continúa el legado de las columnas hplc - waters.com · las columnas con partículas de núcleo...

Continúa el legado

[ COLUMNAS HPLC ]

de las columnas HPLC

Creación de una cromatografía excepcional

La reputación de Waters se basa en la cromatografía, pero nosotros no

creamos cromatografía: ese es su papel. El pensamiento innovador que

surge de su laboratorio crea los análisis y los métodos cromatográficos

que sustentan su negocio. Los parámetros de su éxito se controlan a

través de los métodos y los resultados que obtiene y la columna de

HPLC que seleccione hoy tiene que respaldar su éxito en el futuro.

Los científicos eligen la gama completa de modernas columnas HPLC

de fase reversa e HILIC que ofrece Waters porque entienden que el

rendimiento y la innovación están vinculados y que su éxito depende

de ellas.

Columnas HPLC

2

CORTECS

XBridge

XSelect

Atlantis

SunFire

Symmetry

XTerra

Waters Spherisorb

Nova-Pak

Resolve

Delta-Pak

µBondaPak/BondaPak

µPorasil/Porasil

3

Las columnas con partículas de núcleo sólido CORTECS® de 2,7 µm maximizan la resolución y la capacidad de picos para todas las sepa-raciones por LC y están optimizadas para incrementar el rendimiento de los instrumentos HPLC. La innovadora tecnología de núcleo sólido y la química enlazada que utilizan las columnas CORTECS le pueden ayudar al proporcionar:

■■ Reducción de la contrapresión de trabajo: menor

contrapresión sin sacrificar la eficacia

■■ Aumento de la sensibilidad: mejora de la relación señal-ruido

para las aplicaciones LC-MS

■■ Simplificación de las transferencias de métodos: compatibilidad con una amplia gama de sistemas

cromatográficos

La selección de columnas CORTECS de 2,7 µm, tanto de fase reversa como de fases HILIC, le aportan flexibilidad para separar rápidamente una amplia gama de clases de compuestos. La mejora de la eficacia de las columnas con núcleo sólido CORTECS de 2,7 µm produce picos mejor definidos y estrechos si se comparan con los que generan las columnas que utilizan substratos totalmente porosos; asimismo, le permiten utilizar caudales más rápidos para poder incrementar la velocidad de análisis de muestras.

Reducción de la contrapresión Las columnas CORTECS reducen la contrapresión de trabajo, lo que

le permite analizar métodos con instrumentos LC convencionales

sin comprometer la eficacia ni la resolución. Además, se pueden usar

columnas más largas para mejorar la resolución de los picos que

coeluyen en mezclas complejas de muestras.

Caudal (mL/min)

2,1 x 50 mm 0,17 0,35 0,52 0,69 0,87 1,043,0 x 50 mm 0,35 0,71 1,06 1,41 1,77 2,124,6 x 50 mm 0,83 1,66 2,49 3,32 4,15 4,99

Caudal (mL/min)

2,1 x 50 mm 0,17 0,35 0,52 0,69 0,87 1,043,0 x 50 mm 0,35 0,71 1,06 1,41 1,77 2,124,6 x 50 mm 0,83 1,66 2,49 3,32 4,15 4,99

Ventajas de las columnas CORTECS de 2,7 µm en cuanto a la eficacia

Ventajas de las columnas CORTECS de 2,7 µm en cuanto a la contrapresión

Efic

acia

(US

P)

Mejor eficacia de su clase

CORTECS C18+, 2,7 μm

C18 totalmente poroso, 2,5 μm

C18 de núcleo sólido del competidor A, 2,6 μm

C18 de núcleo sólido del competidor B, 2,7 μm

Velocidad lineal (cm/min)

Caudal (mL/min)

2,1 x 50 mm 0,17 0,35 0,52 0,69 0,87 1,043,0 x 50 mm 0,35 0,71 1,06 1,41 1,77 2,124,6 x 50 mm 0,83 1,66 2,49 3,32 4,15 4,99

Pre

sión

de

la c

olum

na (p

si)

Un 25% menos contrapresión que la columna de partículas de núcleo sólido de 2,6 µm de la competencia

CORTECS C18+, 2,7 μmC18, totalmente poroso, 2,5 μmC18 de núcleo sólido del competidor A, 2,6 μmC18 de núcleo sólido del competidor B, 2,7 μm

Velocidad lineal (cm/min)

Caudal (mL/min)

2,1 x 50 mm 0,17 0,35 0,52 0,69 0,87 1,043,0 x 50 mm 0,35 0,71 1,06 1,41 1,77 2,124,6 x 50 mm 0,83 1,66 2,49 3,32 4,15 4,99

Las columnas CORTECS de 2,7 µm muestran una eficacia excelente si se comparan con las columnas con partículas de núcleo sólido y totalmente porosas de tamaño similar. Condiciones experimentales: columnas: 2,1 x 50 mm; fase móvil: agua/acetonitrilo (25/75, v/v); temperatura de la columna: 30 ˚C; detección: UV a 254 nm; volumen de inyección: 0,5 µL; compuestos: acenafteno (200 µg/mL), octanofenona (100 µg/mL).

Las columnas CORTECS de 2,7 µm consiguen reducir la contrapresión de trabajo en un 25% sin sacrificar la eficacia. Condiciones experimentales: columnas: 2,1 x 50 mm; fase móvil: agua/acetonitrilo (25/75, v/v); temperatura de la columna: 30 ˚C; detección: UV a 254 nm; volumen de inyección: 0,5 µL; compuestos: acenafteno (200 µg/mL), octanofenona (100 µg/mL).

Es posible que las separaciones mostradas en las comparativas no sean representativas de todas las aplicaciones.


OSi

O

OO

SiO

O

CORTECS C18+ C18 HILIC

Tipo de ligando C18 trifuncional C18 trifuncional Ninguno

Densidad del ligando 2,4 µmol/m2 2,6 µmol/m2 N/A

Carga de carbono 5,7% 6,6% No enlazada

Tipo de recubrimiento final

Patentado Patentado Ninguno

Clasificación USP L1 L1 L3

Rango de pH 2–8 2–8 1–5

Límite de temp. a pH bajo

45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C

Límite de temp. a pH alto

45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C

Diámetro de poro 90 Å 90 Å 90 Å

4

Aumento de la sensibilidad La tecnología de superficie cargada mejora la forma de los picos y la carga de compuestos al usar fases móviles con baja fuerza iónica, tales como

las preparadas con ácido fórmico. La carga superficial permanente de bajo nivel usada durante el proceso de enlace del C18+ mejora la relación señal-

ruido al no tener que utilizar aditivos ni reactivos de par iónico que, de otro modo, afectarían negativamente a las aplicaciones LC-MS.

Forma de pico excelente para el análisis de impurezas a concentraciones bajas

El análisis por HPLC-UV/MS de la imipramina, un antidepresivo básico de baja fuerza iónica, revela la presencia de una impureza de baja concentración. El uso de la columna CORTECS C18+ de 2,7 µm, diseñada para utilizarse con fases móviles ácidas de baja fuerza iónica, da como resultado picos más estrechos y una mejor relación señal-ruido.


Condiciones de LCColumnas: 3,0 x 50 mmFase móvil A: ácido fórmico al 0,1% en aguaFase móvil B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitriloGradiente: del 25 al 35% de B en 4,6 minutosCaudal: 0,8 mL/minTemp. de la columna: 30 SDgrCDetección: UV a 254 nm y ESI+ MSVolumen de inyección: 10 μL

Compuestos Imipramina (0,5 mg/mL) Impureza adicionada al 0,1% (0,5 μg/mL)

%

0

100

1: SIR de 1 canal ES+TIC (impureza adicionada al 0,1%)

3,68e7

1: SIR de 1 canal ES+TIC (impureza adicionada al 0,1%)

3,68e7

0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 min

(1) PDA, canal 1, 254 nm a 4,8 nmRango: 1

Impureza adicionada al 0,1%PW13,4%: 0,089 min

Relación S/N: 180Relación S/N: 113

0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 min

0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 min0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 min

UA

0,0

5,0e-3

1,0e-2

1,5e-2

2,0e-2

2,5e-2

3,0e-2

3,5e-2

4,0e-2

(1) PDA, canal 1, 254 nm a 4,8 nmRango: 8e-1

Impureza adicionada al 0,1%PW13,4%: 0,132 min

C18 de núcleo sólido de la competencia, 2,6 μmPresiónmáx: 3250 psi

CORTECS C18+, 2,7 μmPresiónmáx: 2750 psi

Aumento del 60% en la relación S/N

Reducción del 35% en la anchura del picoImipramina Imipramina

5

6

www.waters.com/cortecs

Transferencia de métodos sencilla Se puede usar una selección específica de 3 fases para separar una amplia gama de clases

de compuestos. Las fases enlazadas de fase reversa CORTECS C18 y C18+ proporcionan a los

técnicos en cromatografía un perfil de retención equilibrado de ácidos, bases y compuestos

neutros, mientras que la fase CORTECS HILIC ortogonal no enlazada ofrece una retención

superior de analitos polares. Gracias a tamaños de partículas que son compatibles con las

plataformas HPLC, UPLC® y UHPLC, cualquier método desarrollado puede transferirse de

forma óptima y sencilla sin que surjan limitaciones por el tamaño de partícula, la configura-

ción de la columna o el fabricante del instrumento.

