STERILNI LEKOVITI PREPARATI

• Parenteralni preparati prema Ph. Eur. 1997 i Ph. Jug. 2000 su sterilni peparati koji se aplikuju putem injekcije, infuzije ili implantacijom u ljudski ili životinjski organizam.

• Parenteralni preparati se injiciraju kroz kožu ili druge spoljašnje delove tkiva, a ne preko digestivnog trakta tako da lekovita supstanca putem gravitacije ili pod pritiskom direktno ulazi u krvne sudove, organe, tkiva ili lezije. Parenteralni preparati se aplikuju putem koji zaobilazi gastrointenstinalni trakt. Ovaj nači aplikacije se koristi za lekove koji ne mogu da se daju oralno („para“ – pored, „enteron“ – crevo).

• Jugoslovenska farmakopeja 2000 i Ph. Eur. 1997 u okviru parenteralnih preparata propisuju:

- Injekcije- Intravenske infuzije- Koncentrate za injekcije ili intravenske infuzije- Praškove za injekcije ili intravenske infuzije i - Implanti.

STERILIZACIJA I METODE STERILIZACIJE

• Sterilizacija je postupak kojim se uništavaju ili odstranjuju vegetativni i sporogeni oblici mikroorganizama.

• Cilj procesa sterilizacije je uništavanje ili eliminisanje svih oblika mikroorganizama, virusa, gljivica u/na preparatu ili priboru, posuđu, uređajima, radnim površinama i u vazduhu.

• U najvišem stepenu se štite parenteralni i oftalmološki preparati od prisustva i uticaja mikroorganizama.

• Sterilnost se definiše kao odsustvo živih mikroorganizama.• Uzroci kontaminacije mogu biti: mikroorganizmi, endotoksini

mikroorganizama (pirogene materije), gljivice i virusi.• Mogućnost prisustva virusa hepatitisa i AIDS virusa u proteinskim

proizvodima (frakcije krvi) doprinele su razvoju metoda sterilizacije za uklanjanje i uništavanje virusa.

Izvori kontaminacije mikroorganizmima mogu biti:-Polazne sirovine-Oprema-Vazduh-Osoblje-Ambalaža•Sterilnost se obezbeđuje primenom odgovarajućeg validiranog procesa proizvodnje. •Postupak mora biti podvrgnut prethodnoj proveri u pogledu efekata na određeni preparat, uključujući i finalnu ambalažu za proizvod.•Utvrditi da je očuvana efikasnost i celovitost preparata nakon primene određenog postupka sterilizacije.•Proces sterilizacije ne sme uticati na osobine i terapijsku aktivnost preparata, tj. materijala koji se steriliše.•Sterilnost je neophodno potvrditi odgovarajućim ispitivanjima, nakon procesa sterilizacije.

VAŽNO!Savremene farmakopeje ističu da ispitivanje sterilnosti ne može da garantuje sterilnost proizvoda, već sterilnost treba da bude obezbeđena primenom odgovarajućeg validiranog procesa proizvodnje.

Kod planiranja proizvodnje trebalo bi poštovati principe GMP i stavove koji se odnose na:•Kvalifikovano osoblje sa odgovarajućom obukom•Adekvatne prostorije•Odgovrajuću proizvodnu opremu•Adekvatne mere predostrožnosti•Validirane postupke•Praćenje uslova u radnoj sredini i postupaka procesne kontrole.

•Pri izboru postupka sterilizacije bira se onaj kojim je moguće sterilisati preparat u finalnoj ambalaži, odnosno već upakovan u primarnu ambalažu.

•Ako nije moguće, primenjuje se aseptični postupak, gde je uključena membranska filtracija.

•Efikasnost sterilizacije izražava se stepenom sigurnosti (SAL – Sterility Assurance Level), koji predstavlja verovatnoću postojan ja nesterilne jedinice u nekoj celini, koja je sterilisana datom metodom sterilizacije.

•Proces sterilizacije treba da obezbedi da verovatnoća pronalaženja nesterilne jedinice bude manja od 1 na milion 10-6.

•Sterilne preparate ili predmete treba čuvati pod uslovima koji osiguravaju održavanje sterilnosti u predviđenom vremenu (roku upotrebe).

Opšta podela metoda sterilizacijeMetode sterilizacije mogu se podeliti na tri velike grupe prema mehanizmima koji su u osnovi procesa uništavaju mikroorganizme:•Mehaničke (fizičko otklanjanje mikroorganizama –bakteriološka filtracija)•Fizičke (sterilizacija toplotom, zračenjem)•Hemijske (sterilizacija tečnostima i gasovima).

