Proyecto Ocratoxina A

Implementación, validación y estudio analítico diagnóstico de los

niveles de Ocratoxina A en vinos producidos en

Chile y difusión de medidas de minimización

para asegurar su inocuidad y fortalecer su

competitividad Fondo del Patrimonio Sanitario Servicio Agrícola y Ganadero

Proyecto C4-94-14-31

Equipo de Trabajo Proyecto

Elena Carretero

Directora Proyecto

Carolina Jiménez

Jefe de Proyectos

Mario VegaJefe de Proyecto)

Claudia Mardones(Investigador)

Erika Herlitz(Investigador)

Roberto Saelzer(Investigador)

Dietrich Von Baer(Coordinador Técnico)

Gisela Rios(Investigador)

Bernardo LatorreInvestigador

René Torres(Investigador)

Gonzalo Díaz(Investigador)

Ocratoxina A: Temas� INTRODUCCION

� METODOLOGIA ANALITICA � NIVELES DE OTA EN VINO

� CONCLUSIONES

Seminario: Impacto de las Micotoxinas en la Inocuidad y Comercio de los Alimentos

Introducción

CÓDIGO DE BUENAS PRÁCTICAS VITIVINÍCOLAS PARA LIMITAR AL MÁXIMO LA PRESENCIA DE OCRATOXINA

A EN LOS PRODUCTOS DERIVADOS DE LA VIÑA

RECOMIENDA a los países que establezcan un sistema de análisis y de estudio de los riesgos de contaminación por OTA que vayan del viñedo a la bodega, a través de acciones colectivas o individuales.

RESOLUCIÓN VITI-OENO 1/2005

Organización Internacional de la Viña y el Vino

Considerando la resolución CST 1/2002 que fija el contenido máximo de ocratoxina A (OTA) en 2,0 µg/L para los vinos.

� 5°país exportador de vino del mundo�10°país productor de vino del mundo� Aproximadamente 2/3 de la producción

nacional de vino se exportan

Chile como país vitivinícola

Exportaciones totales de vino el año 2008: � 588 millones de litros� US$ 1.376 millones.� Vino embotellado: 82% del monto

exportado� Vino a granel: 10,7 % en valor

33,8 % en volumen

5°país exportador de vino del mundo10°país productor de vino del mundoAproximadamente 2/3 de la producción nacional de vino se exportan

Chile como país vitivinícola

• Son muchos los alimentos que pueden estar contaminados por micotoxinas

• Cereales (50 %) y vino producen una mayor contribución a la ingesta diaria total de OTA.

Contribución de los alimentos a la ingesta total de OTA .

Que indica la presencia de OTA en vino?

• La presencia de OTA estádirectamente relacionada con los planes HACCP implementados en la industria, pero más específicamente con las Buenas Prácticas Enológicas.

• Por ende su ausencia, se relaciona con un vino producido bajo estrictos estándares de calidad.

Factores que influyen en la contaminación con micotoxinas

None of the red wines produced in Argentina or Chile analysed by uspresented contamination.

Other authors found two out of seven Argentinian red wines analysed withOTA at 0.028 and 0.042 µg/L; and two out of five Chilean wines contaminated with 0.028 and 0.07 µg/L.

Soleas et al. reported that five out of 17 Argentinian and eight out of 42 Chilean red wines were contaminated at levels below 0.05 µg/L.

Información Disponible sobre OTA en Vino en Chile al Inicio del Proyecto

1.- IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACION DE METODOLOGÍA ANALÍTICA

• Implementación y validación del método de la Resolución OENO 16/2001 de la OIV para la determinación de OTA en vino.

• Implementación y validación de un método alternativo usando columnas C-18 para la determinación de OTA en vino.

• Evaluación de inyección directa de muestra

CRITERIOS PARA VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA ANALÍTICA:

• Resolución OENO 16/2001 de la Organización Internacional de la Vid y el Vino (OIV) sobre determinación de OTA usando columnas de inmunoafinidad.