Se pueden escalar y transferir métodos desarrollados con columnas totalmente porosas de 5 µm a columnas más cortas de 2,7 µm. Para mejorar aún más la eficacia y la productividad, se pueden usar columnas UPLC con tamaños de partícula inferiores a 2 µm, lo que permite una mayor flexibilidad y reproducibilidad de métodos al realizar la transferencia entre laboratorios de una misma organización o a socios con vinculación contractual.

1

2

34

5

UA

0,00

0,01

0,02

UA

0,00

0,01

0,02

UA

0,00

0,01

0,02

12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 22,0 24,0 26,0 28,0 30,0 min

3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 min

UA

0,00

0,01

0,02

3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 min

1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 min

C18 totalmente poroso, 5 μm, 4,6 x 150 mmCaudal: 1,00 mL/minVolumen de inyección: 8 μLSistema: Alliance® HPLC

CORTECS C18+, 2,7 μm, 4,6 x 75 mmCaudal: 1,85 mL/minVolumen de inyección: 4 μLSistema: Alliance® HPLC

CORTECS C18+, 2,7 μm, 4,6 x 75 mmCaudal: 1,85 mL/minVolumen de inyección: 4 μLSistema: ACQUITY UPLC® H-Class

CORTECS UPLC C18, 1,6 μm, 2,1 x 50 mmCaudal: 0,65 mL/minVolumen de inyección: 0,6 μLSistema: ACQUITY UPLC H-Class

Método original

Transferencia a 2,7 µm

Método 4 veces más rápido

Dos veces menos eluyente

Compatible con sistemas

HPLC, UHPLC y UPLC

Transferencia a 1,6 µm

Método 9 veces más rápido

12 veces menos eluyente

Transferencia de métodos USP de abacavir en función del tiempo y del consumo de eluyente

Compuestos 1. Desciclopropilabacavir 2. Abacavir 3. 1R,4R trans-abacavir 4. o-(4-cloro-2,5-diaminopirimidina)-abacavir 5. o-t-butilo-abacavir


Condiciones de LCFase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1% en aguaFase móvil B: metanol al 85% en aguaColumna A: columna C18 totalmente porosa de 5 μm,

4,6 x 150 mmColumna B: columna CORTECS C18 de 2,7 μm, 4,6 x 75 mmColumna C: columna CORTECS C18 de 1 6 μm, 2,1 x 50 mmGradientes escalados geométricamente (es decir, los mismos volúmenes de columna por paso de gradiente):Columna A: del 5 al 30% de B en 23,6 minutos y del 30 al 90% de B en 14,8 minutosColumna B: del 5 al 30% de B en 6,4 minutos y del 30 al 90% de B en 4,0 minutosColumna C: del 5 al 30% de B en 2,5 minutos y del 30 al 90% de B en 1,6 minutosFase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1% en aguaFase móvil B: metanol al 85% en agua

[ENCABEZADO INTERIOR DEL FOLIO]

7

* Valor esperado o aproximado.

Las columnas para HPLC XBridge® están concebidas para un único propósito: maximizar la productividad. Tanto si su objetivo es crear un método de control de calidad como desarrollar un ensayo LC/MS de vanguardia, las columnas XBridge le pueden

ayudar al proporcionar:

■■ Mejora de la estabilidad frente al pH: aumento de la vida

útil de la columna

■■ Mejora de la fiabilidad de la columna: análisis más

robustos

■■ Maximización de la eficacia de las partículas: forma y

capacidad de picos inigualables

Con una selección de 10 fases enlazadas diferentes para aplicaciones de uso general y específicas, que abarcan la gama más amplia de tamaños de partículas que se encuentra disponible, ninguna otra familia de columnas HPLC le proporciona las herramientas necesarias para los retos cromatográficos más exigentes. Tanto si se necesitan métodos HPLC robustos, una transferencia óptima a UPLC® o un escalado preparativo para el aislamiento de productos, se puede contar con la versatilidad de una columna XBridge.

XBridge C18 C8 Shield RP18 Fenilo HILIC Amida Péptidos BEH C18, 130 Å Péptidos BEH C18, 300 Å Proteínas BEH C4, 300 Å Oligo BEH C18

Tipo de ligando C18 trifuncional C8 trifuncionalGrupo polar integrado

monofuncional Fenilo-hexilo trifuncional

Partícula BEH no enlazada

Amida C18 trifuncional C18 trifuncional C4 monofuncional C18 trifuncional

Densidad del ligando* 3,1 µmol/m2 3,2 µmol/m2 3,3 µmol/m2 3,0 µmol/m2 N/A 7,5 µmol/m2 3,1 µmol/m2 3,1 µmol/m2 2,4 µmol/m2 3,1 µmol/m2

Carga de carbono* 18% 13% 17% 15% No enlazada 12% 18% 12% 8% 18%

Tipo de recubrimiento final Patentado Patentado TMS Patentado N/A Ninguno Patentado Patentado Ninguno Patentado

Clasificación USP L1 L7 L1 L11 L3 - L1 L1 L26 L1

Rango de pH 1–12 1–12 2–11 1–12 1–9 2–1 1–12 1–12 1–10 1–12

Límite de temp. a pH bajo 80 °C 60 °C 50 °C 80 °C 45 °C 90 °C 80 °C 80 °C 80 °C 80 °C

Límite de temp. a pH alto 60 °C 60 °C 45 °C 60 °C 45 °C 90 °C 60 °C 60 °C 50 °C 60 °C

Diámetro de poro* 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 300 Å 300 Å 130 Å

Área superficial* 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 90 m2/g 90 m2/g 185 m2/g

Tamaño de partícula2,5; 3,5; 5;

10 µm2,5; 3,5; 5;

10 µm2,5; 3,5; 5;

10 µm2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5 µm 3,5; 5; 10 µm 3,5; 5; 10 µm 3,5 µm 2,5 µm

OSi

O

O

OSiO

O

OSiO

O

OSi

CH Polar Group

3

CH3

OSi

O

O

OSiO

O

OSiO

O

OSi

CH Polar Group

3

CH3

OSi

O

O

OSiO

O

OSiO

O

OSi

CH Polar Group

3

CH3

OSi

O

O

OSiO

O

OSiO

O

OSi

CH Polar Group

3

CH3

Prueba acelerada de estabilidad a pH alto de las columnas de la competencia

0 50 100 150 200 horasHoras con 50 mM de TEA, pH 10, 50 °C

Analito: Acenafteno

30

50

70

90

110

% N

5s in

icia

lXBridge C18

XTerra® MS C18

Gemini™ C18

Luna® C18(2)

YMC™ Pro C18

Zorbax® Extend C18

Los cromatogramas, obtenidos a intervalos regulares durante el estudio de vida útil a pH alto, demuestran que el 86% de la eficacia original de las columnas XBridge se mantiene después de 300 horas a un pH de 10 y a una temperatura elevada, con pocos cambios en la forma de los picos o en el tiempo de retención.

Estabilidad frente al pH Las columnas XBridge se han diseñado de manera específica para contener las fases enlazadas cromatográficas más estables desde el punto de vista químico que se encuentran disponibles, lo que le permitirá explorar todas las ventajas que aporta el poder utilizar fases móviles con un amplio rango de pH (1-12). La estabilidad química, especialmente para los valores extremos de pH, se incorpora a las partículas durante el proceso de síntesis y no se puede reproducir mediante el proceso convencional de enlace a la base de sílice. Ninguna otra columna puede igualar la estabilidad química de una columna XBridge.

8

Fiabilidad de la columna La mayoría de los costes derivados del desarrollo de un método

cromatográfico están asociados con el riguroso proceso de

evaluación y validación del método final. Entendemos que

la revalidación del método no es una opción, de modo que

evaluamos meticulosamente cada lote de columnas y fases

enlazadas para garantizar las columnas más reproducibles que se

encuentran disponibles. Con una columna XBridge, puede estar

seguro de que el método que desarrolle hoy será reproducible

durante toda la vida útil del análisis.

Eficacia de las partículas Las partículas híbridas con puentes de etileno (BEH) ofrecen

muchas ventajas con respecto a las partículas basadas en sílice

convencionales, incluida la capacidad para controlar la actividad

silanólica con gran precisión. Al controlar la actividad silanólica,

se controlan y reducen las interacciones silanólicas no deseadas

que aumentan la asimetría de los picos.

