two stages fermentation of vitamin c

8/12/2019 Two Stages Fermentation of vitamin c

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V o l . 4 3 , N o . 5P P L I E D N ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , May 1 9 8 2 , p . 1 0 6 4 - 1 0 6 90 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 2 / 0 5 1 0 6 4 - 0 6 0 2 . 0 0 / 0

P r o d u c t i o n o f 2 - K e t o - L - G u l o n i c A c i d f r o m D - G l u c o s e b y Two-S t a g e F e r m e n t a t i o nTAKAYASU SON OY A M A,* HIROYOSHI TANI, KATSUHIRO MATSUDA, BUNJI KAGEY A M A ,M A S A H I R O T A N I M O T O , KOBEI KOBAYASHI, SHIGEO YAGI, HISASHI KYOTANI, AND KENJIMITSUSHIMA

D e p a r t m e n t o f P r o d u c t i o n , S h i o n o g i a n d C o m p a n y , L t d . , 1 9 2 , I m a f u k u , A m a g a s a k i , Hyogo 6 6 0 , J a p a nR e c e i v e d 1 6 S e p t e m b e r 1 9 8 1 / A c c e p t e d 3 0 December 1 9 8 1

A p r a c t i c a l m e t h o d f o r t h e p r o d u c t i o n o f c a l c i u m 2 - k e t o - L - g u l o n a t e ( a n i n t e r m e -d i a t e i n t h e R e i c h s t e i n s y n t h e s i s o f L - a s c o r b i c a c i d ) f r o m D - g l u c o s e h a s b e e ne s t a b l i s h e d b y u s i n g a t w o - s t a g e f e r m e n t a t i o n s y s t e m . D - G l u c o s e was f i r s tc o n v e r t e d t o c a l c i u m 2 , 5 - d i k e t o - D - g l u c o n a t e b y a mutant s t r a i n o f E r w i n i a s p . i n amedium c o n t a i n i n g D - g l u c o s e , c o r n s t e e p l i q u o r , ( N H 4 ) 2 H P 0 4 , a n d C a C O 3 . A f t e ra 2 6 - h c u l t i v a t i o n , 3 2 8 . 6 mg o f c a l c i u m 2 , 5 - d i k e t o - D - g l u c o n a t e per m l waso b t a i n e d , w i t h a 9 4 . 5 y i e l d f r o m D - g l u c o s e . T h i s b r o t h was u s e d d i r e c t l y f o r t h en e x t c o n v e r s i o n w i t h o u t r e m o v a l o f c e l l s b y t r e a t m e n t w i t h s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e . T h e s t e r e o s p e c i f i c r e d u c t i o n o f c a l c i u m 2 , 5 - d i k e t o - D - g l u c o n a t e t o c a l c i u m2 - k e t o - L - g u l o n a t e was p e r f o r m e d w i t h a mutant s t r a i n o f C o r y n e b a c t e r i u m s p .When t h e c e l l g r o w t h r e a c h e d a m a x i m um ( a b o u t 1 6 h ) i n a medium c o n t a i n i n g D-g l u c o s e , c o r n s t e e p l i q u o r , N a N O 3 , K H 2 P O 4 , a n d t r a c e e l e m e n t s , NaNO3 wasa d d e d t o t h e c u l t u r e , a n d t h e n t h e c a l c i u m 2 , 5 - d i k e t o - D - g l u c o n a t e b r o t h was f e dover a p e r i o d o f a b o u t 5 0 h . S i n c e t h e mutant s t r a i n r e q u i r e s a h y d r o g e n d o n o r f o rr e d u c t i o n , t h e c a l c i u m 2 , 5 - d i k e t o - D - g l u c o n a t e b r o t h was m i x e d w i t h D - g l u c o s eb e f o r e b e i n g f e d . The r e s u l t s o f f o u r t w o - s t a g e f e r m e n t a t i o n s i n 1 0 - m 3 c o n v e n t i o n -a l f e r m e n t o r s s h o w e d t h a t a n average o f 1 0 6 . 3 m g o f c a l c i u m 2 - k e t o - L - g u l o n a t e perm l was o b t a i n e d , w i t h a 8 4 . 6 y i e l d f r o m D - g l u c o s e , t h e s t a r t i n g m a t e r i a l o fc a l c i u m 2 , 5 - d i k e t o - D - g l u c o n a t e p r o d u c t i o n . C a l c i u m 2 - k e t o - L - g u l o n a t e was s t a b l ei n t h e b r o t h . N e i t h e r 2 - k e t o - D - g l u c o n i c a c i d n o r 5 - k e t o - D - g l u c o n i c a c i d wasd e t e c t e d i n t h e f i n a l b r o t h .

I t i s w e l l k n o w n t h a t 2 - k e t o - L - g u l o n i c a c i d( 2 K L G ) i s r e a d i l y c o n v e r t e d t o L - a s c o r b i c a c i d( v i t a m i n C ) b y a o n e - s t e p c h e m i c a l p r o c e d u r e i nt h e R e i c h s t e i n m e t h o d ( 2 0 ) . D u r i n g t h e p a s t 2d e c a d e s , c o n s i d e r a b l e e f f o r t s h a v e b e e n m a d e t of i n d m i c r o b i a l m e t h o d s f o r p r e p a r i n g 2KLGf r o m v a r i o u s s t a r t i n g m a t e r i a l s , i n c l u d i n g D -s o r b i t o l , L - s o r b o s e , L - s o r b o s o n e , a n d L - i d o n i ca c i d ( 2 , 3 , 6 , 7 , 9 , 1 5 , 1 6 , 1 9 ) . A v a i l a b l e i n f o r m a -t i o n , h o w e v e r , i n d i c a t e s t h a t n e i t h e r o f t h e s em e t h o d s h a s y e t b e e n u s e d f o r t h e c o m m e r c i a lp r o d u c t i o n o f 2KLG. L o w p r o d u c t i v i ty o f2KLG o r d i f f i c u l t y i n o b t a i n i n g s t a r t i n g m a t e r i -a l s e c o n o m i c a l l y s e e m s t o b e t h e r e a s o n f o r t h e i ri m p r a c t i c a l u s e 5 ) .2 , 5 - D i k e t o - D - g l u c o n i c a c i d ( 2 5 D K G ) i s p r o -d u c e d e f f e c t i v e l y f r o m D - g l u c o s e b y P s e u d o m o -n a s a l b o s e s a m a e , w h i c h w a s i s o l a t e d b y W a k i -s a k a ( 1 7 ) . I n t h e c o u r s e o f s t u d i e s o n t h e u s e o f2 5 D K G , o u r a t t e n t i o n w a s d i r e c t e d t o w a r d f i n d -i n g m i c r o o r g a n i s m s c a p a b l e o f c o n v e r t i n g25DKG t o 2KLG b y s t e r e o s p e c i f i c r e d u c t i o n a tt h e C - 5 p o s i t i o n . C o n s e q u e n t l y , a n u m b e r o fm i c r o o r g a n i s m s b e l o n g i n g t o t h e c o r y n e f o r mb a c t e r i a w e r e i s o l a t e d f r o m s o i l s a m p l e s a s t h e

m o s t e f f e c t i v e s t r a i n s f o r 2KLG p r o d u c t i o n .T h i s d i s c o v e r y e n c o u r a g e d u s t o a t t e m p t t h ei m p r o v e m e n t o f t h e s e s t r a i n s a n d t h e d e v e l o p -m e n t o f a p r o c e s s b a s e d o n t h e r e d u c t i o n o f25DKG b e c a u s e 25DKG i s i n e x p e n s i v e l y p r o -d u c e d f r o m D - g l u c o s e . D e t a i l e d i n f o r m a t i o nc o n c e r n i n g t h e s e r e s u l t s w i l l b e s u b j e c t s f o rf u t u r e r e p o r t s .I n t h i s p a p e r , we r e p o r t a p r a c t i c a l f e r m e n t a -t i o n m e t h o d , e s t a b l i s h e d b y u s i n g 1 0 - m i 3 c o n v e n -t i o n a l s t a i n l e s s - s t e e l f e r m e n t o r s , f o r t h e p r o d u c -t i o n o f c a l c i u m 2KLG ( C a - 2 K L G ) f r o m D -g l u c o s e v i a c a l c i u m 25DKG ( C a - 2 5 D K G ) . T h ep r o c e s s c o n s i s t s o f a t w o - s t a g e f e r m e n t a t i o n :o x i d a t i v e f e r m e n t a t i o n o f D - g l u c o s e t o C a -25DKG b y a m u t a n t s t r a i n o f E r w i n i a s p . , w h i c hw a s n e w l y i s o l a t e d f r o m f r u i t , a n d t h e n i t sr e d u c t i v e f e r m e n t a t i o n t o Ca-2KLG b y a m u t a n to f C o r y n e b a c t e r i u m s p .

