Introducción a las columnas

de HPLC

1

En esta clase aprenderá lo

siguiente: Los diferentes usos de las columnas de

HPLC.

Los materiales de relleno de lascolumnas.

Cómo seleccionar el diámetro de partícula adecuado.

Cómo seleccionar el diámetro interno de columna adecuado.

Cómo seleccionar la longitud de columna correcta.

2

Columnas de HPLC

Columna

analítica

Fase móvil

desde la

bomba

PrecolumnaMuestreador

Al detector

Actúa sobre la muestra

para atrapar partículas y

componentes de muestras

retenidos con fuerza.

Las columnas varían en los siguientes aspectos:

• Longitud

• Diámetro interno

• Material de la fase estacionaria

• Tamaño de partícula de la fase estacionaria

La columna

analítica lleva

a cabo la

separación.

3

Columna - Acero inoxidable

estándar

Capilar

Frita de filtro de

acero inoxidable

Tamaño de poro

de 2 um

Relleno de

columna

4

Columna - Columnas de

cartucho

Soporte del cartucho de protección

Frita PEEK/Junta

Cartucho de protección

Columna de cartucho

Conexión del

extremo

5

Materiales de relleno de

columnas - Sílice

Soles de sílice Xerogeles

Esférico

IrregularLas partículas tienen un diámetro de

3 a 10 mm en las columnas estándar.

6

Materiales de relleno de

columnas - Fases enlazadas

SiR1

R2

Si CH3H3C

O

O

Si

O O

OH

Poros

Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl

R1

R2

Fase enlazada monomérica

Cadena de carbono

con forma de cepillo

7

Materiales de relleno de columnas - Fases

enlazadas extensamente utilizadas

CH3

|

-0-Si- R

|

CH3

HPLC de fase inversa

•C18

•C8

•C4

•C1

•Fenilo

Las columnas de HPLC más utilizadas

Separaciones de proteínas

Dipolo débil - dipolo inducido

Interacciones con analitos polares

HPLC de fase normal o inversa

• CN

• NH2

HPLC de fase normal

• Diol Separaciones de compuestos con

polaridades muy diferentes

Polaridad intermedia

Intercambio iónico

DEAE (dietilaminoetanol)

QAE (aminoetilo cuaternario)

Carboximetilo

Exclusión de tamaño

Glicerilpropilo

8

Materiales de relleno de columnas

Rendimiento mejorado de desoxinucleósidos

utilizando fase enlazada óptima

mAU

-4

0

4

8

12

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0061.D)

min0 2 4 6 8

mAU

0

10

20

30

40

DAD1 A, Sig=254,16 Ref=360,100 (H:\NUKE\NUKE0056.D)

G

CA

TZorbax SB-C18

92% A : 8% B

6 min

2 min

Zorbax SB-CN97,5% A : 2,5% B

G

C A

T

LC: HP1090

Columnas: 4,6 x 50

mm, 3,5 µM

Flujo: 1,0 ml / min.

A: 0,1% TFA

B: 90% MeOH:

10% H2O (0,1%

TFA)

Temp.: 30 °C

Detec.: 254 nm

9

Materiales de relleno de columnas -

Soportes de polímeros

Admiten:

Fase normal e inversa

Intercambiadores iónicos

Cromatografía por exclusión de tamaño

CH = CH 2

+

- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -

Estireno Divinil benceno

- CH2 - CH - CH-2 - CH - CHC2 - CH - CH22 - -

CH = CH 2

CH = CH 2

Estireno-divinilbenceno

10

Tamaño de partícula - Efecto en

la eficacia

Fase móvil, 20% ACN/80% acuosa, 0,1% TFA

Columnas Zorbax SB-C8; d.i. de columna, 4,6 mm; ciprofloxacina; 22 °C

3 -µm

5 -µm

10 -µm

Velocidad de flujo

N

Teórico

Velocidad de flujo de la fase móvil, ml/min

Núm

ero

de p

lato

s/m

etr

o/1

03

11

Tamaño de partícula - Efecto en la

eficacia y la resolución

0 1 3 5 7 92 4 6 8

Tiempo de retención, min.

