 mm 2.1 mm (-30%)

Flow Rate ±50%Reducir lo que necesite Si bi l á

Injection VolumeReducir lo que necesite-

manteniendo la precisión y limites de detección-

Si se cambia a una columna máspequeña haz el cambio apropiado en el volumen de inyección.Puedes cambiar la long de la col y el

Tamaño de particula Reduce como máximo el 50%

tamaño de particula para mantener la misma resolución

5um 3.5um (-30%)3 5 1 8 ( 49%)3.5um 1.8um (-49%)

5um 2.7um (-46%)

*Para ver la copia oficial, ir la página http://web.ora.fda.gov/dfs/policies/manuals/default.htm (ORA: Office Regulatory Affairs) //** USP 30 Revisiones al Segundo Suplemento PF34(1)

May 4, 20103

(ORA: Office Regulatory Affairs) // USP 30 Revisiones al Segundo Suplemento, PF34(1)

2) Varios enfoques para reducir el gasto de solventes en el HPLCa) Reducir el diametro de la columna – Cambiar a columnas “Solvent Saver” (3.0mm ID) o Narrow Bore (2.1mm ID)

Se adecúa a las normativas de la FDA y a las futuras normativas de la USP• Se adecúa a las normativas de la FDA y a las futuras normativas de la USPb) Reducir la longitud y el tamaño de partícula de la columna

Mayor flexibilidad Asegurate que encuentras la Resolución necesaria• Mayor flexibilidad, Asegurate que encuentras la Resolución necesaria• Columnas más cortas con tamaño de partícula pequeño

– Columnas “Rapid Resolution “ para cualquier LC (3 5um)– Columnas Rapid Resolution para cualquier LC (3.5um)– Columnas Rapid Resolution HT( 1.8um) – 50mm para cualquier LC y más

largas para RRLC (1200) o columnas RRHD para UHPLC (1290)– Columnas Poroshell 120 (2.7um) para cualquier HPLC o UHPLC– Esto puede hacerse siguiendo las directrices de la USP y FDA sobre

ét d fi i lmétodos oficialesc) Reducir simultáneamente la longitud, el tamaño de partícula y el diametro.

May 4, 20104

a) Primer enfoque: Reducir el diametro Selección del diametro de la columna

La selección del diametro de la columna tendrá un gran impacto en el gastode disolvente porque el flujo depende del diametro interno de la columna!

Cuando se cambia el ID hay que mantener la misma velocidad lineal y portanto reducir el flujo y se podría reducir el volumen de inyección

F2 = r22 F1

r 2r12

Pasando de 4.6mm i.d. a 1mL/min a 3.0mm i.d. :-F = 3 02 x 1 0 = 0 42mL/minF2 = 3.02 x 1.0 = 0.42mL/min

4.62

Escala volumenes de InyecciónEscala volumenes de InyecciónV2 = V1 x [(r2

2 x L2)/(r12 x L1)] r = radio de columna,

L= longitud

5

L longitud

Beneficios al reducir el Diametro de la columna

• Reducir el uso y gasto de solvente

• Mantener el tiempo de análisis y laMantener el tiempo de análisis y la resolución

• Aumentar sensibilidad con el mismo volumen de inyección (por lo tanto puedes reducir el volumen de inyección cambiandoreducir el volumen de inyección cambiando el ID)

6

Columnas de HPLC de diámetro interno máspequeño reducen el gasto de solvente

Analitica Estándar Solvent Saver Narrow Bore

ID Columna 4 6 mm 3 0 mm 2 1 mmID Columna 4.6 mm 3.0 mm 2.1 mm

Actual Solvente 100 mL 40 mL 20 mLusado 100 mL 40 mL 20 mL

% disminuciónde Solvente 60% 80%de Solvente

Usado- 60% 80%

Reduciendo el ID el uso del solvente se reduce en gran medida– Primer paso para h l t !

7

ahorrar solvente!