M A T E R I A LS A N D M E THODSC h e m i c a l s . Ca-25DKG a n d c a l c i u m 5 - k e t o - D - g l u c o -n a t e w e r e o b t a i n e d f r o m D - g l u c o s e a s t h e o x i d a t i o np r o d u c t s o f P . a l b o s e s a m a e a n d A c e t o b a c t e r s u b o x y -d a n s ( S h i o n o g i ) , r e s p e c t i v e l y , a c c o r d i n g t o t h e m e t h -

1 0 6 4


2/6

2KLG PRODUCTION 1 0 6 5o d s d e s c r i b e d b y W a k i s a k a ( 1 8 ) a n d S t u b b s e t a l . ( 1 2 ) .C a l c i u m L - i d o n a t e w a s o b t a i n e d f r o m c a l c i u m 5 - k e t o -D - g l u c o n a t e a s t h e r e d u c t i o n p r o d u c t o f B r e v i b a c t e r i -u m k e t o s o r e d u c t u m A T C C 2 1 9 1 4 b y t h e m e t h o d o fS o n o y a m a e t a l . ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e 2KLG w a sp r e p a r e d f r o m t h e m o n o h y d r a t e o f d i a c e t o n e g u l o n i ca c i d b y a c i d h y d r o l y s i s . C a l c i u m 2 - k e t o - D - g l u c o n a t e( C a - 2 K D G ; i t s f r e e a c i d i s r e f e r r e d t o a s 2KDG) w a sp u r c h a s e d f r o m N a k a r a i C h e m i c a l s , L t d . ( K y o t o , J a -p a n ) . F o r t h e a s s a y o f D - g l u c o n i c a c i d , g l u c o n a t ek i n a s e , P - N A D P a n d 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o -g e n a s e , a n d A T P w e r e o b t a i n e d f r o m B o e h r i n g e rM a n n h e i m - Y a m a n o u c h i C o . , L t d . ( T o k y o , J a p a n ) ,O r i e n t a l Y e a s t C o . , L t d . ( T o k y o , J a p a n ) , a n d KyowaH a k k o K o g y o C o . , L t d . ( T o k y o , J a p a n , r e s p e c t i v e l y .O t h e r c h e m i c a l s u s e d f o r a n a l y s e s w e r e r e a g e n t g r a d e .A l l c o m p o n e n t s o f t h e m e d i a u s e d w e r e c o m m e r c i a lp r e p a r a t i o n s , u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d .

F e r m e n t a t i o n m e t h o d f o r Ca-25DKG p r o d u c t i o n .S t r a i n SUS 2 6 2 9 0 0 1 , a b l o c k e d m u t a n t d e r i v e d f r o mE r w i n i a s p . SHS 2 0 0 6 ATCC 3 1 6 2 6 ) , w a s g r o w n a t2 8 C f o r 2 4 h o n a g a r s l a n t s c o n t a i n i n g 0 . 5 g l y c e r o l ,0 . 5 y e a s t e x t r a c t ( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t ,M i c h . ) , 0 . 3 p e p t o n e ( D i f c o ) , 0 . 1 K H 2 P O 4 , 0 . 0 2M g S O 4 - 7 H 2 O , a n d 2 a g a r . T h e p r e s e e d m e d i u m ( 6 0 0m l i n a 2 - l i t e r f l a s k ) a n d t h e s e e d m e d i u m ( 4 2 0 l i t e r s i na 1 - m 3 s t a i n l e s s - s t e e l f e r m e n t o r ) c o n s i s t e d o f 0 . 5g l y c e r o l , 3 c o r n s t e e p l i q u o r , 0 . 1 K H 2 P O 4 , 0 . 0 1p - 2 0 0 0 ( V o r a n o l - 2 1 2 0 ; T h e Do w C h e m i c a l C o . , F r e e -p o r t , T e x . ) a n t i f o a m , a n d t a p w a t e r . T h e s e m e d i a w e r ea d j u s t e d t o pH 6 . 8 b e f o r e s t e r i l i z a t i o n a t 1 2 1 C f o r 2 0m i n . T h e p r e s e e d i n o c u l u m w a s p r e p a r e d b y i n o c u l a t -i n g a f r e s h a g a r s l a n t o f s t r a i n SHS 2 6 2 9 0 0 1 i n t h es t e r i l e m e d i u m a n d i n c u b a t i n g a t 2 8 C f o r 2 0 h o n ar o t a r y s h a k e r a t 2 7 5 r p m . T h e e n t i r e c o n t e n t s o f t h ef i v e p r e s e e d f l a s k s w e r e a d d e d t o t h e s t e r i l e s e e dm e d i u m , w h i c h w a s i n c u b a t e d a t 2 8 C f o r 1 0 h w i t h a na i r f l o w r a t e o f 0 . 4 2 m 3 / m i n ( n o r m a l t e m p e r a t u r e a n dp r e s s u r e ) a n d a g i t a t i o n a t 2 4 4 r p m .Ca-25DKG w a s p r e p a r e d i n a 1 0 - m 3 c o n v e n t i o n a ls t a i n l e s s - s t e e l f e r m e n t o r . T h e f e r m e n t o r m e d i u m w a sc o m p o s e d o f ( g r a m s p e r l i t e r ) : D - g l u c o s e , 5 8 ; c o r ns t e e p l i q u o r , 1 1 . 3 ; ( N H 4 ) 2 H P 0 4 , 5 . 6 ; C a C O 3 , 1 8 4 ; p -2 0 0 0 a n t i f o a m , 0 . 2 ; a n d t a p w a t e r . D - G l u c o s e w a ss t e r i l i z e d s e p a r a t e l y a t 1 1 5 C f o r 1 5 m i n . C o r n s t e e pl i q u o r a n d C a C O 3 w e r e a l s o s t e r i l i z e d s e p a r a t e l y a t1 2 1 C f o r 2 0 m i n , w h e r e a s ( N H 4 ) 2 H P 0 4 w a s s t e r i l i z e db y f i l t r a t i o n . T h e pH o f s t e r i l i z e d t o t a l m e d i u m w a sm a i n t a i n e d a t 6 . 8 b y a d j u s t i n g t h o s e o f t h e m e d i u mc o m p o n e n t s b e f o r e s t e r i l i z a t i o n . T h e f e r m e n t o r ( 1 . 8 6m 3 o f t h e m e d i u m ) w a s i n o c u l a t e d w i t h t h e e n t i r ec o n t e n t s o f t h e 1 - m 3 s e e d f e r m e n t o r a n d i n c u b a t e d a t2 8 C . A g i t a t i o n w a s m a i n t a i n e d a t 1 6 0 r p m , a n d a i r wass p a r g e d i n a t a r a t e o f 3 . 6 m 3 / m i n ( N . T . P . ) a t a t a n kp r e s s u r e o f 1 . 5 k g / c m 2 ( g a u g e ) . A f t e r 3 h o f c u l t i v a t i o n , as t e r i l e 1 - g l u c o s e s o l u t i o n was f e d i n t e r m i t t e n t l y t o t h ec u l t u r e a s d e s c r i b e d i n R e s u l t s . B a c t e r i a l g r o w t h wasm o n i t o r e d b y m e a s u r i n g o p t i c a l d e n s i t y c h a n g e s a t 6 6 0n m w i t h a H i t a c h i s p e c t r o p h o t o m e t e r , m o d e l 1 3 9 .A f t e r c o m p l e t i o n o f C a - 2 5 D K G f e r m e n t a t i o n , t h eb r o t h w a s t r e a t e d w i t h s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e a sd e s c r i b e d i n R e s u l t s .F e r m e n t a t i o n m e t h o d f o r Ca-2KLG p r o d u c t i o n . C a -2KLG was a l s o p r o d u c e d i n a 1 0 - m 3 c o n v e n t i o n a ls t a i n l e s s - s t e e l f e r m e n t o r . A g a r s l a n t s o f s t r a i n SHS7 5 2 0 0 1 , a b l o c k e d m u t a n t d e r i v e d f r o m C o r y n e b a c t e r i -u m s p . SHS 0 0 0 7 ( A T C C 3 1 0 9 0 ) , w e r e p r e p a r e d w i t h