Factores de asimetría USP de la familia XBridge

1

2

3

C8 Zorbax®

SB-C18

Desipramina

Amitriptilina

pH 3 pH 7

Nortriptilina

Amitriptilina

Fact

or d

e as

imet

ría (T

f)

Fenilo Shield RP18 C18

XBridge C18 C8 Shield RP18 Fenilo HILIC Amida Péptidos BEH C18, 130 Å Péptidos BEH C18, 300 Å Proteínas BEH C4, 300 Å Oligo BEH C18

Tipo de ligando C18 trifuncional C8 trifuncionalGrupo polar integrado

monofuncional Fenilo-hexilo trifuncional

Partícula BEH no enlazada

Amida C18 trifuncional C18 trifuncional C4 monofuncional C18 trifuncional

Densidad del ligando* 3,1 µmol/m2 3,2 µmol/m2 3,3 µmol/m2 3,0 µmol/m2 N/A 7,5 µmol/m2 3,1 µmol/m2 3,1 µmol/m2 2,4 µmol/m2 3,1 µmol/m2

Carga de carbono* 18% 13% 17% 15% No enlazada 12% 18% 12% 8% 18%

Tipo de recubrimiento final Patentado Patentado TMS Patentado N/A Ninguno Patentado Patentado Ninguno Patentado

Clasificación USP L1 L7 L1 L11 L3 - L1 L1 L26 L1

Rango de pH 1–12 1–12 2–11 1–12 1–9 2–1 1–12 1–12 1–10 1–12

Límite de temp. a pH bajo 80 °C 60 °C 50 °C 80 °C 45 °C 90 °C 80 °C 80 °C 80 °C 80 °C

Límite de temp. a pH alto 60 °C 60 °C 45 °C 60 °C 45 °C 90 °C 60 °C 60 °C 50 °C 60 °C

Diámetro de poro* 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 130 Å 300 Å 300 Å 130 Å

Área superficial* 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 90 m2/g 90 m2/g 185 m2/g


10 µm2,5; 3,5; 5;

10 µm2,5; 3,5; 5;

10 µm2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5 µm 3,5; 5; 10 µm 3,5; 5; 10 µm 3,5 µm 2,5 µm

O Si O

O

O

NH 2Link

er

OSi

O

O

OSiO

O

OSiO

O

OSi

CH Polar Group

3

CH3

OSi

O

O

OSiO

O

OSiO

O

OSi

CH Polar Group

3

CH3

OSi

O

O

OSiO

O

OSiO

O

OSi

CH Polar Group

3

CH3

OSi

CH 3

CH3

OSi

CH 3

C4

C4

H 9

H 9

CH3

La combinación de la excelente estabilidad tanto de los ligandos como de las partículas, así como la elevada eficacia cromatográfica, convierte a las columnas XBridge en la elección ideal para los métodos a pH bajos e intermedios.


9

www.waters.com/xbridge

Condiciones de LC Sistema: ACQUITY UPLC con detector TUV Columnas: XBridge C18, 5 μm, 2,1 x 150 mm XBridge C18, 3,5 μm, 2,1 x 100 mm XBridge C18, 2,5 μm, 2,1 x 75 mm ACQUITY UPLC BEH C18, 1,7 μm, 2,1 x 50 mm Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1% en aguaFase móvil B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitriloCaudal: consultar el cromatograma anterior Volumen de inyección: consultar el cromatograma anteriorIsocrática: 95% A:5% BDiluyente de la muestra: acetonitrilo al 3% en agua con ácido fórmico al 0,1%Conc. de la muestra: 25 μg/mLTemp. de la columna: 38 °CDetección: UV a 280 nmVelocidad de adquisición: 40 pts/s Constante de tiempo: 0,05

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 min

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 min

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 min

1,1 min

1,7 µm – 50 mmInyección: 1,7 µL

Caudal: 0,6 mL/min

5 µm – 150 mm Inyección: 5,0 µL

Caudal: 0,2 mL/min


Caudal: 0,5 mL/min


Caudal: 0,3 mL/min

Transferencia de métodos con columnas de 2,5 μm Todas las columnas para HPLC XBridge y XSelect® (que se describen en la siguiente página) se ofrecen con los formatos eXtended Performance [XP] de 2,5 µm a fin de ayudarle a transferir los métodos de los instrumentos HPLC a los UPLC. Las columnas XP de 2,5 µm mejoran el rendimiento de los instrumentos HPLC actuales y permiten conseguir una efica-cia de separación máxima mediante la tecnología ACQUITY UPLC con tamaños de partícula

inferiores a 2 µm.

Columnas de diferentes longitudes y tamaños de partículas se han utilizado para reducir satisfactoriamente los tiempos de análisis y mantener la resolución.

Separaciones escalables

10


11

OSi

FF

F

FF

O

OO

SiO

OO

SiO

OO

SiO

OO

SiO

OO

SiO

OO

Si

FF

F

FF

O

OO

SiCN


Los substratos o partículas base influyen de manera

fundamental en la selectividad del analito; el ligando enlazado

ejerce una influencia secundaria. Cada uno de ellos, cuando

se usa por separado, no genera cambios de selectividad

notorios; sin embargo, juntos, el substrato y el ligando crean

las herramientas definitivas para mejorar la selectividad del

analito. Es por este motivo que la familia de columnas XSelect

contiene tanto la tecnología de partículas de sílice de alta

resistencia (HSS) como la de partículas híbridas de superficie

cargada (CSH™) con una optimización única de ligandos

enlazados. El resultado es una gran reproducibilidad y una alta

selectividad.

Las columnas para HPLC XSelect están concebidas para los

científicos encargados de desarrollar métodos, que exigen la

selección más diversa de fases enlazadas para separar con

facilidad las coeluciones de analitos más dificultosas. Las

columnas XSelect son herramientas que están:

■■ Diseñadas para la selectividad: mejoran la capacidad para

separar picos que eluyen muy cerca

■■ Concebidas para el aislamiento y la purificación:

proporcionan la mayor capacidad de carga de analito que se

encuentra disponible

■■ Ideales para el rápido desarrollo métodos: reducen el

tiempo y los costes asociados al desarrollo de métodos

XSelect CSH C18

CSH fenilo-hexilo

CSH fluorofenilo

HSS T3 HSS C18 HSS C18 SB HSS PFP HSS CN

Tipo de ligando C18 trifuncionalC6 fenilo trifun-

cionalPropilfluorofenilo

trifuncionalC18 trifuncional C18 trifuncional C18 trifuncional

Pentafluorofenilo trifuncional

Cianopropilo monofuncional

Densidad del ligando* 2,3 µmol/m2 2,3 µmol/m2 2,3 µmol/m2 1,6 µmol/m2 3,2 µmol/m2 1,6 µmol/m2 3,2 µmol/m2 2,0 µmol/m2

Carga de carbono* 15% 14% 10% 11% 15% 8% 7% 5%

Tipo de recubrimiento final

Patentado Patentado Ninguno Patentado Patentado Ninguno Ninguno Ninguno

Clasificación USP L1 L11 L43 L1 L1 L1 L43 L10

Rango de pH 1–11 1–11 1–8 2–8 1–8 2–8 2–8 2–8


80 ˚C 80 ˚C 60 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C


45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C

Diámetro de poro* 130 Å 130 Å 130 Å 100 Å 100 Å 100 Å 100 Å 100 Å

Área superficial* 185 m2/g 185 m2/g 185 m2/g 230 m2/g 230 m2/g 230 m2/g 230 m2/g 230 m2/g


10 µm2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm 2,5; 3,5; 5 µm

12


0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 min

1

2

3 45,6 7

34

34 56 7

12

34 5

6 7

12

34

56

7

5,6

12

3 4

5,67

HSS C18 SB

HSS C18

HSS T3

HSS CN

HSS PFP

CSH fluorofenilo

CSH fenilo-hexilo

CSH C18

Condiciones de LC Sistema: ACQUITY UPLC con detector PDA Columnas: 2,1 x 50 mm Fase móvil A: 10 mM de formiato de de amonio, pH de 3,0Fase móvil B: metanol Caudal: 0,4 mL/min Volumen de inyección: 1 μLDiluyente de la muestra: aguaTemp. de la columna: 30 °C

Gradiente: Tiempo(min)

%A %B

0,00 70 303,00 15 853,50 15 853,51 70 304,50 70 30

Detección: UV a 260 nmVelocidad de adquisición: 20 pts/sRespuesta del filtro: normal

Mejora de la selectividad La selectividad y la capacidad de retención son las herramientas más poderosas que poseen los desarrolladores de métodos para influir en el comportamiento cromatográfico. La familia XSelect ofrece una variada gama de columnas C18 de fase reversa (por ejemplo, CSH C18, HSS C18 y HSS C18 SB) para separaciones de fines generales, así como columnas que proporcionan un incremento de la retención polar (T3) y mayores opciones de selectividad (fenilo-hexilo, fluorofenilo y ciano) para el desarrollo de métodos.