• Norma 2002/657/CE de la Unión Europea sobre los criterios de funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados.

• Norma 2006/401/CE de la Unión Europea sobre los métodos de muestreo y análisis de control oficial de niveles de micotoxinas en alimentos.

--Se

cumplen2.28 ± 0.25

(sesgo: + 8,3%)

Veracidad ± dsValor de referencia:2.09 ± 0.92

Se cumplen

93.2 ± 3.2Se cumplen

91.8 ± 2.6Exactitud (% recuperación± ds)

Se cumplen

2.2 % (1.0 µg L-1)1.9 % (2.0 µg L-1)1.2 % (3.0 µg L-1)

Se cumplen

1.7 % (1.0 µg L-1)1.8 % (2.0 µg L-1)1.5 % (3.0 µg L-1)

Reproducibilidad Interna (RSD%)

Se cumplen

2.0 % (1.0 µg L-1 )0.8 % (2.0 µg L-1 )1.3 % (3.0 µg L-1 )

Se cumplen

2.1 % (1.0 µg L-1 )1.2 % (2.0 µg L-1 )0.8 % (3.0 µg L-1 )

Repetibilidad (RSD%)

Se cumplen

0.02 µg L -1Se cumplen

0.01 µg L -1LOD

Criterios de aceptación

Resultados Laboratorio

Criterios de aceptación

Resultados Laboratorio

VINO BLANCOVINO TINTO

LOD: Límite de detección del método, ds = desviación estándar.

CARACTERÍSTICAS ANALÍTICAS DEL MÉTODO VALIDADO, CONTRASTADO CON CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:

Implementación y validación del método de la OIV

ColumnaInmunoafinidad

MUESTRA: 5 mL vino + 5 mL 1% PEG- 5% NaHCO3

en H2OLAVADO: - 5 mL NaCl 2,5 %/ 5% NaHCO 3 en H20- 5 mL H20ELUCIÓN: 2 mL metanol

50 uL

RECONSTITUCIÓNen fase móvil

(agua/acetonitrilo/ác. acético 49.5/49.5/1 (v/v)

V i n o t i n t o c o n s o b r e c a r g a d e O T A 3 , 0 u g / L

C

V i n o t i n t o c o n s o b r e c a r g a d e O T A 3 , 0 u g / LV i n o t i n t o c o n s o b r e c a r g a d e O T A 3 , 0 u g / L

C

ANÁLISIS CROMATOGRÁFICOEVAPORACIÓN

a sequedad con N 2

PreconcentraciPreconcentraci óón de OTA en columnas de n de OTA en columnas de InmunoafinidadInmunoafinidad (IAC) (IAC) -- OIV OENO 16/2001

7.94

4

OTA tR= 7.94 min

Vino tinto sobrecargado con 2.0 ug/L OTA

Metodología Resolución OIV OENO 16/2001 con Cartuchos de Inmunoafinidad (IAC)

Condiciones cromatográficas HPLC-FLDPre-columna: Waters Simmetry® C18, 5 µm, 3.9 x 20 mmColumna: Waters Simmetry® C18, 4.6 x 150 mm. Fase móvil: Agua/acetonitrilo/ acido acético 49.5/49.5/1 v/vInyección: 50 µL; Detección: Excitación a 333 nm, emisión a 460 nm.

(%)

LOD 0,014 ug L -1

LOQ 0,04 ug L -1

2,0 ug L -1Máx, permitido

(%)

2,0 ug L -1Máx, permitidoLOQ

0,07 ug L -1LOD

0,021ug L -1

Límites de Detección (LOD) y Cuantificación (LOQ)Metodología Resolución OIV OENO 16/2001

con Cartuchos de Inmunoafinidad (IAC)

Vino Tinto

Vino Blanco

Columna SPEAccu Bond II C-18 500 mg/3cc,

Agilent.