m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 5 D - g l u c o s e , 0 . 5 y e a s t e x -t r a c t ( D i f c o ) , 0 . 5 p e p t o n e ( D i f c o ) , 0 . 1 K H 2 P O 4 ,0 . 0 2 M g S O 4 - 7 H 2 O , a n d 2 . 0 a g a r . T h e y w e r e g r o w na t 2 8 C f o r 4 0 h . T h e p r e s e e d medium 6 0 0 m l i n a 2 -l i t e r f l a s k ) c o n s i s t e d o f 1 D - g l u c O s e , 0 . 5 y e a s te x t r a c t ( D i f c o ) , 0 . 5 p e p t o n e ( D i f c o ) , 0 . 1 N a N O 3 ,0 . 1 K H 2 P O 4 , a n d 0 . 0 2 M g S O 4 - 7 H 2 O . T h e pH o ft h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o 7 . 0 b e f o r e s t e r i l i z a t i o n a t1 2 1 C f o r 1 5 m i n . A s h a k e f l a s k w a s i n o c u l a t e d w i t h af r e s h s l a n t o f s t r a i n SHS 7 5 2 0 0 1 a n d i n c u b a t e d a t 2 8 Cf o r 2 4 h o n a r o t a r y s h a k e r a t 2 7 5 r p m . T h e s e e dm e d i u m ( 4 7 0 l i t e r s i n a 1 - m 3 c o n v e n t i o n a l s t a i n l e s s -s t e e l f e r m e n t o r ) c o n t a i n e d 1 . 0 D - g l u c o s e , 2 . 0 c o r ns t e e p l i q u o r , 0 . 2 N a N O 3 , 0 . 1 K H 2 P O 4 , 0 . 0 2M g S O 4 - 7 H 2 O , 0 . 0 0 5 p - 2 0 0 0 a n t i f o a m , a n d t a p w a t e r .T h e pH o f t h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o 7 . 0 b e f o r es t e r i l i z a t i o n a t 1 2 1 C f o r 2 0 m i n . T h e e n t i r e c o n t e n t s o f1 0 p r e s e e d f l a s k s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o t h e s ee d m e d i -u m , w h i c h w a s i n c u b a t e d a t 2 8 C f o r 2 4 h w i t h a n a i rf l o w r a t e o f 0 . 4 7 m 3 / m i n ( N . T . P . ) a n d a g i t a t i o n a t 2 4 4r p m .T h e f e r m e n t o r m e d i u m c o n s i s t e d o f ( g r a m s p e rl i t e r ) : D - g l u c o s e , 2 0 ; c o r n s t e e p l i q u o r , 3 0 ; N a N O 3 ,3 . 4 5 ; K H 2 P O 4 , 0 . 6 7 ; p - 2 0 0 0 a n t i f o a m , 0 . 0 1 6 7 ; t r a c ee l e m e n t s , i n c l u d i n g ZnSO4 7H2O ( 4 . 9 m g ) ,M n C l 2 - 4 H 2 O ( 0 . 8 m g ) , t h i a m i n e h y d r o c h l o r i d e ( 0 . 2 2m g ) , a n d c a l c i u m D - p a n t o t h e n a t e ( 0 . 1 7 m g ) ; a n d t a pw a t e r . T r a c e e l e m e n t s w e r e f i l t e r s t e r i l i z e d . D - G l u c o s ew a s s t e a m s t e r i l i z e d a t 1 1 5 C f o r 1 5 m i n . T h e r e s t o ft h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o a pH o f 7 . 2 a n d s t e a ms t e r i l i z e d a t 1 2 1 C f o r 2 0 m i n . T h e pH o f s t e r i l i z e d t o t a lm e d i u m w a s a p p r o x i m a t e l y 6 . 9 . T h e f e r m e n t o r ( 4 . 2 3m 3 o f t h e m e d i u m ) w a s i n o c u l a t e d w i t h t h e e n t i r ec o n t e n t s o f t h e 1 - m 3 s e e d f e r m e n t o r a n d i n c u b a t e d a t2 8 C w i t h a g i t a t i o n a t 1 6 0 r p m , w h e r e a s a i r w a sa d m i t t e d t h r o u g h a p i p e s p a r g e r a t a r a t e o f 1 . 1 8 m 3 /m i n ( N . T . P . ) a n d a t a n k p r e s s u r e s l i g h t l y o v e r a t m o -s p h e r e . When t h e c e l l g r o w t h r e a c h e d a maximum ( 1 6h i n F i g . 2 ) , 9 . 7 k g o f a s t e r i l e s o l u t i o n o f 4 8 . 5 ( w t / w t )NaNO3 w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e , a n d t h e n f e e d i n g o ft h e Ca-25DKG b r o t h w a s s t a r t e d a s d e s c r i b e d i nR e s u l t s . B a c t e r i a l g r o w t h w a s m e a s u r e d b y o p t i c a ld e n s i t y i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h a t o f Ca-25DKGf e r m e n t a t i o n .A n a l y t i c a l m e t h o d s . T h e C a - 2 5 D K G c o n t e n t i n b o t ht h e C a - 2 5 D K G a n d Ca-2KLG f e r m e n t a t i o n b r o t h s w a sd e t e r m i n e d w i t h a T e c h n i c o n A u t o a n a l y z e r b y t h ef o l l o w i n g N H 4 0 H - H C l m e t h o d d e v i s e d b y u s . To 0 . 6m l o f s u i t a b l y d i l u t e d s a m p l e ( C a - 2 5 D K G , 8 0 t o 4 0 0, u M ) o f t h e f e r m e n t a t i o n b r o t h , 0 . 6 m l o f a i r , 0 . 6 m l o fc a l c i u m c h l o r i d e ( 1 2 . 0 m M ) , 0 . 3 2 m l o f 1 . 5 N NH40H,a n d 0 . 3 4 m l o f 4 N H C l w e r e p u m p e d p e r m i n a n dm i x e d i n c o i l s s u c c e s s i v e l y . T h e m i x t u r e ( 2 . 4 6 m l / m i n )w a s p a s s e d t h r o u g h a 2 8 - m l - c a p a c i t y c o i l ( 1 . 6 - m mi n s i d e d i a m e t e r ) p l a c e d i n a h e a t i n g b a t h a t 5 0 C , a n dt h e n t h e a b s o r b a n c e a t 4 6 0 n m was m e a s u r e d i n t h ef l o w c e l l . F o r t h e a s s a y o f C a - 2 K L G , d i r e c t c o n v e r -s i o n o f 2KLG t o L - a s c o r b i c a c i d was c a r r i e d o u t i n ar e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n i n g 1 m l o f s u i t a b l y d i l u t e ds a m p l e ( C a - 2 K L G , 5 t o 2 8 , u m o l ) o f t h e f e r m e n t a t i o nb r o t h w i t h 3 m l o f 8 N H C I . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 3 0 m i na t 9 0 C , t h e r e a c t i o n was s t o p p e d b y a d d i n g 4 m l o f 5 NNaOH, a n d t h e r e s u l t i n g s o l u t i o n was e x t r a c t e d w i t h 3m l o f i s o a m y l a l c o h o l . T h e amount o f L - a s c o r b i c a c i dr e m a i n i n g i n t h e l o w e r p h a s e was t h e n d e t e r m i n e ds p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y b y a m o d i f i e d p h o s p h o - 1 8 -t u n g s t i c a c i d m e t h o d 1 ) . T h e a b s o r b a n c e a t 7 5 0 n m