Separación de Antibacteriales en Columnas con diferentes diametros

SB-C18 Solvent Saver SB-C183 0 150 5

SB-C182 1 150 5

Columna: ZORBAX SB-C18 Fase Móvil*: 20% ACN: 80% Citrato/fosfato pH 2.6 *200/87/713 ACN/0.2M Na2HPO4/0.1M ácido cítricoTemperatura: ambiente Muestra: Antibacteriales 1. Sulfamerazina 2. Furazolidona 3. Acido Oxolínico 4. Sulfadimetoxina 5. Sulfaquinoxolina 6. Ácido Nalidíxico

1

4

1

4

4.6 x 150 mm, 5 um 3.0 x 150 mm, 5 um 2.1 x 150 mm, 5 um

1

2 3

4

56

2 3 562

3 56

0 40Time (min)0 400 40 Time (min)Time (min)

Solvente Usado: 31 mL Solvente Usado: 8 mL% Ah S l t 74%

Solvente Usado: 15 mL% Ah S l t 52% % Ahorro Solvente= 74%% Ahorro Solvente= 52%

Flujo: 1.0 mL/minInyección: 3 uL

Flujo: 0.5 mL/minInyección: 2 uLV l C ld D t t 8 L

Flujo: 0.25 mL/minInyección: 1 uLy

Volumen Celda Detector: 8 uL Volumen Celda Detector: 8 uLy

Volumen Celda Detector: 2 uL

Las columnas “Solvent Saver” reducen el uso de solvente más del 50% mientras mantienen los mismostamaños de particula, fase ligadas y longitudes de columna.

May 4, 20108

Esto cumple con las directrices de la FDA para el ajuste de método.

b) Segundo enfoque: Variación de la longitud y del tamaño de partícula

Reduce el tamaño de particula y longitud de

del tamaño de partícula.

p y gcolumna simultaneamente para:

Reducir tiempo de analisisR d i l t d di l tReducir el uso y gasto de disolventeMantener la resolución

May 4, 20109

Análisis de Propranolol con una columna ‘Rapid Resolution’ (3.5um) usando 50% menos de Acetonitrilo(3.5um) usando 50% menos de Acetonitrilo

SB-C184 6 x 150 mm 5 μm

SB-C18 Rapid Resolution4 6 x 75 mm 3 5 μm4.6 x 150 mm, 5 μm 4.6 x 75 mm, 3.5 μm

Plates: 6371

USP Tf (5%): 1 09Platos: 6370

USP Tf (5%): 1.09

Tiempo deretención: 6.50 min

S l

USP Tf (5%): 1.14

Tiempo deretención: 3.11 minFase Móvil: 75% 50 mM KH2PO4,

pH 4 4: 25% ACNSolventeUsado: 12 mL Solvent

Usado: 6 mLSolvent

pH 4.4: 25% ACNFlujo: 1.5 mL/minMuestra: 1. Propranolol

So e tAhorrado: 50%

• Excelente forma de pico en columnas SB-C18 , cumplen los requerimientos con muy poco tailing.R id R l ti SB C18 d l ti d áli i lt d i l t

0 5 10Time (min)

0 5 10Time (min)

May 4, 201010

• Rapid Resolution SB-C18 reduce el tiempo de análisis con resultados equivalentes.

Paso siguiente– Columnas Rapid Resolution HT (RRHT 600 bares) o RRHD 1200 bares para UHPLC(RRHT 600 bares) o RRHD 1200 bares para UHPLC o Columnas Poroshell para uso en HPLC o UHPLC

Las columnas ‘Rapid Resolution HT’ y ‘Rapid Resolution HD’ tienen tamaño de particulas de1.8um

Esta reducción en el tamaño de partícula permite incluso el usode columnas más cortas con la misma resolución.

Las columnas Poroshell 120 también generan más eficacia a presiones de HPLC convencionalpresiones de HPLC convencional

Columnas más cortas implica menores tiempos de análisis y ahorro substancial de disolventesahorro substancial de disolventes.

11

Se pueden hacer Ajustes al Método para Transferir el Ensayo USP para la Suspensión de Ibuprofeno Oral a columnas RRHT

mAU

Requerimientos USP:Columna L7R >1.5

4.6 x 150 mm, 5 um5 ul iny.