Oficinalne metode sterilizacijeMetode propisane Ph.Jug.IV:1.Sterilizacija suvim vrućim vazduhom:a)2 sata na 160±5 oCb)3 sata na 140 ±5oC2. Sterilizacija zasićenom vodenom parom pod pritiskom (autoklav):a)20 minuta na 120±1oC i nadpritisku od 101,3 kPab)6 minuta na 135±1oC i nadpritisku od 202,6 kPa

3. Sterilizacija u struji vodene pare ili ključaloj vodi 30minuta na 98-100 oC.4. Sterilizacija plamenomPredmet se provlači nekoliko puta kroz najtopliji deo plamena, tako da se

predmet svaki put zadrži u plamenu najmanje 20 sekundi.5. Sterilizacija filtracijom.6. Aseptični postupak.Metode sterilizacije propisane u Jugoslovenskoj farmakopeji 2000 (Ph. Jug.V) i

Ph. Eur. 1997:-sterilizacija parom (zagrevanje u autoklavu)-sterilizacija suvim vazduhom-sterilizacija jonizujućim zračenjem-sterilizacija gasom-filtracija -aseptični postupak.

Sterilizacija suvim vrućim vazduhom (suva toplota)Primenjuje se za sterilizaciju:•Predmeta, pribora, ambalaže (metal, staklo, porcelan)•Masti i ulja ( uljani rastvarači, podloge za masti i preparati pripremljeni sa mastima i uljima)•Hirurških instrumenataSuva toplota se koristi za sterilizaciju i depirogenizaciju.Mehanizam uništavanja mikroorganizama suvom toplotom zasniva se na oksidacionim procesima, gubitku vlage i denaturaciji proteina.Kao primeri neki od mogućih uslova sterilizacije:Na 140oC u trajanju od 180 minNa 160 oC u trajanju od 120 minNa 170 oC u trajanju od 90-120 minNa 180oC u trajanju od 60-90 minDepirogenizacija na 230oC u trajanju od 60-90 minNa 250oC u trajanju od 30-60 min

Sterilizacija suvom toplotom izvodi se u suvom sterilizatoru i zagrevanje se odvija:-kondukcijom (provođenje toplote sa metalnih uložaka)-konvekcija (prenošenje toplote pomoću vazduha)-zračenjem (zidovi ster. zrače toplotu) Materijal mora da bude pravilno raspoređen, tako da se ne ometa kretanje vazduha.Predmeti koji se sterilišu treba da se upakuju.

Nedostaci:-visoka temperatura-dugo trajanje-ne može se primeniti za sterilizaciju gume, plastike, tekstila.

Sterilizacija zasićenom vodenom parom pod pritiskomPrimenjuje se za sterilizaciju:• Vodenih parenteralnih preparata (injekcija, intravenskih infuzija)• Vodenih oftalmoloških preparata• Pribora i uređaja (metal, guma, najlon)• Hirurškog materijala (zavojni materijal, uniforme)Dokazano je da je ova metoda sterilizacije veoma efikasna (brzo uništava m.o. uz

minimum štetnog delovanja na materijal koji se steriliše).Efikasnost pare zasniva se na:• Visokoj temperaturi• Velikoj latentnoj toploti• Redukciji volumena pri kondenzaciji• Sposobnost hlađenja.Prednosti primene pare:Čistoća, laka distribucija, laka kontrola temperature, dobra moć penetracije,

ekonomska prihvatljivost.Mehanizam uništavanja mikroorganizama zasniva se na koagulaciji protoplazme

mikroorghanizama.

• Prema Ph. Jug. V minimalna temperatura sterilizacije je 121 oC i vreme od 15 min za vodene preparate.

• Izvodi se u autoklavu.• Proces sterilizacije u autoklavu odvija se u sledećim fazama:-odstranjivanje vazduha iz komore autoklava-odstranjivanje vodene pare iz komore-hlađenje i sušenje materijala.Posle sterilizacije autoklav se ostavlja da se ohladi (ispod 80oC), a hlađenje se

može ubrzati uvođenjem hladnog vazduha.Odgovarajućim testovima proverava se ispravnost rada autoklava.Sterilizacija filtracijomPrimenjuje se za sterilizaciju:

-rastvora termolabilnih supstanci-velikih količina tečnosti-preparati koji se ne mogu sterilisati u finalnoj ambalaži-gasova.