V O L . 4 3 , 1 9 8 2


3/6

1 0 6 6 SONOY M E T A L .f e e d i n g p e r i o d o fD - g l u c o s e

I 60 . 54

20( 0D I O 1 0

a ) 3c u001

4E40 0 c -E

a030 0 0aX

20 0 C )

C \ j

1 0 0 0L O

0 1 0 20 30C u l t i v a t i o n Time ( h )

F I G . 1 . T i m e c o u r se o f t y p i c a l Ca-25DKG p r o d u c -t i o n b y a m u t a n t s t r a i n o f E r w i n i a s p . i n a 1 0 - m 3c o n v e n t i o n a l s t a i n l e s s - s t e e l f e r m e n t o r . S y m b o l s : 0o p t i c a l d e n s i t y ; 0 C a - 2 5 D K G ; A C a - 2 K D G ; * ,c a l c i u m D -g l u c o n a t e ( C a - D G ) ; A p H .

was m e a s u r e d . Ca-2KDG c o n t e n t i n t h e Ca-25DKGf e r m e n t a t i o n b r o t h was e s t i m a t e d as f o l l o w s . T h ef e r m e n t a t i o n b r o t h s a m p l e was d i v i d e d i n t o tw o por-t i o n s . One p o r t i o n o f t h e s a m p l e was u s e d t o m e a s u r et h e Ca-25DKG c o n c e n t r a t i o n w i t h t h e NH40H-HClm e t h o d . A n o t h e r p o r t i o n o f t h e s a m p l e was s u b j e c t e dt o a t r e a t m e n t s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d a b o v e f o r t h eCa-2KLG assay, a n d t h e a b s o r b a n c e a t 7 5 0 nm C a -25DKG p l u s Ca-2KDG) was r e a d . Ca-2KDG c o n c e n -t r a t i o n was t h e n d e t e r m i n e d b y s u b t r a c t i n g t h e C a -25DKG v a l u e ( 7 5 0 n m ) , w h i c h was o b t a i n e d i nc o m p a r i s o n w i t h a s t a n d a r d curve o f Ca-25DKG c o n -c e n t r a t i o n s , f r o m t h e s a m p l e v a l u e ( 7 5 0 n m ) a n dc o m p a r i n g t h e r e s u l t i n g v a l u e ( 7 5 0 n m ) w i t h a s t a n d a r dcurve o f Ca-2KDG c o n c e n t r a t i o n s . To e n s u r e t h ea c c u r a c i e s o f a l l a s s a y systems u s e d h e r e , new s t a n -d a r d curves w e r e made u p p e r i o d i c a l l y . D - G l u c o n i ca c i d was d e t e r m i n e d e n z y m a t i c a l l y b y t h e m e t h o dd e s c r i b e d b y M o l l e r i n g a n d B e r g m e y e r ( 8 ) . D - G l u c o s ewas a l s o m e a s u r e d e n z y m a t i c a l l y b y u s i n g t h e G l u -c o s e - B - T e s t ( W a k o P u r e C h e m i c a l I n d u s t r i e s , L t d . ,O s a k a , J a p a n ) , b a s e d on a m o d i f i e d m e t h o d o f S h a r p( 1 0 ) .A p a p e r c h r o m a t o g r a p h i c s y s t e m , a c c o r d i n g t o t h em e t h o d d e s c r i b e d b y W a k i s a k a ( 1 8 ) , was u s e d f o r t h ei d e n t i f i c a t i o n o f 2KLG, 2KDG, 25DKG, 5 - k e t o - D -g l u c o n i c a c i d , D - g l u c o s e , a n d o t h e r m e t a b o l i c p r o d -u c t s . T h e c u l t u r e s w e r e a l s o a n a l y z e d w i t h a S h i m a z ugas c h r o m a t o g r a p h ( m o d e l G C - 5 A ) a n d a t h e r m a lc o n d u c t i v i t y d e t e c t o r f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f D - g l u -

c o n i c a c i d , L - i d o n i c a c i d , a n d o t h e r m e t a b o l i c p r o d -u c t s . T h e t r i m e t h y l s i l y l e s t e r d e r i v a t i v e s o f t h e s e c o m -p o u n d s w e r e p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o f S w e e l y e t a l .( 1 3 ) . A 1 0 - , u 1 s a m p l e w a s i n j e c t e d i n t o a c o i l e d g l a s sc o l u m n ( 2 , 0 0 0 b y 3-mm i n s i d e d i a m e t e r ) , p a c k e d w i t h5 S E - 5 2 o n 8 0 / 1 0 0 C h r o m o s o r b WAW D M CS ( G e n -e r a l E l e c t r i c C o . , W a t e r f o r d , N . Y . ) . H e l i u m s e r v e d a st h e c a r r i e r g a s . T h e i n j e c t i o n p o r t a n d d e t e c t o r t e m -p e r a t u r e s w e r e 2 3 0 a n d 2 3 5 C , r e s p e c t i v e l y , a n d t h ei n i t i a l c o l u m n o v e n w a s s e t a t 1 6 0 C , f o l l o w e d b y a4 C / m i n t e m p e r a t u r e i n c r e a s e t o 2 1 0 C . n - H e n e i c o -s a n e w a s u s e d a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d . P e a k s w e r ei d e n t i f i e d b y c o m p a r i s o n w i t h a u t h e n t i c s t a n d a r d s .RESULTS