0

20

40

60 TF(5%) < 2.0 5 u y32 mL Solvent Usado

R = 11

min0 2 4 6 8 10 12 14

0

mAU

60

) 4.6 x 100 mm, 3.5 um3.3 ul iny.20 mL Solvente Usado

Los factores de cola para todos los picos son<1.15

0

20

40

20 mL Solvente Usado38% ahorro disolvente

R = 11

min0 2 4 6 8 10 12 14

mAU

60

)

Rapid Resolution HT 4.6 x 50 mm, 1.8 um 1.7 ul iny.11 mL Solvente Usado66% ahorro disolvente Fase Móvil( 63:37) agua :acetonitrilo + 1 8 ml H3PO4

min0 2 4 6 8 10 12 14

0

20

4066% ahorro disolvente Fase Móvil( 63:37) agua :acetonitrilo + 1.8 ml H3PO4

Flujo = 2.0ml/min. Temp. : ambiente LC: Agilent 1100Muestra: Suspensión Oral de Ibuprofeno para niños, con benzofenona como estandar interno preparado según USP

R = 10.0

May 4, 201012

min0 2 4 6 8 10 12 14

¿Qué Clase de Productividad puede lograrseusando las columnas RRHD con el 1290 Infinity LC?

1. Análisis Rápidos y con bajo consumo de disolventes–especialmente con muestras algo complejas

1. Análisis en gradiente con 4-10 componentes

2. Más resolución en menor tiempo2. Más resolución en menor tiempo1. Elección de diferentes longitudes de columna para obtener la

resolución deseada2. Maximizar la capacidad de picos en separaciones de gradientes de

muestras complejas

Page 13

Análisis Rápidos en ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18High Definition Eclipse Plus C18

mAU

DAD1 D, DAD1C, DAD: Signal C, 280 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)

415

DAD1 E, DAD1D, DAD: Signal D, 255 nm/Bw:10 nm Ref 400 nm/Bw:50 nm (G:\1290\AOX JASMIN\AOX-AM2-45C-101.D)

THBP RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 x 50mm, 1.8um,

500

600 0.4 p , , ,

Pmax 1070 barEsta muestra de 10 compuestos requiere un gradiente que va más allá de los 1000 bar.

400

Datos Cortesía de: Gerd Vanhoenacker

g qEs una separación de menos de 2 minutos!Gasto de solvente: 2,9mL

200

300

0.2

72

055

PGOG

DG

Research Institute for ChromatographyKennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium

100

200

0.4

80

0.7

57

0.8

83

1.

1.5

2455

6 1.6

84

TBHQNDGA

BHA

Ionox-100BHT AP

min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

0

1.0

11 1.5Ionox 100

Month ##, 200XPage 14

Análisis Rápido en Agilent Zorbax Rapid Resolution High Definition Eclipse Plus C18MétodoColumna ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 

(SN USDAY01001)Fase Móvil A=0.02% H3PO4, B=acetonitrilo/metanol 3/1l /Flujo 1.6 mL/minGradiente 0‐1.85 min 30‐100% BVolumen de inyección 1 µLD t t Si 280/10 R f 400/50 80 HDetector Sig=280/10 nm, Ref=400/50, 80 Hz

Sig=255/10 nm, Ref=400/50, 80 HzTemperatura 45°CMuestra Mezcla de Antioxidantes ca 100 ppmMuestra Mezcla de Antioxidantes, ca. 100 ppm

Un flujo de 1.6 mL/min es muy rápido, y permite una rápida separación.

Datos Cortesía de: Gerd Vanhoenacker Research Institute for ChromatographyKennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium

Month ##, 200XPage 15

Kennedypark 26 8500 Kortrijk Belgium

¿Dónde cae este ejemplo en el Rango del 1290 Infinity?

Esta app. cae en el “Power Range”1070 bar, 1.6ml/min

Month ##, 200XPage 16Page 16

Elige la Longitud de la columna según el Tiempo de Análisis y la RsFase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo Flujo: 0 5 mL/min Temp: ambiente Columnas: RRHD SB-C18 2 1 mm ID Longitudes

RRHD 1.8um 1200 bar

Fase Móvil: 40:60 agua:acetonitrilo, Flujo: 0.5 mL/min, Temp: ambiente, Columnas: RRHD SB C18, 2.1 mm ID, Longitudes abajo Picos: 1: uracilo, 2 acetofenona, 3 propiofenona, 4 butirofenone, 5 valerofenona, 6 hexanofenona

Rs3,2: 5.64N6 : 10,700Presión: 350 barSolvente: 1,25mL

50 mm

min0 1 2 3 4

Rs3,2: 9.02N6 : 21,100Presión : 566 bar100 mm

0 1 2 3 4

R 11 98

Presión : 566 barSolvente: 1,75mL

100 mm

min0 1 2 3 4

Rs3,2: 11.98N6 : 34,100Presión :750 barSolvente: 2 5mL

150 mm

Solvente: 2,5mLmin0 1 2 3 4

0

La columna RRHD de 150mm es una buena elección para alcanzar altal ió l 1290 I fi it LC

Month ##, 200XPage 17Page 17

resolución con el 1290 Infinity LC.

Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:

80 90% d fi i i d l b 2

Las columnas Poroshell 120 tienen:

• 80-90% de eficicacia de las sub 2um• A presiones un ~40-50% más bajas• El doble de la eficacia de las

columnas 3.5um (totalmente porosas)• Con un tamaño de partícula de 2.7um• Con una frita de entrada de 2um que• Con una frita de entrada de 2um que

no se bloquea• Con un límite de presión de 600 bar,

0.5um

para uso en HPLC y UHPLC 1.7um

• La partícula tiene un núcleo sólido(1.7um) y una cubierta exterior porosade 0 5um como zona de difusión

0.5um

de 0.5um como zona de difusión

May 4, 2010

Confidentiality Label

18

Las Columnas Poroshell 120 proporcionan

Separaciones de Alta Velocidad y Alta Resolución a presionesconvencionales de HPLC.convencionales de HPLC.• Compatible con HPLC estandard– incluso con columnas 150mm largas!• Columnas de alta eficacia significa alta resolución y capacidad de flujos altosColumnas de alta eficacia significa alta resolución y capacidad de flujos altos.

Separaciones de Ultra Resolución a presiones UHPLC

U l ió di i l d A il t d ti id dUna solución adicional de Agilent para una mayor productividad• Solo Agilent tiene partículas superficialmente porosas de 2.7um y partículas

t t l t b 2totalmente porosas sub 2um• Distintas soluciones para resolver las distintas necesidades de los clientes –

y no una explicación de porqué el único producto que la competencia tieney p p q p q presolverá todas las necesidades.

Page 19

Elija Poroshell 120 para HPLC de Alta EficaciaColumnas: 3.0 x 100mm, Fase Móvil: 65% A: 0.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol Isocratico, Flujo 0.5 mL/min1 µL inyección 26 °C Sig = 220, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3. Ácido P-hidroxibenzoico4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico

C i 2X l fi i d 3 5mAU

200

300Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 100mm, 2.7 µm; N = 21 567 P 300 bar

Casi 2X la eficacia de 3.5umPresión HPLC (< 400 bar)

min1 2 3 4 5 60

100N = 21,567, P = 300 bar

mAU

100

200

300 RRHT Eclipse Plus C18 3.0 x 100mm, 1.8 µm;N = 25753, P = 456 bar

1,2 ml de consumo

min1 2 3 4 5 6 70

mAURapid Resolution Eclipse Plus C18,

050

100150200250

p p ,3.0 x 100mm 3.5 µm;N = 11651, P = 153 bar

Page 20

min1 2 3 4 5 6 7

Poroshell 120 EC-C18 para Separaciones rápidas en UHPLCUHPLC

Columna: Poroshell 120 EC-C18 3.0 x 100mm, 2.7um Fase Móvil: 65% A: 0.2% Ácido Fórmico: 35% B: Metanol Isocrático, Varios Flujos 1 µL inyección 26 oC Señal = 220, 4 nm, Ref = Off Muestra: 1. Sacarina 2. Cafeina 3. Ácido P-hidroxibenzoico 4. Aspartamo 5. Ácido Dehidroacético 6. Ácido Benzoico

mAU

100

200

300

Flujo = 0.5 mL/min, P = 300 bar N = 24567

2 4 6

0

100

mAU300

P = 300 bar, NAB = 24567

2 4

0

100

200 Flujo = 0.75 mL/min, P = 433 bar

2 4

mAU

100

200 Flujo = 1.0 mL/min, P = 559 bar

min2 4

0

100 P = 559 bar

3Pueden usarse Solventes más viscosos como el metanol a presiones HPLC o UHPLC

Page 21

Pueden usarse Solventes más viscosos como el metanol a presiones HPLC o UHPLC.