Las columnas XSelect proporcionan diversas selectividades de analitos

UA

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Imip

ram

ina

Imip

ram

ina

2,0%

1,0%

0,5% 0,1%

2,0% 1,0%

0,5% 0,1%

Amitriptilina

Concentraciones de imipraminamantenidas constantes a 0,5 mg/mL

Amitriptilina

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 min

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 min

ACQUITY UPLC CSH C18

UA

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Kinetex® C18

Condiciones de LCSistema: ACQUITY UPLC H-Class con detector PDA para ACQUITY UPLCColumnas: 2,1 x 50 mmFase móvil A: aguaFase móvil B: acetonitriloFase móvil C: ácido fórmico al 2% en aguaGradiente: Tiempo

(min)Flujo

(mL/min) %A %B %C Curva

inicial 0,6 70 25 5 inicial2,0 0,6 60 35 5 63,0 0,6 0 95 5 63,1 0,6 70 25 5 65,0 0,6 70 25 5 6

Volumen de inyección: 5 μLDiluyente de la muestra: aguaConc. de la muestra: imipramina: 0.5 mg/mL; amitriptilina: como se indica (% de la imipramina)Temp. de la columna: 40 °CDetección: UV a 254 nmEluyente de lavado: acetonitrilo/agua 50/50 Eluyente de purga: acetonitrilo/agua 50/50

Aislamiento y purificación Las aplicaciones de alta capacidad de carga, como la purificación de compuestos, la obtención de perfiles de impurezas y las pruebas de disolución, exigen que las columnas tengan un excelente rendimiento. En el caso de estos tipos de aplicaciones, la carga de la columna está limitada por su incapacidad para mantener una forma de picos simétrica. Esto se pone de manifiesto por el excesivo ensanchamiento del pico del compuesto principal, el cual, con frecuencia, oculta las impurezas traza que se tratan de eliminar durante la purificación. Las columnas XSelect CSH proporcionan de forma sistemática picos estrechos bajo condiciones de carga altas y otorgan al técnico en cromatografía la posibilidad de separar productos de degradación o impurezas a nivel de trazas y, por tanto, permiten una

mayor capacidad de carga reduciendo el tiempo y el consumo de eluyente.

Mantenimiento de la forma de los picos con una alta capacidad de carga

Diferencias de selectividad observadas para una mezcla de analitos básicos. Compuestos: [1] aminopirazina, [2] pindolol, [3] quinina, [4] labetalol, [5] verapamilo, [6] diltiazem, [7] amitriptilina.

La mejora de la capacidad de carga de las columnas XSelect permite la separación, identificación y cuantificación de productos de degradación o impurezas que eluyen muy cerca.

13

Desarrollo y transferencia de métodos Al desarrollar métodos, los técnicos en cromatografía experimentados se dan cuenta de que el desarrollo de cualquier método que utilice únicamente columnas selectivas debe poder transferirse con facilidad entre un laboratorio y otro, independientemente de la plataforma de LC usada. Las columnas XSelect se han diseñado para el desarrollo de métodos y son completamente compatibles con todos los modos de detección modernos.

Condiciones de LCSistema: ACQUITY UPLC con detector PDA para ACQUITY UPLC Columnas: 2,1 x 50 mmCaudal: 0,5 mL/minFase móvil A: 15,4 mM de formiato de amonio, pH de 3,0Fase móvil B: acetonitriloGradiente: lineal del 5% al 90% de B en 5 minutosVolumen de inyección: 5 μLDiluyente de la muestra: aguaTemp. de la columna: 30 °CDetección: UV a 254 nmVelocidad de adquisición: 20 pts/sRespuesta del filtro: normal

Separaciones reproducibles y escalables

3,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 4,0 min

1 2

3 4

5 6

7

8

9

10 XSelect CSH fluorofenilo, 5 µm

XSelect CSH fluorofenilo, 3,5 µm

ACQUITY UPLC CSH fluorofenilo, 1,7 µm

Reproducibilidad y escalabilidad de separaciones por gradiente con columnas de 2,1 x 50 mm que contienen nueve lotes diferentes de CSH fluorofenilo que representan tres tamaños de partículas (1,7, 3,5 y 5 µm).

Compuestos 1. Tiourea2. Resorcinol3. Metoprolol4. 3-nitrofenol5. Ácido 2-clorobenzoico6. Amitriptilina7. Dietilftalato8. Fenoprofeno9. Dipropilftalato10. Ácido pirenosulfónico

www.waters.com/xselect14


15


Atlantis T3 dC18 HILIC Silica

Densidad del ligando*

1,6 µmol/g 1,6 µmol/g N/A

Carga de carbono* 14% 12% N/A

Tipo de recu-brimiento final

Patentado Patentado N/A


Rango de pH 2–8 3–7 1-5


45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C


45 ˚C 45 ˚C 45 ˚C

Diámetro de poro* 100 Å 100 Å 100 Å

Área superficial* 330 m2/g 330 m2/g 330 m2/g

Tamaño de partícula 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm

OSiO

O

Las columnas para HPLC Atlantis® no solo ofrecen un rendimiento,

una versatilidad y una retención excepcionales para los

compuestos polares, sino además una retención equilibrada para

las mezclas complejas de analitos. Compatibilidad con fases móviles totalmente acuosas Para maximizar la retención de los compuestos polares con

métodos de fase reversa, es posible utilizar las columnas

HPLC de fase reversa Atlantis con tampones y fases móviles

muy acuosas sin correr el riesgo de que se produzca la

deshumectación de los poros ni el colapso hidrofóbico de la fase

estacionaria.

Larga vida útil de las columnas con fases móviles de pH bajo Las columnas Atlantis resisten la hidrólisis del ligando cuando se usan

fases móviles muy ácidas, lo que mantiene la eficacia del método, la

retención del compuesto y la selectividad crítica del analito.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

20 horas de exposición a TFA al 0,5% y a una temperatura de 60 °C

Atlantis

T3

SunFire C 18

Pheno

menex

® Syn

ergi™

Hyd

ro-RP

Shis

eido C

apce

ll PAK

® AQ

Pheno

menex

® Synerg

i™ P

olar-R

P

Agilen

t Zorb

ax E

clips

e® Plus

Atlantis

dC 18

Pheno

menex

® Aqu

a

YMC Hyd

rosph

ere™

C18

GL Scie

nces

Inert

sil® O

DS-SP

YMC-Pac

k™ O

DS AQ™

Durante esta prueba acelerada, las columnas se expusieron a unas condiciones de pH bajo y alta temperatura para determinar la influencia de la pérdida del ligando a causa de la hidrólisis. El enlace de la columna Atlantis T3 resiste la hidrólisis del ligando y mantiene la retención del analito bajo condiciones extremadamente adversas de la fase móvil.

% d

e pé

rdid

a de

rete

nció

n pa

ra e

l met

ilpar

aben

o


16

Retención de compuestos polares sin reactivos de par iónico La eliminación de los reactivos de par iónico mejora los límites de detección, así como la robustez y la reproducibilidad del método; al mismo tiempo, reduce las labores de mantenimiento del instrumento debidas a las condiciones adversas de la fase móvil.

20 horas de exposición a TFA al 0,5% y a una temperatura de 60 °C

Condiciones de LC Columna: 4,6 x 150 mmFase móvil: 10 mM de formiato de amonio, pH de 3,0Caudal: 1,3 mL/min para 3 µmVolumen de inyección: 2,0 µLTemp. de la columna: 30 °CDetección: 254 nmVelocidad de adquisición: 10 pts/sSistema: Alliance 2695 con detector de absorbancia de doble longitud de onda 2487Compuestos1. Tiourea2. 5-fluorocistina3. Adenina4. Guanosina-5'-monofosfato5. Timina

Retención de compuestos polares

Separación de analitos muy polares con la columna Atlantis T3 y con columnas de la competencia. Los científicos confían en la forma de picos y en la retención inigualables que solo pueden ofrecer las columnas Atlantis.

1 2 3 4

5

12

43,5

1

2

3,4

5

1 2

4

3

5

1 23

45

0 1 2 3 4 5 6 7 8 min

Atlantis T3

Agilent Zorbax® SB-AQ

Thermo Hypersil Gold AQ™

Phenomenex® Synergi™ Hydro-RP

Shiseido Capcell PAK® C18 AQ


www.waters.com/atlantis17


SunFire C8 C18 Sílice

Densidad del ligando*

3,5 µmol/g 3,5 µmol/g N/A

Carga de carbono* 12% 16% N/A

Tipo de recu-brimiento final

Patentado Patentado N/A


Rango de pH 2–8 2–8 2–8


40 ˚C 50 ˚C 55 ˚C


40 ˚C 40 ˚C 45 ˚C

Diámetro de poro* 100 Å 100 Å 100 Å

Área superficial* 340 m2/g 340 m2/g 340 m2/g


10 µm2,5; 3,5; 10 µm 2,5; 3,5; 10 µm

OSiO

CH 3O

SiO

CH 3

Separación isocráticaFase móvil A: 20 mM de fosfato de dipotasio al 35%/ 20 mM de fosfato monopotásico con un pH de 7,0Fase móvil B: metanol al 65%Longitud de onda: 254 nmCaudal: 1,0 mL/minVol. de inyección: 14 µLTemp. de la columna: 23 ˚CSistema: Alliance 2695 con detector de absorbancia de doble longitud de onda 2487Compuestos1. Uracilo 2. Propranolol 3. Butilparabeno 4. Naftaleno

0

12

3

4

5 6

5 10 15 20 25 30 35 40 min

TUSP – 1,26

TUSP – 1,35

TUSP – 1,79

SunFire C18 4,6 x 150 mm, 5 µm

Phenomenex® Luna® C18 (2) 4,6 x 150 mm, 5 µm

ACT® Ace® C18 4,6 x 150 mm, 5 µm


Las columnas SunFire™ se han convertido en el estándar de referencia de las columnas para HPLC de sílice enlazada a C18 y C8 más modernas. Gracias a varios años de investigación y desarrollo de productos, las columnas SunFire son el resultado de lo mejor de los conocimientos técnicos en cuanto a partículas y enlaces; asimismo, ofrecen un nivel de rendimiento cromatográfico líder en el sector.

