Diapositiva 1

RNAi knockdown of a salivary transcript leading tolethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum

Navdeep S. Mutti, Yoonseong Park, John C. Reese and Gerald R. Reeck.Biologia molecularFrancisco dumasFelipe HerreraCarlos LopezLorena Pealoza1Informacin de la publicacinJournal of Insect Science

Volume 6, Number 38

Received: 18.11.2005 Accepted: 3.4.2006 Published: 30.10.2006abstractInyecciones de pequeos ARNi (SiRNA) en fidos partenogenticos de guisante (Acyrthosiphon pisum) Agotamiento de factor de transcripcin para glndula salival.

siRNA a partir de RNA doble cadena (coo2)

Niveles transcripcin caen 3 das despus de la inyeccin

iRNASilenciamiento de genes

dsRNA exgeno se introduce en la clula reduce transcripcin de genes blanco

Documentado anteriormente para C. elegans

Mtodo para estudiar genes individuales

Inyecciones con iRNA en invertebrados (post-embrionarios)

Caenorhabditis eleganses unaespeciedenematodorabdtidofamiliaRhabditidaeque mide aproximadamente 1 mm de longitud, y vive en ambientes templados. Ha sido un importante modelo de estudio para labiologa, muy especialmente lagentica del desarrollo, a partir de los aos 70.

abeja melfera, Apis mellifera(Amdam et al., 2003), las polillas Hyalophoracecropia (Bettencourt et al., 2002), Spodopteralitura (Rajagopal et al. 2002), Bombyx mori(Uhlirova et al. 2003) y Manduca sexta (Levinet al. 2005), los mosquitos, Anopheles gambiae(Osta et al. 2004) y Aedes aegypti (Attardo etal. 2003), la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster(Goto et al. 2003), un saltamontes, Schistocercaamericana (Dong y Friedrich 2005), el rojoharina Tribolium castaneum escarabajo (Arkane et al.2005a y 2005b, Tomoyasu et al. 2005) y unatermitas, Reticulitermes flavipes (Zhou et al.2006)5Accin del iRNAEn insectos: hemolinfa a tejidos y rganos (disminuye nivel transcripcin)

Accin sobre fidos aun no probada

Se quiere probar accin sobre glndula salival.

Uso comn: RNA largo de doble cadena.

Evita transcripcion al degradar RNAm diana6siRNA 21 pares de bases

Altamente efectivos para obtener iRNA

In vitro utilizando la enzima Dicer, (forma de RNasa III) y tambin (Bernstein et al. 2001).

Importancia de las protenas en saliva de fidosPapel interaccin insecto planta

Enzimas

Formacin estilete

Vulnera defensas

Bibliotecas de cDNA

C002 (mas abundante y menos transcripcin)

Materiales y mtodosfidos recolectados de alfalfa y luego criados en habas (vicia fabae) en macetas.

Luces de sodio alta intensidad (L:D, 16:8)

Recoleccin de ninfas partogenticas

7 das en plantas para luego aplicar tratamiento

Ninfas: falta de madurez en gnadas, menor tamao general (incluyendo alas)9Preparacin ADN doble cadena y siARNPara doble cadena se usaron cebadores T7

Para siRNA secuencias 5 '- TAA TAC GAC TCA CTATAG GGA AGT TA - 3 'y 5' - TAA TAC GACTCA CTA TAG GGA AAC TT - 3

Los dos cebadores desde la posicin 5 a la posicin637 de un total 660 bases

Los cebadores para protena verde fluorescente ARN tenan la secuencia : 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GAT GC - 3' y 5 '- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGA CT - 3' .Estos cubren una regin de 520 bases. (control)Inyecciones siRNAAgujas de vidrio (1mm diametro exterior, 0,5mm interior)

Fueron inyectados en la sutura de la unin al mesotrax y metatrax

Niveles de transcripcin por RT-PCRSe aisl ARN de las cabezas usando reactivo tri (tiocianato de guanidine y fenol) y se trat con DNasa I Transcriptasa inversa con cebadores oligo-dT para sintetizar cDNA.

Discusin y resultados

Discusin y resultados

injection siC002-RNA (blue line, closed triangles) or siGFP-RNA (red line, open squares). Data are averages of normalized intensities from several individual insects at each time point and bars depict standard errors. The green line (open triangles) shows the survival of siC002-RNA-injected insects from Figure 1.