Lista Completa de Part Numbers C18 Poroshell 120

EC-C18, 2.7umPart Number Poroshell 120

SB-C18, 2.7um Part Number

4.6 x 150mm 693975-902 4.6 x 150mm 683975-9024.6 x 100mm 695975-902 4.6 x 100mm 685975-9024.6 x 75mm 697975-902 4.6 x 75mm 687975-9024.6 x 50mm 699975-902 4.6 x 50mm 689975-9024.6 x 50mm 699975 902 4.6 x 50mm 689975 9024.6 x 30mm 691975-902 4.6 x 30mm 681975-9023.0 x 150mm 693975-302 3.0 x 150mm 683975-3023 0 x 100mm 695975-302 3 0 x 100mm 685975-3023.0 x 100mm 695975-302 3.0 x 100mm 685975-3023.0 x 75mm 697975-302 3.0 x 75mm 687975-9023.0 x 50mm 699975-302 3.0 x 50mm 689975-3023 0 x 30mm 691975 302 3 0 x 30mm 681975 3023.0 x 30mm 691975-302 3.0 x 30mm 681975-3022.1 x 150mm 693775-902 2.1 x 150mm 683775-9022.1 x 100mm 695775-902 2.1 x 100mm 685775-9022.1 x 75mm 697775-902 2.1 x 75mm 687775-9022.1 x 50mm 699775-902 2.1 x 50mm 689775-9022.1 x 30mm 691775-902 2.1 x 30mm 681775-902

Page 22

Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell120 EC C18 4 6 x 100 mm 2 7um120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um

96

Sulfadiazina,SulfatiazolSulfapiridinaSulfamerazina,Sulfametazina

Tiempo %B0 833 3334 33

Fase Móvil:A: 0.1% Ácido Fórmico en AguaB: 0.1% Ácido Fórmico en ACN

Tiempo %B0 812 3313.2 33

mAU

60

80

100

9.71

2

11.1

1611

.59

12.6

74

15.2

48

16.1

5116

.435

687

29.2

90

Sulfametazina, Sulfametazol, Sulfametoxipiridazina,SulfacloropiridazinaSulfametoxazol, Sulfadimetoxina

34 33Columna: Eclipse Plus C184.6 x 250mm, 5umFlujo: 1 mL/min

Columna: 4.6 x 100mmPoroshell 120 EC-C18, 2.7umFlujo: 1.85 mL/min

13 ml de

20

40

60 9

20.6

23.0

76110 bar13 ml de consumo

min5 10 15 20 25 300

mAU

200

250 2.31

1 7.03

7

Análisis más rápido(columna más corta, flujo más alto)Mayor sensibilidad(partícula más pequeña,pico más estrecho)

325 bar

100

150

200

1.71

92.

189

2.60

6

3.86

7

4.43

7 4.5

58

5.45

05.

920

Más optimizado (un análisis más rápido permite ajustar mejor)Ambos análisis en Agilent 1100 G1315B DAD (bajo 400 bar)No se requiere cambio en la preparación de muestra, frita de entrada

de 2 micras en ambas columnas.6 ml de consumo

min5 10 15 20 25 300

50consumo

Page 23

Comparación de 4.6 x 250 mm 5 um con Poroshell120 EC C18 4 6 x 100 mm 2 7um120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7um

96

Ver condiciones en diapositiva anteriormAU

60

80

100

9.71

2

11.1

1611

.59

12.6

74

15.2

48

16.1

5116

.435

687

29.2

90

20

40

60 9

20.6

23.0

76110 bar

min5 10 15 20 25 300

mAU

200

250 2.31

1 7.03

7

325 bar Mejor Resolución ,

50

100

150

200

1.71

9

2.18

9

2.60

6

3.86

7

4.43

7 4.55

8

5.45

0

5.92

0 linea base!!

5

0

50

min

Page 24

Análisis Rápidos de Analgésicos en Poroshell 120 –Son posibles Flujos elevados, para Análisis Rápidos

mAU 1 0 L/ i 142 b

1. Acetaminofen 2. Cafeina 3. 2-acetamidofenol 4. Acetanilida 5. Fenacetin 6. Ácido Salicílico

2

min1 2 3 4

mAU

0

20

401.0 mL/min 142 bar1 3 4 5

6

i

mAU

0

20

40 1.5 mL/min 211 bar

min1 2 3 4mAU

0

20

40 2.0 mL/min 279 bar

min1 2 3 40

mAU

20

40

2.5 mL/min 347 bar

Condiciones: Columna: Poroshell 120 SB-C18, 4.6 x 50mm, 2.7um Fase Móvil: 0.2% Ácido Fórmico 80% agua:20% ACN T t 25 °C D t ió 275 I ió d t 2 l

min1 2 3 40

Month ##, 200XPage 25

ACN Temperatura: 25 °C, Deteción: 275 nm, Inyección de muestra: 2ul

Sub 2um vs. Poroshell 120Análisis de 17 Amino Acidos en 1290 InfinityAnálisis de 17 Amino Acidos en 1290 Infinity