Excelente estabilidad a pH bajos Con fases móviles de pH bajo, las columnas SunFire tienen una

vida útil que supera a la de muchas marcas de columnas para

HPLC basadas en sílice. Alta eficacia Se precisa una combinación sinérgica de síntesis de partículas,

tecnología de relleno e ingeniería de hardware para lograr

una eficacia alta. Las columnas SunFire Intelligent Speed™

(IS™) y Optimum Bed Density (OBD™) se han desarrollado

específicamente a partir de estos conocimientos. Formas de picos excelentes Durante años, las columnas SunFire han proporcionado picos

simétricos para mejorar la resolución de los compuestos ácidos,

neutros y básicos a rangos de pH bajos y moderados (2–8).

Comparación entre las formas de picos de las columnas SunFire

18

www.waters.com/sunfire

0 5 10 15 20 25 30 35 40 min

Lote 112 (2005)

Lote 118 (2007)

Lote 130 (2007)

Lote 134 (2008)

Reproducibilidad entre lotes de las columnas SunFire

Esta excelente reproducibilidad es consecuencia de nuestro compromiso de mantener las especificaciones más estrictas en el sector de las columnas HPLC. Las columnas SunFire parten de materias primas de alta pureza y se producen mediante procesos de fabricación y procedimientos de empaquetado de columnas controlados que ofrecen a los científicos actuales las mejores y más reproducibles columnas para HPLC que se encuentran disponibles.

Reproducibilidad entre lotes Waters se compromete con el mantenimiento de las

especificaciones más estrictas en el sector de la HPLC. Los

procesos de fabricación y los procedimientos de empaquetado

de columnas controlados le aseguran que recibirá la mejor y

más reproducible columna HPLC que se encuentra disponible.

19

Symmetry Symmetry

C18

Symmetry C8

SymmetryShield RP18

SymmetryShield RP18

Symmetry300 C18

Symmetry300 C4

Tamaño de partícula 3,5; 5µm 3,5; 5 µm 3,5 µm 5 µm 3,5 µm 5 µm

Forma de las partículas Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica

Tamaño de poro 100 Å 100 Å 100 Å 100 Å 300 Å 300 Å

Carga de carbono 12% 12% 15% 17% 8,5% 2,8%

Recubrimiento final Si Si Si Si Si Si

OSi

CH3

CH3

OSi

CH 3

CH 3

OSi

CH 3

CH 3

OSi

CH3

CH3

OSi

CH Polar Group

3

CH 3O

SiCH Polar G

roup

3

CH 3

Las columnas Symmetry® se fabrican con sílice de alta pureza y mediante procesos de fabricación controlados de forma estricta para garantizar que recibirá una columna que supere los estándares establecidos para el rendimiento de las columnas HPLC. Ninguna otra marca de columnas para LC basadas en sílice puede igualar la reproduc-ibilidad entre columnas y entre lotes de la familia Symmetry. Las columnas Symmetry están disponibles en formatos de columna,

de cartucho y de precolumna:

■■ Columnas Symmetry C18 y C8:

ofrecen la máxima reproducibilidad

■■ Columnas SymmetryShield™ RP18 y RP8:

ofrecen una forma de picos excelente

■■ Columnas Symmetry300™ C18 y C4: ofrecen recuperaciones

elevadas de péptidos y proteínas

0,0

1 2

3

4

1,50 3,0 4,5 6,00 7,5 9,0 10,5 12,0

Lote 136 (1998)

Lote 142 (1998)

Lote 149 (1999)

Lote 151 (2000)

Lote 156 (2001)

13,5 15,0 min

Reproducibilidad sin igual un año tras otro.

Reproducibilidad entre lotes de las columnas Symmetry

Condiciones de LCColumna: Symmetry C18, 5 µm, 4,6 x 150 mm Fase móvil A: aguaFase móvil B: acetonitriloFase móvil C: pH de 3,75; 100 mM de formiato de amonio en agua Caudal: 1,4 mL/minIsocrática: 30% A; 60% B; 10% C

RSD para tiempos de retención1. Terbinafina HCI 0,7% 2. Ibuprofeno 0,8%3. Lovastatina 0,6%4. Simvastatina 0,7%

Columnas Symmetry para la máxima reproducibilidad Puede confiar en las columnas para HPLC Symmetry si desea que

el rendimiento sea robusto y reproducible. Los estrictos intervalos

de las especificaciones de las columnas minimizan la variación

y le ofrecen la seguridad de que, el día de mañana, podrá seguir

utilizando los métodos que usa hoy en día.

Volumen de inyección: 5,0 µLTemperatura: 30 °CDetección: UV a 233 nm

20

Symmetry Symmetry

C18

Symmetry C8

SymmetryPrep™ C18

SymmetryPrep C8

SymmetryShield RP18

SymmetryShield RP18

Symmetry300 C18

Symmetry300 C4

Tamaño de partícula 3,5; 5 µm 3,5; 5 µm 7 µm 7 µm 3,5 µm 5 µm 3,5 µm 5 µm

Forma de las partículas Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica

Tamaño de poro 100 Å 100 Å 100 Å 100 Å 100 Å 100 Å 300 Å 300 Å

Carga de carbono 12% 12% 19% 12% 15% 17% 8,5% 2,8%

Recubrimiento final Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí

Columnas Symmetry para formas de picos excelentes Las columnas SymmetryShield incorporan la tecnología de grupos

polares integrados patentada por Waters; dicha tecnología protege los

silanoles residuales de la sílice de los analitos muy básicos y mejora la

forma general de los picos. Además, al colocar el grupo polar integrado

cerca de la superficie de sílice, la actividad de los silanoles superficiales

se reduce aún más. De este modo, se confiere una selectividad y una

retención diferentes de las del ligando Symmetry C18.

Reproducibilidad sin igual un año tras otro.

Reproducibilidad entre lotes de las columnas Symmetry

RSD para tiempos de retención1. Terbinafina HCI 0,7% 2. Ibuprofeno 0,8%3. Lovastatina 0,6%4. Simvastatina 0,7%

La tecnología de grupos polares integrados mejora la selectividad y las formas de los picos cromatográficos.

Las columnas SymmetryShield ofrecen una selectividad única

Factor de asimetría USP = 1,2

SymmetryShield RP18

Factor de asimetría USP = 1,9

Symmetry C18

0 5 10 15 20 25

12

3

4

5

7 6

0 5 10 15 20 25

1 2

3

4

56

7

UA

UA

30 min

30 min

Condiciones de LCColumna: SymmetryShield RP18, 5 µm, 3,9 x 150 mm Symmetry C18, 5 µm, 3,9 x 150 mm Fase móvil: metanol al 65%; 20 mM de fosfato monopotásico al 35%/ fosfato de dipotasio con un pH de 7Caudal: 1,0 mL/minDetección: UV a 254 nmTemp. de la columna: 23 °C

Compuestos 1. Uracilo2. Propranolol3. Butilparabeno4. Dipropilftalato5. Naftaleno6. Amitriptilina7. Acenafteno

Volumen de inyección: 5,0 µLTemperatura: 30 °CDetección: UV a 233 nm

www.waters.com/symmetry21

Las columnas XTerra® MS, Shield RP y Phenyl combinan las mejores propie-

dades de la sílice y de las fases enlazadas poliméricas con la tecnología

patentada de partículas híbridas, que reemplaza uno de cada tres silanoles

por un grupo metilo durante la síntesis de partículas. Solo se puede con-

seguir dicho reemplazo durante la síntesis de partículas inicial; asimismo,

la inclusión de este grupo metilo es una parte integral de la estructura de

las partículas base. El resultado es un partícula mecánicamente fuerte que

puede usarse para separaciones a pH altos; como consecuencia, se mejora

la carga y las formas de picos de los compuestos básicos.