300SB-C8 (4,6 x 50 mm)

5µm

300SB-C8 (4,6 x 50 mm)

3,5µm

1. Met Encefalina

2. Leu Encefalina

3. Angiotensina II

4. Neurotensina

5. RNasa

6. Insulina

7. Lisozima

8. Calmodulina

9. Mioglobina

10. Anihidrasa carbónica

12

3 4

5

67

8

910

12

Número aproximado de platos (N) y

volumen vacío (Vm) para columnas de 5

mm y 3,5 mmSi se reducen simultáneamente la longitud de la columna (N ) y el tamaño de partícula (N ), se podrá:

◦ Mantener la resolución

◦ Reducir el tiempo de análisis

◦ Reducir el uso de disolventes

Tamaño de lacolumna

Tamaño de partículaNúmero de platos

(N)Volumen vacío

(Vm)

4,6 x 250 mm 5-mm 20.000 2,5 ml

4,6 x 150 mm 5-mm 12.000 1,5 ml

4,6 x 150 mm 3.5-mm Resolución rápida 20.000 1,5 ml

4,6 x 75 mm 3.5-mm Resolución rápida 10.000 0,75 ml

4,6 x 50 mm 3.5-mm Resolución rápida 6.000 0,5 ml

4,6 x 30 mm 3.5-mm Resolución rápida 3.600 0,3 ml

4,6 x 15 mm 3.5-mm Resolución rápida 2.000 0,15 ml

13

Aumentar la velocidad de análisis

mientras se mantiene la resolución

Dimensiones 250 x 4,6 mm 150 x 4,6mm 150 x 4,6 mm 75 x 4,6 mm

Tiempo deanálisis (min)

30 min 18 min 18 min 9 min

Residuo dedisolvente(ml)

30 ml 18 ml 18 ml 9 ml

N 20.000 20.000 12.000 10.000

5 mm 3,5 mm 5 mm 3,5 mm

40%

Reducción

40%

Reducción

Sin modificar 9% de diferencia

50%

Reducción

50%

Reducción

14

Conseguir todo el potencial con

mayor velocidad de flujomAU

0100200300

mAU

0100200300

min0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0.6 0.7 0.8 0,9

mAU

0100200300

0

Velocidad

de flujo

3 ml/min

2 ml/min

4 ml/min

Zorbax SB-C18, 3,5 µm, 4,6 x 30 mm

90 bar

133 bar

181 bar

Presión

30 seg

Rs2,1 = 2,1

Rs2,1 = 2,2

Rs7,6 = 2,2

Rs7,6 = 2,2

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Columnas con diámetro interno pequeño y muy

pequeño

Ventajas:

Consumo reducido de disolvente.

Idóneas para análisis de trazas si la cantidad de muestra es limitado.

Fácil conversión de velocidad de flujo para cambiar el método de columna analítica a columna de diámetro muy pequeño.

Inconvenientes:

La instrumentación debe tener un volumen externo a la columna muy bajo.

Las fritas se deben cambiar con más frecuencia.

Convencional

Diámetro interno

muy pequeño

4,6 mm

4,6 mm

2,1 mm

d = 10 dmmp

0 2 4 6 8 10

1,00 ml/min

0 4 6 8 10

0,01 ml/min

2

o

1,0 mm 100 mm200 mm

d = 5 dmmp

d = 5 dmmp

16

Velocidades de flujo típicasd.i. de columna

(partículas de 5 mm )

Flujo

ml/min

4,6 1 –2

3,0 0,4 - 0,8

2,1 0,2 – 0,4

1,0 0,05 – 0,09

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Separación de alta resolución utilizando

una columna de diámetro interno estrecho

Columna ZORBAX 300SB-C8, 2,1 x 150 mm, 50 pmol BSA

Tryptic Digest en 4M de urea, 50 ºC, 0,2 ml/min., UV-214 nm, A:

0,1% TFA en agua, B: 0,1% TFA en acetonitrilo/20% agua,

Gradiente: 2-62% B en 70 min.

18

Longitud de columna - Adaptar la

longitud a la resolución deseada DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0035.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0032.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0037.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0027.D)

DAD1 A, Sig=275,16 Ref=360,40 (F:\2\DATA\HUMMER\HUMM0038.D)

min0 1 2 3 4 5 6 7 8

Ad

sorb

ance

4,6 x 15 mm

4,6 x 30 mm

4,6 x 50 mm

4,6 x 75 mm

4,6 x 150 mm

Ab

so

rba

nc

ia

SB-C18

Condiciones: LC: Hewlett-Packard HP1100

Columnas: Zorbax SB-C18, 3,5 µm

Fase móvil: 1 mM octano ácido sulfónico, Na sal, pH 2,5: ACN (80:20)

UV: 275 nm; flujo: 2,0 ml / min.; 70 °C

Vol. de inyección: 1 µl

Muestra:

1. Acetoaminofeno (4-acetoamidofenol)

2. Cafeína

3. 2-Ac2-Acetoamidofenol

4. Acetanilida

5. Aspirina (ácido acetilsalicílico)

6. Ácido salicílico

7. Fenacetina (acetofenetidina)

1 23 4

5 6 7

los 7 componentes se descomponen en menos de 1 min

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