Poroshell 120 EC-C183 0 100 2

mAU

50

3.0 x 100mm, 2.7um

Pmax=331 barF=0.86 mL/min

Rs6,5=1.98 Rs14,13=1.81W½ 9 =0.043 min.

min0 2 4 6 8 10 120

AURRHT Eclipse Plus C183 0 100mm 1 8 mRs =2 28mAU

0

50

3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=474 barF=0.86 mL/min

Rs6,5=2.28Rs14,13=1.81W½ 9 =0.045 min.

min0 2 4 6 8 10 120

mAURRHD Eclipse Plus C183.0 x 100mm, 1.8um

Rs6,5=2.90Rs14 13=2.34

W½ 9 =0.036 min.

i0 2 4 6 8 10 120

50 Pmax=528 barF=0.86 mL/min

Rs14,13 2.34

Group/Presentation TitleAgilent Restricted

Month ##, 200X

min0 2 4 6 8 10 12

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c) Tercer enfoque: Variación de la longitud, el tamaño de particula y el diámetro internotamaño de particula y el diámetro interno

Asegurese de que los cambios de parámetros se ajustan a la normativa definida para la modificacion de métodos en su pmétodo en cuestión.

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Cambiando longitud,diametro y tamaño de partícula de la columnaCambio de columna de 4.6 x 250 mm (5 um) a 3.0 x 100 mm (3.5 um).

Fase Móvil: 25% metanol en 0.4% Ácido Fórmico

ZORBAX SB-C18 4 6 x 250 mm 5 um1mAU

Ajuste de Método:Longitud: -60% (70%)ZORBAX SB-C18, 4.6 x 250 mm, 5 um

1 mL/min

Solvente usado: 34 mL100

125

150

175

3

Longitud: -60% (70%)Tamaño Partícula:-30% (50%)ID: -45% (50% FDA ok)

25

50

75

100

2 45 6

ZORBAX Solvent Saver Plus SB-C18, 3.0 x 100 mm, 3.5 um, 0 425 L/ i

min0 5 10 15 20 25 30 35

0

mAU

150

175

0.425 mL/min

Solvente usado: 5.7 mL, disminuye 83% (disminución en tiempo de análisis de 57%)75

100

125

150

( p )

0

0

25

50

May 4, 201028Page 28

min0 5 10 15 20 25 30 35

Combine RRHT y Solvent Saver para la Máxima Reducción de Solvente Muestra Diet SodaReducción de Solvente – Muestra Diet Soda

Eclipse Plus C184.6 x 150, 5um1

1. Saccharine2. Caffeine

Ajuste de Método:Longitud: -67% (70%)T ñ P tí l 64% (50%)F=1.0 mL/min (P=96 bar)

11 mL/análisis2

43

3. Aspartame4. Benzoic acid

Tamaño Partícula:-64% (50%)ID: -35% (50% FDA ok)

min2 4 6 8 10Solvent Saver HT

43

85%

Solvent Saver HT Eclipse Plus C183.0 x 50, 1.8umF=0.43 (P=181bar)

1.6 mL/análisis

2 3

menossolvente

42 3

Fase Móvil.: A: 20 mM Fosfato B: acetonitrilo A:B (79:21) Temp: 25º C Detección: UV 220nm,16, ref=420,20 Celda de Flujo: 3mm, 2uL Veloc adqu. datos: 1 s Vol. iny 3 uL for 4.6, 1.5 for 3.0 Instrumento Bin 1200SLMuestra: diet soda filtrada en 0 2 um

4

May 4, 201029May 4, 2010Page 29

Muestra: diet soda filtrada en 0.2 um

¿Hay alguna otra forma de ahorrar ACN?

Reciclaje de solvente con o sin detección de pico.• Solamente útil con métodos isocráticos con solventes premezcladosSolamente útil con métodos isocráticos con solventes premezclados• Riesgo de contaminación de solventes• Ruido inesperado y picos en el cromatográma inaceptable a nivel de p y p g p

trazas y análisis regulados

Cambio de solvente a metanol• Puede requerir una revalidación del método.• Puede requerir redesarrollo substancial del método por cambios de

selectividad.• La separación en fase reversa con metanol requiere frecuentemente

tiempos de análisis más largos que con acetonitrilotiempos de análisis más largos que con acetonitrilo.