Ca-25DKG p r o d u c t i o n i n a 1 0 - m 3 f e r m e n t o r .T h e f o r m a t i o n o f D - g l u c o n i c a c i d , 2KDG, a n d25DKG o c c u r r e d s i m u l t a n e o u s l y w i t h D - g l u c o s eu t i l i z a t i o n d u r i n g t h e c u l t i v a t i o n . F i g u r e 1 s h o w st h e r e s u l t s o b t a i n e d when 1 4 . 4 k g o f a s t e r i l es o l u t i o n o f 50 ( w t / w t ) D - g l u c o s e was f e d a t 4 . 5 -m i n i n t e r v a l s o v e r a p e r i o d o f 1 2 h . The a m o u n t so f c a l c i u m D - g l u c o n a t e a n d Ca-2KDG d e c r e a s e dr a p i d l y a f t e r c o m p l e t i o n o f D - g l u c o s e f e e d i n g ,w h e r e a s t h e a c c u m u l a t i o n o f Ca-25DKG c o n t i n -u e d a n d r e a c h e d a p e a k , 3 2 8 . 6 m g / m l a t 2 6 h o fc u l t i v a t i o n . T h e y i e l d o f 9 4 . 5 mol Ca-25DKGw a s o b t a i n e d f r o m t h e t o t a l a m o u n t s o f D -g l u c o s e a d d e d . I n t h e f i n a l b r o t h , 2 . 5 mg o fc a l c i u m D - g l u c o n a t e p e r m l r e m a i n e d u n c o n v e r t -e d , w h e r e a s D - g l u c o s e a n d Ca-2KDG w e r e n o td e t e c t e d . T h e p H , w h i c h w a s n o t r e g u l a t e d ,b e g a n a t 7 . 1 , d r o p p e d t o 4 . 7 a t 3 h o f c u l t i v a t i o n ,a n d f i n a l l y r e a c h e d 3 . 9 . T h e v o l u m e o f t h e b r o t hw a s i n c r e a s e d f r o m 2 . 2 8 t o 4 . 2 m 3 b y f e e d i n g o fD - g l u c o s e s o l u t i o n . P r e c i p i t a t i o n o f c a l c i u m D -g l u c o n a t e , C a - 2 K D G , o r Ca-25DKG w a s n o to b s e r v e d d u r i n g t h e f e r m e n t a t i o n . N o 5 - k e t o - D -g l u c o n i c a c i d w a s d e t e c t e d b y m e a n s o f p a p e rc h r o m a t o g r a p h y t h r o u g h o u t t h e f e r m e n t a t i o n .T r e a t m e n t o f C a - Z 5 D K G b r o t h w i t h s o d i u md o d e c y l s u l f a t e . T h e Ca-25DKG b r o t h ( 4 . 2 m 3 )w a s m i x e d w i t h 7 . 2 7 k g o f a s t e r i l e s o l u t i o n o f1 4 . 4 ( w t / w t ) s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e a n d m a i n -t a i n e d a t 2 8 C f o r 6 h w i t h m i l d a g i t a t i o n a t 8 0r p m . B y t h i s t r e a t m e n t , t h e t o t a l v i a b l e c e l lp o p u l a t i o n w a s d e c r e a s e d f r o m 5 x 1 0 9 t o 9 x1 0 c e l l s p e r m l . F i n a l l y , t h e b r o t h w a s c o o l e da n d m a i n t a i n e d a t a p p r o x i m a t e l y 1 0 C t o m i n i -m i z e t h e d e c o m p o s i t i o n o f C a - 2 5 D K G . T h e C a -25DKG b r o t h t h u s t r e a t e d w a s u s e d d i r e c t l y a st h e s o u r c e o f Ca-25DKG f o r t h e n e x t c o n v e r -s i o n , w i t h o u t r e m o v a l o f c e l l s .Ca-2KLG p r o d u c t i o n i n a 1 0 - m 3 f e r m e n t o r .T h e m u t a n t s t r a i n SHS 7 5 2 0 0 1 r e q u i r e s a h y d r o -g e n d o n o r f o r t h e r e d u c t i o n o f 25DKG t o 2KLG.F i g u r e 2 p r e s e n t s t h e d a t a o b t a i n e d w h e n D -g l u c o s e w a s u s e d a s t h e h y d r o g e n d o n o r . T h eCa-25DKG b r o t h p r e p a r e d i n t h e p r e c e d i n gs t a g e w a s m i x e d w i t h a s t e r i l e s o l u t i o n o f 50( w t / w t ) D - g l u c o s e i n t h e p r o p o r t i o n o f 0 . 2 k g o f

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


4/6

2KLG PRODUCTION 1 0 6 7f e e d i n g p e r i o d o fCa-25DKG b r o t h

9_I 8 Z / a _

6

c O-10c oc0

3C. _0 : ~1

1 2 0 E

1 1 aa )

80 - 0L - c ma E

6 0 J c oC 6 L o )o

C\ J40 C 6c s20 - 4 2 E

2 E0O - O a :0 2 0 40 60C u l t i v a t i o n Time ( h )

F I G . 2 . Time c o u r se o f t y p i c a l Ca-2KLG p r o d u c -t i o n b y a mutant s t r a i n o f C o r y n e b a c t e r i u m s p . i n a 1 0 -m 3 c o n v e n t i o n a l s t a i n l e s s - s t e e l f e r m e n t o r . S y m b o l s :0 o p t i c a l d e n s i t y ; 0 Ca-2KLG; Ca-25DKG; A ,p H .

D - g l u c o s e t o 1 k g o f 25DKG b e f o r e b e i n g f e d .T h e f e e d i n g o f t h e Ca-25DKG b r o t h was s t a r t e da t 1 8 h o f c u l t i v a t i o n a n d c o n t i n u e d over a p e r i o do f 4 8 h . T h e f e e d r a t e o f t h e Ca-25DKG b r o t hw a s a d j u s t e d t o m a i n t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f* C a - 2 5 D K G i n t h e Ca-2KLG f e r m e n t a t i o n b r o t hb e l o w 5 m g / m l . T h e a c c u m u l a t i o n o f Ca-2KLGb e g a n i m m e d i a t e l y a f t e r t h e Ca-25DKG b r o t hwas f e d a n d f i n a l l y r e a c h e d 1 0 6 . 5 m g / m l ( 9 7 . 0m g / m l as f r e e a c i d ) . I n t h e f i n a l b r o t h , h o w e v e r ,1 . 6 mg o f Ca-25DKG p e r m l r e m a i n e d u n c o n -v e r t e d . A f t e r c o m p l e t i o n o f Ca-25DKG b r o t hf e e d i n g , n e i t h e r a n i n c r e a s e n o r a d e c r e a s e o fCa-2KLG c o n t e n t i n t h e b r o t h was o b s e r v e d .T h e y i e l d o f Ca-2KLG f r o m Ca-25DKG u t i l i z e dwas 9 2 . 5 m o l , w h e r e a s t h e o v e r a l l y i e l d o f C a -2KLG f r o m D - g l u c o s e , t h e s t a r t i n g m a t e r i a l o fCa-25DKG p r o d u c t i o n , was 8 6 . 0 m o l . T o t a lv o l u m e o f t h e b r o t h i n c r e a s e d g r a d u a l l yt h r o u g h o u t t h e p e r i o d o f f e e d i n g f r o m 4 . 7 t o 7 . 4 3m i 3 . T h e p H , w h i c h was n o t r e g u l a t e d , d r o p p e df r o m 8 . 3 t o 6 . 1 , w h e r e a s t h e c e l l p o p u l a t i o n wash e l d c o n s t a n t a t a r o u n d 2 2 ( o p t i c a l d e n s i t y a t 6 6 0n m ) .R e s u l t s o f f o u r t w o - s t a g e f e r m e n t a t i o n s a res h o w n i n T a b l e 1 . I n a l l c a s e s , D - g l u c o s e , c a l c i -um L - i d o n a t e , c a l c i u m D - g l u c o n a t e , c a l c i u m

5 - k e t o - D - g l u c o n a t e , a n d Ca-2KDG w e r e n o t d e -t e c t e d b y m e a n s o f p a p e r a n d g a s c h r o m a t o g r a -p h y i n t h e f e r m e n t a t i o n b r o t h o v e r t h e p e r i o d o fCa-25DKG f e e d i n g .T o t a l a c c u m u l a t e d Ca-2KLG i n t h e b r o t h w a si s o l a t e d b y K . T o k u y a m a , M . K i y o k a w a , a n d T .S o n o y a m a a s c r y s t a l s i n t h e f o r m o f t h e m o n o -h y d r a t e o f i t s s o d i u m s a l t w i t h p u r i t i e s o f >99( u n p u b l i s h e d d a t a ) . A p o r t i o n o f t h e s e c r y s t a l sw a s r e c r y s t a l l i z e d f r o m d i s t i l l e d w a t e r a n d s u b -m i t t e d t o p h y s i c o c h e m i c a l a n a l y s e s b y M .S a w a d a ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e m e l t i n g p o i n tw a s 1 4 5 . 5 C ( d e c o m p o s i t i o n ) , a n d t h e o p t i c a lr o t a t i o n w a s [ o a ] D 2 2 = - 2 5 . 6 0 ( c = 2 . 0 , w a t e r ) .E l e m e n t a l a n a l y s i s c o r r e s p o n d s t o C 6 H 9 0 7 -Na H 2 O ; c a l c u l a t e d : C , 3 0 . 7 8 ; H , 4 . 7 7 ; N a , 9 . 8 2 .