MÉTODO ALTERNATIVO CON COLUMNA C-18MUESTRA

5 mL vino + 5 mL agua desionizada

LAVADO2 mL agua desionizada

2 mL metanol/agua (60/40 v/v )

ELUCIÓN2 mL metanol/ácido acético glacial

99,5/0,5 v/v

EVAPORACIÓNA sequedad con N2

RECONSTITUCIÓNEn fase móvil

(agua/acetonitrilo/ác. acético 49.5/49.5/1 (v/v)

V in o t in t o c o n s o b r e c a r g a d e O T A 3 , 0 u g /L

C

V in o t in t o c o n s o b r e c a r g a d e O T A 3 , 0 u g /LV in o t in t o c o n s o b r e c a r g a d e O T A 3 , 0 u g /L

C

ANÁLISIS CROMATOGRÁFICOVolumen de inyección: 50 uL

Metodología Alternativa con cartuchos C-18

8.21

3

OTA tR= 8.21 min

Vino tinto sobrecargado con 2.0 ug/L OTA

Condiciones cromatográficas HPLC-FLDPre-columna: Waters Simmetry® C18, 5 µm, 3.9 x 20 mm.Columna: YMC-Pack ODS-A, S-5 µm 4.6 x 150 mm. Fase móvil: agua/acetonitrilo/ácido acético 49.5/49.5/1 v/vInyección: 50 µL. Detección: Excitación a 333 nm, Emisión a 460 nm.

2.01 ± 0.09 (n = 3)2.28 ± 0.25 (n = 3)Veracidad (µg/L ± ds)

Valor de referencia = 2.09 ± 0.92

93.2 ± 3.591.8 ± 2.6Exactitud (% recuperación ± d.s)

Repetibilidad (%RSD)3.2 % (1.0 µg/L)3.2 % (2.0 µg/L)3.1 % (3.0 µg/L)

2.1 % (1.0 µg/L)1.2 % (2.0 µg/L)0.8 % (3.0 µg/L)

2.8014.00Costo unitario columna en Euro (€)

93.7 ± 1.991.8 ± 2.6% Recuperación en vino tinto

0.086 µg/L0.014 µg/LLímite de Detección metodológico

0.20 µg/L0.18 µg/LLímite de Detección instrumental

26.71 ± 0.08(mvolt*s*L* µg -1)

26.71 ± 0.08(mvolt*s*L* µg -1)

PendienteCurva de calibración instrumental

Columna C-18Columna IAC

Preconcentración sobrePropiedad analítica

Comparación de Métodos de preconcentración de OTA: Columna IAC (Mét. OIV) y columna C-18 (Mét. Alterna tivo)

1.50

3

2.32

5

9.53

6

OTA tR= 1.49 min

Vino tinto sobrecargado con 2.0 ug/L OTA

Tafuri A., Meca G. and Ritieni A., J. Food Protection, 71, 2008, 2133 – 2137Propusieron: Filtración e inyección directa de muestra en una columna monolítica SIN PRECONCENTRACION

No apropiado para niveles traza de OTA habituales en vino

�Se implementó la metodología de la Resolución OENO 16/2001 de la OIV para la determinación de OTA en vino tinto y blanco, debidamente validada.

�Se desarrolló un método alternativo que usa columnas C-18, las cuales son de mucho menor costo que las columnas de inmunoafinidad, y que presenta características analíticas estadísticamente comparables a las del método OIV.

�El pre-tratamiento de muestra es esencial para la determinación de OTA en vino tinto por HPLC con detección de fluoresencia a los niveles usualmente encontrados en vino.

CONCLUSIONES –1. Metodología Analítica

2. DIAGNÓSTICO DE NIVELES OTA EN VINO PRODUCIDO EN CHILE

• Porcentaje de producción de vinos con denominación de origen

• Porcentaje de exportación de la producción de vinos nacionales

• Producción por variedad

• Producción por valle.

Fuente: Servicio Agrícola y Ganadero – SAG, División de Protección Agrícola, Subdepartamento de Viñas y Vinos, Producción de Vinos 2007. Informe Ejecutivo Informe elaborado al 30 de Junio de 2007.