30

Si tienes que/o quieres cambiar a metanolEmpieza por calcular el procentaje apropiado de metanolp e a po ca cu a e p oce aje ap op ado de e a opara tener la misma fuerza que el acetonitrilo.

Correr la muestra (misma columna)( )

Evaluar la retención y resolución del método• Tendrás tiempos de análisis más largos si tu método contiene compuestos• Tendrás tiempos de análisis más largos si tu método contiene compuestos

básicos• Los compuestos neutros no deberían mostrar mucho cambio• Aunque pueden ocurrir cambios en selectividad y resoluciónAjustar la composición en metanol para cambiar la retenciónsegún se necesite (fuerza isoelutrópica)según se necesite (fuerza isoelutrópica)

Cambia la fase ligada como última opción para ajustar lasnecesidades de selectividad cuando la columna establecida nonecesidades de selectividad cuando la columna establecida no funciona.• Ver Poster de Desarrollo de Métodos, pub no 5989-7282EN para distintas posibilidades.

31

Ver Poster de Desarrollo de Métodos, pub no 5989 7282EN para distintas posibilidades.

Comparación de Acetonitrilo y MeOH para la misma separación- ComportamientoTípico

Columna: ZORBAX RRHT Eclipse Plus C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 μmFase Móvil : A: 25 mM NaH2PO4 , pH 3.0 B: organico

Flujo: 2.0 mL/min Temperatura: 30°C Detección: UV 240 nm 1mAU

80

100

120

140

23 4

j pMuestra: Fármacos Cardíacos 1.Pindolol 2. Disopiridamida 3.Propranolol 4.Diltiazem 5. Dipiridamol

5

1

Resolución de los pares(2,3), (3,4), (4,5)

0

20

40

602

50% MeOH(2,3), (3,4), (4,5)es mejor en MeOH.Cambio de Selectividad enPico 5

1 2 3-20

mAU140 1 3

45

Pico 5

60

80

100

120

30% ACN2Resolución del par critico (1,2), es mejor en ACN

1 2-20

0

20

40( ) j

May 4, 201032

1 2

3) Sugerencias de ahorro no relacionadascon el cambio de método o columnacon el cambio de método o columna

• ¿Puedes reducir el tiempo de estabilización y re-estabilizaciónd l l ? L í d l f d lde la columna? La mayoría de las fases reversas de lascolumnas se equilibrarían con 10 volúmenes de columna.

Ti t ti t bl id h á t d t• ¿Tienes un stop time establecido mucho más tarde que tuúltimo pico y estás gastando solvente extra?

E tá di d ti t áli i ? P d• ¿Estás perdiendo tiempo entre análisis?¿Puedes programartu HPLC para inyectar más rápido o estar preparado parainyectar rapidamente?inyectar rapidamente?

• Aunque el acetonitrilo es un buen solvente para limpieza/almacenamiento ¿podrías emplear metanol para estos/almacenamiento ¿podrías emplear metanol para estospasos?

33

Conclusiones

Puede reducir el consumo de disolvente con los nuevos UHPLC1290 InfinityUHPLC1290 Infinity.Sencillos cambios en la columna para controlar el uso de solvente son efectivos en la reducción del uso de acetonitrilo• ‘Solvent Saver’ (3 mm) y ‘Narrow Bore’ (2.1mm)• ‘Rapid Resolution’ (3.5um) – con columnas más cortas• ‘Rapid Resolution HT’ ó RRHD (1.8um) – con columnas aún más cortas

• Columnas Poroshell (2.7um)- con columnas cortas

Muchos cambios pueden realizarse siguiendo las directricespara ajustes de métodos de los organismos oficiales.

Se requerirá documentación, pero no la completa revalidacióndel método

34

Recursos adicionales

Páginas:

www.agilent.com/chem/savesolventnow

www zorbaxmethod com para cualquierwww.zorbaxmethod.com para cualquierrecomendación de columnas y

métodosmétodos.

Folleto:

Soluciones Agilent ante la escasez de acetonitrilo

Page 35

Soluciones Agilent ante la Escasez de ACN

Page 36