La eficacia de la sílice con la estabilidad de los polímeros La gran mayoría de las separaciones HPLC de fase reversa tienen lugar

en fases estacionarias basadas en sílice. A la sílice se le ha atribuido

durante mucho tiempo una eficacia elevada y una gran resistencia

mecánica. Sin embargo, la sílice tiene como inconvenientes la obten-

XTerra MS C18 RP18 RP8 Fenilo

Tamaño de partícula 2,5; 3,5; 5; 10 µm

3,5; 5; 10 µm

3,5; 5; 10 µm 3,5; 5 µm

Forma de las partículas

Esférica Esférica Esférica Esférica

Tamaño de poro 125 Å 125 Å 125 Å 125 Å

Carga de carbono 15,5% 15,0% 13,5% 12,0%

Recubrimiento final Sí Sí Sí Sí

Proceso de fabricación tradicional de la sílice Partículas de sílice enlazadas y con recubrimiento final

Proceso de fabricación del relleno híbrido de primera generación (XTerra) Mucho más que una modificación de la superficie Partículas XTerra enlazadas y con recubrimiento final

ción de formas de picos deficientes para las bases y un rango de pH

limitado. Una de las formas con la que los técnicos en cromatografía

han tratado de superar estas limitaciones ha sido la utilización de fases

estacionarias basadas en polímeros. Los polímeros, no obstante, no

han gozado de la aceptación de la sílice debido a su poca eficacia, a su

baja resistencia mecánica y a un orden de elución de picos impredecible

cuando se transfieren métodos de columnas poliméricas a columnas

basadas en sílice.

La tecnología de partículas híbridas supera estas limitaciones; no solo

combina los mejores atributos de ambos materiales, sino que subsana

las debilidades de cada material. El resultado es un material robusto

con una resistencia mecánica elevada, una eficacia alta, una forma de

picos excelente para las bases y un escalado sencillo de la cromato-

grafía analítica a la preparativa.

Comparación entre el proceso de fabricación del relleno híbrido de primera generación (XTerra) y el de la sílice

Si

CH 3

Polar Group

CH 3

O Si

CH 3

Polar Group

CH 3

O OSi

C H 3

C H 2C H

C H 3O

n■■La cobertura homogénea más alta

n 1/3 menos de silanoles

n■Excelente forma de picos

n■Rango de pH entre 1 y 12

n La cobertura superficial

más baja

n Forma de picos

deficiente

n Rango de pH entre 2 y 8

PartículaXTerra

no enlazada

Metilpolietoxisilano(MPEOS)

Tetraetoxisilano(TEOS)

Metiltrietoxisilano(MTEOS)

Partícula de sílice no enlazada

Politoxisilano(PEOS)

Tetraetoxisilano(TEOS)


OH

SiO O

OO

SiO

OH

OSi

O

OH

OSi

O

OO

Si

OSi

O

OH

SiOH

O

Si

OO

Si

Si

Si OH

O O

Si OO

Si

SiSi

Si

Si

Si

SiHO

Si

SiO

O

SiO

O

Si O

HO O

SiSi

Si

SiOHO

O

Si

SiO

HO

OSi

O

HO

HO

Si

Si

OSi

O

OH

O

Si

Si

OH

O O

O

SiOH

OO

Si

Si

Si OH

OO

SiO

OSi OH

O

Si

Si

SiSi

OH

SiO O

O

SiOO

SiO

OHO

Si O

OO

Si

OSi

O

OH

SiO

Si

O

O

O

Si

Si

Si

O O

Si OO

Si

SiSi

Si

Si

Si

Si

HOSi

O

SiO

O

SiO

O

Si O

HO O

SiSi

Si

SiO

O

Si

SiO

HO

OSi

O

HOSi

Si

OSi

O

OHO

Si

Si

OH

O

O

SiOO

Si

Si

Si OH

OO

SiO

OSi OH

O

Si

Si

SiSiH3C

H3C CH3

H3C

H3C

H3C

CH3CH3

H3C

CH3

CH3

CH3

H3C

H3C

CH3

CH3

22

Separaciones con la eficacia típica de la sílice trabajando a pH típicos de rellenos poliméricos

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

1

3

2

4

6

5

10 20

UA

6

54

3

2

1UA

0

0,4

0,8

1,2

10 20 min min

Condiciones de LCFase móvil A: 20 mM de NH4OH, pH de 10,7 Fase móvil B: acetonitriloCaudal: 3 mL/min Gradiente: Tiempo Perfil (min) %A %B 0,00 70 30 25,00 40 60 28,00 40 60Volumen de inyección: 5 µL Temperatura: ambiente Detección: UV a 220 nm Instrumento: detector de matriz de fotodiodos

2690 y 996 de Waters

Compuestos 1. Codeína2. Yohimbina 3. Tebaína4. Cocaína5. Reserpina6. Metadona

XTerra RP18: 4,6 x 150 mm pH 10,7

Columna polimérica: 4,1 x 150 mm pH 10,7

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

1

3

2

4

6

5

10 20

UA

6

54

3

2

1UA

0

0,4

0,8

1,2

10 20 min min

www.waters.com/xterra23

COLUMNAS WATERS SPHERISORB Las columnas Waters Spherisorb® son una de las columnas HPLC más citadas en la literatura científica. Existen más de

2000 resúmenes analíticos publicados que mencionan las columnas Waters Spherisorb, lo que brinda un intervalo extraordinario de

aplicaciones y métodos validados que le pueden servir de ayuda durante el proceso de desarrollo de métodos.

Las columnas Waters Spherisorb se fabrican en un rango amplio de tamaños de partícula (3, 5 y 10 µm) y de fases enlazadas para satisfacer

cualquier necesidad cromatográfica. Además, las fases enlazadas de calidad superior de las columnas Waters Spherisorb ofrecen muchas

selectividades de separación diferentes y únicas. Las columnas analíticas Waters Spherisorb se suministran con conectores de columna de

estilo Parker, que constituyen el estándar del sector. Los cartuchos de columna Waters Spherisorb precisan conectores de cartucho de estilo

Parker reutilizables.

Spherisorb

Tipo de ligando ODS2 (C18) ODS1 (C18) ODSB (C18) C8 C6 C1 NH2 (amino)

Tamaño de partícula 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 5 μm 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm

Área superficial 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g

Forma de las partículas Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica

Tamaño de poro 80 Å 80 Å 80 Å 80 Å 80 Å 80 Å 80 Å

Carga de carbono 11,5% 6,2% 11,5% 7,75% 4,7% 2,15% 1,9%

Cobertura del ligando

2,98 µmol/m2 1,49 µmol/m2 2,98 µmol/m2 3,12 µmol/m2 3,36 µmol/m2 2,97 µmol/m2 2,64 µmol/m2

Recubrimiento final Sí No Sí Sí Sí No No

Tipo de ligando Fenilo CN (nitrilo) OD/CN W (sílice) SCX SAX

Tamaño de partícula 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 5 μm 3; 5; 10 µm 5; 10 µm 5; 10 µm

Área superficial 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g


Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica


Carga de carbono 2,5% 3,1% 5% N/A 4% 4%


2,72 µmol/m2 3,29 µmol/m2 1,15 µmol/m2 N/A – –

Recubrimiento final No No Sí N/A No No

www.waters.com/spherisorb

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Spherisorb

Tipo de ligando ODS2 (C18) ODS1 (C18) ODSB (C18) C8 C6 C1 NH2 (amino)

Tamaño de partícula 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 5 μm 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm

Área superficial 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g



Carga de carbono 11,5% 6,2% 11,5% 7,75% 4,7% 2,15% 1,9%


2,98 µmol/m2 1,49 µmol/m2 2,98 µmol/m2 3,12 µmol/m2 3,36 µmol/m2 2,97 µmol/m2 2,64 µmol/m2

Recubrimiento final Sí No Sí Sí Sí No No

Tipo de ligando Fenilo CN (nitrilo) OD/CN W (sílice) SCX SAX

Tamaño de partícula 3; 5; 10 µm 3; 5; 10 µm 5 μm 3; 5; 10 µm 5; 10 µm 5; 10 µm

Área superficial 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g 220 m2/g


Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica


Carga de carbono 2,5% 3,1% 5% N/A 4% 4%


2,72 µmol/m2 3,29 µmol/m2 1,15 µmol/m2 N/A – –

Recubrimiento final No No Sí N/A No No

Nova-Pak

Química C18 C8 Fenilo CN Sílice Prep HR C18 Prep HR Sílice

Tamaño de partícula 4 µm 4 µm 4 µm 4 µm 4 µm 6 µm 6 µm



Carga de carbono 7% 4% 5% 2% N/A 7% N/A

Recubrimiento final Sí Sí Sí Sí N/A Sí N/A

COLUMNAS NOVA-PAK Las fases enlazadas de las columnas Nova-Pak® cuentan con tamaños de partículas de 4 y 6 µm que ofrecen una resolución elevada, así como una

cromatografía más rápida y eficaz. El tamaño de partícula más pequeño, en combinación con unas longitudes más cortas de columnas, se puede

usar para reducir el consumo de eluyente, así como para mantener la resolución en el caso de las mezclas complejas. Las columnas analíticas que

tienen un relleno con un tamaño de partícula de 4 µm se encuentran disponibles como columnas de acero con longitudes de 75, 150 y 300 mm.