F o u n d : C , 3 0 . 8 0 ; H , 4 . 7 7 ; N a , 9 . 8 8 . T h e i n f r a r e ds p e c t r u m o f t h e c r y s t a l s i n a KBr d i s k w a si d e n t i c a l t o t h a t o f a n a u t h e n t i c s a m p l e .DISCUSSION

C o n v e r s i o n o f D - g l u c o s e t o 25DKG v i a D -g l u c o n i c a c i d a n d 2KDG w a s f i r s t p r o v e d b yK a t z n e l s o n e t a l . ( 4 ) w i t h A c e t o b a c t e r m e l a n o -g e n u s MA 6 . 2 a n d l a t e r b y W a k i s a k a ( 1 8 ) w i t h P .a l b o s e s a m a e . R e c e n t l y , S t r o s h a n e a n d P e r l m a n( 1 1 ) r e p o r t e d t h a t A . m e l a n o g e n u s A T C C 9 9 3 7c o n v e r t s D - g l u c o s e t o 25DKG v i a D - g l u c o n i ca c i d a n d 5 - k e t o - D - g l u c o n i c a c i d . O u r s t r a i n SHS2 6 2 9 0 0 1 , a m u t a n t s t r a i n d e r i v e d f r o m E r w i n i as p . , a c c u m u l a t e d D - g l u c o n i c a c i d a n d 2KDG a si n t e r m e d i a t e p r o d u c t s ( F i g . 1 ) . N o 5 - k e t o - D -g l u c o n i c a c i d c o u l d b e d e t e c t e d i n t h e b r o t ht h r o u g h o u t t h e c u l t i v a t i o n . T h i s o b s e r v a t i o ns u g g e s t s t h a t s t r a i n SHS 2 6 2 9 0 0 1 c o n v e r t s D -g l u c o s e t o 25DKG i n a p a t h w a y s i m i l a r t o t h o s eo f A . m e l a n o g e n u s MA 6 . 2 a n d P . a l b o s e s a m a e .T h e h i g h - y i e l d p r o d u c t i o n o f 25DKG f r o m D -g l u c o s e ( > 9 0 ) h a s a l r e a d y b e e n r e p o r t e d w i t hr e l a t i v e l y l o w a c c u m u l a t i o n o f 25DKG ( a b o u t 9 0m g / m l ) , a l t h o u g h a t s h a k e f l a s k s c a l e ( 1 1 , 1 8 ) . I nt h i s w o r k t h e p r o d u c t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f25DKG w a s d e m o n s t r a t e d w i t h 1 0 - m i 3 f e r m e n -T A B L E 1 . Ca-2KLG p r o d u c t i o n i n 1 0 - m 3f e r m e n t o r s a

P a r a m e t e r A c c u m u l a t e d C a - 2 K L G y i e l d f r o m( m g / m l ) D - g l u c o s e ( m o l )Maximum 1 0 6 . 9 8 6 . 0Mean 1 0 6 . 3 8 4 . 6Minimum 1 0 5 . 1 8 2 . 9

a V a l u e s w e r e o b t a i n e d i n f o u r t w o - s t a g e f e r m e n t a -t i o n s . F e r m e n t a t i o n s were c a r r i e d o u t i n t h e c u l t u r a lc o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . The Ca-25DKGb r o t h s w e r e f e d o v e r a p e r i o d o f 5 0 h .b D - G l u c o s e was t h e s t a r t i n g m a t e r i a l o f Ca-25DKGp r o d u c t i o n .

V O L . 4 3 , 1 9 8 2


5/6

1 0 6 8 SONOYAMA ET AL.t o r s . S t r a i n SHS 2 6 2 9 0 0 1 c o n v e r t e d t h e a d d e d D-g l u c o s e t o 25DKG w i t h a y i e l d o f 9 4 . 5 mol a n da c c u m u l a t e d 3 2 8 . 6 mg o f Ca-25DKG ( 2 9 7 . 6 m g /m l as f r e e a c i d ) p e r m l i n l o w - c o s t c o r n s t e e pl i q u o r m e d i u m ( F i g . 1 ) ; t h e t i m e r e q u i r e d f o r t h i sf e r m e n t a t i o n was 2 6 h . T h i s h i g h p r o d u c t i v i t ywas o b t a i n e d b y m a i n t a i n i n g t h e d i s s o l v e d - o x y -g e n c o n c e n t r a t i o n s i n t h e c u l t u r e b r o t h a b o v ezero t h r o u g h o u t t h e f e r m e n t a t i o n a n d i m p l e -m e n t i n g t i m e l y f e e d i n g o f D - g l u c o s e .T h e 25DKG i s u n s t a b l e , e s p e c i a l l y t o h e a t a n di n a l k a l i n e s o l u t i o n ( 4 ) . O u r e a r l y a t t e m p t s t oi s o l a t e Ca-25DKG f r o m t h e b r o t h r e s u l t e d i ns i g n i f i c a n t l o s s e s ( m o r e t h a n 3 0 ) o f C a -25DKG. T h i s p h e n o m e n o n o f t h e i n s t a b i l i t y o f25DKG was a l s o o b s e r v e d b y S t r o s h a n e a n dP e r l m a n ( 1 1 ) i n t h e i r s t u d i e s o n t h e i s o l a t i o n o f25DKG f r o m b r o t h . T h u s , t h e e l i m i n a t i o n o f t h ei s o l a t i o n p r o c e s s o f C a - 2 5 D K G , w h i c h i s a na d d i t i o n a l a d v a n t a g e i n i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s ,was i m p o r t a n t t o t h e s u c c e s s o f t h i s w o r k . Ofa b o u t 2 0 c h e m i c a l a g e n t s t e s t e d , s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e was s e l e c t e d as t h e most e f f e c t i v e o n eh a v i n g b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y a g a i n s t SHS 2 6 2 9 0 0 1( a g r a m - n e g a t i v e r o d ) . T h e u s e o f t h e 25DKGb r o t h t r e a t e d w i t h s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( a p -p r o x i m a t e l y 2 5 0 , u g / m l ) d i d n o t i n h i b i t t h e c o n -v e r s i o n o f Ca-25DKG t o Ca-2KLG a n d r a t h e re n h a n c e d Ca-2KLG p r o d u c t i o n i n c o m p a r i s o nw i t h t h e u s e o f t h e Ca-25DKG p o w d e r ( d a t a n o ts h o w n ) .T h e m i c r o b i a l r e d u c t i o n o f 5 - k e t o - D - g l u c o n i ca c i d t o L - i d o n i c a c i d was f o u n d f i r s t b y T a k a g i( 1 4 ) w i t h F u s a r i u m s p e c i e s a n d l a t e r b y u s( u n p u b l i s h e d d a t a ) w i t h B . k e t o s o r e d u c t u mA T C C 2 1 9 1 4 . H o w e v e r , t h e s e l e c t i v e a n d s t e -r e o s p e c i f i c r e d u c t i o n o f 25DKG t o 2KLG b ym i c r o o r g a n i s m s , d e s c r i b e d h e r e , i s a new f i n d -i n g t o o u r k n o w l e d g e .T h e m u t a n t s t r a i n SHS 7 5 2 0 0 1 c o u l d u t i l i z ev a r i o u s c a r b o h y d r a t e s a n d l o w - c o s t m o l a s s e s ash y d r o g e n d o n o r s ( d a t a n o t s h o w n ) . I n t h i s r e p o r twe p r e s e n t t h e r e s u l t s o b t a i n e d when D - g l u c o s ewas u s e d as t h e d o n o r ( F i g . 2 ; T a b l e 1 ) . A l l o ff o u r t w o - s t a g e f e r m e n t a t i o n s i n 1 0 - m 3 f e r m e n -t o r s r e s u l t e d i n e x c e l l e n t l e v e l s o f Ca-2KLGp r o d u c t i o n ( T a b l e 1 ) : a n a v e r a g e o f 1 0 6 . 3 mg o fCa-2KLG ( 9 6 . 8 m g / m l a s f r e e a c i d ) p e r m l wasa c c u m u l a t e d , w i t h an 8 4 . 6 m ol y i e l d f r o m D-g l u c o s e , t h e s t a r t i n g m a t e r i a l o f Ca-25DKG p r o -d u c t i o n . T h e s t a n d a r d d e v i a t i o n s f r o m t h e meanw e r e 0 . 8 f o r t h e a c c u m u l a t i o n a n d 1 . 5 f o r t h ey i e l d . T h u s , t h e r e l i a b i l i t y a n d r e p r o d u c i b i l i t y o ft h e a b o v e f e r m e n t a t i o n m e t h o d f o r Ca-2KLGp r o d u c t i o n , b o t h e s s e n t i a l f o r t h e c o m m e r c i a lp r o d u c t i o n , were a l s o d e m o n s t r a t e d . S i n c e t h eCa-25DKG y i e l d f r o m D - g l u c o s e , t h e Ca-2KLGy i e l d f r o m Ca-25DKG u t i l i z e d , a n d t h e o v e r a l ly i e l d o f Ca-2KLG f r o m D - g l u c o s e were 9 4 . 5 ,9 2 . 5 , a n d 8 6 . 0 ( F i g . 1 a n d 2 ) , r e s p e c t i v e l y , t h e

