Introduccina la

CromatografaHPLC

Humax Mayo 2012Carlos Lpez Qumico MScca

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arriba-pcRectangle

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A

BC

D

E

Mezcla - Muestra

Cromatograma

0 5 10 15 20Tiempo (minutos)

Ab

un

dan

cia A

BC

D

E

Cromatgrafo

El Tiempo al cual aparezca un pico (su tiempo de retencin) es una herramienta (no la nica) para identificar un compuesto dado

El tamao relativo de un pico (rea o altura) es proporcional a la abundancia relativa del compuesto en la mezcla

Tipo de Informacinca

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Nomenclatura de un Pico cromatogrfico

< 621> Chromatography USP 35 p 280carlo

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Trminos Cromatogrficos

El Tiempo de Retencin (tR) = el tiempo que despus de la inyeccin le toma a un soluto alcanzar el detector

Tiempo Muerto (Dead time t0) = El tiempo que le toma a un soluto no retenido alcanzar el detector (Uracilo,Tiourea, Acetona, NNDimetilformamida, o Nitrato de Sodio para RP y Floroglucinolpara NP)

Todos los solutos gastan la misma cantidad de tiempo en la fase mvil

Velocidad de la fase mvil (u) = L / tM; la velocidadlineal promedio de las molculas en la fase mvil

L = longitud de la columna cromatogrfica

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Determinando el valor de t0

Nitrato de SodioUraciloTiourea

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Los valores observados de to para una columna dada pueden variar con la composicin de la fase movil tanto como 1015% para valores entre 0100% B (%B refiere al % volmen del solvente orgnico en la fase movil) usualmente to varia entre

Volumen muerto de columna (Vm)

Con L y dc en mm. El volumen muerto Vm representa el volumen total d efase movildentro d ela columna,tanto dentro como afuera de l asparticulas del empaque d elacolumna. Por ejemplo, si Vm = 2 mL, y F = 0.5 mL/min, entonces t0 = Vm/F = 2/0.5 = 4 min;

T0 puede ser considerado como el tiempo requerido para vaciar la columna de fase movilque estaba originalmente en la columna.

Para el caso mas comun donde el diametro interno d ela coulmna es 4.6 mm, podemos stimar de manera conveniente el valor de Vm

Para columnas entre 4 a 5 mm i.d.Con L en mm

Primera Aproximacin:

Segunda Aproximacin:

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Calculando el volumen de su columna

Lavar con aproximadamente 10 volmenes de columna!!!NOTA: Lo importante es el volumen del lavadono el tiempo!!

Tercera Aproximacin:

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Factor de Retencin (k) = trmino usado para describir la migracin de los solutos (analitos) a travs de la columna

Interpretando el factor de Retencin

Si kA < 1;la elucin es demasiado rpida para la determinacin del tR.

Si kA > 20; la elucin es demasiado lenta para ser practica

El rango preferido para kA est entre 1 y 10

Trminos Cromatogrficosca

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Factor de Retencin en Gradienteca

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Ejemplo de calculo del factor de Retencinca

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Donde k es el factor de retencin de la especie ms fuertemente retenida (as que >1)

En HPLC sule ocurrir una inversin en el orden de elucin cuando se producen cambios en la naturaleza de la fase mvil o en el pH.

Factor de Selectividad ( ) = KB /KAca

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Ejemplo de Selectividadca

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El Calculo de la Selectividadca

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Trminos usados para describir cuantitativamente la eficiencia de unacolumna cromatogrfica

La eficiencia de una columna se aumenta en la medidad que N aumentaN = L/H

Donde:N = el nmero de interacciones (i.e. etapas de migracin del solutoentre la fase mvil y la fase estacionaria) que tiene el soluto durante suresidencia en la columna

H= la distancia a travs de la columna que viaja el soluto entre esatsinteracciones (tpicamente en mm o cm)

L H

Plate

L = length of column packing H = height of plate N = plate number

Eficiencia: Altura de Plato (H) y Platos Tericos (N)ca

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Calculo de la Eficiencia de la Columnaca

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Ejemplo de calculo de la eficienciaca

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Es una medida cuantitativa que mide la habilidad de la columna para separar

dos analitos consecutivos

Para aumentar la Resolucin aumente la longitud de la columna (L)

Limitaciones: Tiempos de anlisis ms largos y picos ms anchos

Usualmente hay un compromiso entre la resolucin y la velocidad de anlisis

La Resolucin (Rs)ca

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Separacin como una funcin de la resolucin, tamao de pico relativo (1:1. 10:1, etc.), and (e, f ) picos en la cola.ca

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Ejemplo de calculo de Resolucinca

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3. Eficiencia1. Retencin2. Selectividad

La ecuacin General de Resolucinca

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La Resolucin como una funcin de la selectividad, la eficiencia o la retencinca

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El pico idealca

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Asimetra de Pico

Una forma de pico gausiano solo resulta cuando el coeficiente de particin, K(=Cs/Cm), es independientede la concentracin del soluto en la columna

Columna Sobrecargada: Cs se hacemuy grande causando que la faseestacionaria empiece a parecerse al soluto. Consecuentemente, el soluto es muy

soluble en la zona sobrecargada de la columna.

Muy poco soluto viaja detrs del pico.

Se presenta una cola larga cuandoalgunos sitios retienen pequeascantidades de soluto de una manerams fuerte que otras

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Medicin del factor de simetra y el coleoca

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Integracin de Picosca

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Errores de integracin producidos por el Coleoca

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Buena lnea base Buena Cuantificacin!!!

La linea base es de mucha importancia para el HPLC cuantitativo; en particular, los algoritmos de integracin de picos utilizan la linea base como la referencia para medir el rea de un pico dado.

La integracin de un pico cromatogrfico define una operacin en la cual el rea bajo la curva (o la altura) del pico es medida.Com era de esperar, existen gran nmero de algoritmos matemticos que se pueden usar para alcanzar tal fin.

La aproximacin Clasica para integrar el area de un pico es dividir el pcio en pequeos rectngulos cuyas reas pueden ser exactaemente computadas y sumadas para dar el rea total del pico.ca

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Relacin entre la calidad de la linea base y la reproducibilidad de la integracin del pico

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Integracin Manual o automtica?ca

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Reto Analtico

Resolucin Tiempo Forma y Tamao

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Flujo por Multiples Caminos

(Difusin Eddy)

Difusin Longitudinal

Procesos De Ensanchamiento De Picos

B

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HETP = A + B / u + C u

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Tiempo de Equlibrio Trasnferencia de Masa

C

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Curva de van deemter

Consecuencia ms importante en HPLC: El tamao de partcula

HETP = A + B / u + C u

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Faster Analysis: Shorter Column, Smaller Particle, Same Flowca

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