Las columnas de cartucho de acero con conectores reutilizables se encuentran disponibles en longitudes de 50, 100, 150 y 250 mm. Las columnas

semipreparativas Prep Nova-Pak HR se empaquetan con rellenos que tienen un tamaño de partícula de 6 µm y proporcionan un intervalo inigualable

de posibilidades de separación. El relleno de alta eficacia de las columnas Prep Nova-Pak HR ofrece separaciones más rápidas utilizando menos

eluyente, así como la ventaja adicional que aportan unas fracciones más concentradas; por tanto, reduce el coste de la cromatografía preparativa.

Todas las columnas Nova-Pak se empaquetan utilizando rigurosos procedimientos de control de calidad que se llevan a cabo en nuestras fábricas de

acuerdo con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP); de esta forma, se garantiza la reproducibilidad entre lotes.

www.waters.com/nova-pak

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COLUMNAS RESOLVE El relleno Resolve™ sin recubrimiento final es considerablemente diferente de otros materiales de relleno de Waters. El cambio en el

comportamiento cromatográfico se detecta, por lo general, en compuestos polares que normalmente se retienen más. Se pueden obtener

cromatogramas de compuestos básicos mediante modificadores de fase móvil, como es el caso de reactivos de par iónico que reducen la

asimetría excesiva de picos. Las columnas Resolve C18 y de sílice están disponibles para aplicaciones que precisan una resolución elevada.

COLUMNAS DELTA-PAK Las columnas Delta-Pak™ son ideales para la separación y el aislamiento de péptidos, proteínas y productos naturales; cuentan con dos

tamaños de poro diferentes que están optimizados para las separaciones de moléculas grandes. Las columnas Delta-Pak son conocidas por el

escalado sistemático y predecible entre formatos de columna, lo que ofrece a los científicos encargados de la purificación la posibilidad de

aislar los compuestos diana con cantidades que van desde varios miligramos a varios gramos. La sílice enlazada de las columnas Delta-Pak,

que es muy estable, dispone de tamaños de partícula muy eficaces de 5 y 15 μm.

Resolve

Tipo de ligando Sílice C18 C8 CN

Tamaño de partícula 5; 10 µm 5; 10 µm 10 µm 10 µm

Forma de las partículas Esférica Esférica Esférica Esférica


Carga de carbono 10% 10% 5% 3%

Recubrimiento final N/A No No No

Delta-Pak

Tipo de ligando C18 C18 C4 C4

Tamaño de partícula 5; 15 µm 5; 15 µm 5; 15 µm 5; 15 µm




Recubrimiento final Sí Sí Sí Sí

www.waters.com/delta-pak

www.waters.com/resolve

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Resolve

Tipo de ligando Sílice C18 C8 CN

Tamaño de partícula 5; 10 µm 5; 10 µm 10 µm 10 µm




Recubrimiento final N/A No No No

Tecnología de partículas irregulares Los primeros materiales de relleno de HPLC constaban de partículas con formas irregulares y no esféricas. Por lo general, estas columnas reducen la estabilidad mecánica y hacen que disminuya la eficacia en comparación con las columnas empaquetadas con partículas esféricas. Sin embargo, incluso con estas limitaciones, existen muchos métodos que precisan el uso de dichas fases enlazadas. Como principal fabri-cante de sorbentes y fases enlazadas, Waters ha mostrado durante más de 40 años que sus columnas ofrecen un rendimiento sistemático y

fiable; por este motivo, continuará respaldando a estas marcas en el futuro.

Columnas µBONDAPAK/BONDAPAK Si su método es adecuado para una columna μBondapak®, solo existe una columna que contenga el material de relleno μBondapak C18. Muchas empresas afirman contar con una selectividad "similar a μBondapak", pero ninguna ha superado las rigurosas pruebas de control de calidad a las que se ven sometidos los lotes de Waters. Los materiales de relleno μBondapak o BondaPak® han demostrado su reproducibilidad un año tras otro desde 1973, lo que ha favorecido que las columnas μBondapak sean la marca de columnas HPLC que con más frecuencia se

ha citado.

Columnas µPORASIL/PORASIL Las partículas μPorasil™ y Porasil™ fueron de los primeros materiales de relleno totalmente porosos que se pusieron a la venta para las

separaciones por LC. Por contraste con la capacidad de separación de fase reversa de μBondapak C18, el material no enlazado basado en sílice

de las columnas μPorasil se creó para proporcionar separaciones de fase normal para una amplia gama de tipos de muestras.

µBondapak/Bondapak

Tipo de ligando C18Fenilo CN NH2

Tamaño de partícula 10 μm 10 μm 10 μm 10 μm

Forma de las partículas Irregular Irregular Irregular Irregular


Carga de carbono 10% 8% 6% 3,5%

Recubrimiento final Sí Sí Sí No

www.waters.com/bondapak

µPorasil/Porasil

Tipo de ligando Sílice

Tamaño de partícula 10, 15-20 μm

Forma de las partículas Irregular

Tamaño de poro 125 Å

Carga de carbono N/A

Recubrimiento final N/A

www.waters.com/delta-pak

www.waters.com/resolve

www.waters.com/porasil

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Nombre del producto

Uso previsto Modo cromatográfico Sistemas Contenido

QCRM de compuestos neutros

Proporciona información del rendimiento cromatográfico independientemente del pH de fase móvil usando 3 compuestos neutros.

Fase reversaTodos los sistemas de UPLC/HPLC con detector UV

Mezcla de 3 componentes que incluye:10 μL/mL de acetona, 0,25 mg/mL de naftaleno y0,4 mg/mL de acenafteno

En una solución de 2 mL de 50/50 acetonitrilo/agua. Almacenar a temperatura ambiente.

QCRM de fase reversa

Proporciona información del rendimiento cromatográfico, incluido el pH de fase móvil, usando 1 marcador de volumen muerto, 3 compuestos neutros, 1 compuesto ácido y 2 compuestos básicos.


Mezcla de 7 componentes que incluye:0,016 mg/mL de uracilo, 0,02 mg/mL de butilparabeno, 0,06 de mg/mL naftaleno,0,4 mg/mL de propranolol, 0,34 mg/mL de dipropilftalato,0,2 mg/mL de acenafteno y 0,1 mg/mL de amitriptilina

En una solución de 2 mL de 65/35 metanol/20 mM de tampón de K2HPO4 a un pH de 7. Almacenar a temperatura ambiente.

HILIC QCRM

Proporciona información del rendimiento cromatográfico del modo HILIC, incluido el pH de fase móvil, usando 1 marcador de volumen muerto, 1 compuesto neutro polar y 2 compuestos básicos polares.

HILIC

Todos los sistemas de UPLC/HPLC con detector UV

Mezcla de 4 componentes que incluye:0,0190 mg/mL de acenafteno, 0,0037 mg/mL de timina0,0037 mg/mL de adenina y 0,0077 mg/mL de citosina

En una solución de 1 mL de 20/80 acetonitrilo/agua. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C tras su recepción.

QDa QCRM

Proporciona información cromatográfica y de espectrometría de masas de cuadrupolo usando una mezcla de 8 componentes para cubrir un amplio rango de m/z de ESI (+-) a una concentración optimizada. Esta solución contiene 1 par crítico para medir el rendimiento cromatográfico.

Fase reversa Todos los sistemas de UPLC/HPLC con el detector ACQUITY® QDa®

Mezcla de 9 componentes que incluye:100,0 μg/mL de paracetamol, 45,0 μg/mL de cafeína, 50,0 μg/mL de sulfaguanidina, 10,0 μg/mL de sulfadimetoxina, 25,0 μg/mL de val-tyr-val, 6,0 μg/mL de verapamilo, 6,0 μg/mL de terfenadina,25,0 μg/mL de leucina-encefalina y 19,0 μg/mL de reserpina

En una solución de 1 mL con 23,5% de acetonitrilo de calidad LC-MS, 76,5% de agua de calidad LC-MS y 0,007% de ácido fórmico. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C.

Quad LCMS QCRM

Proporciona información cromatográfica y de espectrometría de masas de alto rendimiento usando una mezcla de 9 componentes a una concentración optimizada. Esta solución contiene 2 pares críticos para medir el rendimiento cromatográfico.

Fase reversaTodos los sistemas de UPLC/HPLC con espectrómetro de masas de cuadrupolo

Mezcla de 8 componentes que incluye:100 µg/mL de paracetamol, 50 µg/mL de sulfaguanidina,10 µg/mL de sulfadimetoxina, 25 µg/mL de val-tyr-val,6 µg/mL de verapamilo, 6 µg/mL de terfenadina,25 μg/mL de leucina-encefalina y 8 μg/mL de reserpina

19/81 acetonitrilo/agua, 0,008% de ácido fórmico. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C tras su recepción.