•Lekoviti preparati koji se sterilišu filtracijom treba da se izrađuju uz odgovarajuće mere predostrožnosti.•Treba svevsti na minimum mogućnost mikrobiološke kontaminacije.•Sterilizacija filtracijom izvodi se pod aseptičnim uslovima, odnosno ova dva postupka se kombinuju. •Proces sterilizacije se izvodi što je moguće bliže mestu punjenja.•Sve operacije posle filtracije se izvode pod aseptičnim uslovima.•Sterilizacija filtracijom zasniva se na mehaničkom odstranjivanju vegetativnih i sporogenih oblika mikroorganizama i drugih stranih čestica filtriranjem kroz sterilne filtre sa odgovarajućom veličinom pora (0,22µm-bakteriološki filtri) pod aseptičnim uslovima.•Odstranjivanje mikroorganizama se vrši sejanjem ili adsorpcijom.Izvodi se pomoću različitih uređaja za filtraciju koji se sastoji od:-nosača filtra-sterilnog filtra-uređaj za regulisanje pritiska (preporučuje se povišen pritisak)

Membranski filtri sterilišu se zasićenom vodenom parom pod pritiskom ili gasnom sterilizacijom (etilenoksid).Nedostaci:-ograničen kapacitet filtracionog medijuma-može doći do pucanja filtra-preparat se može kontaminirati pri punjenju u finalnu ambalažu.Aseptični postupak Podrazumeva izradu lekovitih preparata pod uslovima koji isključuju mogućnost kontaminacije.Primenjuje se za:-farmaceutske preparate koji se ne mogu sterilisati u finalnom pakovanju-suspenzije i emulzije za parenteralnu aplikaciju-neke koloidne i uljane rastvore.

•Aseptični postupak se izvodi u komori sa laminarnim protokom „Laminar flow“ gde je obezbeđena odgovarajuća čistoća vazduha stepena A, B ili C (klasa 100 i 10 000).•Kretanje vazduha je potisno, bez turbulencije.•Brzina kretanja vazduha u komori je 0,2 m/s – 0,5 m/s.•Vazduh koji dolazi u radni prostor prvo prolazi kroz predfiltracioni medijum, a potom kroz filtracioni medijum tzv. HEPA – filter (High Efficiancy Particulate Air-Visoko efikasni filtri za čestice iz vazduha), koji uklanjaju 99,97% lebdećih čestica veličine 0,3µm i većih.

Sterilizacija etilenoksidom (sterilizacija gasom)Primenjuje se za:Plastične komponente za medicinsku terapiju (kateteri, sistemi za i.v. aplikaciju, sonde)Plastičnu ambaažu za lekovite preparatePapirnu ambalažu.

• Etilenoksid je bezbojan gas teži od vazduha, mirisa sličnog etru, reaktivan, ima tendenciju polimerizacije.

• Njegovo sterilizirajuće dejstvo zasniva se na reakciji alkilovanja u ćeliji.• Zapaljiv je, toksičan i eksplozivan, da bi se smanjila mogućnost upaljivanja

i eksplozije meša se sa gasovima.• Sterilizacija se izvodi u uređajima koji mogu da podnesu vakuum ili koji

mogu da podnesu visok pritisak ako se koriste mešavine etilenoksida sa CO2.

• Aktivacija se vrši u prisusutvu vodene pare, povišene temperature i odgovarajuće koncentracije etilenoksida.

Uslovi procesa:-temperatura 40-60 oC-koncentracija etilen oksida 400-1299 mg/l-vlažnost najmanje 33%-vreme.Etilenoksid dobro prodire materijal, ali se zadržava i sporo otklanja oko 14

dana.

Sterilizacija zračenjemPrimenjuje se za sterilizaciju termolabilnih materijala.Tipovi zračenja:- elektromagnetno (ultravioletno i gama zračenje)-čestično (elektroni visoke energije)UV zračenje talasne dužine 240-280 nm ima baktericidni efekat, ali ima i ograničenu penetraciju. -Koristi se za sterilizaciju vazduha, radnih površina, površina predmeta i vode u tankom sloju. -Ne preporučuje se za sterilizaciju medicinskih uređaja ili lekovitih preparata.Gama zračenje se uspešno primenjuje za farmaceutske materijale: enzime, vitamine, minerale, antibiotike, peptide i dr.-Najveća primena je pri sterilizaciji medicinskih instrumenata, plastičnih uređaja, delova uređaja, hirurških uniformi.