T ABLE 2 . Ca-2KLG p r o d u c t i o n ( m e a n s) i n 3 0 - l i t e r ,1 - r m 3 , a n d 1 0 - m 3 f e r m e n t o r s aA c c u m u l a t e d C a - 2 K L G y i e l d f r o mF e r m e n t o r Ca-2KLG ( m g / m l ) D - g l u c o s e ( m o l ) b

3 0 l i t e r s 1 0 8 . 3 8 3 . 61 m 3 1 0 5 . 4 8 4 . 31 0 m 3 1 0 6 . 3 8 4 . 6a F e r m e n t a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e c u l t u r a lc o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . T h e Ca-25DKGb r o t h s w e r e f e d o v e r a p e r i o d o f 5 0 h .b D - G l u c o s e w a s t h e s t a r t i n g m a t e r i a l o f Ca-25DKGp r o d u c t i o n .

d e c o m p o s i t i o n o f C a - 2 5 D K G d u r i n g t h e p e r i o d so f t h e t r e a t m e n t w i t h s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e a n dt h e s t o r a g e f o r f e e d i n g w a s e s t i m a t e d t o b e a b o u t1 . 5 .A l t h o u g h t h e m u t a n t s t r a i n SHS 7 5 2 0 0 1 i ss t r i c t l y a e r o b i c , l o w a e r a t i o n r a t e s b e l o w 0 . 2 5v o l / v o l p e r m i n ( N . T . P . ) w e r e s u i t a b l e f o r C a -2KLG p r o d u c t i o n . T h e o n s e t o f f e e d i n g o f t h eC a - 2 5 D K G b r o t h w a s m o s t f a v o r a b l e a t t h ee a r l y s t a t i o n a r y p h a s e o f c e l l g r o w t h , i n d i c a t i n gt h e o p t i m a l p h a s e o f t h e o v e r f l o w o f r e d u c i n gp o w e r s s u c h a s NAD P)H t o r e d u c t i o n o f25DKG i n t h e c e l l ' s m e t a b o l i s m .F o r e c o n o m i c c o n s i d e r a t i o n s , i t may b e n o t e dh e r e t h a t t h e s e r e s u l t s o f Ca-2KLG p r o d u c t i o nw e r e o b t a i n e d w i t h c o m m e r c i a l l y f e a s i b l e m e d i af o r b o t h C a - 2 5 D K G a n d Ca-2KLG f e r m e n t a t i o n .I n a d d i t i o n , t h e s t a b i l i t y o f Ca-2KLG a l l o w e dm o r e f l e x i b i l i t y i n t h e i s o l a t i o n o f t h e p r o d u c t .F u r t h e r m o r e , t h e a b s e n c e o f D - g l u c o s e , c a l c i u mD - g l u c o n a t e , c a l c i u m L - i d o n a t e ( t h e i s o m e r o f D -g l u c o n a t e ) , c a l c i u m 5 - k e t o - D - g l u c o n a t e , a n d e s -p e c i a l l y Ca-2KDG ( t h e i s o m e r o f 2KLG a n dr e a d i l y c o n v e r t e d t o i s o a s c o r b i c a c i d i n t h e s a m ec h e m i c a l p r o c e d u r e a s t h a t o f L - a s c o r b i c a c i ds y n t h e s i s f r o m 2KLG) i n t h e f i n a l b r o t h a l s oa l l o w e d u s t o s i m p l i f y t h e i s o l a t i o n p r o c e s s o f2KLG f r o m t h e b r o t h .S i m i l a r r e s u l t s o n t h e k i n e t i c s o f c e l l g r o w t ha n d Ca-2KLG p r o d u c t i o n w e r e o b t a i n e d w i t h3 0 - l i t e r , 1 - m 3 , a n d 1 0 - m 3 f e r m e n t o r s ( T a b l e 2 ) ,p o s s i b l y i n d i c a t i n g e a s y s c a l e - u p t o i n d u s t r i a l -s c a l e p r o d u c t i o n .I n c o n c l u s i o n , t h e m e t h o d d e s c r i b e d h e r e w i l lp r o v i d e a new way o f c o m m e r c i a l l y p r o d u c i n g2KLG, a n i n t e r m e d i a t e i n t h e s y n t h e s i s o f L -a s c o r b i c a c i d .

A C K N O W L E DGM E N T SW e t h a n k T a h i k o H o n j o , f o r m e r d i r e c t o r o f o u r d e pa r t me n t ,

f o r h i s c o n t i n u e d i n t e r e s t a n d e n c o u r a g e m e n t d u r i n g t h ec o u r s e o f t h i s w o r k . W e a r e a l s o g r a t e f u l t o S h u i c h i A i b a ,O s a k a U n i v e r s i t y , f o r v a l u a b l e d i s c u s s i o n s .LITERATURE CITED

1 . F u g i t a , A . , a n d T . E b i h a r a . 1 9 3 7 . K o l o r i m e t r i s c h e B e s t -i m m u n g v o n V i t a m i n C m i t t e l s P h o s p h o - 1 8 - w o l f r a m s a u r e .B i o c h e m . Z . 2 9 0 : 1 8 2 - 1 9 1 .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


6/6

2KLG P R ODUC T I O N 1 0 6 92 . I s o n o , M . , I . N a k a n i s h i , K . S a s a j i m a , K . M o t i z u k i , T .K a n z a k i , H . O k a z a k i , a n d H . Y o s h i n o . 1 9 6 8 . 2 - K e t o - L -g u l o n i c a c i d f e r m e n t a t i o n . I . P a p e r c h r o m a t o g r a p h i c c h a r -a c t e r i z a t i o n o f m et a bo l i c p r o d u c t s f r o m s o r b i t o l a n d L -s o r b o s e b y v a r i o u s b a c t e r i a . A g r i c . B i o l . C h e m . 3 2 : 4 2 4 -