Criterios Considerados en el Diseño del Plan Anual de Muestreo

BODEGA DE MUESTRASSUBTERRANEO FACULTAD DE FARMACIA

ETIQUETA DE IDENTIFICACIÓN DE MUESTRAS

Ejecución Plan Anual de Muestreo

Diseño Plan Anual de Muestreo

• MUESTRAS A COLECTAR EN VIÑAS: 210 • MUESTRAS A COLECTAR EN COMERCIO CON DO: 98

• MUESTRAS A COLECTAR EN COMERCIO SIN DO: 42

• TOTAL VINOS A ANALIZAR POR AÑO: 350• AÑOS DE MUESTREO (2007, 2008 y 2009) 3

Muestras Analizadas Año 1 y 2 de Proyecto

•MUESTRAS A COLECTADAS EN VIÑAS: 433

• MUESTRAS COLECTADAS EN COMERCIO CON DO: 251•MUESTRAS COLECTADAS EN COMERCIO SIN DO: 114• TOTAL VINOS ANALIZADOS (Años 1 y 2) 798

97%

1% 2%

no detectada

trazas

cuantificable96,2 %

1,4 % 2,4 %

Distribución Porcentual de Niveles de OTA en Vinos Producidos en Chile –

Resultado Global Muestreos Años 2007 y 2008 (n= 798 )

Niveles de OTA reportados en Distintas Areas del Mun doVisconti et al, Food Additives and Contaminants, 25, 193 – 202 (2008)

Var et al (2007) 95 Turquía 86 <0,006-0,815

�Ninguna de las muestras analizadas a la fecha (n > 1000) presentó niveles de OTA sobre el máximo permitido (2.00 µg L-1)

�Los muestreos de años 1 y 2 (n = 798) arrojaron niveles de OTA muy por debajo de aquellos reportados para Europa y para países europeos en particular (España, Italia, Grecia).

CONCLUSIONES –2. Niveles de OTA I

�En una revisión internacional, la menor prevalencia de OTA en vino se reportó para Australia (15 %), mientras en el presente estudio a la fecha (años 1 y 2) se observan niveles detectables o cuantificables significativamente menores que en Australia.

�Los niveles máximos encontrados a la fecha en el presente estudio son menores a los reportados previamente para vinos producidos en Chile (Pacin et al, 2005).

CONCLUSIONES –2. Niveles de OTA II

�De mantenerse en el tercer año de proyecto la tendencia observada hasta ahora, se confirmaría sobre una amplia base muestral y representativa, empleando metodología debidamente validada, la situación privilegiada de Chile en cuanto a sus niveles de OTA en vino, favoreciendo su competitividad en los mercados internacionales.

3.- PREVENCIÓN DE CONTAMINACIÓN DE VINOS CON OTA

Aplicar PrAplicar PráácticascticasRecomendadas por la OIVRecomendadas por la OIVhttp://http:// news.reseaunews.reseau --concept.netconcept.net //imagesimages //oiv_esoiv_es //ClientClient /VITI/VITI--OENO_1OENO_1--2005_2005_ES.pdfES.pdf

Especies y razas de hongos ocratoxigénicos en Chile

Aspergillus ocratoxigénicos*

A. carbonariusA. niger

A. westerdijkiaeA. wentii

umbrales deumbrales detoleranciatolerancia

0,5% de las bayas*con A. carbonaris

> 2 ug/L de OTAen vinos* aislamientos de bayas y muestras de aire

* Cabernet Sauvignon

Latorre et al., International Journal of Food Microbiology . 2009, 13: 195 – 199.

Proyecto C4-94-14-31 Fondo del Mejoramiento del Patrimonio Sanitario Servicio Agrícola y Ganadero del Ministerio de Agricultura República de Chile

http://www.vinnova.cl/

A todas las viñas que han aportado muestras para la realización de esta investigación

Agradecimientos