LCMS QCRM


Fase reversa Todos los sistemas de UPLC/HPLC con espectrómetro de masas de alto rendimiento

Mezcla de 9 componentes que incluye:10,0 µg/mL de paracetamol, 1,5 µg/mL de cafeína,5,0 μg/mL de sulfaguanidina, 1,0 μg/mL de sulfadimetoxina,2,5 µg/mL de val-tyr-val, 0,2 µg/mL de verapamilo,0,2 µg/mL de terfenadina, 2,5 µg/mL de leucina-encefalina y0,6 μg/mL de reserpina

En una solución de 500 μL de 5,7% de acetonitrilo y 94,3% de agua. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C tras su recepción.

Los estándares de referencia QCRM contienen mezclas de patrones seleccionadas de forma específica para ofrecer una manera sencilla y fiable de controlar el rendimiento de cualquier sistema cromatográfico. El uso de los QCRM le puede servir para asegurarse de que la columna y el sistema estén preparados para analizar las muestras. El uso regular de QCRM también proporciona una oportunidad para optimizar los sistemas cromatográficos y consultar la evolución del rendimiento de dichos sistemas a lo largo del tiempo, lo que facilita la identificación de problemas de forma proactiva y la posibilidad de resolverlos con mayor rapidez.

Dado que los análisis cromatográficos son complejos y dependen de muchas variables diferentes, como la composición de la fase móvil, el tipo de columna y el método de detección, Waters ha formulado mezclas de QCRM específicas diseñadas para evaluar los sistemas teniendo en cuenta estas diferencias.

Para obtener más información acerca de los estándares específicos para la calibración, la cualificación y el ajuste de instrumentos y detectores, así como una lista más completa de los estándares y reactivos que se encuentran disponibles, visite asr.waters.com.

¿Cómo puede saber que su sistema cromatográfico funciona de forma adecuada?

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http://asr.waters.com

Nombre del producto

Uso previsto Modo cromatográfico Sistemas Contenido

QCRM de compuestos neutros

Proporciona información del rendimiento cromatográfico independientemente del pH de fase móvil usando 3 compuestos neutros.


Mezcla de 3 componentes que incluye:10 μL/mL de acetona, 0,25 mg/mL de naftaleno y0,4 mg/mL de acenafteno

En una solución de 2 mL de 50/50 acetonitrilo/agua. Almacenar a temperatura ambiente.

QCRM de fase reversa

Proporciona información del rendimiento cromatográfico, incluido el pH de fase móvil, usando 1 marcador de volumen muerto, 3 compuestos neutros, 1 compuesto ácido y 2 compuestos básicos.


Mezcla de 7 componentes que incluye:0,016 mg/mL de uracilo, 0,02 mg/mL de butilparabeno, 0,06 de mg/mL naftaleno,0,4 mg/mL de propranolol, 0,34 mg/mL de dipropilftalato,0,2 mg/mL de acenafteno y 0,1 mg/mL de amitriptilina

En una solución de 2 mL de 65/35 metanol/20 mM de tampón de K2HPO4 a un pH de 7. Almacenar a temperatura ambiente.

HILIC QCRM

Proporciona información del rendimiento cromatográfico del modo HILIC, incluido el pH de fase móvil, usando 1 marcador de volumen muerto, 1 compuesto neutro polar y 2 compuestos básicos polares.

HILIC

Todos los sistemas de UPLC/HPLC con detector UV

Mezcla de 4 componentes que incluye:0,0190 mg/mL de acenafteno, 0,0037 mg/mL de timina0,0037 mg/mL de adenina y 0,0077 mg/mL de citosina

En una solución de 1 mL de 20/80 acetonitrilo/agua. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C tras su recepción.

QDa QCRM

Proporciona información cromatográfica y de espectrometría de masas de cuadrupolo usando una mezcla de 8 componentes para cubrir un amplio rango de m/z de ESI (+-) a una concentración optimizada. Esta solución contiene 1 par crítico para medir el rendimiento cromatográfico.

Fase reversa Todos los sistemas de UPLC/HPLC con el detector ACQUITY® QDa®

Mezcla de 9 componentes que incluye:100,0 μg/mL de paracetamol, 45,0 μg/mL de cafeína, 50,0 μg/mL de sulfaguanidina, 10,0 μg/mL de sulfadimetoxina, 25,0 μg/mL de val-tyr-val, 6,0 μg/mL de verapamilo, 6,0 μg/mL de terfenadina,25,0 μg/mL de leucina-encefalina y 19,0 μg/mL de reserpina

En una solución de 1 mL con 23,5% de acetonitrilo de calidad LC-MS, 76,5% de agua de calidad LC-MS y 0,007% de ácido fórmico. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C.

Quad LCMS QCRM


Fase reversaTodos los sistemas de UPLC/HPLC con espectrómetro de masas de cuadrupolo

Mezcla de 8 componentes que incluye:100 µg/mL de paracetamol, 50 µg/mL de sulfaguanidina,10 µg/mL de sulfadimetoxina, 25 µg/mL de val-tyr-val,6 µg/mL de verapamilo, 6 µg/mL de terfenadina,25 μg/mL de leucina-encefalina y 8 μg/mL de reserpina

19/81 acetonitrilo/agua, 0,008% de ácido fórmico. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C tras su recepción.

LCMS QCRM


Fase reversa Todos los sistemas de UPLC/HPLC con espectrómetro de masas de alto rendimiento

Mezcla de 9 componentes que incluye:10,0 µg/mL de paracetamol, 1,5 µg/mL de cafeína,5,0 μg/mL de sulfaguanidina, 1,0 μg/mL de sulfadimetoxina,2,5 µg/mL de val-tyr-val, 0,2 µg/mL de verapamilo,0,2 µg/mL de terfenadina, 2,5 µg/mL de leucina-encefalina y0,6 μg/mL de reserpina

En una solución de 500 μL de 5,7% de acetonitrilo y 94,3% de agua. Almacenar a una temperatura refrigerada de 2–5 °C tras su recepción.

Herramientas on-line

Waters Reversed-P hase Column Selectivity Chart (Gráfico de selectividad de las columnas de fase reversa de Waters)

www.waters.com/selectivitychart

Waters Part Selector and Selectivity Chart for iPad® (Selector de piezas y gráfico de selectividad de Waters para iPad)

www.waters.com/apps

Waters Column Advisor (Asesor de columnas de Waters)

www.waters.com/columnadvisor

Para obtener una lista con los números de referencia de todas las columnas mencionadas en este folleto, visite waters.com/findmycolumn.

Recursos adicionales

Descripción Referencia

Documentación técnica sobre patrones de referencia QCRM y la optimización del rendimiento del instrumento 720004535EN

Nota de aplicación sobre la resolución de problemas habituales del sistema con los patrones de referencia QCRM de compuestos neutros 720004635EN

Guía de selección de reactivos, patrones analíticos y columnas de Waters 720002241EN

29

www.waters.com/hplccolumns

OFICINAS DE VENTAS:

Austria 43 1 877 18 07

Australia 61 2 9933 1777

Bélgica y Luxemburgo 32 2 726 1000

Brasil 55 11 4134 3788

Canadá 1 800 252 4752

China 86 21 6156 2666

República Checa 420 2 617 11384

Dinamarca 45 46 59 8080

Finlandia 358 9 5659 6288

Francia 33 1 30 48 72 00

Alemania 49 6196 400 600

Hong Kong 852 2964 1800

Hungría 36 1 350 5086

India 91 080 49292200 03

Irlanda 353 1 448 1500

Israel 9723 3731391

Italia 39 02 265 0983

Japón 81 3 3471 7191

Corea 82 2 6300 9200

México 52 55 52 00 1860

Países Bajos 31 76 508 7200

Noruega 47 6 384 6050

Polonia 48 22.101 5900

Portugal 351 21 893 61 77

Puerto Rico 1 787 747 8445

Rusia/CEI 7 495 727 4490 / 336 7000

Singapur 65 6593 7100

España 34 93 600 9300

Suecia 46 8 555 115 00

Suiza 41 56 676 7000

Taiwán 886 2 2508 5500

Reino Unido 44 208 238 6100

Estados Unidos 1 800 252 4752

Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA 01757 EE. UU. TEL 508 478 2000 Fax: 508 872 1990 www.waters.com

Waters, The Science of What’s Possible, CORTECS, UPLC, Alliance, ACQUITY UPLC, XBridge, XSelect, Atlantis, Symmetry, XTerra, Waters Spherisorb, Nova-Pak, BondaPak, µBondaPak, QDa y ACQUITY son marcas comerciales registradas de Waters Corporation. BEH Technology, CSH, SunFire, Intellignet Speed, IS, OBD, SymmetryShield, Symmetry300, µPorasil, Porasil, Resolve, Delta-Pak y SymmetryPrep son marcas comerciales de Waters Corporation. Todas las demás marcas comerciales pertenecen a sus respectivos propietarios.

©2014 Waters Corporation. Impreso en EE. UU.Septiembre de 2014 720003995ES AO-SIG

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