4 3 1 .3 . K a n z a k i , T . , a n d H . O k a z a k i . 1 9 7 0 . 2 - K e t o - L - g u l o n i c a c i df e r m e n t a t i o n . I V . L - S o r b o s e m e t a b o l i s m i n P s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a . A g r i c . B i o l . C h e m . 3 4 : 4 3 2 - 4 3 6 .4 . K a t z n e l s o n , H . , S . W. T a n e n b a u m , a n d E . L . T a t u m .1 9 5 3 . G l u c o s e , g l u c o n a t e , a n d 2 - k e t o - g l u c o n a t e o x i d a t i o nb y A c e t o b a c t e r m e l a n o g e n u m . J . B i o l . C h e m . 2 0 4 : 4 3 - 5 9 .5 . K u l h a n e x , M . 1 9 7 0 . F e r m e n t a t i o n p r o c e s s e s e m p l o y e d i nV i t a m i n C s y n t h e s i s . A d v . A p p l . M i c r o b i o l . 1 2 : 1 1 - 3 3 .6 . M a k o v e r , S . , G . B . R a m s e y , F . M. V a n e , C . G . W i t t , a n dR . B . W r i g h t . 1 9 7 5 . N e w m e c h a n i s m s f o r t h e b i o s y n t h e s i sa n d m e t a b o l i s m o f 2 - k e t o - L - g u l o n i c a c i d i n b a c t e r i a . B i o -t e c h n o l . B i o e n g . 1 7 : 1 4 8 5 - 1 5 1 4 .7 . M a r t i n , C . K . A . , a n d D . P e r l m a n . 1 9 7 6 . C o n v e r s i o n o f L -s o r b o s e t o 2 - k e t o - L - g u l o n i c a c i d b y m ix t u r e s o f i m m o b i -l i z e d c e l l s o f G l u c o n o b a c t e r m e l a n o g e n u s I F O 3 2 9 3 a n dP s e u d o m o n a s s p e c i e s . E u r . J . A p p l . M i c r o b i o l . 3 : 9 1 - 9 5 .8 . M o l l e r i n g , H . , a n d H . U . B e r g m e y e r . 1 9 7 4 . D - G l u c o n a t e ,p . 1 24 3- 12 47 . I n H . U . B e r g m e y e r ( e d . ) , M e t h o d s o fe n z y m a t i c a n a l y s i s , v o l . 3 , 2 n d E n g l i s h e d . A c a d e m i cP r e s s , I n c . , N ew Y o r k .9 . O k a z a k i , H . , T . K a n z a k i , K . S a s a j i m a , a n d Y . T e r a d a .1 9 6 9 . 2 - K e t o - L - g u l o n i c a c i d f e r m e n t a t i o n . I I I . E v a l u a t i o no f t h e p a t h w a y o f s o r b i t o l m e t a b o l i s m i n G l u c o n o b a c t e rm e l a n o g e n u s . A g r i c . B i o l . C h e m . 3 3 : 2 0 7 - 2 1 1 .1 0 . S h a r p , P . 1 9 7 2 . I n t e r f e r e n c e i n g l u c o s e o x i d a s e - p e r o x i -d a s e b l o o d g l u c o s e m e t h o d s . C l i n . C h i m . A c t a 4 0 : 1 1 5 -1 2 0 .1 1 . S t r o s h a n e , R . M . , a n d D . P e r l m a n . 1 9 7 7 . F e r m e n t a t i o n o fg l u c o s e b y A c e t o b a c t e r m e l a n o g e n u s . B i o t e c h n o l .B i o e n g . 1 9 : 4 5 9 - 4 6 5 .

1 2 . S t u b b s , J . J . , L . B . L o c k w o o d , E . T . R o e , B . T a b e n k i n ,a n d G . E . W a r d . 1 9 4 0 . P r o d u c t i o n o f k e t o g l u c o n i c a c i d sf r o m g l u c o s e . I n d . E n g . C h e m . 3 2 : 1 6 2 6 - 1 6 3 1 .1 3 . S w e e l y , C . C . , R . B e n t l e y , M. M a k i t a , a n d W. W. W e l l s .1 9 6 3 . G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f t r i m e t h y l s i l y l e d e r i v -a t i v e s o f s u g a r s a n d r e l a t e d s u b s t a n c e s . J . Am. C h e m .S o c . 8 5 : 2 4 9 7 - 2 5 0 7 .1 4 . T a k a g i , Y . 1 9 6 2 . R e d u c t i o n o f 5 - k e t o - D - g l u c o n i c a c i d t o L -i d o n i c a c i d b y F u s a r i u m s p e c i e s . A g r i c . B i o l . C h e m .2 6 : 7 1 7 - 7 1 8 .1 5 . T e n g e r d y , R . P . 1 9 6 1 . R e d o x p o t e n t i a l c h a n g e s i n t h e 2 -k e t o - L - g u l o n i c a c i d f e r m e n t a t i o n . I I . R e l a t i o n s h i p b e -t w e e n r e d o x p o t e n t i a l a n d p r o d u c t f o r m a t i o n . J . B i o c h e m .M i c r o b i o l . T e c h n o l . E n g . 3 : 2 5 5 - 2 6 0 .1 6 . T s u k a d a , Y . , a n d D . P e r l m a n . 1 9 7 2 . T h e f e r m e n t a t i o n o fL - s o r b o s e b y G l u c o n o b a c t e r m e l a n o g e n u s . I . G e n e r a lc h a r a c t e r i s t i c o f t h e f e r m e n t a t i o n . B i o t e c h n o l . B i o e n g .1 4 : 7 9 9 - 8 1 0 .1 7 . W a k L s a k a , Y . 1 9 6 4 . C a r b o h y d r a t e s o x i d a t i o n b y P s e u d o -m o n a s n o v . s p . I . T a x o n o m i c s t u d i e s o n a n e w l y i s o l a t e db a c t e r i u m , P s . a l b o s e s a m a e n o v . s p . A g r i c . B i o l . C h e m .2 8 : 3 6 9 - 3 7 4 .1 8 . W a k i s a k a , Y . 1 9 6 4 . C a r b o h y d r a t e s o x i d a t i o n b y P s e u d o -m o n a s a l b o s e s a m a e n o v . s p . I I . C h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h ep r o d u c t o n g l u c o s e a n d g l u c o n a t e o x i d a t i o n . A g r i c . B i o l .C h e m . 2 8 : 8 1 9 - 8 2 7 .1 9 . Y a m a z a k i , M. 1 9 5 3 . P r o d u c t i o n o f V i t a m i n C b y f e r m e n t a -t i o n . I I . O x i d a t i o n o f C a -L - i d o n a t e a n d C a - D - g l u c o n a t e b yP s e u d o m o n a s s p . a n d i s o l a t i o n o f t h e p r o d u c t s . J . F e r -m e n t . T e c h n o l . 3 1 : 8 6 - 9 0 .2 0 . Y a m a z a k i , M. 1 9 5 4 . P r o d u c t i o n o f V i t a m i n C b y f e r m e n t a -t i o n . I I I . T h e f o r m a t i o n a n d i s o l a t i o n o f 2 - k e t o - L - g u l o n i ca c i d f r o m C a - L - i d o n a t e a n d C a - D - g l u c o n a t e m i x t u r e b yt h e s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o n , a n d s y n t h e s i s o f V i t a m i n Cf r o m 2 - k e t o - L - g u l o n i c a c i d . J . A g r i c . C h e m . S o c . J p n .2 8 : 8 9 0 - 8 9 4 .

V O L . 4 3 , 1 9 8 2

two stages fermentation of vitamin c

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