Prednosti metode:-smanjenje degradacije proizvoda-visoka produktivnost-temperaturna nezavisnost-ekonomičnostElektroni visoke energije (ubrzani elektroni)Primenjuje se kao alternativa gama zračenju u industriji.Nedostaci:Mala moć penetracije u poređenju sa gama zracimaMogu proizvesti x-zrake

Ispitivanje sterilnosti

•Ispitivanje se izvodi po završenoj izradi preparata koji je bio podvrgnut sterilizaciji i u toku procesa sterilizacije, da bi se kontrolisao proces.•Svrha ispitivanja je da se utvrdi da li je proizvod koji je sterilisan kontaminiran mikroorganizmima.•Ispituju se samo oni uzorci koji prema propisu farmakopeje treba da budu sterilni.•Sterilnost cele proizvodne serije se potvrđuje pored testa sterilnosti, dokazima da su uslovi pod kojima je proizvedena ispitivana serija u skladu sa zahtevima GMP standarda.Metode ispitivanja sterilnosti su:•direktna inokulacija•membranska filtracija

•Membransku filtraciju za ispitivanje sterilnosti treba koristiti uvek kada priroda proizvoda to dozvoljava.•Preporučuje se za vodene preparate koji se mogu filtrirati, za alkoholne ili uljane ili za suve praškove koji se mogu rastvoriti sa vodom ili uljanim rastvaračem.•Direktna metoda je inokulacija preparata u propisanu podlogu i inkubacija pod propisanim uslovima.•Membranska filtracija je postupak koji se sastoji u tome da se preparat filtrira kroz membranski filter, pod aseptičnim uslovima, a potom filter prenese na hranljivu podlogu i podloga inkubira pod propisanim uslovima.•Na osnovu odgovarajućih postupaka vrši se interpretacija rezultata i utvrđuje da li je preparat u saglasnosti sa zahtevima testa sterilnosti.•Biološki indikatori predstavljaju standardizovane preparate koji sadrže selekcionisane mikroorganizme koji pokazuju visoku otpornost na postupke sterilizacije, a na osnovu njih se verifikuje i prati proces sterilizacije.

Pirogene materije (pirogeni)Predstavljaju metaboličke proizvode mikroorganizama. Najpoznatije i najpotentnije pirogene materije su endotoksini.Endotoksini potiču primarno od spoljašnjeg ćelijskog zida gram-negativnih bakterija.Gram-pozitivne bakterije i gljivice takođe proizvode pirogene, ali manje potencije i druge hemijske prirode.Endotoksini su lipopolisaharidi visoke molekulske mase. Parenteralni rastvori ne smeju biti kontaminirani mikroorganizmima, jer oni otpuštaju pirogene.Parenteralni preparati koji su kontaminirani pirogenima nakon aplikacije proizvode bezbroj bioloških raekcija „pirogene reakcije“, koje karakteriše:Visoka temperatura, oslobađanje histamina, promene permeabilnosti krvnih sudova.Kada su prisutne visoke koncentracije endotoksina mogu uzrokovati agregaciju krvnih pločica, prouzrokovati šok i smrt.

•Posebno je ozbiljan problem kod kontaminacije pirogenima intravenskih infuzija (veliki volumen).

Prisustvo pirogena u preparatu kao posledica:-zagađenosti polaznog materijala endotoksinom-dospeće bakterijskih endotoksina u toku procesa proizvodnje.

Ispitivanje prisustva pirogena u preparatu1.Pirogen test (pirogeni različitog porekla)

2. LAL test - Test na bakterijske endotoksine -Limulus amebocyte lysat koji je specifičan za endotoksine iz bakterijskih izvora.

1. Pirogeni test na kunićima (Ph.JugV, Ph.Eur. 1997, Ph.Jug.IV) karakteriše sledeće:- u testu se koristi kunić- pirogeni se mere fiziološkim efektom- nije sasvim pouzdan- pogodan kao završni test jednog proizvodnog procesa-skup. 2. Limulus amebocyte lysate (LAL test) karakteriše sledeće:- za ispitivanje prisustva endotoksina koristi se LAL reagens- kvalitativan test (na prisustvo endotoksina) i kvantitativni test(koncentracija endotoksina)- brže izvođenje- manje skup- osetljiv test za male količine parenteralnih rastvora- pogodan za ispitivanje pirogena u toku proizvodnje- otkriva se bakterijski endotoksin u slobodnom stanju ili udružen sa neoštećenim ćelijskim zidom gram-negativne bakterija.

•Reagens Limulus Amebocyte lisate (LAL) priprema se iz krvi zdravog, odraslog, potkovičastog račića Limulus polyphemus srčanom punkcijom.•Amebociti (ćelije krvi) peru se i liziraju osmotskim putem.•Lizat reagens pokazuje reakciju koagulacije proteina, pod uslovima propisanim za in vitro ispitivanje.•Otkrivaju se male količine endotoksina 1 mg/ml ili manje.•Mehanizam je stvaranje limulus lizat gela, pri čemu je zamućenje srazmerno koncentraciji prisutnog endotoksina.•Kvantitativno određivanje se vrši spektrofotometrijski i turbidimetrijski.

Limulus polyphemus